CN105524961A - 一种发酵生产两性霉素b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高微生物发酵生产两性霉素B产量的方法。该方法通过优化有机复合氮源和发酵条件，降低不同批次间氮源对发酵代谢的影响；通过添加前体物质，促进两性霉素B生物合成。发酵结束后，两性霉素B的发酵单位达到14469ug/ml。与优化前相比，两性霉素B产量提高103%，发酵时间缩短14%，提高了设备利用率，同时易于下游的纯化。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产两性霉素B的方法。
背景技术
两性霉素B是由结节性链霉素发酵产生的，由37个碳原子构成的多烯大环内酯类抗生素，临床用于治疗由多种深部真菌如白色念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌等引起的心脏或全身感染。对某些严重的深部真菌病如新生隐球菌脑膜炎、侵袭性曲霉病，特别是对免疫缺陷或严重粒细胞缺乏的患者的治疗以及某些地方性真菌病如球孢子菌病、组织胞浆菌病、皮炎芽生菌病等仍需应用两性霉素B，两性霉素B仍然是治疗侵袭性真菌感染的一线药物及“金标准”。
两性霉素B为多烯大环内酯类抗生素，其生物合成途径为PKSI，可以分解为活化前体的生成（乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)、内酯环的生成(多聚乙酰途径)和氨基糖的形成。在两性霉素B的生物合成途径中，内酯环的形成是限制性因素。内酯环的形成是以乙酸为起始单位、丙二酸为延续单位通过聚酮体途径缩合而成，这表明两性霉素B生物合成的重要前体物质是短链脂肪酸，这些脂肪酸前体物不易被菌体合成，因而成为限制两性霉素B生物合成的决定性因素。在两性霉素B发酵过程中加入前体物质是提高发酵单位的重要手段，通过补加前体物质，可以达到控制两性霉素B产生菌的生物合成方向及增加两性霉素B产量的目的。从外界补加前体物质，能明显地提高两性霉素B的发酵水平。但是，外源性前体物质在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌株中毒，不利于两性霉素B的生物合成；而前体物质不足也会大大影响两性霉素B的生产。因此，研究加入何种前体物质以及添加策略对两性霉素B的高产稳产具有重要的意义。
工业发酵过程的调控往往是一个复杂的多因素问题，直接影响到发酵效价及目的产物的生产，是工业发酵中最核心的问题之一。利用微生物发酵生产两性霉素B，其培养基成分相当复杂。影响微生物代谢的因素除培养基成分外，还包括pH值、温度等操作条件，可变因子较多。因而选择合适、高效的优化方法显得尤为重要。
有机氮源作为一种成分复杂而且组分不容易定量的培养基原料，对发酵过程影响很大。长期以来，工业发酵大都采用玉米浆等大宗农副产品作为有机氮源，不同厂家、不同批次有机氮源组分之间存在不稳定性和差异性，所以导致不同批次发酵代谢产物及代谢水平不一致，因此有机氮源的选取和使用是非常关键的。
因此，如何调整两性霉素B发酵培养基的成分以及发酵条件，加入何种前提物质，加入的量以及加入时机的选择，成为如何提高微生物发酵生产两性霉素B产量的所迫切需要研究的课题。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备两性霉素B存在的发酵过程不稳定及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件，在发酵过程中添加前体物质，促进两性霉素B的生物合成，来提高两性霉素B产量的方法。
本发明的关键构思为：采用结节性链霉素菌株为出发菌株，在微生物发酵生产两性霉素B的过程中，优化初始pH值、发酵温度及时间、接种量等条件，优化新型复合有机氮源，在两性霉素B产物合成初期，添加前体物质，提高两性霉素B的产量。
本发明所提供的一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：
a、制备结节性链霉素菌株的种子液
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发酵罐中培养44-52h获得种子液。
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、热榨黄豆饼粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌可选用菌种编号ATCC14899的菌种。
b.制备结节性链霉素菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-15%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24-50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120-140h，发酵温度26-30℃，得到发酵液。
其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-40.0克、玉米粉20.0-30.0克、热榨黄豆饼粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-30.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-8.0克、磷酸二氢钾0.5-0.8克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-8.0，121℃灭菌30min。
其中所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0.4-4克。
其中所述前体物质添加时间为发酵30-40小时之间加入。
其中所述步骤b中棉籽蛋白粉和酵母粉的质量比为6：1-3：1。
其中步骤b中所述发酵为压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为200-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。
其中所述种子液以体积百分比8-10%的接种量接种于发酵培养基。
其中所述种子液在种子培养基中培养46-48小时。
其中所述发酵培养基的初始最适pH值为为7.3-7.6。
其所述步骤b中中棉籽蛋白粉和酵母粉，比例为5:1-4:1。
上述优选条件，所获得两性霉素B的产量从7131ug/ml提高到14469ug/ml，为两性霉素B的工业化生产提供了一种新的方法。本发明中通过优化发酵配方、新型复合有机氮源和发酵条件，保证了不同发酵批次间代谢产物及发酵水平的一致性；加入前体物质后可显著促进两性霉素B的生物合成。优化后两性霉素B产量提高103%，发酵时间缩短14%，提高了产能，缩短了生产周期，降低了能耗及三废排放。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料；所用的棉籽蛋白粉由青岛科瑞提供，酵母粉由安琪酵母有限公司提供，丙酸钠、正丙醇由天津永大化学试剂有限公司提供。
实施例1、10L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26℃、220rpm、培养48h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉10.0克、玉米浆8.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
发酵培养基组成：
葡萄糖280.0克、玉米粉140.0克、热榨黄豆饼粉140.0克、玉米浆35.0克、磷酸二氢钾3.5克、氯化钠7.0克、碳酸钙28克，加自来水定容至7000mL，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：1.0vvm，装料量为7L，种子培养46小时后接种，接种量为10%，培养温度为26℃，转速为300r/min。在发酵培养开始24小时后加入丙酸钠，每升发酵液加入0.4g，发酵培养140小时。
结果见表1，在优化的发酵条件下，采用传统的黄豆饼粉作为有机氮源，在发酵过程中加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为8557ug/ml。
实施例2、5L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃、220rpm、培养46h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉30.0克、葡萄糖10.0克、热榨黄豆饼粉15.0克、酵母粉8.0克、玉米浆5.0克、氯化钠2.0克、碳酸钙4.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.5，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
发酵培养基组成：
葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、棉籽蛋白粉90.0克、酵母粉15.0克、玉米浆18.0克、磷酸二氢钾2.1克、氯化钠4.5克、碳酸钙9克，加自来水定容至3000mL，pH7.5，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：0.8vvm，装料量为3L，种子培养46小时后接种，接种量为8%，培养温度为28℃，转速为400r/min。在发酵培养开始50小时后加入正丙醇，每升发酵液加入4g，发酵培养120小时。
结果见表1，在优化的发酵条件下，采用棉籽蛋白粉和酵母粉（6：1）作为有机氮源，在发酵过程中加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为14469ug/ml。
实施例3、10L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，30℃、220rpm、培养44h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉25.0克、葡萄糖15.0克、热榨黄豆饼粉20.0克、酵母粉5.0克、玉米浆2.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
发酵培养基组成：
葡萄糖140克、玉米粉210克、棉籽蛋白粉175克、酵母粉35克、玉米浆56克、磷酸二氢钾3.5克、氯化钠14克、碳酸钙42克，加自来水定容至7L，pH7.6，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：1.2vvm，装料量为7L，种子培养44小时后接种，接种量为6%，培养温度为30℃，转速为300r/min。在发酵培养开始30小时后加入丙酸钠，每升发酵液加入2g，发酵培养130小时。
结果见表1，在优化的发酵条件下，采用棉籽蛋白粉和酵母粉（5：1）作为有机氮源，在发酵过程中加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为14561ug/ml。
实施例4、100L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于10L罐种子培养基，装量7L，30℃、300rpm、通气比1：1vvm、培养52h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉210.0克、葡萄糖70.0克、热榨黄豆饼粉140.0克、酵母粉35.0克、玉米浆21.0克、氯化钠14.0克、碳酸钙28.0克，加自来水定容至7000mL，pH7.5，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
发酵培养基组成：
葡萄糖1500克、玉米粉1250克、棉籽蛋白粉1500克、酵母粉500克、玉米浆250克、磷酸二氢钾40克、氯化钠50克、碳酸钙200克，加自来水定容至50L，pH8.0，121℃灭菌30min，100L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：1.2vvm，装料量为60L，种子培养52小时后接种，接种量为15%，培养温度为30℃，转速为200r/min。在发酵培养开始40小时后加入正丙醇，每升发酵液体积加入3g，发酵培养130小时。
结果见表1，在优化的发酵条件下，采用棉籽蛋白粉和酵母粉（3：1）作为有机氮源，在发酵过程中加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为14667ug/ml。
对比例1、10L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃、220rpm、培养48h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉10.0克、玉米浆8.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
发酵培养基组成：
葡萄糖280.0克、玉米粉140.0克、热榨黄豆饼粉140.0克、玉米浆35.0克、磷酸二氢钾3.5克、氯化钠7.0克、碳酸钙28克，加自来水定容至7000mL，pH7.0，121℃灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：1.0vvm，装料量为7L，种子培养48小时后接种，接种量为10%，培养温度为26℃，转速为300r/min。发酵培养140小时。
结果见表1，在优化的发酵条件下，采用传统的黄豆饼粉作为有机氮源，不加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为7113ug/ml。
对比例2、5L自动发酵罐发酵制备两性霉素B
结节性链霉素菌株种子液的制备
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，30℃、220rpm、培养44h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0克、热榨黄豆饼粉10.0克、酵母粉10.0克、玉米浆8.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙3.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明所述两性霉素B产生菌为菌种编号ATCC14899的菌种。
发酵培养基组成：
葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、棉籽蛋白粉90.0克、酵母粉15.0克、玉米浆18.0克、磷酸二氢钾2.1克、氯化钠4.5克、碳酸钙9克，加自来水定容至3000mL，pH7.5，121℃灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
发酵条件：罐内的压力为0.05MPa，通气比为1：0.8vvm，装料量为3L，种子培养44小时后接种，接种量为8%，培养温度为28℃，转速为400r/min。发酵培养120小时。
结果见表1，在优化的发酵条件下，采用棉籽蛋白粉和酵母粉（6：1）作为有机氮源，不加入前体物质，发酵结束后，两性霉素B的发酵单位为12134ug/ml。
将表1中结果计算可知，有机氮源为棉籽蛋白粉和酵母粉时，比为黄豆饼粉时，发酵单位提高（12134-7131）/7131=70%。
添加前体丙酸钠或正丙醇，均可使发酵单位提高约20%：如有机氮源为黄豆饼粉时，发酵单位提高（8557-7131）/7131=20%，有机氮源为棉籽蛋白粉和酵母粉时，发酵单位提高（14469-12134）/12134=19.2%等。
综合优化后，即实施例2相对对比例1，发酵单位提高（14469-7131）/7131=103%，发酵时间缩短14%。
Claims (4)
1.一种发酵生产两性霉素B的方法，包括以下步骤：
a、制备结节性链霉素菌株的种子液
将结节性链霉素菌株的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，26-30℃、在摇瓶或发酵罐中培养44-52h获得种子液；
其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、热榨黄豆饼粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米浆2.0-8.0克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-4.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌30min；
b.制备结节性链霉素菌株的发酵液
将上述种子液以体积百分比6-15%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发酵，发酵24-50小时之间加入前体物质丙酸钠或正丙醇，继续发酵，总发酵时间120-140h，发酵温度26-30℃，得到发酵液；
其中所述发酵培养基按以下方法制得：葡萄糖20.0-40.0克、玉米粉20.0-30.0克、热榨黄豆饼粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-30.0克、酵母粉0-10.0克、玉米浆5.0-8.0克、磷酸二氢钾0.5-0.8克、氯化钠1.0-2.0克、碳酸钙3.0-6.0克，加水定容至1000mL，pH7.0-8.0，121℃灭菌30min。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤b中前体物质添加量为每升发酵液加入0.4-4克。
3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤b中前体物质添加时间为发酵30-40小时之间加入。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤b中所述发酵为压力为0.05±0.01Mpa、搅拌速度为200-400rpm，通气比为1:0.8-1.2vvm。
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