CN111118090B - 一种提高两性霉素b产量的补料控制发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法，通过控制发酵体系pH、温度、DO值、葡萄糖浓度和添加外源添加物达到提高提高两性霉素B产量的目的。本发明分阶段发酵调控策略能够提供结节链霉菌一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境，有利于两性霉素B的积累；同时补料调控则通过补料培养基和外源化合物的补料，避免了营养物质在发酵过程中的消耗，后期得不到必要的补充的问题。采用本发明发酵方法，两性霉素B放罐单位可以达到16g/L以上，生产成本较目前的先进水平降低15％左右，所得两性霉素B发酵液中，副产物两性霉素A下降了30％以上，降低了后期分离纯化的难度。

Description

一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法
(一)技术领域
本发明涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
(二)背景技术
两性霉素B(Amphotericin B，AmB)是重要的抗真菌类抗生素，自1966年上市以来，一直是深部真菌感染的首选药物。AmB纯品的颜色为黄色或橘黄色，由于其分子结构中亲水基团与疏水基团的不对称分布和带有酸碱性的特点，使得AmB在水相及大部分有机相中的溶解度极低。AmB抗真菌谱广、活性强，对念珠菌、隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都有很强的抗真菌作用，还能有效抑制假丝酵母菌和用于治疗利什曼病等，因此两性霉素B及其衍生物的应用仍然非常广泛。
目前两性霉素B的工业生产仍主要采用的是微生物发酵法，微生物发酵生产抗生素的水平高低除了与菌种遗传特性有关，还与发酵培养基成分和发酵条件及发酵过程控制有关。对于前者目前有诱变育种和分子改造等手段，对于后者主要通过优化得到最适发酵培养基配方、发酵培养条件，同时通过发酵过程控制及补料可实现抗生素的提产，尤其是与发酵调控结合下补料分批发酵能够更有利于抗生素产量的提高。
补料可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的影响，改善发酵流变学的性质；可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。AmB发酵属于好氧过程，结节链霉菌在发酵过程中存在葡萄糖流加速率与溶氧控制相关联的问题。如果葡萄糖流加过快，则会导致溶氧水平过低，使发酵处于厌氧状态，目标产物产量降低；如果葡萄糖流加过慢，则会导致溶氧水平过高，菌体处于饥饿状态，自溶现象增加，影响目标产物的产生。目前，两性霉素B仍存在产量较低，产业化生产发展缓慢的问题限制了两性霉素B的发展。因此，开拓出一条新的提高两性霉素B的产量的方法，对实际应用具有很大意义。
(三)发明内容
本发明的目的是针对上述存在的缺陷而提供一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法。
本发明采用的技术方案是：
一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法，所述方法包括：将结节链霉菌接种至种子培养基，获得种子液；种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，发酵总时间120±36小时(较佳的为132±12小时)，发酵过程中参数控制如下：
(1)控制发酵体系pH维持在6.0～7.5，直至发酵结束；
(2)在发酵培养第0～48h，维持温度在30±3℃，当发酵至48h时，将温度降至26±3℃，维持该温度直至发酵结束；
(3)发酵前期使菌体在自然DO条件下生长，当发酵体系DO值下降至5～50％时，控制DO值维持在5％～50％至第108h，后恢复自然DO值直至发酵结束；
(4)控制发酵培养基中葡萄糖浓度，发酵过程中葡糖糖浓度下降到20～40g/L时，进行恒速补料，葡糖糖补料速率为0.1～5.0g/L·h；所用的发酵罐可为上海保兴生物BIOTECH系列的5L发酵罐；每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。补料培养基为：100～500g/L葡萄糖，1～20g/L蛋白胨和0.01～5g/L硫酸铵，溶剂为水；
(5)在发酵第24h，补加5～15mL/L丙酮酸、0.001～0.1g/L烟酰胺、0.1～5mmol/L丙氨酸和0.1～15mg/L异丙醇四种混合外源添加物。
葡萄糖的流加调节，避免了葡萄糖在整个发酵过程中浓度不均一，以及一次性补入大量葡萄糖，不利于菌体的生长代谢的问题。此外糖高会产生酸性物质，如乳酸等，造成菌体不长，pH下降；糖低营养不足，造成菌体不长。菌体不长或生长缓慢将会打破两性霉素B生物合成过程中的正常代谢途径，同时造成pH变化，最终形成更多复杂的副产物，不利于后期的分离纯化。通过本发明的补料控制方法，可以保证发酵液中葡萄糖的相对稳定浓度，使得菌体生长的各个阶段都可以保持最佳生产状态，有效提高两性霉素B的产率。
优选的，所述种子培养基组成如下：蛋白胨10～30g/L，酵母提取物5～20g/L，氯化钠1～10g/L，葡萄糖5～20g/L，碳酸钙0.5～2g/L，溶剂为水，pH为7.0～7.2。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖60～80g/L，棉籽粉10～30g/L，碳酸钙5～15g/L，磷酸二氢钾0.05～5g/L，溶剂为水，自然pH值。
发酵过程中以质量浓度为30±2％的氨水或乙酸来控制pH值。
优选的，所述结节链霉菌为结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426，已在CN 110564718A中披露。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
分阶段发酵调控策略能够提供结节链霉菌一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境，有利于两性霉素B的积累；同时补料调控则通过补料培养基和外源化合物的补料，避免了营养物质在发酵过程中的消耗，后期得不到必要的补充的问题。补料培养基中各营养物质需要分开灭菌，混合外源化合物则采用过滤除菌，不会对各物质造成破坏。采用本发明发酵方法，两性霉素B放罐单位可以达到16g/L以上，生产成本较目前的先进水平降低15％左右。所得两性霉素B发酵液中，副产物两性霉素A下降了30％以上，降低了后期分离纯化的难度。
(四)附图说明
图1为对比例发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图2为实施例1发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图3为实施例2发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图4为实施例3发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图5为实施例4发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图6为实施例5发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图7为实施例6发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图8为实施例7发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图9为实施例8发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
图10为实施例9发酵过程曲线，显示了在发酵过程中的两性霉素B产品的产量，菌体生物量和葡萄糖剩余量的变化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
对比例：
本发明实施例中所用的菌种为结节链霉菌Streptomyces nodosus ZJB2016050(CCTCC No：M 2017426)，来自中国典型培养物保藏中心。
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
两性霉素B的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，在26℃、500r/min和6L/min通气量的条件下培养5天，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第5天时结束发酵，取样检测AMB含量，结果如图1所示，用高效液相色谱测得AMB含量为9.89g/L。
实施例1：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
发酵过程中，加入氨水和乙酸来调节pH值，氨水和乙酸质量百分比浓度为30％。
两性霉素B的分阶段pH调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，初始发酵条件为26℃、500r/min转速和6L/min通气量，待发酵液的pH值下降至7.0时，控制pH值在7.0，直至发酵结束，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第6天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图2所示，最终测得AMB产量为12.66g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了28％。
实施例2：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
两性霉素B的分阶段温度调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，初始发酵条件为500r/min和6L/min通气量，自然pH和DO条件。在发酵前期0-48h，将温度控制在30℃，发酵至48h时，逐渐将温度降低至26℃，保持该温度进行培养，直至发酵结束。每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第6天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图3所示，最终测得AMB产量为11.79g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了19％。
实施例3：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
两性霉素B的分阶段DO调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，初始发酵条件为26℃，500r/min，6L/min通气量和自然pH条件。在发酵前期，使菌体在自然DO条件下进行发酵，直至DO下降至20％时，控制溶氧在20％至108h；108h时，恢复自然状态下DO直至发酵结束，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第6天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图4所示，最终测得AMB产量为11.28g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了14％。
实施例4：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
外源化合物的补料浓度和组成如下：丙酮酸15mL/L、烟酰胺0.02g/L、丙氨酸1.5mmol/L和异丙醇5mg/L。
发酵过程中，加入氨水和乙酸来调节pH值，氨水和乙酸质量百分比浓度为30％。
两性霉素B的基于混合分阶段调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，在发酵前期使菌体在自然pH及DO，恒定温度30℃，500r/min和6L/min通气量条件下使菌体自然生长，待后期同时采用分阶段pH 7.0，温度T:30℃-26℃(第0～48h温度30℃，48h起温度26℃直至发酵结束)，溶氧DO:20％(当发酵体系DO值下降至20％时，控制DO值维持在20％至108h，后恢复自然DO值直至发酵结束)混合调控策略。同时，在发酵24h时，补加15mL/L丙酮酸、0.02g/L烟酰胺、1.5mmol/L丙氨酸和5mg/L异丙醇四种混合外源添加物。在发酵培养第7天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图5所示，最终测得AMB产量为13.15g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了33％；同时副产物两性霉素A下降了32％。
实施例5：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
补料培养基包括以下成分：葡萄糖200g/L，蛋白胨5g/L和硫酸铵0.3g/L，溶剂为蒸馏水。
两性霉素B的恒速补料调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，初始发酵条件为26℃，500r/min，6L/min通气量，自然pH和DO条件。在发酵前期，使菌体自然生长，待发酵培养基中的葡萄糖浓度下降至20g/L时，开始进行恒速补料，补料速率为1.5g/(L·h)，最终总补料900mL，每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第7天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图6所示，最终测得AMB产量为15.78g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了60％。
实施例6：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
补料培养基包括以下成分：葡萄糖200g/L，蛋白胨5g/L和硫酸铵0.3g/L，溶剂为蒸馏水。
两性霉素B的恒速残余葡萄糖浓度补料调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，初始发酵条件为26℃，500r/min，6L/min通气量，自然pH和DO条件。在发酵前期，使菌体自然生长，残糖浓度自然下降，待发酵培养基中的葡萄糖浓度下降至20g/L时，开始进行补料，并且将残糖浓度维持在20g/L左右，最终总补料900mL；每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第7天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图7所示，最终测得AMB产量为14.51g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了47％。
实施例7：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
补料培养基包括以下成分：葡萄糖200g/L，蛋白胨5g/L和硫酸铵0.3g/L，溶剂为蒸馏水。
两性霉素B的变速补料调控策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，初始发酵条件为26℃，500r/min，6L/min通气量，自然pH和DO条件。在发酵前期，使菌体自然生长，
残糖浓度自然下降，待发酵培养基中的葡萄糖浓度下降至20g/L时，开始进行补料，补料速率为1.5g/(L·h)；发酵108h时，将补料速率变为2.0g/(L·h)，最终总补料900mL。每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第7天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图8所示，最终测得AMB产量为13.94g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了41％。
实施例8：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
补料培养基包括以下成分：葡萄糖200g/L，蛋白胨5g/L和硫酸铵0.3g/L，溶剂为蒸馏水。
外源化合物的补料浓度和组成如下：丙酮酸10mL/L、烟酰胺0.025g/L、丙氨酸1mmol/L和异丙醇4mg/L。
发酵过程中，加入氨水和乙酸来调节pH值，氨水和乙酸质量百分比浓度为30％。
两性霉素B的基于分阶段调控下的补料控制策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，在发酵前期使菌体在自然pH及DO，恒定温度30℃，500r/min和6L/min通气量条件下使菌体自然生长，待后期同时采用分阶段pH 7.0，温度T:30℃-26℃(第0～48h温度30℃，48h起温度26℃直至发酵结束)，溶氧DO:20％(当发酵体系DO值下降至20％时，控制DO值维持在20％至108h，后恢复自然DO值直至发酵结束)调控策略，待到发酵过程中的葡糖糖浓度下降到20g/L左右，开始进行恒速补料，葡萄糖补料速率为1.5g/(L·h)，最终总补料900mL。同时，在发酵24h时，补加10mL/L丙酮酸、0.025g/L烟酰胺、1mmol/L丙氨酸和4mg/L异丙醇四种混合外源添加物。每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第7天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图9所示，最终测得AMB产量为18.39g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了86％；同时副产物两性霉素A下降了45％。
实施例9：
一级和二级种子培养基包括以下成分：蛋白胨15g，酵母提取物10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，碳酸钙1g，蒸馏水补足至1L，以NaOH调节pH值为7.0，115℃灭菌30min；
发酵培养基包括以下成分：葡萄糖70g，棉籽粉25g，碳酸钙9g，磷酸二氢钾0.1g，蒸馏水补足至1L，自然pH值，115℃灭菌30min。
补料培养基包括以下成分：葡萄糖300g/L，蛋白胨15g/L和硫酸铵1.5g/L，溶剂为蒸馏水。
外源化合物的补料浓度和组成如下：丙酮酸15mL/L、烟酰胺0.05g/L、丙氨酸2mmol/L和异丙醇10mg/L。
发酵过程中，加入氨水和乙酸来调节pH值，氨水和乙酸质量百分比浓度为30％。
两性霉素B的基于分阶段调控下的补料控制策略发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Streptomyces nodosus ZJB2016050种子培养：
从GYM斜面培养基上取一环带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得一级种子液；2天后，以2％的接种量转接到一瓶含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，培养温度为26℃，摇床转速200r/min，培养2天，获得二级级种子液。
(2)Streptomyces nodosus ZJB2016050发酵培养：
以10％的接种量将二级种子液接种到5L发酵罐中，在发酵前期使菌体在自然pH及DO，恒定温度30℃，500r/min和6L/min通气量条件下使菌体自然生长，待后期同时采用分阶段pH 7.0，温度T:30℃-26℃(第0～48h温度30℃，48h起温度26℃直至发酵结束)，溶氧DO:20％(当发酵体系DO值下降至20％时，控制DO值维持在20％至108h，后恢复自然DO值直至发酵结束)调控策略，待到发酵过程中的葡糖糖浓度下降到20g/L左右，开始进行恒定残糖补料，将残余葡萄糖浓度维持在20g/L左右，最终总补料900mL。同时，在发酵24h时，补加15mL/L丙酮酸、0.05g/L烟酰胺、2mmol/L丙氨酸和10mg/L异丙醇四种混合外源添加物。每隔12h对葡萄糖浓度进行实时检测。在发酵培养第7天时结束发酵，取样用高效液相色谱检测AMB含量，结果如图10所示，最终测得AMB产量为16.36g/L，与对照组(9.89g/L)相比，提高了65％；同时副产物两性霉素A下降了30％。

Claims (3)

1.一种提高两性霉素B产量的补料控制发酵方法，所述方法包括：将结节链霉菌CCTCCNO：M 2017426接种至种子培养基，获得种子液；种子液接种至发酵培养基，进行发酵培养，发酵总时间120±36小时，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖60~80 g/L，棉籽粉10~30 g/L，碳酸钙5~15 g/L，磷酸二氢钾0.05~5 g/L，溶剂为水，自然pH值；发酵过程中参数控制如下：
（1）控制发酵体系pH维持在6.0~7.5，直至发酵结束；
（2）在发酵培养第0~48h，维持温度在30±3℃，当发酵至48h时，将温度降至26±3℃，维持该温度直至发酵结束；
（3）发酵前期使菌体在自然DO条件下生长，当发酵体系DO值下降至5~50%时，控制DO值维持在5%~50%至108h，后恢复自然DO值直至发酵结束；
（4）控制发酵培养基中葡萄糖浓度，发酵过程中葡糖糖浓度下降到20~40 g/L时，进行恒速补料，葡糖糖补料速率为0.1~5.0 g/L·h；
（5）在发酵第24h，补加5~15 mL/L丙酮酸、0.001~0.1 g/L烟酰胺、0.1~5 mmol/L丙氨酸和0.1~15 mg/L异丙醇四种混合外源添加物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基组成如下：蛋白胨10~30 g/L，酵母提取物5~20 g/L，氯化钠1~10 g/L，葡萄糖5~20 g/L，碳酸钙0.5~2 g/L，溶剂为水，pH为7.0~7.2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于发酵过程中以质量浓度为30±2%的氨水或乙酸来控制pH值。
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