CN117230136A - 一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法 - Google Patents
一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117230136A CN117230136A CN202311122075.2A CN202311122075A CN117230136A CN 117230136 A CN117230136 A CN 117230136A CN 202311122075 A CN202311122075 A CN 202311122075A CN 117230136 A CN117230136 A CN 117230136A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- glucose
- sugar
- spinosad
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 229930185156 spinosyn Natural products 0.000 title claims description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 142
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 142
- JFLRKDZMHNBDQS-UCQUSYKYSA-N CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C(=C[C@H]3[C@@H]2CC(=O)O1)C)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C.CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C=C[C@H]3C2CC(=O)O1)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C Chemical compound CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C(=C[C@H]3[C@@H]2CC(=O)O1)C)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C.CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C=C[C@H]3C2CC(=O)O1)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C JFLRKDZMHNBDQS-UCQUSYKYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- 239000005930 Spinosad Substances 0.000 claims abstract description 59
- 229940014213 spinosad Drugs 0.000 claims abstract description 59
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims abstract description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 46
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 32
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 26
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 25
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 24
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 22
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 22
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 20
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 16
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 16
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 16
- QYDYPVFESGNLHU-UHFFFAOYSA-N elaidic acid methyl ester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OC QYDYPVFESGNLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 16
- QYDYPVFESGNLHU-KHPPLWFESA-N methyl oleate Chemical group CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC QYDYPVFESGNLHU-KHPPLWFESA-N 0.000 claims description 16
- 229940073769 methyl oleate Drugs 0.000 claims description 16
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 16
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 16
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 15
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 13
- 241000868102 Saccharopolyspora spinosa Species 0.000 claims description 11
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 10
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 9
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 8
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 7
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000005929 Spinetoram Substances 0.000 claims description 3
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 claims description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 23
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 21
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000222640 Polyporus Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物发酵工程技术领域，提供了一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其主要包括控制发酵初期糖浓度4％‑5％，通过流加葡萄糖使发酵90‑200h控还原糖浓度2.5‑3.5％，发酵至200‑300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，并在菌体量不再变化时补加混合油脂，使多杀菌素的产率提高了50％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供数据支持。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及了一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法。
背景技术
多杀菌素(Spinosad)是刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂，兼具化学农药的高效性和生物农药的低毒性，选择性高，无残留，不易产生抗药性，具有良好的环境相容性，可克服化学农药污染环境、破坏生态平衡、易产生耐药性的缺陷，符合国内对生物农药的技术需求，并且对改善环境污染，保障粮食、食品安全有着重要的现实意义。
现有技术中制备多杀菌素的方法主要有：
CN103667404A公开了一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，通过控制多孢菌菌体生长和多杀菌素合成两个阶段的不同溶氧需求，提高多杀菌素产量，使得多杀菌素产量在发酵196小时达到160.9mg/L。
CN107523598A公开了一种提高多杀菌素产量的发酵方法，通过向发酵液中补充复合有机氮源，提高多杀菌素的产量，使得多杀霉素产量在发酵216小时达到5.66g/L。
王美玲等在《混合油脂补料发酵提高多杀菌素的产量》的研究中通过在96h补加3％的混合油脂，同时在96h和144h分别补加1％的玉米浆可使多杀菌素发酵单位达到804.59mg/L。
多杀菌素是刺糖多胞菌发酵的次级代谢产物，代谢网络具有复杂的非线性调控机制，单纯以时间限制确定补料时间无法适应易被外界条件影响的发酵过程，可能会导致补料达不到应有的效果。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足之处，提供了一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其主要包括控制发酵初期糖浓度4％-5％，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控还原糖浓度2.5-3.5％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，并在菌体量不再变化时补加混合油脂，使多杀菌素的产率提高了50％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供数据支持。
本申请的主要发明点在于通过改善发酵工艺，根据实验过程中测得数据适时调整发酵补料，建立一种分段控糖补油手段提高多杀菌素产量的方法，为多杀菌素的工业化生产提供参考。主要包括通过实验确定初始培养基糖添加量，通过还原糖量确定不同时期的补糖量，通过菌体浓度确定补加油脂时间起点等，最大限度地提高多杀菌素的产率。
本申请的具体技术方案如下：
一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，具体步骤如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，28-30℃培养7-10天后接入摇瓶。
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，27-32℃，180-250rpm，培养3-7天。
上述两步均为刺糖多孢菌的常规发酵方案，发明人不再赘述。
发酵培养：按10％-20％(v/v)的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有发酵基础培养基的发酵罐，温度28-32℃，摇瓶转速180-250rpm，发酵罐上根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上，pH控制在6.5-7.2，发酵360-450h；
其中从第96h开始每6h取样测菌体量，当菌体量不再变化时停止取样，开始匀速流加混合油脂直至发酵结束；上述混合油脂为油酸甲酯与大豆油，比例为1:1-1:3(v/v)，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.1％-1％。
同时从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h中控制还原糖浓度2.5-3.5％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至发酵液中还原糖浓度低于0.5％后停止发酵；此时发酵总时长360-450h。
其中所用的培养基组成如下：
固体培养基：葡萄糖0.3-0.8％，酪蛋白胨0.2-0.7％，酵母浸粉0.3-0.8％，硫酸镁0.2-0.8％，琼脂2％，灭菌前调至pH 6.8-7.3。
种子培养基：葡萄糖0.4-1.8％，酵母浸粉0.5-2％，蛋白胨0.5-3％，黄豆饼粉0.5-1.5％，饴糖0.4-0.9％，磷酸二氢钾0.2-0.8％，硫酸镁0.05-0.1％，灭菌前调至pH 6.8-7.3。
发酵培养基：葡萄糖4-5％，蛋白粉0.5-1.5％，玉米浆0.4-1.6％，蛋白胨1-1.8％，棉籽蛋白2-6％，油酸甲酯1.5-9％，大豆油1-2％，酵母粉0.6-1.2％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸铵0.1-0.35％，消泡剂0.5-1％，碳酸钙0.1-1％，灭菌前pH调至7.3-7.5。
与现有技术相比，本申请将发酵培养基中葡萄糖的初始浓度降低，现有技术中的初始浓度一般为葡萄糖5-8％，发明人研究后发现，这会导致葡萄糖效应，又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用，即当微生物可以大量利用易降解的底物如葡萄糖时，对于其他较难降解底物的利用能力明显下降，即葡萄糖抑制和排斥了微生物对其他底物的利用。通常微生物会在混合碳源下，选择性的利用最容易降解的底物，而抑制了对难降解底物的利用；本申请将葡萄糖用量降至4-5％的范围后，有效的抑制了葡萄糖效应，提高了对底物的利用率。
本发明的技术方案所采用的发酵菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)，优选采用保藏编号为CGMCC No.25093的菌株。该菌株已经在申请人的在先申请申请号202210995561.4，名称为一种提高多杀菌素摇瓶发酵水平的方法中公开，发明人不再赘述。
与现有技术相比，本发明所提供的方法发酵生产多杀菌素，可清晰的判断混合油脂与葡萄糖的补料时间，形成稳定的多杀菌素生产工艺，促进多杀菌素的生产，通过实验验证，相比普通发酵过程，本发明技术方案中多杀菌素的产率提高了50％以上，大幅提高了多杀菌素的发酵单位，为后期生物大发酵提供了依据。
附图说明
图1为实验例中发酵培养基初始葡萄糖添加量对多杀菌素产量和菌浓的影响柱状图；
图2为刺糖多孢菌发酵过程中的菌浓和多杀菌素含量随时间变化曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如消泡剂等原来均为本领域常规选择，下述实施例中所采用的菌种为刺糖多孢菌，选自CGMCC No.25093的菌株。
实验例多杀菌素发酵培养基初始糖添加量实验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
菌种：刺糖多孢菌
1.1.2培养基组成
固体培养基：葡萄糖0.5％，酪蛋白胨0.4％，酵母浸粉0.6％，硫酸镁0.5％，琼脂2％，灭菌前调节pH 6.8-7.3。
种子培养基：葡萄糖1.0％，酵母浸粉1.2％，蛋白胨0.8％，黄豆饼粉1.25％，饴糖0.5％，磷酸二氢钾0.6％，硫酸镁0.07％，灭菌前pH 6.8-7.3。
发酵基础培养基(去葡萄糖)：蛋白粉0.8％，玉米浆1.0％，蛋白胨1.2％，棉籽蛋白4％，油酸甲酯6％，大豆油1％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸铵0.2％，消泡剂0.75％，碳酸钙0.8％，灭菌前pH调至7.3-7.5；
1.2方法
1.2.1培养基的配制
分别配制种子培养基与发酵培养基，并在上述发酵基础培养基中加入不同量的葡萄糖，葡萄糖添加量分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，灭菌后备用；
1.2.2培养方法
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，28-30℃培养7-10天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，27-32℃，180-250rpm，培养3-7天；
发酵培养：按10％(v/v)的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有上述发酵基础培养基的摇瓶中，温度28-32℃，摇瓶转速180-250rpm。
将种子液接入发酵培养基后，培养至第96h停止发酵，测多杀菌素含量，及菌浓度，确定最佳的葡萄糖添加量。
1.2.5检测方法
多杀菌素含量检测方法：
色谱柱：C18(VP-ODS，4.6mm×150mm)；
进样量：10uL；
流动相：乙腈：甲醇：水(含0.05％乙酸铵)＝45:45:10；
流速：1.0mL/min；
检测波长：250nm。
取1mL发酵结束后的发酵液置于离心管中，加入4mL乙腈，封口后置于摇床中常温震荡30min，取出离心，10min，10000rpm，然后取上清，过膜后通过HPLC进行含量检测。
菌浓测定：取发酵液5mL，3000r/min离心15min，计算沉淀固形物占总体积的百分比。
还原糖：DNS法。
2.结果与分析
结果如图1所示，刺糖多孢菌发酵96h，当葡萄糖的添加量为1％-4％时，多杀菌素含量随着糖含量的增加而增加，最高可达0.51g/L，继续提高培养基中的糖含量，多杀含量不升反降，分析为培养基中过高的糖含量引起葡萄糖效应，阻碍了多杀菌素的合成。菌种发酵至96h，当糖含量高于4％时，菌浓趋于稳定，继续提高糖含量，菌浓未出现明显变化，分析认为菌浓的增长受限因素较多，通气量、搅拌转速、糖含量等糖含量虽然较高，但是当菌浓达到40％时，经观察发酵液的粘度较高，调节转速、增加通气量对体系的溶解氧并没有起到很明显的作用，限制了菌的进一步生长，但在此时补加糖，则会降低体系粘度，可有效提高体系中的溶解氧，进而提高多杀菌素产量。
因此，通过实验确定，从菌浓和多杀菌素含量两方面考虑，发酵培养基中的初始糖添加量为4％-5％。
实施例1
一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，使用的培养基为：
固体培养基：葡萄糖0.3％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.3％，硫酸镁0.5％，琼脂2％，灭菌前调节pH 6.8-7.3。
种子培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉0.7％，蛋白胨0.9％，黄豆饼粉0.85％，饴糖0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.08％，灭菌前pH 6.8-7.3。
30L小罐发酵培养基：蛋白粉1.2％，玉米浆1.5％，蛋白胨1％，棉籽蛋白5％，油酸甲酯4％，大豆油1％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.2％，消泡剂0.75％，碳酸钙0.5％，灭菌前pH调至7.3-7.5。
实验组A：空白对照组，葡萄糖添加量为7％，为正常普通发酵过程；
实验组B：实验组，仅补油。葡萄糖初始添加量为4％。从第96h开始每6h取样测菌体量，当菌体量不再变化时停止取样，开始匀速流加混合油脂匀速流加混合油脂(油酸甲酯与大豆油，比例为1:1(v/v))，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.5％；
实验组C：葡萄糖初始添加量为4％，从第96h开始每6h取样测菌体量，当菌体量不再变化时停止取样，开始匀速流加混合油脂(油酸甲酯与大豆油，比例为1:1(v/v))，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.5％；从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控制还原糖浓度3.0％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2.0％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至0.5％后停止发酵。
具体发酵过程如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，28-30℃培养7-10天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按1-3％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，27-32℃，180-250rpm，培养3-7天；
30L小罐发酵培养：按10％(v/v)的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有20L发酵基础培养基的30L发酵罐中，温度30℃，根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上，pH控制在6.7，发酵400h。
检测方法与实验例中完全相同。
结果分析
刺糖多孢菌发酵过程中的菌浓和多杀菌素含量随时间变化曲线如图2所示，在发酵前期，即从开始发酵到90h，A、B、C三组发酵中的多杀菌素含量随时间变化基本相同，菌量有所差异，说明此时是菌体的快速生长期，且A罐比B、C两罐菌体生长更快，菌浓更高，原因应该是A中初始糖含量高，可以提供更多的能量，但同时也导致A在90h以后菌体增长较快，但多杀菌素增长较慢，过高的糖含量用于菌体生长的缘故，发酵结束，多杀菌素含量为2.412g/L。B罐降低了初始糖含量，完成了早期的菌体积累，并且由于油脂的及时补充，多杀菌素含量较A有较大的增长，但多杀菌素的快速增长维持时间太短，且糖含量降低导致菌体过早凋亡，发酵结束后多杀菌素含量为3.723g/L。C罐初始糖含量降低，通过补加油脂与葡萄糖，最终发酵后多杀菌素含量为6.989g/L，比A提高了190％。
多杀菌素同其他大多数抗生素一样，属于微生物发酵过程中的次级代谢产物。根据文献所述，次级代谢产物的发酵呈现出明显的两段性，即菌体生长阶段和次级代谢产物合成阶段。在微生物的菌体生长阶段即对数期，菌体快速增长但次级代谢产物的合成很少或者不合成，待微生物从对数生长期进入稳定期，次级代谢产物开始快速合成。因此，想要提高多杀菌素的产量，应尽量的延长菌体稳定期。通过葡萄糖的流加，维持发酵液中的葡萄糖浓度，即可达到延长稳定期的目的，因此本实施例中的实验组C是筛选出的最佳条件。
实施例2
一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，使用的培养基为：
固体培养基：葡萄糖0.5％，酪蛋白胨0.7％，酵母浸粉0.3％，硫酸镁0.5％，琼脂2％，灭菌前调节pH 6.8-7.3。
种子培养基：葡萄糖1.5％，酵母浸粉2％，蛋白胨3％，黄豆饼粉1.5％，饴糖0.9％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.1％，灭菌前pH 6.8-7.3。
发酵培养基：葡萄糖4％，蛋白粉1.5％，玉米浆1.6％，蛋白胨1.8％，棉籽蛋白6％，油酸甲酯9％，大豆油2％，酵母粉1.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸铵0.35％，消泡剂1％，碳酸钙1％，灭菌前pH调至7.3-7.5；
具体发酵过程如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，28-30℃培养7-10天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按2％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，27-32℃，180-250rpm，培养3-7天；
30L小罐发酵培养：按10％(v/v)的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有20L发酵基础培养基的30L发酵罐中，温度30℃，根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上，pH控制在6.7，发酵400h。
葡萄糖初始添加量为5％，从第96h开始每6h取样测菌体量，当菌体量不再变化时停止取样，开始匀速流加混合油脂(油酸甲酯与大豆油，比例为1:2(v/v))，流加速度为每小时补加发酵液体积的1％；从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控制还原糖浓度3.5％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2.0％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至0.5％后停止发酵。
发酵420h后发酵液还原糖低于0.5％，最终多杀菌素发酵水平为7.036g/L。
实施例3
一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，使用的培养基为：
固体培养基：葡萄糖0.7％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.6％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，灭菌前调节pH 7.1。
种子培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉1.2％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉0.7％，饴糖0.9％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.07％，灭菌前pH 7.2。
发酵培养基：葡萄糖5％，蛋白粉1％，玉米浆1.4％，蛋白胨1.5％，棉籽蛋白4％，油酸甲酯6％，大豆油1.5％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.25％，消泡剂1％，碳酸钙0.75％，灭菌前pH调至7.4。
具体发酵过程如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，29℃培养8天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按2％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，30℃，210rpm，培养6天；
30L小罐发酵培养：按15％(v/v)的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有20L发酵基础培养基的30L发酵罐中，温度31℃，根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上，pH控制在6.8。
葡萄糖初始添加量为4.5％，从第96h开始每6h取样测菌体量，发酵至120h菌体量不再变化，开始匀速流加混合油脂(油酸甲酯与大豆油，比例为1:1(v/v))，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.8％；从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控制还原糖浓度3％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2.0％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至0.5％后停止发酵。
发酵400h后发酵液还原糖低于0.5％，最终多杀菌素发酵水平为7.016g/L。
实施例4：
多杀菌素的发酵中试(2t)
一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，使用的培养基为：
固体培养基：葡萄糖0.7％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.6％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，灭菌前调节pH 7.1。
种子培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉1.2％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉0.7％，饴糖0.9％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.07％，灭菌前pH 7.2。
发酵培养基：葡萄糖5％，蛋白粉1％，玉米浆1.4％，蛋白胨1.5％，棉籽蛋白4％，油酸甲酯6％，大豆油1.5％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.25％，消泡剂1％，碳酸钙0.75％，灭菌前pH调至7.4；
具体发酵过程如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，29℃培养8天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按2％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，30℃，210rpm，培养6天；
一级种子罐培养(100L)
一级种子罐装量60L种子培养基，从种子瓶按照1.5％(v/v)的接种量接种到种子罐，罐温29℃，搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，培养时间96h后获得成熟的一级种子液；
二级种子罐培养(500L)
二级种子罐装量300L种子培养基，一级种子液按10％(v/v)的接种量接种至二级种子罐中，罐温30℃，初始搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，培养时间36h后获得成熟的二级种子液；
发酵罐培养(2t)
发酵罐装量发酵培养基1m3，将种子液按15％(v/v)的接种量接种于发酵罐，罐温为31℃，初始转速100rpm，pH控制在6.8左右，根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上。
葡萄糖初始添加量为5％，从第96h开始每6h取样测菌体量，至128h时菌体量不再变化，开始匀速流加混合油脂(油酸甲酯与大豆油，比例为1:1v/v)，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.8％；从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控制还原糖浓度3％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2.0％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至0.5％后停止发酵。
发酵450h后发酵液还原糖低于0.5％，最终多杀菌素发酵水平为7.134g/L。
实施例5：
多杀菌素的发酵生产(30t)
一种分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，使用的培养基为：
固体培养基：葡萄糖0.7％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.6％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，灭菌前调节pH 7.1。
种子培养基：葡萄糖1％，酵母浸粉1.2％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉0.7％，饴糖0.9％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.07％，灭菌前pH 7.2。
发酵培养基：葡萄糖5％，蛋白粉1％，玉米浆1.4％，蛋白胨1.5％，棉籽蛋白4％，油酸甲酯6％，大豆油1.5％，酵母粉0.8％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.25％，消泡剂1％，碳酸钙0.75％，灭菌前pH调至7.4；
具体发酵过程如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，29℃培养8天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按2％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，30℃，210rpm，培养6天；
一级种子罐培养(1m3)
一级种子罐装量600L种子培养基，从种子瓶按照1.5％(v/v)的接种量接种到种子罐，罐温29℃，搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，培养时间96h后获得成熟的一级种子液；
二级种子罐培养(10m3)
二级种子罐装量6m3种子培养基，一级种子液按10％(v/v)的接种量接种至二级种子罐中，罐温30℃，初始搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，培养时间36h后获得成熟的二级种子液；
发酵罐培养(30t)
发酵罐装量20m3发酵培养基，将种子液按15％(v/v)的接种量接种于发酵罐，罐温为31℃，初始转速100rpm，pH控制在6.8左右，根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上。
葡萄糖初始添加量为5％，从第96h开始每6h取样测菌体量，至135h时菌体量不再变化，开始匀速流加混合油脂(油酸甲酯与大豆油，比例为1:1v/v)，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.8％；从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵90-200h控制还原糖浓度3％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2.0％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至0.5％后停止发酵。
发酵462h后发酵液还原糖低于0.5％，最终多杀菌素发酵水平为7.206g/L。
通过实施例3到实施例5可以看出，随着发酵规模的递增，发酵产量会有一定幅度的递增，这说明随着发酵规模的扩大，发酵罐的各项参数便于更加精准的控制，对多杀菌素的发酵有明显的增益效果。
在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，包括如下步骤：菌种活化、摇瓶培养和发酵培养，其特征在于：
发酵培养时从第96h开始每6h取样测菌体量，当菌体量不再变化时停止取样，开始匀速流加混合油脂直至发酵结束；
同时发酵培养时从第64h开始每6h取样测还原糖含量，通过流加葡萄糖使发酵至90-200h的发酵液中还原糖浓度为2.5-3.5％，发酵至200-300h控制发酵液中还原糖浓度为2％，当多杀菌素含量变化缓慢时停止补糖，继续耗糖至发酵液中还原糖浓度低于0.5％后停止发酵。
2.根据权利要求1所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：混合油脂为油酸甲酯与大豆油，比例为1:1-1:3v/v，流加速度为每小时补加发酵液体积的0.1％-1％。
3.根据权利要求1所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：具体步骤如下：
菌种活化：从超低温冰箱中取出保藏有刺糖多孢菌的甘油管，快速融化后划线至固体培养基平板，28-30℃培养7-10天后接入摇瓶；
摇瓶培养：将平板上的孢子刮下后制备成孢子悬液，孢子悬液按1-3％v/v的接种量接种至摇瓶种子培养基，27-32℃，180-250rpm，培养3-7天；
发酵培养：按10-20％v/v的接种量将刺糖多孢菌种子液接种至装有发酵基础培养基的发酵罐，温度28-32℃，摇瓶转速180-250rpm，发酵罐上根据溶氧水平调节转速和通气量，调整溶氧控制在30％以上，pH控制在6.5-7.2，发酵360-450h。
4.根据权利要求1或3所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：菌种活化时固体培养基组成按重量百分比为：葡萄糖0.3-0.8％，酪蛋白胨0.2-0.7％，酵母浸粉0.3-0.8％，硫酸镁0.2-0.8％，琼脂2％，灭菌前调至pH 6.8-7.3。
5.根据权利要求1或3所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：摇瓶培养时种子培养基组成按重量百分比为：葡萄糖0.4-1.8％，酵母浸粉0.5-2％，蛋白胨0.5-3％，黄豆饼粉0.5-1.5％，饴糖0.4-0.9％，磷酸二氢钾0.2-0.8％，硫酸镁0.05-0.1％，灭菌前pH调至6.8-7.3。
6.根据权利要求1或3所述分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法，其特征在于：发酵培养时发酵培养基组成按重量百分比为：葡萄糖4-5％，蛋白粉0.5-1.5％，玉米浆0.4-1.6％，蛋白胨1-1.8％，棉籽蛋白2-6％，油酸甲酯1.5-9％，大豆油1-2％，酵母粉0.6-1.2％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，硫酸铵0.1-0.35％，消泡剂0.5-1％，碳酸钙0.1-1％，灭菌前pH调至7.3-7.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311122075.2A CN117230136A (zh) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | 一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311122075.2A CN117230136A (zh) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | 一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117230136A true CN117230136A (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=89085361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311122075.2A Pending CN117230136A (zh) | 2023-09-01 | 2023-09-01 | 一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117230136A (zh) |
-
2023
- 2023-09-01 CN CN202311122075.2A patent/CN117230136A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10006067B2 (en) | Method for producing DHA through solid culture and liquid fermentation of Schizochytrium | |
| Bai et al. | Parameter oscillations in a very high gravity medium continuous ethanol fermentation and their attenuation on a multistage packed column bioreactor system | |
| US11753658B2 (en) | Pichia stipitis strain and cultures and uses of the same | |
| CN109971663B (zh) | 一株耐热亚罗解脂酵母及其应用 | |
| CN106635934B (zh) | 一种嗜热型乳酸杆菌及人工添加该嗜热型乳酸杆菌的玉米浸泡方法 | |
| CN110923268A (zh) | 酿酒酵母y3401的培养方法及其在白酒酿造中的应用 | |
| Groleau et al. | Production of polyols and ethanol by the osmophilic yeast Zygosaccharomyces rouxii | |
| CN108342437B (zh) | 一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素b的方法 | |
| CN109486693A (zh) | 一种酿酒酵母菌及其在乙醇发酵中的用途 | |
| US20240043881A1 (en) | Systems and methods for co-culture of oxygen sensitive bacteria and yeast | |
| CN101195837B (zh) | 一种发酵法生产1,3-丙二醇的连续发酵方法 | |
| CN102533570A (zh) | 一种黑曲霉及其应用及发酵制备柠檬酸的方法 | |
| CN111334532A (zh) | 一种丁酸连续发酵的方法 | |
| CN102443611B (zh) | 一种柠檬酸的生产方法 | |
| CN109055284B (zh) | 一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用 | |
| CN117230136A (zh) | 一种利用分段控糖手段提高多杀菌素产量的方法 | |
| JP7450959B2 (ja) | 酵母菌およびそのエルゴチオネイン製造における用途 | |
| CN107988288B (zh) | 一种高密度发酵生产丙酸杆菌细菌素的方法 | |
| CN108048503B (zh) | 提高安丝菌素p-3生产的方法 | |
| CN111118090B (zh) | 一种提高两性霉素b产量的补料控制发酵方法 | |
| JP5249106B2 (ja) | エタノールの連続発酵製造方法 | |
| CN114015604A (zh) | 一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法 | |
| CN105132390A (zh) | 一种利用混菌发酵制备右旋糖酐蔗糖酶的方法 | |
| CN113151061A (zh) | 一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌 | |
| CN101698836B (zh) | 一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |