CN114015604A - 一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法，包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一和二；发酵基础培养基包括：葡萄糖7.5‑8％，棉籽粉2.5‑3％，酵母膏0.5‑1％，玉米浆0.5‑1％，蛋白胨0.5‑1％，磷酸二氢钾0.2‑0.4％，碳酸钙0.2‑0.3％，硫酸铵0.5‑1％，硫酸锰0.0002‑0.0005％，钼酸钠0.0002‑0.0005％，硫酸亚铁0.0001‑0.0002％，大豆油0.5‑1％，消沫剂0.015‑0.03％；补料培养基一包括：玉米浆30％、磷酸二氢钾2％、氯化钠2％；补料培养基二包括：葡萄糖65％，磷酸二氢钾0.5％。本发明显著提高了刺糖多胞菌的多杀菌素产素水平。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法。
背景技术
多杀菌素是刺糖多胞菌有氧发酵的胞内次级代谢产物，属于大环内酯类抗生素，其因高效低残留对哺乳动物、鸟类、鱼类甚至大多数益虫具有宽广的安全界限等优点，而多次获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。
然而，目前多杀菌素的发酵生产所存在的问题是，传统的发酵方式下，刺糖多胞菌的产素水平低，刺糖多胞菌的生产潜力不能得到有效发挥。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的的缺陷，提供了一种发酵培养基及发酵生产多杀菌素的方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
技术方案一：
一种多杀菌素发酵培养基，包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一，发酵补料培养基二；
所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖7.5-8％，棉籽粉2.5-3％，酵母膏0.5-1％，玉米浆0.5-1％，蛋白胨0.5-1％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，碳酸钙0.2-0.3％，硫酸铵0.5-1％，硫酸锰0.0002-0.005％，钼酸钠0.0002-0.0005％，硫酸亚铁0.0001-0.0002，大豆油0.5-1％，消沫剂0.015-0.03％；水余量，PH调至7.2-7.4；
所述发酵补料培养基一中，包括以下原料：玉米浆30％、磷酸二氢钾2％、氯化钠2％，水余量；
所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖65％，磷酸二氢钾0.5％，水余量。
进一步的，所述发酵基础培养基的灭菌方法为：121-123℃温度灭菌30min；
所述发酵补料培养基一的灭菌方法为：121-123℃温度灭菌30min；
所述发酵补料培养基二的灭菌方法为：115-120℃温度灭菌20-25min。
技术方案二：
一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下步骤：
首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液按10％-15％的接种量接种于发酵基础培养基中，发酵培养250-320h，即可。
进一步的，发酵培养时，发酵温度为28-30℃。
进一步的，发酵培养时，发酵液溶氧水平为：菌体处于迟滞期和对数生长期时，控制发酵液溶氧水平大于等于50％；
菌体进入生产期后，控制发酵液溶氧水平35-50％。
进一步的，发酵培养时，当菌体进入生产期后，通过补入pH调节剂的方式控制发酵液pH为6.0-7.0。
进一步的，发酵培养中，当发酵时间达到85-90h和185-190h时，分别补入发酵补料培养基一；所述发酵补料培养基一的补料体积为运行体积的1.5-2.0％。
进一步的，发酵培养中，当发酵液残糖水平<2.0％(重量体积比百分含量)时，每24h补入一次发酵补料培养基二，当发酵液运行中生物量有开始下降趋势或者通过补料后残糖消耗速度减慢时，即可停止补料；所述发酵补料培养基二的补料体积＝(2％-当天检测残糖的含量％)*发酵液体积/发酵补料培养基二中葡萄糖的浓度。
进一步的，所述发酵补料培养基二的补料方式为：一次性加入的补料方式或自动流加的补料方式。
进一步的，发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
进一步的，所述种子培养液由活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养获得，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、发酵液培养过程补料工艺控制：本发明的发明人研究发现，剌糖多胞菌发酵生产多杀菌素是一个部分生长偶联型发酵，在生长期菌体主要以消耗氮源为主，碳源的消耗速率比较低，因此，为了提高发酵液生物量，本发明在基础培养基中加入了酵母膏和玉米浆这两种快速利用的氮源，促进了菌体的生长和生物量的累积，而到了生产期快速利用的氮源减少，菌体生长速率和生物量的维持得不到保证，菌丝体自溶及衰老的速度加快，为此在菌体进入生产期后，本发明通过补入含有速效氮源玉米浆的发酵补料培养基，以确保菌体生长所必须的营养物质，
在本发明中还添加有磷酸二氢钾，其是刺糖多胞菌发酵生产多杀菌素不可缺少的物质之一，其既能促进菌体的生长代谢又有利于产物的合成；而且本发明在发酵补料培养基中也添加磷酸二氢钾的方式，其目的在于：可以将发酵基础培养基中磷酸二氢钾的用量从传统的超量范围降低到最适范围，避免高浓度的磷酸二氢钾对菌体的生长代谢和产物的合成产生抑制作用，此外，随着培养周期的运行，底物中的浓度不断减少，磷酸二氢钾的促进作用会逐渐减弱，为此在补料中添加了一定的磷酸二氢钾，在确保其促进作用同时还对发酵液的PH值起到一定缓冲作用。
本发明在发酵补料培养基二中加入氯化钠，可以起到维持细胞内外渗透压的作用，确保菌丝体的正常的生长代谢和产物的合成，降低胞内产物的不断积累造成的负面影响；
2、发酵过程中残糖工艺的控制：
刺糖多胞菌发酵生产多杀菌素优选葡萄糖做为单一的碳源，但是高浓度的葡萄糖会产生葡萄糖效应，影响菌丝体对碳源的利用，从而影响到菌体的生长和产物合成，为此在基础培养基中只加入了7-8％的葡萄糖，随着菌体的生长代谢和产物的合成，葡萄糖不断被消耗利用，发酵液中残糖会逐渐减少，不能满足菌体正常的生长代谢和产物的合成，因此，本发明在发酵液残糖水平<2.0％(重量体积比百分含量)时，需要补充一定量的葡萄糖。
3、发酵结束时间的控制：发酵液运行当生物量有开始下降趋势，残糖表现通过补料后消耗速度减慢时停止补料，运行后出现PH回升，氨基氮提高，发酵液的效价几乎不再增长时，此时意味发酵结束，本发明发酵液运行周期控制在250-320小时。
综上，本发明通过合理配比发酵基础培养基并采用多次补料的方式对刺糖多胞菌进行发酵，将多杀菌素的产素水平由传统方式的400-500mg/l提高到1000mg/l。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所采用的的所有原料均为市购产品。
在本发明中，发酵液中多杀菌素浓度测定的方法为：取发酵液1ml，加无水甲醇4ml，充分振荡1min，超声30分钟，用HPLC测定多杀菌素的产量。色谱条件：C18反相柱(250mm*4.0mm)；流动相为甲醇：乙晴：水＝45：45：10(v/v/v，其中水含.05％乙酸铵)；流速1.0ml/min检测波长245nm。
葡萄糖含量测定：使用S-10系列生物传感分析仪。
氨基氮含量测定：甲醛法。
生物量的测定：发酵液5ml，3500r/min离心15分钟，计算沉淀固体占发酵液的质量百分比。
实施例1：
一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下内容：
一、培养基
1、发酵培养基包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一，发酵补料培养基二，发酵补料培养基二；
所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖7.5％，棉籽粉2.5％，酵母膏1％，玉米浆0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.4％，碳酸钙0.3％，硫酸铵1％，硫酸锰0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸亚铁0.0002％，大豆油0.5％，消沫剂0.015％；水余量；pH7.4；灭菌温度为121-123℃，灭菌时间30min。
所述发酵补料培养基一中，包括以下原料：玉米浆30％、磷酸二氢钾2％、氯化钠2％，水余量，121-123℃，灭菌时间30min；
所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖65％，磷酸二氢钾0.5％，水余量，115-120℃温度灭菌20-25min；
2、种子培养基，包括以下原料：淀粉1.5-1.8％、酵母膏0.3-0.4％、蛋白胨2.5-3.0％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、硫酸镁0.1-0.2％、消沫剂0.025-0.03％。
二、发酵工艺：
包括如下步骤：
步骤1、将活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养，获得种子培养液，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
步骤2、首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液按15％的接种量接种于发酵基础培养基中，采用50L发酵罐发酵培养250-320h，即可；发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
发酵培养时，发酵温度控制为30℃；
发酵培养时，在生长期通气量控制在15-30L/min，搅拌300-500rpa，罐压0.035-0.04mpa，表现溶氧DO在80-100％，PH从7.2-7.8-6.97，发酵液培养时间为从0-56小时；进入生产期通气量控制在20-25L/min，搅拌350-400rpa，罐压0.035-0.04mpa，表现溶氧DO在35-50％，PH6.3-6.7，运行时间从57-305h。
发酵培养中，当发酵时间达到90h和185h时，分别补入发酵补料培养基一；所述发酵补料培养基一的补料体积均为运行体积的1.9％；
发酵培养中，当发酵液残糖水平<2.0％(重量体积比百分含量)时(本实施例为发酵119h时)，每24h补入一次发酵补料培养基二，当发酵液运行中生物量有开始下降趋势或者通过补料后残糖消耗速度减慢时，即可停止补料；所述发酵补料培养基二的补料体积＝(2％-当天检测残糖含量％)*发酵液体积/发酵补料培养基二中葡萄糖的浓度。
所述发酵补料培养基二的补料方式为：一次性加入的补料方式。
本批发酵运行时间为305h，发酵结束后，测得本实施例发酵液产物浓度达到1150mg/L。
对比例1
一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下内容：
一、培养基
1、发酵培养基包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一和发酵补料培养基二；
所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖7.5％，棉籽粉2.5％，酵母膏1％，玉米浆0.5％，蛋白胨0.3％，磷酸二氢钾0.4％，碳酸钙0.3％，硫酸铵1％，硫酸锰0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸亚铁0.0002％，大豆油0.5％，消沫剂0.015％；水余量，pH7.4；灭菌温度为121-123℃，灭菌时间30min；
所述发酵补料培养基一中，包括以下原料：玉米浆30％、磷酸二氢钾6％、氯化钠3％，水余量；
所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖65％，磷酸二氢钾1.5％，氯化钠0.75％，水余量；
2、种子培养基，包括以下原料：淀粉1.5-1.8％、酵母膏0.3-0.4％、蛋白胨2.5-3.0％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、硫酸镁0.1-0.2％、消沫剂0.025-0.03％。
二、发酵工艺：
包括如下步骤：
步骤1、将活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养，获得种子培养液，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
步骤2、首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液按15％的接种量接种于发酵基础培养基中，采用50L的发酵罐进行发酵培养282h，即可；发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
发酵培养时，发酵温度控制为30℃，；
发酵培养时，在生长期通气量控制在15-30L/min，搅拌300-500rpa，罐压0.035-0.04mpa，表现溶氧DO在65-100％，PH从7.6-8.0-7.01，发酵液培养时间为从0-61小时；进入生产期通气量控制在20L/min，搅拌400rpa，罐压0.035-0.04mpa，表现溶氧DO在40-60％，PH6.2-7.0，运行时间从62-282h。
发酵培养中，当发酵时间达到96h时，补入发酵补料培养基一；所述发酵补料培养基一的补料体积为运行体积的2.1％；
发酵培养中，当发酵液残糖水平<2.0％(重量体积比百分含量)时(本实施例为发酵120h时)，每24h补入一次发酵补料培养基二，当发酵液运行中生物量有开始下降趋势或者通过补料后残糖消耗速度减慢时，即可停止补料；所述发酵补料培养基二的补料体积＝(2％-当天检测残糖含量％)*发酵液体积/发酵补料培养基二中葡萄糖的浓度。
所述发酵补料培养基二的补料方式为：一次性加入的补料方式。
本批发酵运行时间为282h，发酵结束后，测得本实施例发酵液产物浓度达到657mg/L。
本对比例与实施例1比较，不同点为发酵液培养时在96小时只补入一次发酵补料培养基一，在补料培养中加入的磷酸二氢钾与氯化钠的浓度高；(2)在补入的补料培养基二葡萄糖溶液中加入磷酸二氢钾浓度高，而且加入了氯化钠，最终发酵单位比实施例1低，说明发酵液培养250小时以上时只补入一次混合培养基，会对生物量的维持及产物合成有一定的影响，菌体衰老明显，后期发酵单位增加缓慢甚至停止增长。而高浓度的磷酸二氢钾及氯化钠也会对产物的合成有抑制作用。
对比例2
一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下内容：
一、培养基
1、发酵培养基包括发酵基础培养基和发酵补料培养基二；
所述发酵基础培养基中，包括以下质量百分比的各原料：葡萄糖8％，棉籽粉3％，酵母膏1％，玉米浆0％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.4％，碳酸钙0.3％，硫酸铵1％，硫酸锰0.0005％，钼酸钠0.0005％，硫酸亚铁0.0002％，大豆油0.5％，消沫剂0.015％；水余量，PH7.4，灭菌温度为121-123℃，灭菌时间30min。
所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖40％；
2、种子培养基，包括以下原料：淀粉1.5-1.8％、酵母膏0.3-0.4％、蛋白胨2.5-3.0％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、硫酸镁0.1-0.2％、消沫剂0.025-0.03％。
二、发酵工艺：
包括如下步骤：
步骤1、将活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养，获得种子培养液，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
步骤2、首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液按接种量15％接种于发酵基础培养基中，采用50L发酵罐发酵培养207h，即可；发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
发酵培养时，发酵温度控制为30℃；
发酵培养时，在生长期通气量控制在15-25L/min，搅拌300-500rpa，罐压0.05mpa，表现溶氧DO在85-100％，PH从6.4-7.65-6.99，发酵液培养时间为从0-58小时；进入生产期通气量控制在20L/min，搅拌350rpa，罐压0.05mpa，表现溶氧DO在40-60％，PH6.3-7.0，运行时间从62-207h。
发酵培养中，当发酵时间达到136、160h时，分别残糖在3％(重量体积比百分含量)时补入发酵补料培养基二；所述发酵补料培养基二的补料体积＝(2％-当天检测残糖含量％)*发酵液体积/发酵补料培养基二中葡萄糖的浓度。
所述发酵补料培养基二的补料方式为：一次性加入的补料方式。
本批发酵运行时间为207h，发酵结束后，测得本实施例发酵液产物浓度达到567mg/L。
本对比例与实施例1进行比较，发酵基础培养基中没有加入玉米浆、增加了葡萄糖和棉籽粉的配比，发酵液培养过程中没有进行发酵补料培养基一的补入，在残糖3％(重量体积比百分含量)下补入2次发酵补料培养基二(葡萄糖液)，其中葡萄液的浓度40％，没有添加磷酸二氢钾，结果非常不理想，生物量明显比补入发酵基础培养基的罐批低15-20％，发酵单位只有567mg/L比案例1降低了50.69％。
对比例3：
一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下内容：
一、培养基
1、发酵培养基仅包括发酵基础培养基
所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖5.5％，糊精2.2％，棉籽粉3％，酵母膏0.5％，玉米浆0.5％，蛋白胨0％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钙0.4％，硫酸铵0.06％，硫酸锰0％，钼酸钠0％，硫酸亚铁0％，大豆油0.5％，消沫剂0.015％；水余量；PH7.4。灭菌温度为121-123℃，灭菌时间30min。
2、种子培养基，包括以下原料：淀粉1.5-1.8％、酵母膏0.3-0.4％、蛋白胨2.5-3.0％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、硫酸镁0.1-0.2％、消沫剂0.025-0.03％。
二、发酵工艺：
包括如下步骤：
步骤1、将活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养，获得种子培养液，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
步骤2、首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液接种于发酵基础培养基中，采用50L发酵罐发酵培养207h，即可；发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
发酵培养时，发酵液溶氧水平为：0-10h通气量控制在10L/min，搅拌150rpa，罐压0.05mpa，11-40h通气量控制在20L/min，搅拌150rpa，罐压0.05mpa，上述溶氧在70％以上，40-65h通气量控制在25L/min，搅拌200rpa，罐压0.05mpa，溶氧35-55％，PH从6.6-7.85；66-110h，通气量控制在25L/min，搅拌500rpa，罐压0.05mpa，溶氧80-95％，PH从7.85-6.90-6.64，112-111h通气量控制在25L/min，搅拌400rpa，罐压0.05mpa，溶氧在70-80％，PH从6.64-7.13。111-207h发酵结束。
本批发酵运行时间为207h，发酵结束后，测得本实施例发酵液产物浓度达到403mg/L。
本对比例与实施例1进行比较，不同点是发酵基础培养基降低了葡萄糖的比例，增加碳源糊精，培养基不是单一的碳源，增加了棉籽粉的比例，减少了玉米浆和酵母膏的比例，减少了无机盐磷酸二氢钾、硫酸铵的比例，由于速效氮源的降低，发酵液的生物量明显偏低，前期比实施例1低近30％，导致C、N源明显代谢缓慢，由于在发酵前期只考虑溶氧，对通气量、搅拌转速没有在菌体对数生长期进行调控，造成菌体进入生产期推迟，发酵液培养过程没有进行补料培养基一的补入和残糖的控制，另外过程培养温度为28℃，相对稍低，这样的培养工艺对造成菌体生长代谢和产物的合成造成影响，菌体的合成产物的能力没有提到充分的发挥，最终发酵单位比较低与案例比较降低了64.9％。
对比例4
一种发酵生产多杀菌素的方法，包括如下内容：
一、培养基
1、发酵培养基仅包括发酵基础培养基，
所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖6.5％，糊精3.2％，棉籽粉4％，蛋白胨2％，酵母膏0.5％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.2％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.1％，消沫剂0.1％，大豆油0.1％；水余量；PH7.4。灭菌温度为121-123℃，灭菌时间30min；
2、种子培养基，包括以下原料：淀粉1.5-1.8％、酵母膏0.3-0.4％、蛋白胨2.5-3.0％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、硫酸镁0.1-0.2％、消沫剂0.025-0.03％。
二、发酵工艺：
包括如下步骤：
步骤1、将活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养，获得种子培养液，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％，种子培养液PH>7.0，菌体形态为球形。
步骤2、首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液按15％的接种量接种于发酵基础培养基中，采用50L发酵罐发酵培养210h，即可；发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
发酵培养时，发酵温度控制为28℃；
发酵培养时，0-10h通气量控制在20L/min，搅拌200rpa，罐压0.05mpa，11-210h通气量控制在25-30L/min，搅拌250-320rpa，罐压0.05mpa，全程溶氧在40％以上，PH145h前从7.3-8.09-6.95，146-193h 6.54-6.95，194h后至放罐PH从6.97上升到7.71。
本批发酵运行时间为210h，发酵结束后，测得本实施例发酵液产物浓度达到101mg/L。
本对比例与实施例1进行比较，不同点是发酵基础培养基降低了葡萄糖的比例，增加碳源糊精，培养基不是单一的碳源，增加了棉籽粉的比例，速效氮源只加入酵母膏，减少了无机盐磷酸二氢钾的比例、硫酸铵没有加入，由于从11-210小时，搅拌转速相对比较低，虽然溶氧在40％以上，PH在145h前维持在7.0以上，这些发酵液的环境因素比较适合菌体的生长，造成本批生物量比较高，最高生物量比案例1提高了12％，但进入生产期的时间比较晚，145小时后PH降到7.0以下，28℃培养温度也不是最佳，至使发酵液的产物浓度非常低，比实施例1降低91.21％。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多杀菌素发酵培养基，其特征在于，包括发酵基础培养基，发酵补料培养基一，发酵补料培养基二；
所述发酵基础培养基中，包括以下原料：葡萄糖7.5-8％，棉籽粉2.5-3％，酵母膏0.5-1％，玉米浆0.5-1％，蛋白胨0.5-1％，磷酸二氢钾0.2-0.4％，碳酸钙0.2-0.3％，硫酸铵0.5-1％，硫酸锰0.0002-0.0005％，钼酸钠0.0002-0.0005％，硫酸亚铁0.0001-0.0002，大豆油0.5-1％，消沫剂0.015-0.03％；水余量，PH调至7.2-7.4；
所述发酵补料培养基一中，包括以下原料：玉米浆30％、磷酸二氢钾2％、氯化钠2％，水余量；
所述发酵补料培养基二中，包括以下原料：葡萄糖65％，磷酸二氢钾0.5％，水余量。
2.根据权利要求1所述的一种多杀菌素发酵培养基，其特征在于，
所述发酵基础培养基的灭菌方法为：121-123℃温度灭菌30min；
所述发酵补料培养基一的灭菌方法为：121-123℃温度灭菌30min；
所述发酵补料培养基二的灭菌方法为：115-120℃温度灭菌20-25min。
3.一种利用如权利要求1或2所述发酵培养基发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
首先将灭菌后的发酵基础培养基调节pH为7.0-7.3；然后将种子培养液按10％-15％的接种量接种于发酵基础培养基中，发酵培养250-320h，即可。
4.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，发酵培养时，发酵温度为28-30℃。
5.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，
发酵培养时，发酵液溶氧水平为：菌体处于迟滞期和对数生长期时，控制发酵液溶氧水平大于等于50％；
菌体进入生产期后，控制发酵液溶氧水平35-50％。
6.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，
发酵培养时，当菌体进入生产期后，通过补入pH调节剂的方式控制发酵液pH为6.0-7.0。
7.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，
发酵培养中，当发酵时间达到85-90h和185-190h时，分别补入发酵补料培养基一；所述发酵补料培养基一的补料体积为运行体积的1.5-2.0％。
8.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，
发酵培养中，当发酵液残糖水平<2.0％时，每24h补入一次发酵补料培养基二，当发酵液运行中生物量有开始下降趋势或者通过补料后残糖消耗速度减慢时，即可停止补料；所述发酵补料培养基二的补料体积＝(2％-当天检测残糖含量％)*发酵液体积/发酵补料培养基二中葡萄糖的浓度。
9.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，发酵培养过程中，每24小时取样检测发酵液的PH、生物量、残糖、氨基氮；40小时后开始每24h取样检测产物多杀菌素的浓度。
10.根据权利要求3所述的发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于，
所述种子培养液由活化后的刺糖多胞菌进行种子罐培养获得，所述种子培养液中菌体的生物量大于等于16％。
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| CN104388500A (zh) * | 2014-09-10 | 2015-03-04 | 张兰波 | 一种高密度发酵多杀菌素的方法 |
| CN105506038A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 牡丹江佰佳信生物科技有限公司 | 利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法 |
| US20180016610A1 (en) * | 2014-11-14 | 2018-01-18 | Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd | Spinosad heterologous expression strain and construction method thereof and use |
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2021
- 2021-11-10 CN CN202111326345.2A patent/CN114015604B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| CN115011526A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-09-06 | 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 | 一种多杀菌素的发酵培养基及多杀菌素的生产方法 |
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