CN115011526A - 一种多杀菌素的发酵培养基及多杀菌素的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多杀菌素的发酵培养基，包括基础培养基、流加培养基与补料培养基；以质量百分数计，所述流加培养基包括：第二碳源20％～50％；玉米浆干粉1％～3％；所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。与现有技术相比，本发明提供的发酵培养基不仅使多杀菌素具有较高的发酵水平，且发酵水平稳定，参数易控制，便于进行扩大生产。

Description

一种多杀菌素的发酵培养基及多杀菌素的生产方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种多杀菌素的发酵培养基及多杀菌素的生产方法。
背景技术
我国是农业大国，对杀虫剂的需求量高达1.8万吨/年，年销售额超过900多亿人民币。随着人们的健康意识普遍提高，对农药相关产品的安全性要求日益严格，开发安全、高效、环保的杀虫剂已经成为全球农药开发的热点。
多杀菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)有氧发酵，经次级代谢产生的一种大环内酯类抗生素，作为一种新型的生物农药，用量低，选择性高，无残留，不易产生耐药性，具有良好的环境相容性。由于多杀菌素兼具有化学农药的高效性和生物农药的低毒性的优点，对大多数有益昆虫普遍比较安全，对哺乳动物和鸟类的毒性相对较低，对水生动物有轻微毒性或中等毒性，克服了化学农药污染环境、破坏生态平衡以及易产生耐药性的缺陷，对改善环境污染，保障粮食和食品安全有着重要的现实意义。
但目前制约多杀菌素产业化的关键因素有发酵工艺复杂，易染菌，发酵水平低造成多杀菌素生产成本高，导致生产潜力不能有效释放。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种多杀菌素的发酵培养基及多杀菌素的生产方法，该生产方法具有较高的发酵水平。
本发明提供了一种多杀菌素的发酵培养基，包括基础培养基、流加培养基与补料培养基；
以质量百分数计，所述基础培养基包括：
Figure BDA0003736935730000011
Figure BDA0003736935730000021
以质量百分数计，所述流加培养基包括：
第二碳源 20％～50％；
玉米浆干粉 1％～3％；
所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。
优选的，所述第一碳源与第二碳源各自独立地选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精与可溶性淀粉中的一种或多种；
所述第一植物油与第二植物油各自独立地选自大豆油、棉籽油、玉米油与葵花油中的一种或多种。
优选的，所述微量元素包括硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁；所述硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁的质量比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)。
本发明提供了一种多杀菌素的生产方法，包括：
S1)将刺糖多孢菌接种至固体培养基进行活化培养，得到孢子；
S2)将孢子接种至种子瓶培养基进行摇瓶培养，得到摇瓶种子液；
S3)将所述摇瓶种子液接种至种子罐中进行扩大培养，得到发酵罐种子液；
S4)将所述发酵罐种子液接种至基础培养基中进行发酵培养，在发酵培养的第5～7天开始加入流加培养基维持发酵液中还原糖在0.5％～3.5％之间，从第6～7天加入补料培养基，得到多杀菌素；
以质量百分数计，所述基础培养基包括：
Figure BDA0003736935730000031
以质量百分数计，所述流加培养基包括：
第二碳源 20％～50％；
玉米浆干粉 1％～3％；
所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。
优选的，以质量百分数计，所述固体培养基包括：
Figure BDA0003736935730000032
以质量百分数计，所述种子瓶培养基包括：
Figure BDA0003736935730000033
Figure BDA0003736935730000041
优选的，所述第三碳源与第四碳源各自独立地为葡萄糖与饴糖；所述葡萄糖与饴糖的质量比为(0.5～1)：(0.5～1)。
优选的，所述步骤S3)中扩大培养为一级扩大培养或二级扩大培养；以质量百分数计，扩大培养中的一级培养基包括：
Figure BDA0003736935730000042
以质量百分数计，扩大培养中的二级培养基包括：
Figure BDA0003736935730000043
优选的，所述第五碳源与第六碳源各自独立地为淀粉与饴糖；所述淀粉与饴糖的质量比为(1.5～3)：(1.5～3)。
优选的，所述步骤S1)中活化培养的温度为27℃～30℃；活化培养的时间为7～10天；
所述步骤S2)中摇瓶培养的温度为27℃～30℃；摇瓶培养时的转速为190～250rpm；摇瓶培养的时间为3～7天；
所述步骤S3)中摇瓶种子液的接种量为1％～7％；扩大培养时的温度为28℃～32℃；扩大培养时溶氧控制在30％以上；扩大培养的时间为48～96h；
所述步骤S4)中发酵罐种子液的接种量为10％～20％；发酵培养的温度为28℃～32℃；发酵培养时溶氧控制在30％以上，pH值控制为6.5～7.2。
优选的，所述步骤S4)中补料培养基分为多次加入，相邻两次补加的时间间隔为24～48h；每次加入的体积为发酵液体积的0.5％～3％。
本发明提供了一种多杀菌素的发酵培养基，包括基础培养基、流加培养基与补料培养基；以质量百分数计，所述基础培养基包括：第一碳源5％～9％；棉籽蛋白2.5％～4.5％；油酸甲酯1％～5％；第一植物油1％～5％；酵母粉0.5％～1.5％；蛋白粉0.5％～1.5％；玉米浆干粉0.5％～1.5％；蛋白胨1％～2％；磷酸二氢钾0.2％～0.4％；硫酸铵0.05％～0.5％；微量元素0.0003％～0.0012％；碳酸钙0.2％～0.3％；消泡剂0.05％～0.15％；以质量百分数计，所述流加培养基包括：第二碳源20％～50％；玉米浆干粉1％～3％；所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。与现有技术相比，本发明提供的发酵培养基不仅使多杀菌素具有较高的发酵水平，且发酵水平稳定，参数易控制，便于进行扩大生产。
实验表明，本发明提供的多杀菌素的生产方法从30L小试发酵到60t发酵逐级进行放大，发酵水平从3654mg/L提高到7835mg/mL，说明本发明极大地提升了多杀菌素的发酵水平。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图；
图2为本发明实施例2中得到的发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图；
图3为本发明实施例3中得到的发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图；
图4为本发明实施例4中得到的发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种多杀菌素的发酵培养基，包括基础培养基、流加培养基与补料培养基；
以质量百分数计，所述基础培养基包括：
Figure BDA0003736935730000061
所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。
本发明提供的发酵培养基不仅使多杀菌素具有较高的发酵水平，且发酵水平稳定，参数易控制，便于进行扩大生产。
按照本发明，所述基础培养基中第一碳源的含量优选为5％～8％，更优选为6％～8％，再优选为6％～7.5％；在本发明提供的实施例，所述基础培养基中第一碳源的含量具体为6％、7％或7.5％；所述第一碳源为本领域技术人员熟知的碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精与可溶性淀粉中的一种或多种，更优选为葡萄糖。
所述基础培养基中棉籽蛋白的含量优选为2.5％～4％，更优选为2.5％～3.5％，再优选为2.5％～3％。
所述基础培养基中油酸甲酯的含量优选为2％～4％，更优选为2％～3％。
所述基础培养基中第一植物油的含量优选为2％～5％，更优选为2％～4％，再优选为3％～4％；在本发明提供的实施例中，所述基础培养基中第一植物油的含量具体为3％、3.5％或4％；所述第一植物油为本领域技术人员熟知的植物油即可，并无特殊的限制，本发明中优选为大豆油、棉籽油、玉米油与葵花油中的一种或多种，更优选为植物油。
所述基础培养基中酵母粉的含量优选为0.5％～1％；在本发明提供的实施例中，所述基础培养基中酵母粉的含量具体为0.5％。
所述基础培养基中蛋白粉的含量优选为0.5％～1％，更优选为0.5％～0.75％；在本发明提供的实施例中，所述基础培养基中蛋白粉的含量具体为0.75％或0.5％。
所述基础培养基中玉米浆干粉的含量优选为0.5％～1％；在本发明提供的实施例中，所述玉米浆干粉在基础培养基中的含量优选为0.5％或1％。
所述基础培养基中蛋白胨的含量优选为1％～1.75％；在本发明提供的实施例中，所述蛋白胨在基础培养基中的含量具体为1％、1.5％或1.75％。
所述基础培养基中磷酸二氢钾的含量优选为0.2％～0.3％，更优选为0.2％～0.25％。
所述基础培养基中硫酸铵的含量优选为0.1％～0.5％；在本发明提供的实施例中，所述硫酸铵在基础培养基中的含量具体为0.5％、0.2％、0.15％或0.1％。
在本发明提供的基础培养基中，所述微量元素的含量优选为0.0005％～0.0012％，更优选为0.0009％～0.0012％；在本发明提供的实施例中，所述微量元素在基础培养基中的含量具体为0.0009％、0.001％或0.0012％；所述微量元素优选包括硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁；所述硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁的质量比优选为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)，更优选为(1～2)：(2～3)：3：3；在本发明提供的实施例中，所述硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁的质量比具体为1：2：3：3、2：2：3：3或3：3：3：3。
所述基础培养基中碳酸钙的含量优选为0.2或0.3％。
所述基础培养基中消泡剂的含量优选为0.08％～0.12％，更优选为0.1％；所述消泡剂为本领域技术人员熟知的消泡剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为有机硅类消泡剂，更优选为聚醚改性硅消泡剂，再优选为消泡剂298。
本发明提供的基础培养基其余成分为水；所述基础培养基在使用前需进行灭菌处理，该基础培养基在灭菌前pH值优选调节至7.3～7.5；所述灭菌的温度优选为121℃～123℃；所述灭菌的时间优选为15～25min，更优选为20min。
本发明提供的发酵培养基除基础培养基外，还包括流加培养基。
所述流加培养基中第二碳源的含量优选为20％～40％，更优选为20％～30％；所述第二碳源为本领域技术人员熟知的碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精与可溶性淀粉中的一种或多种，更优选为葡萄糖。
所述流加培养基中玉米浆干粉的含量优选为1％～2％，更优选为1％～1.5％，再优选为1％～1.2％。
所述流加培养基其余成分为水；所述流加培养基在使用前需进行灭菌处理；所述灭菌的温度优选为121℃～123℃；所述灭菌的时间优选为15～25min，更优选为20min。
在本发明中，所述发酵培养基还包括补料培养基；所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比优选为(1～2)：(1～3)，更优选为(1～2)：(1～2)，再优选为(1～2)：(1～1.5)；在本发明提供的实施例中，所述补料培养基中油酸甲酯与第二植物油的比例具体为1：1.5、1：1、1.5：1、2：1；所述第二植物油为本领域技术人员熟知的植物油即可，并无特殊的限制，本发明中优选为大豆油、棉籽油、玉米油与葵花油中的一种或多种，更优选为植物油。
本发明还提供了一种多杀菌素的生产方法，包括：
S1)将刺糖多孢菌接种至固体培养基进行活化培养，得到孢子；
S2)将孢子接种至种子瓶培养基进行摇瓶培养，得到摇瓶种子液；
S3)将所述摇瓶种子液接种至种子罐中进行扩大培养，得到发酵罐种子液；
S4)将所述发酵罐种子液接种至基础培养基中进行发酵培养，在发酵培养的第5～7天开始加入流加培养基维持发酵液中还原糖在0.5％～3.5％之间，从第6～7天加入补料培养基，得到多杀菌素；
以质量百分数计，所述基础培养基包括：
Figure BDA0003736935730000091
以质量百分数计，所述流加培养基包括：
第二碳源 20％～50％；
玉米浆干粉 1％～3％；
所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。
本发明提供的生产方法依次包括菌种活化、摇瓶培养、种子罐培养及发酵罐培养。
将刺糖多孢菌接种至固体培养基进行活化培养，得到孢子；所述刺糖多孢菌的菌株为本领域技术人员熟知的菌株即可，并无特殊的限制，本发明中优选为实验室筛选和保存的刺糖多孢菌YJY-12(Saccharopolyspora spinosa YJY-12)；在本发明中优选从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接种至固体培养基进行活化培养；以质量百分数计，所述固体培养基优选包括第三碳源1％～2％；酪蛋白胨0.2％～0.5％；酵母浸粉0.2％～0.5％；硫酸镁0.2％～0.5％；琼脂1％～2％；其中，所述固体培养基中第三碳源的含量优选为1.5％；所述第三碳源优选为葡萄糖与饴糖；所述葡萄糖与饴糖的质量比优选为(0.5～1)：(0.5～1)，更优选为1：0.5；所述固体培养基中酪蛋白胨的含量优选为0.5％；所述固体培养基中酵母浸粉的含量优选为0.5％；所述固体培养基中硫酸镁的含量优选为0.2％；所述固体培养基中硫酸镁的含量优选为0.2％；所述固体培养基中琼脂的含量优选为2％；所述固体培养基在灭菌前的pH值优选为6.9～7.3；所述活化培养的温度优选为27℃～30℃；活化培养的时间为7～10天。
将孢子接种至种子瓶培养基进行摇瓶培养，得到摇瓶种子液；在本发明中优选先将孢子制备成孢子悬液然后接种至种子瓶培养基中；所述孢子悬液的浓度优选为106～109个/mL；所述孢子悬浮液的接种量优选为1％～3％(v/v)；以质量百分数计，所述种子瓶培养基包括：第四碳源1％～2％；酵母浸粉0.5％～1.5％；蛋白胨1％～2％；黄豆饼粉0.5％～1.5％；磷酸二氢钾0.5％～1％；氯化钠0.5％～1％；硫酸镁0.05％～0.15％；其中，所述种子平培养基中第四碳源的含量优选为1.5％；所述第四碳源优选为葡萄糖与饴糖；所述葡萄糖与饴糖的质量比优选为(0.5～1)：(0.5～1)，更优选为1：0.5；所述种子平培养基中酵母浸粉的含量优选为0.5％；所述种子瓶培养基中蛋白胨的含量优选为2％；所述种子瓶培养基中黄豆饼粉的含量优选为0.5％；所述种子瓶培养基中磷酸二氢钾的含量优选为0.5％；所述种子瓶培养基中氯化钠的含量优选为1％；所述种子瓶培养基中硫酸镁的含量优选为0.1％；所述种子瓶培养基灭菌前的pH值优选为6.9～7.3；所述摇瓶培养的温度优选为27℃～30℃；摇瓶培养时的转速优选为190～250rpm，更优选为200～220rpm；摇瓶培养的时间优选为3～7天。
将所述摇瓶种子液接种至种子罐中进行扩大培养，得到发酵罐种子液；在本发明中，种子罐扩大培养优选为一级扩大培养或二级扩大培养；当扩大培养为一级扩大培养时，仅包括一级培养基；以质量百分数计，扩大培养中的一级培养基优选包括：第五碳源3％～6％；棉籽蛋白1％～2％；黄豆饼粉0.5％～1.5％；酵母浸粉0.2％～0.5％；氨基酸0.05％～0.15％；硫酸镁0.1％～0.5％；硫酸铵0.05％～0.15％；碳酸钙0.05％～0.2％；其中，所述一级培养基中第五碳源的含量优选为4％～5％，更优选为4％；所述第五碳源优选为淀粉与饴糖；所述淀粉与饴糖的质量比优选为(1.5～3)：(1.5～3)，更优选为(2～3)：(1.5～2)，再优选为2.5：1.5；所述一级培养基中棉籽蛋白的含量优选为1％；所述一级培养基中黄豆饼粉的含量优选为1％～1.5％，更优选为1.5％；所述一级培养基中酵母浸粉的含量优选为0.5％；所述一级培养基中氨基酸的含量优选为0.1％～0.15％，更优选为0.15％；所述氨基酸优选为甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸；所述甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸的质量比优选为1：1：1；所述一级培养基中硫酸镁的含量优选为0.1％～0.3％；所述一级培养基中硫酸铵的含量优选为0.1％～0.3％；所述一级培养基中碳酸钙的含量优选为0.1％～0.2％，更优选为0.2％；在本发明中，所述一级培养基中优选还包括消泡剂；所述一级培养基中消泡剂的含量优选为0.05％～0.2％，更优选为0.1％；所述消泡剂为本领域技术人员熟知的消泡剂即可，并无特殊的限制，在本发明中优选为有机硅类消泡剂，更优选为聚醚改性硅消泡剂，再优选为消泡剂298；所述一级扩大培养时的接种量优选为1％～7％(v/v)，更优选为1％～5％(v/v)；所述一级扩大培养时的温度优选为28℃～32℃，更优选为30℃～32℃；扩大培养的初始转速优选为100～200rpm；之后根据溶氧调节转速和通气量，在本发明中扩大培养时溶氧控制在30％以上；扩大培养的时间优选为48～96h，更优选为60～96h。在本发明中，当所述扩大培养为二级扩大培养时，除一级培养基外，还包括二级培养基，利用二级培养基继续进行扩大培养；以质量百分数计，扩大培养中的二级培养基优选包括：第六碳源3％～6％；棉籽蛋白1％～2％；黄豆饼粉0.5％～1.5％；酵母浸粉0.2％～0.5％；氨基酸0.05％～0.15％；硫酸镁0.1％～0.5％；硫酸铵0.05％～0.5％；碳酸钙0.05％～0.2％；其中，所述二级培养基中第五碳源的含量优选为4％～5％，更优选为4％；所述第五碳源优选为淀粉与饴糖；所述淀粉与饴糖的质量比优选为(1.5～3)：(1.5～3)，更优选为(2～3)：(1.5～2)，再优选为2.5：1.5；所述二级培养基中棉籽蛋白的含量优选为1％；所述二级培养基中黄豆饼粉的含量优选为1％～1.5％，更优选为1.5％；所述二级培养基中酵母浸粉的含量优选为0.5％；所述二级培养基中氨基酸的含量优选为0.1％～0.15％，更优选为0.15％；所述氨基酸优选为甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸；所述甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸的质量比优选为1：1：1；所述二级培养基中硫酸镁的含量优选为0.1％～0.3％；所述二级培养基中硫酸铵的含量优选为0.1％～0.3％；所述二级培养基中碳酸钙的含量优选为0.1％～0.2％，更优选为0.2％；在本发明中，所述二级培养基中优选还包括消泡剂；所述二级培养基中消泡剂的含量优选为0.05％～0.2％，更优选为0.1％；所述消泡剂为本领域技术人员熟知的消泡剂即可，并无特殊的限制，在本发明中优选为有机硅类消泡剂，更优选为聚醚改性硅消泡剂，再优选为消泡剂298；所述二级扩大培养时的接种量优选为10％～20％(v/v)；所述二级扩大培养时的温度优选为28℃～32℃，更优选为30℃～32℃；扩大培养的初始转速优选为100～200rpm；之后根据溶氧调节转速和通气量，在本发明中扩大培养时溶氧控制在20％以上，更优选为30％以上；扩大培养的时间优选为20～60h，更优选为36～60h。
将所述发酵罐种子液接种至基础培养基中进行发酵培养；所述基础培养基同上所述，在此不再赘述；所述发酵罐种子液的接种量为10％～20％(v/v)；所述发酵培养的温度优选为28℃～32℃，更优选为30℃～32℃；所述发酵培养的初始转速优选为100～200rpm；之后根据溶氧水平调节转速和通气量，在本发明中优选发酵培养时溶氧控制在30％以上；所述发酵培养的pH值优选为6.5～7.2；在本发明提供的实施例中，所述发酵培养的pH值具体为6.9～7.1、7～7.2、6.7～7或6.5～6.8。
在发酵培养的第5～7天开始加入流加培养基维持发酵液中还原糖在0.5％～3.5％之间，更优选为在0.5％～2.5％之间；所述流加培养基同上所述，在此不再赘述。
从第6～7天加入补料培养基；在本发明中优选在开始加入流加培养基的第二天加入补料培养基；所述补料培养基同上所述，在此不再赘述；在本发明中补料培养基优选分为多次加入，相邻两次补加的时间间隔优选为24～48h；每次加入的体积优选为发酵液体积的0.5％～3％，更优选为0.5％～2％再优选为0.5％～1％。
当发酵水平不再提高或增加较为缓慢时，发酵结束，得到多杀菌素。
在本发明中多杀菌素发酵水平测定方法优选为：取发酵液1mL，加无水乙腈4mL，充分振荡30min，10000g离心10min取上清，HPLC法测定多杀菌素的发酵水平。
色谱柱：C18(VP-ODS，4.6mm×150mm)；
流动相：甲醇:乙腈:水(0.05％乙酸铵)＝45:45:10(v/v/v)；
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
波长：250nm。
还原糖：DNS法。
菌浓测定：取发酵液5mL，3,000r/min离心15min，计算沉淀固形物占总体积的百分比。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种多杀菌素的发酵培养基及多杀菌素的生产方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售；实施例中原料为刺糖多孢菌YJY22-16(Saccharopolyspora spinosa YJY22-16)；实施例中所用酵母浸粉，蛋白胨和酪蛋白胨为安琪酵母股份公司生产；所述黄豆饼粉，棉籽蛋白和蛋白粉为北京鸿润宝顺科技有限公司生产。
实施例1
多杀菌素的发酵小试(30L)
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接种至固体培养基，30℃培养10天，活化菌种，形成孢子。
固体培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，pH6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
摇瓶培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液(浓度106～109个/mL)，孢子悬液按1％(v/v)的接种量接种至种子培养基，32℃，200rpm，培养3天，得到成熟的摇瓶种子液。
种子瓶培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨2.0％，黄豆饼粉0.5％，磷酸二氢钾0.5％，NaCl1.0％，硫酸镁0.1％，pH6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
种子罐培养(3L)：
种子罐装量2L，培养基为一级种子培养基，摇瓶培养液按5％(v/v)的接种量接种至种子罐中，罐温32℃，初始转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，将溶氧控制在30％以上，培养60h后获得成熟的种子液。
种子罐培养基：淀粉2.5％，饴糖1.5％，棉籽蛋白1.0％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(质量比为1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
发酵罐培养(30L)：
发酵罐装量20L，培养基为基础发酵培养基，种子液按10％(v/v)的接种量接种至发酵基础培养基中，罐温为32℃，初始转速100rpm，根据溶氧水平调节转速和通气量，溶氧控制在30％以上，pH控制在6.9～7.1。从第5天开始，开始流加流加培养基，维持发酵液中还原糖在1.5％～2.5％之间。从第6天开始补加复合油脂(补料培养基)，每隔一天补加0.5％。发酵到进入第12天，发酵水平不在提高，结束发酵，发酵水平为3654mg/L；按照上述方法对发酵液的发酵水平测定方法进行检测，得到发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图如图1所示。
基础发酵培养基：葡萄糖6.0％，棉籽蛋白2.5％，油酸甲酯2.0％，大豆油3.0％，酵母粉0.5％，蛋白粉0.5％，玉米浆干粉0.5％，蛋白胨1.0％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸铵0.1％，硫酸镍0.0001％，硫酸铜0.0002％，钼酸铵0.0003％，硫酸亚铁0.0003％，消泡剂2980.1％，碳酸钙0.2％，pH 7.3～7.5，加水定容至相应体积，121～123℃温度灭菌20min；
发酵流加培养基：葡萄糖30％，玉米浆干粉1.0％，121℃温度灭菌20min；
发酵补料培养基：复合油脂(油酸甲酯和大豆油质量比1:1.5)，121℃温度灭菌20min。
实施例2
多杀菌素的发酵中试(2t)
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接种至固体培养基，30℃培养10天，活化菌种，形成孢子。
固体培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，消前pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
摇瓶培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液(浓度106～109个/mL)，孢子悬液按1％(v/v)的接种量接种至摇瓶种子培养基，31℃，200rpm，培养4天，得到成熟的摇瓶种子液。
种子瓶培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨2.0％，黄豆饼粉0.5％，磷酸二氢钾0.5％，NaCl 1.0％，硫酸镁0.1％，消前pH 6.9-7.3；121℃温度灭菌20min。。
一级种子罐培养(200L)
一级种子罐装量120L，种子罐培养基为一级种子培养基，从种子瓶按照5％(v/v)的接种量接种到种子罐，罐温31℃，搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，溶氧控制在30％以上，培养60h后获得成熟的一级种子液。
一级种子罐培养基：淀粉2.5％，饴糖1.5％，棉籽蛋白1.0％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(质量比为1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
二级种子罐培养(500L)
二级种子罐装量300L，一级种子液按20％(v/v)的接种量接种至二级种子罐中，罐温31℃，初始搅拌转速100rpm根据溶氧调节转速和通气量，溶氧控制在20％以上，培养时间36h后获得成熟的二级种子液。
二级种子罐培养基：淀粉2.0％，饴糖2.0％，棉籽蛋白1.5％，黄豆饼粉1.0％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(质量比为1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.2％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9-7.3；121℃温度灭菌20min。
发酵罐培养(2t)
发酵罐装量1m3，将种子液按20％(v/v)的接种量接种于发酵基础培养基中，罐温为31℃，初始转速100rpm，溶氧控制在30％以上，pH控制在7.0～7.2。第5天开始，开始流加流加培养基，维持发酵液中还原糖在1.0％～1.5％之间。第8天开始，补加补料培养基，每隔一天补加1％。发酵到进入第13天，发酵水平不在提高，结束发酵，发酵液的发酵水平为5358mg/L；按照上述方法对发酵液的发酵水平测定方法进行检测，得到发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图如图2所示。
基础发酵培养基：葡萄糖7.0％，棉籽蛋白3.0％，油酸甲酯3.0％，大豆油4.0％，酵母粉0.5％，蛋白粉0.5％，玉米浆干粉1.0％，蛋白胨1.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸铵0.15％，硫酸镍0.0002％，硫酸铜0.0002％，钼酸铵0.0003％，硫酸亚铁0.0003％，消泡剂298 0.1％，碳酸钙0.2％，加水定容至相应体积，灭菌前pH调至7.3-7.5，121-123℃温度灭菌20min；
发酵流加培养基：葡萄糖30％，玉米浆干粉1.2％，121～123℃温度灭菌20min；
发酵补料培养基：复合油脂(油酸甲酯和大豆油质量比1:1)，121～123℃温度灭菌20min。
实施例3
多杀菌素的发酵生产(30t)
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接种至固体培养基，31℃培养10天，活化菌种，形成孢子。
固体培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，消前pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
摇瓶培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液(浓度106～109个/mL)，按1％(v/v)孢子悬液接种量接种至种子培养基，31℃，200rpm，培养4天，得到摇瓶种子液；
种子瓶培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨2.0％，黄豆饼粉0.5％，磷酸二氢钾0.5％，NaCl 1.0％，硫酸镁0.1％，消前pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
一级种子罐培养(1m3)
一级种子罐装量0.6m3，种子罐培养基为一级种子培养基，从种子瓶按照1％(v/v)的接种量接种到种子罐，罐温32℃，搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，溶氧控制在30％以上，培养时间96h后获得成熟的一级种子液。
一级种子罐培养基：淀粉2.5％，饴糖1.5％，棉籽蛋白1.0％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(质量比为1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
二级种子罐培养(5m3)
二级种子罐装量3m3，一级种子液按20％(v/v)的接种量接种二级种子罐中，罐温32℃，初始搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，溶氧控制在30％以上，培养48h后获得成熟的种子液。
二级种子罐培养基：淀粉2.0％，饴糖2.0％，棉籽蛋白1.5％，黄豆饼粉1.0％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(质量比为1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.2％，硫酸铵0.2％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
发酵罐培养(30m3)
发酵罐装量20m3，将种子液按20％(v/v)的接种量接种于发酵基础培养基中，罐温为32℃，初始转速100rpm，溶氧控制在30％以上，pH控制在6.7～7.0。从第6天开始，开始流加流加培养基，维持发酵液中还原糖在1.5％～2.5％之间；补加补料培养基，每隔48h补加1.5％(v/v)。发酵到进入第15天，发酵水平不再提高，结束发酵，发酵水平为6435mg/L；按照上述方法对发酵液的发酵水平测定方法进行检测，得到发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图如图3所示。
基础发酵培养基：葡萄糖7.5％，棉籽蛋白3.0％，油酸甲酯3.0％，大豆油3.5％，酵母粉0.5％，蛋白粉0.5％，玉米浆干粉0.5％，蛋白胨1.5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸铵0.2％，硫酸镍0.0002％，硫酸铜0.0002％，钼酸铵0.0003％，硫酸亚铁0.0003％，消泡剂0.1％，碳酸钙0.2％，加水定容至相应体积，灭菌前pH调至7.3～7.5，121～123℃温度灭菌20min。
发酵流加培养基：葡萄糖30％，玉米浆干粉1.2％，121～123℃温度灭菌20min。
发酵补料培养基：复合油脂(油酸甲酯和大豆油质量比1.5:1)，121-123℃温度灭菌20min。
实施例4
多杀菌素的发酵生产(60t)
菌种活化：
从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，划线接种至固体培养基，30℃培养10天，活化菌种，形成孢子。
固体培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酪蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.2％，琼脂2％，消前pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
摇瓶培养：
取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液(浓度106～109个/mL)，孢子悬液按1％(v/v)的接种量接种至种子培养基，30℃，200rpm，培养4天，得到摇瓶种子液。
种子瓶培养基：葡萄糖1.0％，饴糖0.5％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨2.0％，黄豆饼粉0.5％，磷酸二氢钾0.5％，NaCl 1.0％，硫酸镁0.1％，消前pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
一级种子罐培养(2m3)
一级种子罐装量1.2m3，培养基为一级种子培养基，摇瓶种子液按1％(v/v)的接种量接种至种子罐，罐温30℃，搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，溶氧控制在30％以上，培养时间在96h获得成熟的一级种子液。
一级种子罐培养基：淀粉2.5％，饴糖1.5％，棉籽蛋白1.0％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
二级种子罐培养(10m3)
二级种子罐装量6m3，培养基为二级种子培养基，一级种子液按10％(v/v)的接种量接种二级种子罐中，罐温30℃，初始搅拌转速100rpm，根据溶氧调节转速和通气量，溶氧控制在30％以上，培养时间在60h获得成熟的种子液。
二级种子罐培养基：淀粉2.5％，饴糖1.5％，棉籽蛋白1.0％，黄豆饼粉1.5％，酵母浸粉0.5％，氨基酸0.15％(质量比为1：1：1的甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸)，硫酸镁0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.2％，消泡剂298 0.1％，pH 6.9～7.3；121℃温度灭菌20min。
发酵罐培养(60m3)
发酵罐装量50m3，将种子液按20％的接种量接种于发酵基础培养基中，罐温为30℃，初始转速100rpm，溶氧控制在30％以上，pH控制在6.5～6.8。从第5天开始，开始补加流加培养基，维持发酵液中还原糖在0.5-1.5％之间；补加补料培养基，每隔一天补加1％。发酵到进入第15天，发酵水平不在提高，结束发酵，发酵液的发酵水平为7835mg/mL；按照上述方法对发酵液的发酵水平测定方法进行检测，得到发酵液乙腈浸提多杀菌素液相色谱图如图4所示。
基础发酵培养基：葡萄糖7.5％，棉籽蛋白3.0％，油酸甲酯3.0％，大豆油3.0％，酵母粉0.5％，蛋白粉0.75％，玉米浆干粉0.5％，蛋白胨1.75％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸铵0.5％，硫酸镍0.003％，硫酸铜0.0003％，钼酸铵0.0003％，硫酸亚铁0.0003％，消泡剂2980.1％，碳酸钙0.3％，加水定容至相应体积，灭菌前pH调至7.3～7.5，121温度灭菌20min；
发酵流加培养基：葡萄糖30％，玉米浆干粉1.2％，121℃温度灭菌20min；
发酵补料培养基：复合油脂(油酸甲酯和大豆油质量比2:1)，121℃温度灭菌20min。
通过实施例1～实施例4可以看出，随着发酵规模的递增，发酵产量会有一定幅度的递增，这说明由于随着发酵规模的扩大，发酵罐的各项参数便于控制，对多杀菌素的发酵有益。

Claims (10)

1.一种多杀菌素的发酵培养基，其特征在于，包括基础培养基、流加培养基与补料培养基；
以质量百分数计，所述基础培养基包括：
Figure FDA0003736935720000011
以质量百分数计，所述流加培养基包括：
第二碳源 20％～50％；
玉米浆干粉 1％～3％；
所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述第一碳源与第二碳源各自独立地选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、淀粉、糊精与可溶性淀粉中的一种或多种；
所述第一植物油与第二植物油各自独立地选自大豆油、棉籽油、玉米油与葵花油中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述微量元素包括硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁；所述硫酸镍、硫酸铜、钼酸铵与硫酸亚铁的质量比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)。
4.一种多杀菌素的生产方法，其特征在于，包括：
S1)将刺糖多孢菌接种至固体培养基进行活化培养，得到孢子；
S2)将孢子接种至种子瓶培养基进行摇瓶培养，得到摇瓶种子液；
S3)将所述摇瓶种子液接种至种子罐中进行扩大培养，得到发酵罐种子液；
S4)将所述发酵罐种子液接种至基础培养基中进行发酵培养，在发酵培养的第5～7天开始加入流加培养基维持发酵液中还原糖在0.5％～3.5％之间，从第6～7天加入补料培养基，得到多杀菌素；
以质量百分数计，所述基础培养基包括：
Figure FDA0003736935720000021
以质量百分数计，所述流加培养基包括：
第二碳源 20％～50％；
玉米浆干粉 1％～3％；
所述补料培养基包括油酸甲酯与第二植物油；所述油酸甲酯与第二植物油的质量比为(1～2)：(1～3)。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，以质量百分数计，所述固体培养基包括：
Figure FDA0003736935720000022
Figure FDA0003736935720000031
以质量百分数计，所述种子瓶培养基包括：
Figure FDA0003736935720000032
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述第三碳源与第四碳源各自独立地为葡萄糖与饴糖；所述葡萄糖与饴糖的质量比为(0.5～1)：(0.5～1)。
7.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S3)中扩大培养为一级扩大培养或二级扩大培养；以质量百分数计，扩大培养中的一级培养基包括：
Figure FDA0003736935720000033
以质量百分数计，扩大培养中的二级培养基包括：
Figure FDA0003736935720000034
Figure FDA0003736935720000041
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述第五碳源与第六碳源各自独立地为淀粉与饴糖；所述淀粉与饴糖的质量比为(1.5～3)：(1.5～3)。
9.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S1)中活化培养的温度为27℃～30℃；活化培养的时间为7～10天；
所述步骤S2)中摇瓶培养的温度为27℃～30℃；摇瓶培养时的转速为190～250rpm；摇瓶培养的时间为3～7天；
所述步骤S3)中摇瓶种子液的接种量为1％～7％；扩大培养时的温度为28℃～32℃；扩大培养时溶氧控制在30％以上；扩大培养的时间为48～96h；
所述步骤S4)中发酵罐种子液的接种量为10％～20％；发酵培养的温度为28℃～32℃；发酵培养时溶氧控制在30％以上，pH值控制为6.5～7.2。
10.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述步骤S4)中补料培养基分为多次加入，相邻两次补加的时间间隔为24～48h；每次加入的体积为发酵液体积的0.5％～3％。
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