CN105838633A

CN105838633A - 一种偶发分枝杆菌及其应用

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Publication number: CN105838633A
Application number: CN201510016326.8A
Authority: CN
Inventors: 薛建萍; 姚再男; 唐璐敏; 范锦锦; 朱健; 丁林富; 卜桂琴
Original assignee: Shanghai Pesticide Research Institute Co Ltd
Current assignee: Shanghai Pesticide Research Institute Co Ltd
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2016-08-10

Abstract

本发明涉及工业微生物和发酵工艺学领域，尤其是一种具有催化功能的偶发分枝杆菌及其应用。这种偶发分枝杆菌保藏号CGMCC No.9657，能够催化植物甾醇生成9α-羟基雄烯二酮，转化率超过95％，选择性为50％～60％。利用该菌株生产9α-羟基雄烯二酮的单耗在2.2～2.5，主要产物为9α-羟基雄烯二酮，制备方法简单，效率高，具有很好的应用前景。

Description

一种偶发分枝杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物化工领域，具体为工业微生物和发酵工艺学领域，尤其是一种具有催化功能的偶发分枝杆菌及其应用。

背景技术

甾体激素类药物是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，是临床上一类重要的药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用，是医药行业的重点发展方向之一。这类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类。皮质激素类药物用于临床的有醋酸可的松(cortisone acetate)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸地塞米松(oexamethasone acetate)、醋酸氟轻松(fluocinonide)等。

甾体激素类药物生产的重要原料为植物甾醇。从植物甾醇经过分支杆菌转化生成9α-羟基-雄烯二酮(又称9-羟基-雄烯二酮，9OH-AD，9α-OH AD)。9α-羟基-雄烯二酮可以作为多种重要甾体类药物的合成原料。

化学合成的方法生产工艺复杂产率不高，因此生物工艺发酵方法生产9α-羟基-雄烯二酮是发展方向。

现有的报道中，采用新金色分枝杆菌(M ycobacterium sp.)微生物催化植物甾醇转化为雄烯二酮，即雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)或雄甾-1,4-烯-3,17-二酮(ADD)，通过诱变筛选到的菌株后ADD产量可明显提高。雄烯二酮需经过进一步反应生成9α-羟基-雄烯二酮。

本发明提供了一种偶发分枝杆菌，可以催化植物甾醇转化为9α-羟基-雄烯二酮。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的偶发分枝杆菌菌株。这种菌株具有催化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮的功能。

本发明的另一个目的在于采用上述菌株生产9α-羟基雄烯二酮。

技术方案为，一种偶发分枝杆菌(拉丁名Mycobacterium foruitum，分类命名：偶发分枝杆菌)，保藏号为CGMCC No.9657(保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2014年9月15日)

该菌株的培养条件为：在斜面培养基上28℃培养6-7天。斜面培养基可以使用偶发分枝杆菌常用的培养基，典型的，其组分为：牛肉膏0.2％、蛋白胨0.4％、甘油2％、琼脂粉2％(pH自然)。

菌株保藏条件为真空冷冻干燥(长期保藏)。

这种偶发分枝杆菌菌株可用于催化植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮。

一种9α-羟基雄烯二酮的制备工艺，以植物甾醇为原料，用上述偶发分枝杆菌发酵转化，发酵的条件为：25～34℃下(优选为26～32℃)通入空气并搅拌；通气比为1：0.3～0.85，发酵转化48～100小时。

优选的通气比为1：0.5～0.75；更优选为1：0.55～0.65。优选的搅拌速度为300～600rpm，更优选450～500rpm。优选的发酵时间为48～120小时，更优选为72～96小时。

更优选的发酵转化培养的条件为：温度29±1℃，通气比1:0.6，搅拌速度480rpm，发酵转化时间为72～96小时。

发酵转化培养基的配方含有：(a)甘油0.5％～2％，(b)磷酸钠或酸式磷酸钠盐0.75％～0.9％，和磷酸钾或酸式磷酸钾盐0.35％～0.5％，(d)铵盐如NH₄Cl0.15％～0.3％，(e)MgSO₄0.02％～0.06％，(f)黄豆粉0.05％～0.2％或0.5％～1％的蛋白胨或酵母膏；(g)分散剂(如吐温80)0.05％～0.2％；均为质量百分比。

发酵转化培养基中还含有植物甾醇0.7％～2％。余量为水。

更优选的，发酵转化培养基的组成为：甘油1％，Na₂HPO₄0.84％，KH₂PO₄0.45％，NH₄Cl0.2％，MgSO₄0.03％，黄豆粉0.1％，植物甾醇1％，分散剂如吐温80 0.1％，余者为水，pH 8.5。

优选的，先将偶发分枝杆菌接种于种子培养基，25～34℃(优选为26～32℃)下通入空气并搅拌，培养48～120小时后再接种于发酵培养液。通气比为1：0.3～0.85，优选为1：0.5～0.75，搅拌速度为300～600rpm，优选为450～500rpm。取种子培养液以5％～12％的体积比接种发酵培养液，优选为10％。

发酵中使用的种子培养基含有：蛋白胨0.8％～1.4％，牛肉膏0.2％～0.5％，NaCl0.45％～0.6％(均为质量百分比)，pH6.8～7.3。优选的，种子培养基pH＝6.9～7.0，含有蛋白胨1％、牛肉膏0.3％和NaCl0.5％。

优选的，种子培养条件为：温度29±1℃，通气比1:0.4～1：0.75，转速300～600rpm，培养72-96小时；更优选的，种子培养条件为：温度29±1℃，通气比1:0.6，转速480rpm，培养72-96小时。

发酵液用有机溶剂，如乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷提取。发酵液与有机溶剂体积比为1：2～2：1，优选为1：1.2～1.2:1。

经检测，用本发明的偶发分枝杆菌发酵转化植物甾醇的主要产物为9α-羟基雄烯二酮，转化率95％以上，选择性达50％～60％，生产9α-羟基雄烯二酮的单耗在2.2～2.5。

本发明所提供的偶发分枝杆菌，催化转化植物甾醇的主要产物为9α-羟基雄烯二酮，制备方法简单，效率高，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例2中，发酵96小时后，提取发酵液检测的液相色谱(HPLC)图

其中，a—副产物1；b—乙酸乙酯；c—9α-羟基雄烯二酮；d—9α-羟基睾酮(副产物2)；e—.副产物3；f—副产物4

图2为实施例2中，不同发酵时间发酵液中的9α-羟基雄烯二酮含量。

具体实施方案

实施例1

本发明的野生型偶发分枝杆菌，采集自土壤。2011年8月采集于湖南张家界。

拉丁名称：Mycobacterium foruitum

保藏号：CGMCC No.9657

保藏日期：2014年9月15日。

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述偶发分枝杆菌的保藏条件为：真空冷冻干燥(长期保藏)。

培养条件为：可以用通用的偶发分支杆菌培养基，25～30℃(优选28℃)在茄子瓶内斜面培养6～7天。典型的斜面培养基成分：牛肉膏0.2％、蛋白胨0.4％、甘油2％、琼脂粉2％(pH自然)。

实施例2

上述的偶发分枝杆菌能够催化植物甾醇生产9α-羟基雄烯二酮。

将20L种子培养基放置于35L种子罐中，接入一个茄子瓶斜面的菌(斜面面积约为8cm×8cm)。种子培养基含有蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl0.5％(均为质量百分比)，并将pH调整为7.0。

种子培养条件均为：温度29±1℃，通气比为1:0.6，转速480rpm，培养96小时。

取种子培养基，按10％体积比接种于发酵培养液，置于50升发酵罐内发酵(装料30L)，用来转化植物甾醇。发酵培养液的pH＝8.5，并含有：黄豆粉0.1％，甘油1％，Na₂HPO₄0.84％，KH₂PO₄0.45％，NH₄Cl0.2％，MgSO₄0.03％，植物甾醇1％，吐温80 0.1％(均为质量百分比)，余量为水。

发酵转化培养的条件为：温度29±1℃，通气比1:0.6，转速480rpm。

转化时间48、72、96、120小时分别取发酵液，并用等体积乙酸乙酯提取。用高效液相色谱检测乙酸乙酯相中产物的含量，每毫升乙酸乙酯中，9α-羟基雄烯二酮的含量如图2所示，发酵时间在72～96小时产量最高。

发酵96小时取发酵液用等体积乙酸乙酯提取，用高效液相色谱检测乙酸乙酯相中各产物的含量及植物甾醇的剩余量(用标准品作为工作标样)。发酵转化的主要产物为9α-羟基雄烯二酮(9α-OH AD)，副产物主要为9α-羟基睾酮(图1中的d)；9α-羟基雄烯二酮与9α-羟基睾酮产量比例(摩尔比)在3:1至5:1。转化率达95％以上，生产9α-羟基雄烯二酮的单耗为2.2～2.5，并且选择性在50％～60％。

转化率％＝转化底物量÷投入底物量×100

收率％＝实际产物量÷理论产物量×100

选择性％＝收率÷转化率×100

单耗＝实际产物量÷投入底物量

以上底物为植物甾醇，产物为9α-羟基雄烯二酮；转化底物量＝投入底物量-剩余底物量；理论产物量＝投入底物量÷底物分子量×产物分子量，底物平均分子量414，产物分子量302。

Claims

1.一种偶发分枝杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.9657。

2.权利要求1所述的偶发分枝杆菌在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用。

3.权利要求1所述的偶发分枝杆菌用于催化植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮。

4.一种制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，以植物甾醇为起始原料，用权利要求1所述的偶发分枝杆菌发酵催化，生成9α-羟基雄烯二酮。

5.权利要求4所述制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，发酵条件为：将权利要求1所述的偶发分枝杆菌接种于含有植物甾醇的发酵培养液中，25～34℃下通入空气并搅拌；发酵转化时间为48～100小时。

6.权利要求5所述制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，发酵转化时间为72～96小时。

7.权利要求5所述制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，将偶发分枝杆菌接种于种子培养基，25～34℃下通入空气并搅拌，培养48～120小时后再接种于发酵培养液。

8.权利要求5或7所述制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，发酵培养液pH＝8.3～8.7，含有以下质量百分比的物质：黄豆粉0.05％～0.2％，甘油0.5％～2％，Na₂HPO₄0.75％～0.9％，KH₂PO₄0.35％～0.5％，NH₄Cl 0.15％～0.3％，MgSO₄0.02％～0.06％，植物甾醇0.7％～2％，分散剂0.05％～0.2％；

种子培养基pH＝6.8～7.3，含有以下质量百分比的物质：蛋白胨0.8％～1.4％，牛肉膏0.2％～0.5％，NaCl 0.45％～0.6％。

9.权利要求5或7所述制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，种子培养和发酵时的通气比为1：0.3～0.85，搅拌速度为300～600rpm。

10.权利要求5或7所述制备9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于，通气比为1：0.5～0.75，搅拌速度为450～500rpm。