CN110564652B - 分枝杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分枝杆菌及其应用，其分类命名为分枝杆菌JYC‑07，于2017年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017325。本发明从自然环境中筛选并分离得到一株能够将坎利酮微生物转化为9α‑羟基坎利酮的菌株Mycobacterium sp.JYC，并进一步通过基因工程获得一株高产3‑甾酮‑9α羟基化酶的菌株Mycobacterium sp.JYC‑07，该菌株能够将坎利酮高效转化为9α‑羟基坎利酮，转化率超过90%，对于扩展甾体原料药物坎利酮的用途有着非常重要的意义，具有很好的产业化前景。

Description

分枝杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种分枝杆菌及其应用。
背景技术
甾体类药物作为仅次于抗生素的世界第二大类药物，对机体起着非常重要的调节作用。不同的甾体药物分子结构均由甾体类药物中间体衍生而来，9α-羟基坎利酮是甾体类药物合成过程中重要的中间体，在甾体工业化生产中起着重要作用。利用9α-羟基坎利酮作为前体物可以合成氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、可的松、泼尼松龙、醋酸波尼松龙、泼尼松、依普利酮、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸曲安奈德、布地奈德、地索奈德、环索奈德等多种皮质激素类甾体原料药产品，具有重要的商业价值。因此，获得经济高效地制备9α-羟基坎利酮方法势在必行。
制备9α-羟基坎利酮的关键步骤是在坎利酮的第9位碳上引入一个α羟基，化学方法合成9α-羟基坎利酮存在合成步骤多、专一性差，副反应多、收率低等问题，同时生产过程中需要使用多种有毒化学试剂，环境污染非常严重。
与传统化学合成方法相比，微生物转化技术具有反应步骤少、条件温和、立体选择性高、副反应少以及环境友好等优点，能够有效的克服一些化学合成法的不足，因此开发高效的微生物转化技术已经逐渐成为甾体医药工业重要的发展方向。
目前，已有文献公开了采用微生物转化技术将坎利酮转化为11α-羟基-坎利酮（参见文献1～文献5）。
但是，至今尚未发现采用微生物转化技术将坎利酮转化为9α-羟基坎利酮的文献报道。
文献1：中国专利文献CN1727494A，公开日为2006年2月1日。
文献2：中国专利文献CN101845474A，公开日为2010年9月29日。
文献3：中国专利文献CN103255192A，公开日为2013年8月21日。
文献4：中国专利文献CN103665083A，公开日为2014年3月26日。
文献5：中国专利文献CN104046675A，公开日为2014年9月17日。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种能够将坎利酮微生物转化为9α-羟基坎利酮的分枝杆菌及其应用。
实现本发明目的的技术方案是：一种分枝杆菌，其分类命名为分枝杆菌JYC-07（拉丁文名称为Mycobacterium sp. JYC-07），保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2017 年6月9日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017325。
上述分枝杆菌JYC-07在制备9α-羟基坎利酮中的应用，具有以下步骤：
①种子培养：将分枝杆菌JYC-07接种于含碳源和氮源的种子培养基中，在100～500rpm的转速以及25～35℃的温度下进行种子培养12～60h，得到种子培养液；
②发酵培养：将步骤①得到的种子培养液接种于含有碳源、氮源以及无机盐的发酵培养基中，在100～500rpm的转速以及25～37℃的温度下进行发酵培养24～72h，得到发酵液；
③生物转化：将坎利酮用促溶剂溶解后加入到步骤②得到的发酵液中，在100～350rpm的转速以及25～35℃的温度下进行生物转化24～96h，得到含有9α-羟基坎利酮的转化液。
上述步骤①中，所述种子培养基的初始pH值为6.0～8.0，优选为6.5～7.5。
上述步骤①中，所述种子培养基中的碳源选自葡萄糖、甘油、谷物淀粉、蔗糖中的一种或者两种以上（含两种）；所述碳源的含量为1.0g/100mL～4.0g/100mL，优选为1.5g/100mL～2.0g/100mL。
上述步骤①中，所述种子培养基中的氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、磷酸铵、豆粕粉中的一种或者两种以上（含两种）；所述氮源的含量为0.5g/100mL～5.0g/100mL，优选为2.5g/100mL～3.5g/100mL。
上述步骤①中，所述转速优选为150～250rpm。
上述步骤②中，所述发酵培养基的初始pH值为5.5～8.0，优选为6.5～7.5。
上述步骤②中，所述发酵培养基中的碳源选自葡萄糖、甘油、谷物淀粉、糖蜜中的一种或者两种以上（含两种）；所述碳源的含量为0.5g/100mL～4.0g/100mL，优选为1.5g/100mL～2.5g/100mL。
上述步骤②中，所述发酵培养基中的氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、磷酸铵、尿素中的一种或者两种以上（含两种）；所述氮源的含量为0.2g/100mL～4.0g/100mL，优选为2.5g/100mL～3.5g/100mL。
上述步骤②中，所述发酵培养基中的无机盐选自磷酸盐、镁盐、铁盐、钾盐中的一种或者两种以上（含两种）；所述无机盐的含量为0.01g/100mL～0.5g/100mL，优选为0.1g/100mL～0.2g/100mL。
上述步骤②中，所述种子培养液接种于所述发酵培养基的接种量为3～20%（V/V）。
上述步骤②中，所述转速优选为180～280rpm。
上述步骤③中，所述坎利酮的投料浓度为0.5g/100mL～1.8g/100mL。
上述步骤③中，所述促溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、豆油、环糊精、DMSO中的一种或者两种以上（含两种）；所述促溶剂的投料浓度为0.5g/100mL～10g/100mL。
上述步骤③中，所述转速优选为150～250rpm。
本发明具有的积极效果：本发明从自然环境中筛选并分离得到一株能够将坎利酮微生物转化为9α-羟基坎利酮的菌株Mycobacterium sp. JYC，并进一步通过基因工程获得一株高产3-甾酮-9α羟基化酶的菌株Mycobacterium sp. JYC-07，该菌株能够将坎利酮高效转化为9α-羟基坎利酮，转化率超过90%，对于扩展甾体原料药物坎利酮的用途有着非常重要的意义，具有很好的产业化前景。
具体实施方式
（实例1）
本实例为高产3-甾酮-9α羟基化酶的分枝杆菌JYC-07的构建。
S1、分枝杆菌JYC的筛选。
S11、取5g江苏佳尔科药业集团有限公司污水处理系统中的活性污泥，加入45mL灭菌的液体富集培养基中，然后在180rpm的转速以及35℃的温度下，气浴摇床富集培养96h，得到富集液。
上述液体富集培养基的配方如下：硫酸铵0.6g/100mL、柠檬酸钠0.5g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL、磷酸氢二钠0.03g/100mL，吐温-80 0.05g/100mL、坎利酮0.15g/100mL，pH值为7.0。
将上述富集液进行梯度稀释后，均匀涂布于固体富集培养基平板，在35℃恒温培养箱中培养73h后，挑取形态大小不同的单克隆，划线纯化后编号保藏，经初筛共得到7株不同的菌株。
上述固体富集培养基相比于上述液体富集培养基增加琼脂2.0g/100mL。
S12、用接种环将上述步骤S11筛选得到的7株不同的菌株分别接种于含15mL液体种子培养基的摇瓶中，然后在180rpm的转速以及32℃的温度下培养72h，备用。
上述液体种子培养基的配方如下：葡萄糖1.5g/100mL、酵母膏0.5g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氢钾0.05g/100mL、硫酸镁0.03g/100mL，pH值为7.0。
S13、分别取10mL上述培养好的液体种子接种于含50mL微生物转化培养基中，然后在200rpm的转速以及32℃的温度下培养。
上述微生物转化培养基的配方如下：葡萄糖1.0g/100mL、玉米淀粉1.5g/100mL、酵母膏0.2g/100mL、玉米浆2.0g/100mL、磷酸二氢钾0.03g/100mL、硫酸镁0.02g/100mL，甲醇2g/100mL，坎利酮0.5g/100mL，pH值为6.5。
用TLC法对这些菌株的转化产物进行分析，发现3株菌株可以转化坎利酮，通过HPLC法进一步检测，发现1株菌株可以将坎利酮转化为9α-羟基坎利酮，经鉴定该菌株为分枝杆菌（Mycobacterium sp.），命名为分枝杆菌JYC（Mycobacterium sp. JYC）。
S2、3-甾酮-9α羟基化酶基因在分枝杆菌JYC中的整合表达。
S21、3-甾酮-9α羟基化酶基因KshA的获取。
根据诺卡氏菌3-甾酮-9α羟基化酶编码基因KshA的序列及载体pMV306-Hsp60的特点，设计特异性引物KshA-F（SEQ ID NO：2）和KshA-R（SEQ ID NO：3），以诺卡氏菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
具体条件如下：92℃预变性2min，95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸5min，35个循环；72℃最后延伸8min。
用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，经测序公司测序分析，得到3-甾酮-9α羟基化酶基因KshA，长度为1143bp（SEQ ID NO：1）。
SEQ ID NO：1如下：
ATGAACAGCGACAGCGAAGTGCGGGTCATCGACGCCGGCGCACCGCCCACCCGGTTCGCCCGCGGCTGGCACTGCCTGGGCCTGGCGGACTCCTTCCGCGACGGCAAGCCGCACACCGTCGCCGCCTTCGGCACCGAACTGGTCGTCTTCGCCGGCGAGGACGGCACGCTCAACGTCCTCAACGCCTACTGCCCGCACATGGGTGGCAATCTCGCCGACGGCACCGTCAAGGGCGATTCGCTGGCCTGCCCGTTCCACGACTGGCGGTGGAACGGCAAGGGCAAATGCACCGGAATCCCCTACGCGCGCCGGGTGCCTCCGCTGGCCCGCACCAAGGCGTGGCCGACGCTGGAGCAGAACAAGCAGCTGTTCGTCTGGAACGATCCCGAGGGCAAGCAGCCACCCGCCGATATCACCATCCCGCGCGTCGACGCCGCCTTCGACGACGGCTGGACCGACTGGACCTGGAACTCGATGATCGTCGAGGCCAACTGCCGCGAGGTCGTCGACAACGTCGTCGACATGGCGCACTTCTTCTACGTGCACTACGGCTTCCCGACCTTCTTCAAGAACGTGTTCGAGGGTCATGTCGCCAGCCAGTACATGACCTCGATCTCGCGCGAGGACATGATGGGCGCGACCGCGAAGGCGTTGGGCGGCAAGAACACTCTGCATTCGGAGGCGTCGTACTACGGCCCCTCCTACATGATCGACTATCTGCGCAGCGAGAGTGCCGGGCTCACGGTCGAGGGCTACCTGATCAACTGCCACTATCCGATCACCGAGAACCGGTTCGTCCTGCAGTACGGCGCCATCGCGAAGAAGCCGGAGGGCGTGTCGCCGGAGCAGGCCGAGCAGATCGCGGCGGCCTTCGTCGGCGGTCTCGGCAAGGGGTTCGAACAGGATGCGGCGATCTGGAAGCGCAAGTCGCGCATCAACAATCCGCTGCTGTGCGAGGAGGACGGGCCGGTCTATCAGCTGCGTCGCTGGTACGAGCAGTTCTACACCGACGTCGCCGACATCTCCGAGGAGATGACCGCGCGCTTCGAATTCGAGGTCGACACCACCCGCGCGGTCACCGCCTGGGAGGCCGAGGTCGCGGAAAACCTCGCCAAGCGGGCCGAACAGGCCGTGGCGGGCTGA。
SEQ ID NO：2如下：
5’-GCGGATCCAGCTGCAGAATTCGATGAACAGCGACAGCGAAGT。
SEQ ID NO：3如下：
5’-ACGCTAGTTAACTACGTCGACTCAGGAACAGGCCGTGGCGGGCTGA。
S22、3-甾酮-9α羟基化酶编码基因KshA表达载体的构建和转化。
利用CloneTM一步法快速克隆试剂盒将步骤S21得到的片段重组到pMV306-Hsp60质粒的EcoRI和SalI位点之间，连接产物经转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自TAKARA公司），筛选验证得到表达重组质粒。
将重组质粒送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，得到KshA基因的过表达质粒pMV306-Hsp60-KshA。
把构建的表达重组质粒按照常规方法转化到步骤S1筛选得到的Mycobacteriumsp. JYC菌株的感受态细胞中，获得高产3-甾酮-9α羟基化酶的基因工程菌，分类命名为Mycobacterium sp. JYC-07（分枝杆菌JYC-07）。
（实施例1）
本实施例为9α-羟基坎利酮的制备方法，具有以下步骤：
①种子培养。
利用接种环将分枝杆菌JYC-07从茄子瓶接种于20mL种子培养基中，在180rpm的转速以及30℃的温度下进行种子培养36h，得到种子培养液。
本实施例的种子培养基组成如下：葡萄糖1.8g/100mL，蛋白胨1.0g/100mL，玉米浆2.0g/100mL，余量为水；初始pH值为7.2；灭菌。
②发酵培养。
将步骤①得到的种子培养液5mL接种于95mL发酵培养基中，也即接种量为5%（V/V），在200rpm的转速以及30℃的温度下进行发酵培养48h，得到发酵液。
本实施例的发酵培养基组成如下：葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.2g/100mL，蛋白胨0.1g/100mL，玉米浆2.5g/100mL，磷酸二氢铵0.04g/100mL，硫酸镁0.1g/100mL，余量为水；初始pH值为6.8；灭菌。
③生物转化。
用3mL甲醇溶清0.8g坎利酮，在无菌条件下加入到步骤②得到的发酵液中，在200rpm的转速以及30℃的温度下进行生物转化培养48h，得到含有9α-羟基坎利酮的转化液。
经检测，本实施例的转化率（坎利酮转化为9α-羟基坎利酮）为96.5%。
检测方法如下：取步骤③得到的转化液1mL，加入2倍体积的乙酸乙酯，震荡均匀后，静置分层，取上层有机相约1mL，用有机膜（0.4μm）过滤后，HPLC分析检测。
HPLC检测条件如下：Agilent Extend-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温为30℃；紫外检测波长为254nm；流动相为：80%甲醇/20%水（V/V）；流速为1.0mL/min；进样量20μL。
（实施例2）
本实施例为9α-羟基坎利酮的制备方法，具有以下步骤：
①种子培养。
利用接种环将分枝杆菌JYC-07从茄子瓶接种于20mL种子培养基中，在200rpm的转速以及32℃的温度下进行种子培养48h，得到种子培养液。
本实施例的种子培养基组成如下：葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏1.2g/100mL，玉米浆2.0g/100mL，余量为水；初始pH值为7.0；灭菌。
②发酵培养。
将步骤①所得种子培养液10mL接种于90mL发酵培养基中，也即接种量为10%（V/V），在220rpm的转速以及30℃的温度下进行发酵培养48h，得到发酵液。
本实施例的发酵培养基组成如下：葡萄糖2.0g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，玉米浆2.5g/100mL，磷酸二氢铵0.05g/100mL，硫酸镁0.1g/100mL，余量为水；初始pH值为7.2；灭菌。
③生物转化。
用3mL甲醇溶清1.2g坎利酮，在无菌条件下加入到步骤②得到的发酵液中，在220rpm的转速以及30℃的温度下进行生物转化培养60h，得到含有9α-羟基坎利酮的转化液。
经检测，本实施例的转化率为94.5%（方法同上）。
（实施例3）
本实施例为9α-羟基坎利酮的制备方法，具有以下步骤：
①种子培养。
利用接种环将分枝杆菌JYC-07从茄子瓶接种于20mL种子培养基中，在180rpm的转速以及30℃的温度下进行种子培养48h，得到种子培养液。
本实施例的种子培养基组成如下：甘油2.0g/100mL，酵母膏0.8g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，玉米浆1.8g/100mL，余量为水；初始pH值为7.5；灭菌。
②发酵培养。
将步骤①得到种子培养液15mL接种于85mL发酵培养基中，也即接种量为15%（V/V），在230rpm的转速以及20℃的温度下进行发酵培养48h，得到发酵液。
本实施例的发酵培养基组成如下：甘油1.0g/100mL，葡萄糖1.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，玉米浆2.5g/100mL，磷酸二氢钠0.05g/100mL，硫酸镁0.1g/100mL，余量为水；初始pH值为7.0；灭菌。
③生物转化。
用3mL甲醇溶清1.8g坎利酮，在无菌条件下加入到步骤②得到的发酵液中，在200rpm的转速以及30℃的温度下进行生物转化培养72h，得到含有9α-羟基坎利酮的转化液。
经检测，本实施例的转化率为92.5%（方法同上）。
序列表
<110> 江苏佳尔科药业集团股份有限公司
<120> 分枝杆菌及其应用
<130> 20191001
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1143
<212> DNA
<213> 分枝杆菌JYC-07(Mycobacterium sp.JYC-07)
<400> 1
atgaacagcg acagcgaagt gcgggtcatc gacgccggcg caccgcccac ccggttcgcc 60
cgcggctggc actgcctggg cctggcggac tccttccgcg acggcaagcc gcacaccgtc 120
gccgccttcg gcaccgaact ggtcgtcttc gccggcgagg acggcacgct caacgtcctc 180
aacgcctact gcccgcacat gggtggcaat ctcgccgacg gcaccgtcaa gggcgattcg 240
ctggcctgcc cgttccacga ctggcggtgg aacggcaagg gcaaatgcac cggaatcccc 300
tacgcgcgcc gggtgcctcc gctggcccgc accaaggcgt ggccgacgct ggagcagaac 360
aagcagctgt tcgtctggaa cgatcccgag ggcaagcagc cacccgccga tatcaccatc 420
ccgcgcgtcg acgccgcctt cgacgacggc tggaccgact ggacctggaa ctcgatgatc 480
gtcgaggcca actgccgcga ggtcgtcgac aacgtcgtcg acatggcgca cttcttctac 540
gtgcactacg gcttcccgac cttcttcaag aacgtgttcg agggtcatgt cgccagccag 600
tacatgacct cgatctcgcg cgaggacatg atgggcgcga ccgcgaaggc gttgggcggc 660
aagaacactc tgcattcgga ggcgtcgtac tacggcccct cctacatgat cgactatctg 720
cgcagcgaga gtgccgggct cacggtcgag ggctacctga tcaactgcca ctatccgatc 780
accgagaacc ggttcgtcct gcagtacggc gccatcgcga agaagccgga gggcgtgtcg 840
ccggagcagg ccgagcagat cgcggcggcc ttcgtcggcg gtctcggcaa ggggttcgaa 900
caggatgcgg cgatctggaa gcgcaagtcg cgcatcaaca atccgctgct gtgcgaggag 960
gacgggccgg tctatcagct gcgtcgctgg tacgagcagt tctacaccga cgtcgccgac 1020
atctccgagg agatgaccgc gcgcttcgaa ttcgaggtcg acaccacccg cgcggtcacc 1080
gcctgggagg ccgaggtcgc ggaaaacctc gccaagcggg ccgaacaggc cgtggcgggc 1140
tga 1143
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 分枝杆菌JYC-07(Mycobacterium sp. JYC-07)
<400> 2
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<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 分枝杆菌JYC-07(Mycobacterium sp. JYC-07)
<400> 3
acgctagtta actacgtcga ctcaggaaca ggccgtggcg ggctga 46

Claims (8)

1.一种分枝杆菌，其分类命名为分枝杆菌JYC-07，于2017年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017325。
2.权利要求1所述的分枝杆菌在制备9α-羟基坎利酮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于具有以下步骤：
①种子培养：将分枝杆菌JYC-07接种于含碳源和氮源的种子培养基中，在100～500rpm的转速以及25～35℃的温度下进行种子培养12～60h，得到种子培养液；
②发酵培养：将步骤①得到的种子培养液接种于含有碳源、氮源以及无机盐的发酵培养基中，在100～500rpm的转速以及25～37℃的温度下进行发酵培养24～72h，得到发酵液；
③生物转化：将坎利酮用促溶剂溶解后加入到步骤②得到的发酵液中，在100～350rpm的转速以及25～35℃的温度下进行生物转化24～96h，得到含有9α-羟基坎利酮的转化液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：上述步骤①中所述种子培养基的初始pH值为6.0～8.0；所述种子培养基中的碳源选自葡萄糖、甘油、谷物淀粉、蔗糖中的一种或者两种以上，所述碳源的含量为1.0g/100mL～4.0g/100mL；所述种子培养基中的氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、磷酸铵、豆粕粉中的一种或者两种以上，所述氮源的含量为0.5g/100mL～5.0g/100mL。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：上述步骤②中所述发酵培养基的初始pH值为5.5～8.0；所述发酵培养基中的碳源选自葡萄糖、甘油、谷物淀粉、糖蜜中的一种或者两种以上，所述碳源的含量为0.5g/100mL～4.0g/100mL；所述发酵培养基中的氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、磷酸铵、尿素中的一种或者两种以上，所述氮源的含量为0.2g/100mL～4.0g/100mL；所述发酵培养基中的无机盐选自磷酸盐、镁盐、铁盐、钾盐中的一种或者两种以上，所述无机盐的含量为0.01g/100mL～0.5g/100mL。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：上述步骤②中所述种子培养液接种于发酵培养基的接种量为3～20%。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：上述步骤③中所述坎利酮的投料浓度为0.5g/100mL～1.8g/100mL。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：上述步骤③中所述促溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、豆油、环糊精、DMSO中的一种或者两种以上，所述促溶剂的投料浓度为0.5g/100mL～10g/100mL。
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CN113584098A (zh) * 2021-07-02 2021-11-02 佳尔科生物科技南通有限公司 一种11a-羟基坎利酮的精制方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN105838633A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海市农药研究所有限公司 一种偶发分枝杆菌及其应用
CN106119180A (zh) * 2016-07-01 2016-11-16 浙江工业大学 一种分枝杆菌重组基因工程菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687903A (zh) * 2007-07-04 2010-03-31 里克特格登有限公司 用于合成9α-羟基甾体化合物的工艺方法
CN105838633A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海市农药研究所有限公司 一种偶发分枝杆菌及其应用
CN106119180A (zh) * 2016-07-01 2016-11-16 浙江工业大学 一种分枝杆菌重组基因工程菌及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中强化表达;王贵娥等;《药物生物技术》;20161015;第23卷(第05期);第381-384页 *

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