CN108796021B

CN108796021B - 一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途

Info

Publication number: CN108796021B
Application number: CN201710291852.4A
Authority: CN
Inventors: 常尊学; 张鑫; 隋靓; 邹雷
Original assignee: Shenyang Botai Biopharmaceutical Co ltd; Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Botai Biopharmaceutical Co., Ltd.; Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2037-04-28
Also published as: CN108796021A

Abstract

本发明提供一种生产睾丸酮专用的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌，所述工程菌为将睾丸酮乙酸酯水解酶基因通过表达载体转入宿主菌中或插入到宿主菌的染色体上，获得可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。本发明还提供一种生产睾丸酮的方法。与现有技术相比，本发明的方法反应条件温和，并且在合成过程中，合成路线短，原料来源广，产率高且对环境污染小。产率可高达98％以上，能够有效率地制造作为医药和医药中间体在工业上有用的化合物‑睾丸酮。

Description

一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种工程菌以及使用该工程菌制备睾丸酮的用途。

背景技术

甾体激素(Steroid hormone)，又称类固醇激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，有极高的医药价值。在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质，1932年至1939年间，从腺体中获得雌酮(Estrone，1932年)、雌二醇(Estradiol，1932年)、睾丸酮(Testosterone，1935年)及皮质酮(Corticosterone，1939年)等的纯品结晶，之后又阐明了其化学结构，从此开创了甾体化学及甾体药物的新领域。随后，人们为扩大生产规模，降低成本，又以薯蓣皂苷(Diosgenin)为原料进行半合成生产甾体药物，使其成为医院临床使用不可缺少的药物。

微生物可以选择性地修饰或改造甾体化合物分子结构，这是通过微生物产生的酶催化进行的。1952年，美国普强药厂的生物化学家D.H.彼得森和微生物学家H.C.默里发现少根根霉能使孕酮的11碳位羟基化，生成11α-羟基孕酮，科学家们又相继发现细菌、真菌、放线菌中的某些种，可以使一定结构的甾体化合物在一定的部位上发生分子结构的改变。这种酶促反应具有严格的底物特异性，一般能使底物分子上1个或2个基团起反应。至今已发现微生物转化甾体化合物的反应类型几乎包括任何已知的微生物酶促反应和已经发现的化学反应，如氧化、还原、水解、缩合、异构化、新的碳碳键的形成以及杂基团的导入等。通常，一个酶促反应可以代替几个化学反应步骤，这就使甾体药物的合成工艺变得更有效并更经济。

睾丸酮(Testosterone)可简称睾酮(17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮)，结构式如式I所示，其是人体体内的基本激素，具有重要的药用价值。它能够加强肌肉的合成代谢，从而增加肌肉含量。此外，睾酮促进身体加速生产血红细胞，提升血液的给肌肉的供氧能力，达到加强肌肉力量及爆发力的效果。

目前有两种常用的睾丸酮制备方法：一是以薯蓣皂苷为原料经过十二步反应得到睾丸酮；二是以4AD(△^1,4-二烯雄甾酮-3,17-二酮)为原料，经过四步反应得到睾丸酮。上述两种方法均为化学方法，具有环境污染大，反应复杂等缺点。目前国内外也开始了对微生物转化制备睾丸酮的研究，但仍收效甚微。

因此，当前对用于生产高纯度的睾丸酮的方法仍存在需求。

发明内容

本发明的发明人发现，使用可以表达睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物，可以选择性地改造睾丸酮乙酸酯的结构。甾体化合物的微生物转化作用是利用微生物的酶对甾体底物进行特定的化学反应，基于此，本发明的发明人发现了一种使用睾丸酮乙酸酯为底物生产睾丸酮的方法。本发明的方法不仅能得到较高纯度的睾丸酮，而且进一步简化了生产工艺，并降低了生产成本。

本发明的目的是通过以下的方案实现的。

一方面，本发明提供了一种具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制备睾丸酮中的用途，其中所述微生物使用睾丸酮乙酸酯为底物。

优选地，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌。

优选地，所述微生物包含编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽的核苷酸序列；

更优选地，所述核苷酸序列具有或者为选自以下的核苷酸序列：

1)编码由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列任选地经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的多肽的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列；优选地为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％的同源性的核苷酸序列；

3)在严格条件下，与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

进一步优选地，所述核苷酸序列具有或者为编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

进一步优选地，所述核苷酸序列具有或者为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一种用于生产睾丸酮的工程菌，所述工程菌具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因；

优选地，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌；

优选地，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)；

优选地，所述工程菌的质粒载体选自pET26b(+)或pET28a(+)；

优选地，所述基因编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽；

进一步优选地，所述基因具有或者为选自以下的核苷酸序列：

1)编码由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列任选地经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的多肽的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性的核苷酸序列；更优选地为具有91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％的同源性的核苷酸序列；

3)在严格条件下，与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

优选地，所述基因具有或者为编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

优选地，所述基因具有或者为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

优选地，所述工程菌为将具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因通过原核表达载体转入大肠杆菌中或将具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的基因插入到宿主菌的染色体上，筛选获得的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。

更优选地，所述工程菌为通过将睾丸酮乙酸酯水解酶基因经过NdeI和HindIII双酶切处理后，插入到所述pET26b(+)的NdeI和HindIII酶切位点之间得到的重组表达载体转入所述大肠杆菌中，筛选获得的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。

优选地，所述睾丸酮乙酸酯水解酶基因是以分枝杆菌Mycobacterium neoaurumDSM 44074基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物，进行PCR扩增得到的。

再一方面，本发明提供一种生产睾丸酮的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将上述具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物或工程菌发酵至对数期，然后对其进行诱导表达；

2)以睾丸酮乙酸酯为底物，使用步骤1)得到的微生物或工程菌进行催化反应，得到睾丸酮。

优选地，在步骤1)中，诱导表达的诱导试剂为IPTG；更优选地，所述IPTG的终浓度为0.5-2mM，进一步优选地为1mM；

优选地，在步骤1)中，所述诱导表达的培养温度为15-37℃，更优选为22℃；

优选地，在步骤1)中，所述诱导表达的培养时间为12-36h，更优选为24小时；

优选地，在步骤1)中，所述发酵的培养温度为30-37℃，更优选为37℃；

优选地，在步骤1)中，所述发酵的培养时间为12-15d，更优选为13d；

优选地，在步骤2)中，所述催化反应的温度为20-37℃，更优选为25℃；

优选地，在步骤2)中，所述微生物或工程菌以完整细胞菌悬液、无细胞裂解液或者固定化细胞的形式进行催化反应；所述固定化细胞优选为固定化微球。

优选地，所述方法还包括将得到的睾丸酮进行分离纯化；更优选地，所述分离纯化是将反应得到睾丸酮的溶液用2倍体积乙酸乙酯萃取3次，浓缩结晶、过滤干燥得到睾丸酮。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

1)本发明使用睾丸酮乙酸酯作为底物，通过一步生物催化法制备睾丸酮，反应条件温和，并且在制备过程中，制备路线短，原料来源广，产率高且对环境污染小。

2)使用本发明的方法生产睾丸酮的产率可高达98％以上，能够有效率地制造作为医药和医药中间体在工业上高价值的化合物-睾丸酮。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为使用本发明的方法合成睾丸酮的反应过程的示意图；

图2为本发明的高效液相图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1睾丸酮乙酸酯水解酶基因的表达载体的构建

根据分枝杆菌Mycobacterium neoaurum DSM 44074基因全序列分析设计睾丸酮乙酸酯水解酶基因引物为F1，R1；

上游引物F1(NdeI)，如SEQ ID NO:3所示(其中，粗体下划线为酶切位点NdeI，前面的AAAAA为保护碱基)，和下游引物R1(HindIII)如SEQ ID NO:4所示(其中，粗体下划线为酶切位点HindIII，前面的AAAAA为保护碱基)；

SEQ ID NO:3 5’-AAAAA

AGCGATAAACTCGACCC；

SEQ ID NO:4 5’-AAAAA

ATCCGGCGGTGACGTGGCTC。

以分枝杆菌染色体DNA为模板，以F1，R1为引物，通过PCR扩增出睾丸酮乙酸酯水解酶基因序列。

睾丸酮乙酸酯水解酶基因PCR扩增体系：(睾丸酮乙酸酯水解酶基因PCR产物大小为972bp)

Q5Hot Start High-Fidelity 2×Master Mix(购自NEB)：25μl；

10μM F2：2.5μl；

10μM R2：2.5μl；

Mycobacterium neoaurum DSM 44074基因组DNA：2μl；

双蒸水：18μl。

睾丸酮乙酸酯水解酶基因PCR扩增程序：

98℃30s,(98℃10s,62℃20s,72℃30s),34个循环,72℃2min,4℃保存。

将得到的PCR产物经过NdeI和HindIII(购自NEB)双酶切处理，纯化后与同样酶切处理过的大肠杆菌表达载体pET26b(+)(购自Invitrogen)用T4连接酶(购自NEB)于16℃连接过夜。

大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备与转化：首先将大肠杆菌E.coli DH5α菌株在LB固体培养基平板上三区划线，37℃培养过夜。第二天挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，37℃培养过夜。将300μl菌液接种至30ml LB液体培养基中，37℃培养2-3h至对数生长期。将菌体转移至50ml离心管中，冰浴10-20min。在4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再收集一遍菌体。用10ml冰冷无菌CaCl₂溶液，悬浮细胞，冰浴30min后在4℃，4000rpm再离心10min。加入1ml冰冷无菌CaCl₂溶液重悬后即得大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。将酶连产物加至100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min后42℃热击90s，立即冰浴5min。每管热击后的感受态细胞中加入1ml LB液体培养基，37℃温育1h。离心12000rpm，1min，弃上清，涂布于LB卡那霉素(LBK，卡那霉素最终浓度为50μg/ml)平板上，晾干，37℃倒置培养16h。

使用卡那霉素抗性平板筛选克隆转化子，对睾丸酮乙酸酯水解酶基因重组质粒进行酶切鉴定和序列分析。筛选出正确的重组质粒，以上述同样转化条件再转化重组质粒至E.coli BL21(DE3)中，使用卡那霉素抗性平板筛选转化子，正确的转化子即为待表达菌株。

实施例2使用本发明的工程菌制备睾丸酮

2.1转化子的诱导表达

首先将如实施例1得到的睾丸酮乙酸酯水解酶大肠杆菌BL21(DE3)转化子进行诱导表达，诱导表达方法如下：首先从-80℃冰箱中挑取菌株，于37℃下，在3ml的LBK液体培养基(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl10.0g，加无离子水至1000ml，调节pH至7.0，蒸汽灭菌。卡那霉素最终浓度为50μg/ml)中活化一代，取培养12-16h的菌液通过1％接种量接种至的5ml LBK液体培养基中，培养至对数生长期时加诱导剂IPTG至终浓度1mM，22℃诱导过夜培养后，收集菌体。

2.2大肠杆菌无细胞裂解液转化方法

加入细胞裂解液，将诱导表达后收集的睾丸酮乙酸酯水解酶表达菌株细胞进行重悬，室温温育20min振荡混匀破碎，而后加至酶活反应体系中。

所述酶活反应体系如下：50mM Tris-HCl，20mM-200mM的睾丸酮乙酸酯，20％体积的睾丸酮乙酸酯水解酶表达菌株细胞裂解液，12.5mM NADPH，至反应完全。

2.3大肠杆菌静息细胞生物转化法

首先分别将睾丸酮乙酸酯水解酶大肠杆菌BL21(DE3)转化子进行诱导表达，诱导表达方法如下：取培养至12-16h的菌液通过1％接种量接种至带有卡那霉素的50ml LB培养基中，待生长至对数生长期时加诱导剂IPTG至终浓度1mM，22℃分别诱导过夜后收集菌体。室温下用磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀制成细胞悬浊液，向细胞悬浊液中加入底物睾丸酮乙酸酯至反应完全。

2.4生物转化提取方法及检测方法

将生物转化反应液1ml利用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，终止反应，反复萃取3次后，合并有机相，烘干溶剂，用200μl N,N-二甲基甲酰胺(DMF)复溶，高效液相验证结果。高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX SB C18(5μm,4.6×150mm)，色谱条件采用梯度洗脱，水为A相，甲醇为B相，流速为1.0ml/min。B相浓度0-15.0min为30-95％，15.0-20.0min为95％，平衡时间5min。最终HPLC测得使用本发明的方法生产睾丸酮，产率高达98％以上。结果如图1所示。

本实验设立三次平行实验及空白对照实验，最终得到数据采用峰面积归一化法计算出睾丸酮的产率公式如下：

睾丸酮产率(％)＝睾丸酮峰面积/总峰面积*100％

即睾丸酮的产率可达到98％以上。

序列表

<110> 沈阳博泰生物制药有限公司

沈阳药科大学

<120> 一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途

<130> DIC16110086

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 1

atgagcgata aactcgaccc gcagatcgcc gccatgatcg aagcgctgga ctccggattc 60

ccgccggtac acaccatgac cggtgatcag gcccgcgcgg cgatccgctc gaggatggtg 120

gcggtgaccg atcccgagcc ggtcgcggcg gtggaggacc gtgagatcgc gggaccgaac 180

ggtccggtga ccgtgcgcat ctaccggccc gaagccgcgg acggcacagg cctaccgacg 240

ctggtctatg cccacggtgg cggctgggtg ttctgcgacc tggacagcca cgacgggctg 300

tgccgggact tcgcaaatcg cctgcccgcc gtggttgttt cggtgcacta tcggcgcgcg 360

gccgaagagg gccagtggcc tgcggcggcc gaggacgtct acgccgcgac cgtctgggcc 420

gccgagaaca tcaccgcgct gggcgacgat ccggatgtcc tgctggtcgg cggcgacagc 480

gccggtggga acctcgcggc ggtcaccgcc ctgatggcac gcgatcgcag cggtccccga 540

ctggccggcc agctgctgtt gtacccggtc atcgccgccg acttcgacac cccgtcctac 600

cgcgagttcg gtcacgggta ctacaacccg cttcccgctc tgcggtggta ttgggatcag 660

tatgtgccca accctgccga ccggaccgat ccgtacgcct cgccactgca cgccgacgat 720

ctgtcgggtc tgccgccgac ggttgctgtg gtggccgggc acgatccgct gcgagacgag 780

ggtatggcct acgccgaggc cctgcgccgg tcgggagttc cggtggtgca gcgctatttc 840

gagggcggtg tgcacggttt catgaccatg ccgagcctgg acctctgtga gaaggcccgc 900

gcccaggcgt gtgcctacct caccggcatc atcaacggtc aggtcaacac atgagccacg 960

tcaccgccgg at 972

<210> 2

<211> 317

<212> PRT

<213> Mycobacterium neoaurum

<400> 2

Met Ser Asp Lys Leu Asp Pro Gln Ile Ala Ala Met Ile Glu Ala Leu

1 5 10 15

Asp Ser Gly Phe Pro Pro Val His Thr Met Thr Gly Asp Gln Ala Arg

20 25 30

Ala Ala Ile Arg Ser Arg Met Val Ala Val Thr Asp Pro Glu Pro Val

35 40 45

Ala Ala Val Glu Asp Arg Glu Ile Ala Gly Pro Asn Gly Pro Val Thr

50 55 60

Val Arg Ile Tyr Arg Pro Glu Ala Ala Asp Gly Thr Gly Leu Pro Thr

65 70 75 80

Leu Val Tyr Ala His Gly Gly Gly Trp Val Phe Cys Asp Leu Asp Ser

85 90 95

His Asp Gly Leu Cys Arg Asp Phe Ala Asn Arg Leu Pro Ala Val Val

100 105 110

Val Ser Val His Tyr Arg Arg Ala Ala Glu Glu Gly Gln Trp Pro Ala

115 120 125

Ala Ala Glu Asp Val Tyr Ala Ala Thr Val Trp Ala Ala Glu Asn Ile

130 135 140

Thr Ala Leu Gly Asp Asp Pro Asp Val Leu Leu Val Gly Gly Asp Ser

145 150 155 160

Ala Gly Gly Asn Leu Ala Ala Val Thr Ala Leu Met Ala Arg Asp Arg

165 170 175

Ser Gly Pro Arg Leu Ala Gly Gln Leu Leu Leu Tyr Pro Val Ile Ala

180 185 190

Ala Asp Phe Asp Thr Pro Ser Tyr Arg Glu Phe Gly His Gly Tyr Tyr

195 200 205

Asn Pro Leu Pro Ala Leu Arg Trp Tyr Trp Asp Gln Tyr Val Pro Asn

210 215 220

Pro Ala Asp Arg Thr Asp Pro Tyr Ala Ser Pro Leu His Ala Asp Asp

225 230 235 240

Leu Ser Gly Leu Pro Pro Thr Val Ala Val Val Ala Gly His Asp Pro

245 250 255

Leu Arg Asp Glu Gly Met Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Arg Arg Ser Gly

260 265 270

Val Pro Val Val Gln Arg Tyr Phe Glu Gly Gly Val His Gly Phe Met

275 280 285

Thr Met Pro Ser Leu Asp Leu Cys Glu Lys Ala Arg Ala Gln Ala Cys

290 295 300

Ala Tyr Leu Thr Gly Ile Ile Asn Gly Gln Val Asn Thr

305 310 315

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 睾丸酮乙酸酯水解酶基因引物F1

<400> 3

aaaaacatat gagcgataaa ctcgaccc 28

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 睾丸酮乙酸酯水解酶基因引物R1

<400> 4

aaaaaaagct tatccggcgg tgacgtggct c 31

Claims

1.一种具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制备睾丸酮中的用途，其中，所述微生物使用睾丸酮乙酸酯为底物；并且所述睾丸酮乙酸酯水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述睾丸酮乙酸酯水解酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种用于生产睾丸酮的工程菌，所述工程菌具有编码睾丸酮乙酸酯水解酶的基因；其中，所述睾丸酮乙酸酯水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌。

6.如权利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

7.如权利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌的质粒载体选自pET26b(+)或pET28a(+)。

8.如权利要求4所述的工程菌，其中，所述睾丸酮乙酸酯水解酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

9.如权利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌为将编码睾丸酮乙酸酯水解酶的基因通过原核表达载体转入大肠杆菌中或将编码睾丸酮乙酸酯水解酶的基因插入到宿主菌的染色体上，筛选获得的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。

10.如权利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌为通过将编码睾丸酮乙酸酯水解酶基因经过Nde I和Hind III双酶切处理后，插入到pET26b(+)的Nde I和Hind III酶切位点之间得到的重组表达载体转入大肠杆菌中，筛选获得的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。

11.一种生产睾丸酮的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将如权利要求1至3中任一项所述的用途中的微生物或如权利要求4至10中任一项所述的工程菌发酵至对数期，然后对其进行诱导表达；

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，诱导表达的诱导试剂为IPTG。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述IPTG的终浓度为0.5-2mM。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述IPTG的终浓度为1mM。

15.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述诱导表达的培养温度为15-37℃。

16.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述诱导表达的培养温度为22℃。

17.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述诱导表达的培养时间为12-36小时。

18.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述诱导表达的培养时间为24小时。

19.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述发酵的培养温度为30-37℃。

20.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述发酵的培养温度为37℃。

21.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述发酵的培养时间为12-15天。

22.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤1)中，当所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌时，所述发酵的培养时间为13天。

23.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤2)中，所述催化反应的温度为20-37℃。

24.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤2)中，所述催化反应的温度为25℃。

25.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤2)中，所述微生物或工程菌以完整细胞菌悬液、无细胞裂解液或者固定化细胞的形式进行催化反应。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，在步骤2)中，所述固定化细胞为固定化微球。

27.根据权利要求11-26中任一项所述的方法，其中，还包括将得到的睾丸酮进行分离纯化的步骤。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述分离纯化是将反应得到睾丸酮的溶液用2倍体积乙酸乙酯萃取3次，浓缩结晶、过滤干燥得到睾丸酮。