CN110713941A - 高表达细胞色素p450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

高表达细胞色素p450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与其在以坎利酮为底物发酵生产11α‑羟基‑坎利酮中的应用。所述赭曲霉菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019616，其重组片段包括细胞色素P450单加氧酶编码基因及其上、下游DNA序列，启动子，终止子和抗生素抗性基因；该基因片段与赭曲霉原始菌株MF018染色体中细胞色素P450单加氧酶基因发生同源重组。本发明将构建的高表达细胞色素P450单加氧酶基因与赭曲霉原始菌株MF018染色体上的细胞色素P450单加氧酶基因发生双交换得到。本发明能够实现发酵过程中生产11α‑羟基‑坎利酮的有效积累。

Description

高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株MF010及其构建 方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
甾体化合物又称为类固醇化合物，是一类以环戊烷多氢菲为母核的化合物的 总称。据报道，甾体化合物具有广泛的药理活性，在抗炎、抗肿瘤、调节性功能 及生育控制等方面有着极其重要的作用。研究表明，天然的甾体化合物往往药理 活性较低，而在甾体化合物的特异位点上引入羟基可以显著提高其药理活性与生 物学活性。甾体化合物结构复杂且含有多个非对称中心，传统的化学合成很难在 甾体骨架的特定位点引入羟基。微生物转化与化学合成相比有着特异性强、效率 高、污染低等优点，已广泛应用于甾体药物的工业化生产。工业上重要的微生物 甾体羟基化位点有C11α、C11β、C9α、C16α等，其中C11α、C11β羟基化 是最重要的微生物甾体羟化反应，其产物广泛用于甾体激素类心血管药物生产，如11α-羟基-坎利酮。11α-羟基-坎利酮是坎利酮羟基化反应后形成的甾体类衍 生物，是临床治疗心血管疾病药物依普利酮的关键医药中间体。
细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)单加氧酶系统具有强大的催化多功 能性，在许多内源性化合物(如类固醇，胆汁酸，脂肪酸，前列腺素，白三烯和 外来化学物质)的氧化、过氧化和还原代谢中起重要作用。据报道丝状真菌甾体 羟化酶属于细胞色素P450单加氧酶，它们主要结合在细胞内质网膜上，通过在 甾体骨架特定位点引入氧原子将一系列亲脂性的甾体化合物转化为相对亲水的 衍生物。
目前，工业上用于甾体11α-羟基反应的菌种主要有黑根霉(Rhizopusnigricans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和赭曲霉(Aspergillus ochraceus)等。 据报道，赭曲霉主要用于转化环氧黄体酮，进行甾体类药物的11α-羟基化反应， 如制备心血管药物11α-羟基-坎利酮。但由于赭曲霉对不同甾体底物的转化特异 性差异较大，且转化率低，其应用范围受到限制。提高赭曲霉对甾体类药物的催 化效率需从发酵条件优化和菌株改造两个方面进行。目前为止，有关赭曲霉催化 甾体类药物发酵条件优化的研究已有不少，但对赭曲霉菌株的定向改造报道不多 见，而后者才是提高甾体催化效率的关键和技术难点。
目前关于11α羟化酶基因克隆表达及甾体类药物的11α-羟基化反应研究大 多选择酵母表达系统。但有报道显示，真菌甾体羟化酶催化活性所需的电子由 NAD(P)H–细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 Reductase，CPR)提供，而酵 母等表达系统无法高效完成该项工作。此外，密码子偏好性等影响因素也限制了 11α-羟化酶的异源表达效率。选用赭曲霉本身作为表达系统则能有效地解决以 上缺陷。赭曲霉真菌生长能力强，能在简单、廉价的培养基中生长，在表达和分 泌蛋白方面，同样具有明显的优势。Yang等人以赭曲霉自身为宿主菌，构建了 过表达类固醇C11α-羟化酶的重组菌株，与野生菌相比，可明显缩短转化时间， 在不添加任何有机溶剂或者表面活性剂的条件下，小于5g/L的16α,17α-环氧 黄体酮转化率能达到75％左右。但该结果与高产赭曲霉菌株相比，在转化率上还 有一定差距，且发酵过程中需添加抗生素也在一定程度上限制了其在工业化生产 上的广泛应用。因此，通过重组技术，将赭曲霉来源的高表达细胞色素P450单 加氧酶整合于赭曲霉染色体上，使其高效催化甾体类药物的11α-羟基化可以较 好克服上述瓶颈问题，极具工业应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何通过基因工程手段对赭曲霉细胞色素 P450单加氧酶进行定点改造，从而获得一种高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲 霉菌株并应用于11α-羟基-坎利酮的生产。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高表达细胞色素P450单加氧酶 赭曲霉(Aspergillus ochraceus)菌株(MF010)，其特征在于，重组片段包括细 胞色素P450单加氧酶编码基因及其上、下游DNA序列，启动子，终止子和抗 生素抗性基因；该基因片段与赭曲霉原始菌株MF018(该菌株现保藏于中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年4月5日，保藏编号为CCTCC NO：M2019186)染色体中细胞色素P450单加氧酶基因发生同源重组，从而提 高细胞色素P450单加氧酶表达量，进而提高以坎利酮为底物发酵生产11α-羟基 -坎利酮效率。该高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株MF010(分类命名： 赭曲霉MF010，拉丁文名称：Aspergillus ochraceus MF010)现保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期 为2019年8月8日，保藏编号为CCTCC NO：M2019616。
本发明还提供了一种上述高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建 方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：克隆扩增赭曲霉细胞色素P450单加氧酶基因上、下游DNA序列；
步骤2)：克隆启动子序列；
步骤3)：克隆赭曲霉细胞色素P450单加氧酶编码基因；
步骤4)：克隆选择性标记基因；
步骤5)：利用巢式PCR依次构建赭曲霉细胞色素P450单加氧酶上游DNA 序列、启动子序列、赭曲霉细胞色素P450单加氧酶编码基因、启动子序列、选 择性标记基因和赭曲霉细胞色素P450单加氧酶下游DNA序列融合基因，并将 融合基因插入质粒构建重组质粒；
步骤6)：制备赭曲霉MF018原生质体细胞；
步骤7)：步骤5)构建的重组质粒转化赭曲霉MF018原生质体；
步骤8)：培养和筛选转化后的赭曲霉阳性转化子；
步骤9)：赭曲霉阳性转化子进行基因水平验证，获得同源重组菌株。
优选地，所述步骤2)中启动的子序列为glaA、tef1、Tr、gpdA。
优选地，所述步骤1)-5)中所用的质粒包括pSilent-Dual1、pBC-Hygro、 pAg1-H3和pMD18-T。
优选地，所述步骤1)-5)中筛选大肠杆菌转化子所用抗性标记为氨苄青霉 素，浓度为10-60μg/mL。
优选地，所述步骤8)中筛选赭曲霉阳性转化子所用的抗性标记为博来霉素 或潮霉素，其浓度为20-150μg/mL。
优选地，所述步骤9)具体为：复筛赭曲霉阳性转化子；提取赭曲霉阳性转 化子基因组DNA；依据赭曲霉染色体上融合基因上、下游DNA序列设计引物； 利用PCR扩增验证是否发生同源重组。
本发明还提供了一种采用上述高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的 构建方法构建的重组质粒或重组菌或由该重组菌表达的细胞色素P450单加氧 酶。
本发明还提供了一种利用上述高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株在 以坎利酮为底物发酵生产11α-羟基-坎利酮中的应用，其特征在于，在PDA斜面 培养基中划取所述高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的孢子接种于种子 培养基中，20-30℃、150-250rpm条件下培养15-20h；再按照发酵培养基质量2-5％ 的接种量转接至发酵培养基中，20-30℃、150-250rpm条件下培养15-20h后，添 加10-30g/L坎利酮，调整转速至200-250rpm进行发酵培养。
优选地，所述PDA培养基中含有：PDA 46g/L，酵母提取物2g/L，琼脂粉 10g/L，pH值为自然值；所述种子培养基中含有：葡萄糖5-10g/L，可溶性淀粉 2-5g/L，玉米浆15-30g/L，蛋白胨5-10g/L，磷酸二氢铵0.5-2.0g/L，氯化镁1-3g/L， pH值为6.0-6.5；所述发酵培养基中含有：葡萄糖10-30g/L，可溶性淀粉5-20g/L， 玉米浆10-30g/L，蛋白胨5-20g/L，磷酸二氢铵0.5-2.0g/L，氯化镁1-3g/L，pH 值为自然值。
本发明利用pSilent-Dual1、pBC-Hygro、pAg1-H3和pMD18-T等质粒构建 赭曲霉细胞色素P450单加氧酶上、下游DNA序列，启动子序列，赭曲霉细胞 色素P450单加氧酶编码基因，选择性标记基因及其融合基因重组质粒。
本发明优点在于，通过同源重组获得高表达细胞色素P450单加氧酶的赭曲 霉菌株。在发酵培养中，该菌过表达细胞色素P450单加氧酶催化坎利酮生成11 α-羟基-坎利酮；无需添加抗生素及诱导剂，即可有效实现目的产物11α-羟基- 坎利酮的积累，从而为依普利酮降压药的产业化奠定了基础。
附图说明
图1为融合基因构建示意图；
图2为插入融合基因的重组质粒图谱；
图3为同源重组赭曲霉菌株PCR验证结果；泳道2、3、4、6为4株阳性转 化子基因组PCR扩增产物；泳道1、5为原始菌株基因组PCR产物；泳道7为 DNA Marker；
图4为11α-羟基-坎利酮标准品的HPLC分析图；
图5为高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株转化主产物的HPLC分析 图；
图6为高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株MF010和原始赭曲霉菌株 MF018底物转化率随时间变化关系。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
1.菌株和质粒
赭曲霉菌株MF018来自于本实验室收藏，该菌种已保藏于中国典型培养物 保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年4月5日，保藏编号为CCTCC NO： M2019186。
质粒pMD18-T simple Vector购于TakaRa公司，质粒pSilent-Dual1和pAg1-H3 购于淼灵质粒平台，质粒pBC-Hygro购于丰晖生物。
2.实施例中所用引物见表1。
表1
Figure BDA0002242781400000051
Figure BDA0002242781400000061
实施例1：重组质粒pB-UTPHD的构建
根据本实验室分离得到的一株赭曲霉的基因组测序结果，预测细胞色素 P450单加氧酶编码基因，确定该基因上下游各1000bp的DNA序列。通过抗性 筛选，确定抗生素种类及抗生素添加量。
(1)上下游同源臂重组质粒pMD18-Up和pMD18-Down的构建
以原始赭曲霉菌株MF018基因组DNA为模板，以引物F-Up和R-Up进行 PCR扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游同源臂片段，将1011bp的PCR产物 进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致；以引物F-Down和R-Down进 行PCR扩增细胞色素P450单加氧酶基因下游同源臂片段，将610bp的PCR产 物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致。采用胶回收试剂盒(生工货 号：B518131-0050)分别胶回收上述目的基因片段(SEQ ID NO：20和SEQID NO:21)，按照操作说明进行TA克隆，分别将上述的基因片段与质粒pMD18-T 连接起来，分别得到质粒pMD18-Up和pMD18-Down。菌落PCR验证结果与预 期一致，即质粒pMD18-Up和pMD18-Down构建成功。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000071
上述PCR程序见表2。
表2
Figure BDA0002242781400000072
(2)启动子的克隆和重组质粒pMD18-Tr的构建
以质粒pSilent-Dual1为模板，以引物F-Tr和R-Tr进行PCR扩增Tr基因， 将359bp的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致。采用胶回 收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收上述目的基因片段(SEQ ID NO： 22)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的基因片段与质粒pMD18-T连接起来， 得到质粒pMD18-Tr。菌落PCR验证结果与预期一致，即质粒pMD18-Tr构建成 功。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000073
Figure BDA0002242781400000081
上述PCR程序见表3。
表3
Figure BDA0002242781400000082
(3)细胞色素P450单加氧酶编码基因克隆及重组质粒pMD18-P450的构建
以原始赭曲霉MF018菌株基因组DNA为模板，以引物F-P450和R-P450 进行PCR扩增细胞色素P450基因，将1834bp的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶 电泳，片段大小与预期一致。采用胶回收试剂盒(生工：B518131-0050)胶回收 上述目的基因片段(SEQ ID NO：23)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的 基因片段与质粒pMD18-T连接起来，得到质粒pMD18-P450。菌落PCR验证结 果与预期一致，即质粒pMD18-P450构建成功。
上述反应体系为：
上述PCR程序见表4。
表4
(4)潮霉素基因的克隆及质粒pMD18-Hyg的构建
以质粒pAg1-H3为模板，以引物F-Tr和R-Hyg进行PCR扩增Hyg基因， 将1908bp的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致。采用胶 回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收上述目的基因片段(SEQ ID NO： 24)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的基因片段与质粒pMD18-T连接起来， 得到质粒pMD18-Hyg。菌落PCR验证结果与预期一致，即质粒pMD18-Hyg构 建成功。
上述反应体系为：
上述PCR程序见表5。
表5
Figure BDA0002242781400000101
(5)上游同源臂、启动子融合片段重组质粒pMD18-UT的构建
以质粒pMD18-Up为模板，以引物F-Up和R-link1进行PCR扩增基因片段 U-L1R；以质粒pMD18-Tr为模板，以引物F-link1和R-Tr进行PCR扩增基因片 段T-L1F。分别采用PCR产物纯化试剂盒(生工货号：B518141-0050)将PCR 产物进行纯化，纯化后的基因片段用于无引物PCR反应。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000102
上述无引物PCR反应程序见表6。
表6
Figure BDA0002242781400000103
Figure BDA0002242781400000111
10个循环后，取出反应管加入引物F-Up和R-Tr，按照表6所示的反应程序 再进行20个循环。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致 (1370bp)。采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收上述目的基 因片段(SEQ ID NO：25)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的基因片段与 质粒pMD18-T连接起来，得到质粒pMD18-UT。菌落PCR验证结果与预期一致， 即质粒pMD18-UT构建成功。
(6)上游同源臂、启动子、细胞色素P450单加氧酶编码基因融合片段重组 质粒pMD18-UTP的构建
以质粒pMD18-UT为模板，以引物F-Up和R-link2进行PCR扩增基因片段 UT-L2R；以质粒pMD18-P450为模板，以引物F-link2和R-P450进行PCR扩增 基因片段P-L2F。分别采用PCR产物纯化试剂盒(生工货号：B518141-0050) 将PCR产物进行纯化，纯化后的基因片段用于无引物PCR反应。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000112
上述无引物PCR反应程序见表7。
表7
10个循环后，取出反应管加入引物F-Up和R-P450，按照表7所示的反应 程序再进行20个循环。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期 一致(3204bp)。采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收上述目 的基因片段(SEQ ID NO：26)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的基因片 段与质粒pMD18-T连接起来，得到质粒pMD18-UTP。菌落PCR验证结果与预 期一致，即质粒pMD18-UTP构建成功。
(7)潮霉素抗性基因、下游同源臂融合片段重组质粒pMD18-HD的构建
以质粒pMD18-Hyg为模板，以引物F-Tr和R-link3进行PCR扩增基因片段 H-L3R；以质粒pMD18-Down为模板，以引物F-link3和R-Down进行PCR扩增 基因片段D-L3F。分别采用PCR产物纯化试剂盒(生工货号：B518141-0050) 将PCR产物进行纯化，纯化后的基因片段用于无引物PCR反应。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000122
上述无引物PCR反应程序见表8。
表8
Figure BDA0002242781400000131
10个循环后，取出反应管加入引物F-Tr和R-Down，按照表8所示的反应 程序再进行20个循环。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期 一致(2518bp)。采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收上述目 的基因片段(SEQ ID NO：27)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的基因片 段与质粒pMD18-T连接起来，得到质粒pMD18-HD。菌落PCR验证结果与预期 一致，即质粒pMD18-HD构建成功。
(8)完整融合片段重组质粒pMD18-UTPHD的构建
以质粒pMD18-UTP为模板，以引物F-Su和R-link4进行PCR扩增基因片 段UTP-L3R；以质粒pMD18-HD为模板，以引物F-link4和R-Ad进行PCR扩 增基因片段HD-L4F。分别采用PCR产物纯化试剂盒(生工货号：B518141-0050) 将PCR产物进行纯化，纯化后的基因片段用于无引物PCR反应。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000132
上述无引物PCR反应程序见表9。
表9
Figure BDA0002242781400000133
Figure BDA0002242781400000141
10个循环后，取出反应管加入引物F-Su和R-Ad，按照表9所示的反应程 序再进行20个循环。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一 致(5722bp)。采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收上述目的 基因片段(SEQ ID NO：28)，按照操作说明进行TA克隆，将上述的基因片段 与质粒pMD18-T连接起来，得到质粒pMD18-UTPHD。菌落PCR验证结果显示， 片段大小与预期一致，即质粒pMD18-UTPHD构建成功。
以上融合基因片段构建流程图见图1。
(9)重组表达载体pB-UTPHD的构建
限制性内切酶Aap I和Spe I双酶切质粒pMD18-UTPHD获得融合基因片段。 将该片段插入用上述限制性内切酶酶切的质粒pBC-hygro，得到重组质粒 pB-UTPHD(质粒图谱见图2)。
重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，20μg/mL氯霉素抗性条件下筛选阳性转 化子。分别用引物对F-Su/R-Tr、F-P450/R-P450、F-Tr/R-Hyg、F-Down/R-Ad通 过菌落PCR验证阳性转化子，结果表明各片段大小均与预期结果一致。即重组 表达载体pB-UTPHD构建成功。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000142
上述PCR程序见表10。
表10
实施例2：高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的获得
(1)重组质粒pB-UTPHD转化赭曲霉MF018
从大肠杆菌中提取重组质粒pB-UTPHD，通过CaCl2/PEG介导转入赭曲霉 MF018原生质体。原生质体经再生培养6-8h后涂布于含125μg/mL潮霉素抗性 的PDA平板上，28℃培养5-6d。挑取阳性单菌落进行复筛培养，培养条件同上。 将复筛后所得的阳性转化子进行基因水平的验证。
其中，原生质体制备操作如下：
挑取PDA平板上生长6-8d的原始赭曲霉菌株MF018于装有10mL生理盐 水的50mL离心管中，涡旋混匀，再将孢子液接入100mL种子培养基中，200rpm， 28℃摇瓶培养约19h，获得较好的种子液。将种子液接种于发酵液培养基中， 200rpm，28℃摇瓶培养17-18h，使赭曲霉处于生长对数期。无菌条件下收集菌 丝体，称取3种细胞壁裂解酶：0.1％蜗牛酶、0.1％纤维素酶和0.01％溶菌酶溶解 在10mL的1M山梨醇溶液中，用0.45μm的细菌滤器过滤酶液于30mL的摇瓶 中。将收集的菌丝体以1:10的比例加入混合酶液中轻轻摇匀，使得菌丝体均匀 分布在酶液中，置于摇床100rpm，28℃、摇瓶裂解3-4h，直至大多数孢子裂解 为原生质体。3层擦镜纸过滤酶解混合液，用1M山梨醇溶液冲洗滤渣2-3次。 收集滤液至1.5mL离心管中，4℃ 3000rpm离心10min。弃上清液留原生质体沉 淀，用500μL的山梨醇-Tris-CaCl2溶液(STC)重悬浮原生质体沉淀。于4℃、3000rpm，离心10min弃上清液，用400mL的STC溶液重悬浮原生质体沉淀。 血球计数板，将原生质体浓度调整在107/mL。4℃、3000rpm，离心2min，弃上 清液，用400μL的STC溶液重悬浮原生质体，逐滴加入100μL的山梨醇 -Tris-CaCl2-PEG4000溶液(SPTC)，冰上放置待用。
转化操作步骤如下：
将1mL的原生质体悬浮液、30μL的重组质粒和2.5μL的肝素钠(5mg/mL) 加入管中，轻轻混匀，冰上静置30min。逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，轻轻 混匀，在室温下静置20min。将混合液转入10mL的RM培养液中，室温静置 2h后28℃、100rpm培养6-8h左右。取400μL菌液涂布于125μg/mL的潮霉素抗 性PDA平板上，以普通PDA平板做对照，静置培养约5-6d。
实施例3：赭曲霉重组菌株的鉴定
挑取经潮霉素抗性平板复筛选所得的阳性转化子于种子培养基中，28℃培养18h，转接种子液至发酵培养基中，28℃培养24h。用OMEGA公司DNA提取试 剂盒(货号：D3390-00)提取的阳性转化子基因组DNA为模板。以原始菌株同 源臂上下游DNA序列设计引物F-Screen和R-Screen，通过PCR进行重组菌双 交换验证。以原始菌株MF018基因组DNA的PCR产物作为对照。若融合基因 UTPHD在原始菌株P450单加氧酶基因位置发生双交换，则可扩增获得6016bp 的基因片段(命名为Sc-UTPHD)(SEQ ID NO：29)；以原始菌株的基因组DNA为对照，用上述引物则扩增获得2465bp的基因片段(命名为Sc-upd)(SEQ ID NO： 30)。分别将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，PCR验证结果见图3。转化 子PCR扩增片段大小与预期的结果一致(6016bp)；对照组目的片段同样与预期 大小一致(3750bp)。测序结果显示该重组菌扩增片段与预期序列同源性高达 99.9％。综上，说明成功得到同源重组赭曲霉菌株。
上述反应体系为：
Figure BDA0002242781400000161
Figure BDA0002242781400000171
上述PCR程序见表11。
表11
Figure BDA0002242781400000172
实施例4：赭曲霉重组菌MF010的发酵及产物验证
将PDA斜面培养的赭曲霉重组菌株MF010孢子接种于种子摇瓶中，28℃， 180rpm培养18-24h。按照5％接种量将种子液接种于无菌发酵培养基中，于28℃、 180rpm恒温摇床中培养18h后加入坎利酮，使其终浓度为20g/L，于28℃、200rpm 继续发酵培养，12h间隔取样测定底物转化率。高效液相色谱(HPLC)测定坎 利酮和11α-羟基坎利酮含量，根据峰面积计算底物转化率。
样品处理及HPLC测定方法如下：样品用2倍体积乙酸乙酯进行萃取。取上 清液进行HPLC测定。流动相为80％的甲醇，20％的水，温度为30℃，流速为 0.8mL/min，进样量为10μL，恒定洗脱30min。测定时间分别为加入坎利酮后转 化12、24、36、48、60、72、84、96、108h。
结果如图4-6所示，在整个生物转化过程中，构建的重组菌转化率比原始菌 高。重组菌在不添加任何有机溶剂和表面活性剂的条件下，在72h时转化率已达 到92％左右，而原始菌96h才达到75％左右。重组菌的最高转化率比野生菌高 出16-17％，且转化时间缩短了20以上。以上结果表明重组菌与原始菌相比转化 率大大提高，且转化时间也同样显著缩短。
通过实施例可知，本发明构建的高表达P450单加氧酶菌株MF010具备高效 催化坎利酮生产11α-羟基-坎利酮的优点。
SEQUENCE LISTNG
上海应用技术大学
高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与应用
2019
30
PatentIn version ——
1
21
DNA
F-Up
1
GGTGATACAATGATTCGGAGA
2
23
DNA
R-Up
2
GATAATGAGCTGTCAGCTTGTGG
3
19
DNA
F-Down
3
ACTCTAACTGCCGATGGAG
4
23
DNA
R-Down
4
ATGCCCTTCTTCACTGGGCTTCT
5
18
DNA
F-Tr
5
CTGATATTGAAGGAGCAC
6
22
DNA
R-Tr
6
ATCGATGCTTGGGTAGAATAGG
7
23
DNA
F-P450
7
ATGCCCTTCTTCACTGGGCTTCT
8
20
DNA
R-P450
8
CTACACAGTTAAACTCGCCA
9
18
DNA
F-Tr
9
CTGATATTGAAGGAGCAC
10
20
DNA
R-Hyg
10
TAGTTCTAGAGCGGCCGCAA
11
35
DNA
F-Link1
11
GCTGACAGCTCATTATCCTGATATTGAAGGAGCAC
12
35
DNA
R-Link1
12
GTGCTCCTTCAATATCAGGATAATGAGCTGTCAGC
13
34
DNA
F-Link2
13
TCTACCCAAGCATCGATATGCCCTTCTTCACTGG
14
34
DNA
R-Link2
14
CCAGTGAAGAAGGGCATATCGATGCTTGGGTAGA
15
39
DNA
F-Link3
15
TTGCGGCCGCTCTAGAACTATAGGTCGAACACGAAGTCC
16
39
DNA
R-Link3
16
GGACTTCGTGTTCGACCTATAGTTCTAGAGCGGCCGCAA
17
37
DNA
F-Link4
17
GGCGAGTTTAACTGTGTAGCTGATATTGAAGGAGCAC
18
37
DNA
R-Link4
18
GTGCTCCTTCAATATCAGCTACACAGTTAAACTCGCC
19
27
DNA
F-Su
19
ACTAGTGGTGATACAATGATTCGGAGA
20
25
DNA
R-Ad
20
GGGCCCACTCTAACTGCCGATGGAG
21
20
DNA
F-Screen
21
CCAGTCAACCTTCTCGGTCG
22
19
DNA
R-Screen
19
GCTGGCAGAGTGCACTTCG
20
1011
DNA
Up序列
20 ggtgatacaatgattcggagattttgcctctatcagcgcgtcagatagatccaacgcccagcaaccacgtcgcgcaagttcactgatcgagcaatagtaaccaacagctcccactcacaagaacgaagcttctcattgatatcacttgctgtccttgctgtatagagggatttagcattgcatttaagtccggccggtgtaaataacggttacggaattaatcaatttgccattctgtacataccaccaaagaaaaagggattcaagctctgaaagccgcgagttatggcgagacccgagaaatatttacaccggacacagaatacacaaatcgtagtcgattttagagagcgggtcggtgttttctggtagccggatgccgtgaccacgttgagccatattttccgcaactacctcctgatatgctcgccccattcgacgtttaacatggcccaaacacagaacagcatggcaagattgctgacaggctaaattgcgatgtttcggaacctcgattgtgccggacgcgctgggacagatatgctggtgggcgtgatcgggagatatatcggggattcgcggtttcgggatcccagagatccccggaagatggttcaatctcagagataaagcgacgataacgacctgtttagccaaccgggatgaacgggcctgatttcccgaaataccgcttggggcttccgatggctttcatttcacacgctccttagtagcaatgctgatcgtcgtgccggacattcgggacgttcctgcagcgacatgccgggctcttacacgcaccagttggatgggcggatcaagtagtgttgaaggtcccgcaatgtcgggctcaggggtcgtctccgtggaagtttttacacttattatgccggagccgaaagattctgagtcgaggggttggggaacaacactataagacctacaaccacttggatttggtgaatttacacgggcattatcaaaacagccacaagctgacagctcattatc
21
610
DNA
Down序列
21
taggtcgaacacgaagtcctgatgaagtgttattggtcagtgggtgaagcaagtcgcagaaatgtgtaacaatttataagaataaaaaagtccgttctcgcatgttaaaggggtaactgtacgctgacgcctctggtatatggctctggtcaacggccacttttgcacaaagcattttcagtcccatacctcctcgaagcttggttaactcttgagtaattatttgtgaactgctaccatagaactgccatacgattaatatagtcaaaataataaaagctaataaatgataccttgctgggactcagcaaaagacgaccattggatgaccacaagctagaatactataggcaattccttacctacagctcccctcctatcattacccatctgtttcaggtttccttctgtcaatgtactcggctatgctacattttaaacacttaggaacatacggggaatttctttcggatgcaatcaacaattaccacgaatttaacaaagaatctatgagatgctaataatgccgtgacttctcgtagcgcaacaggtatttatcccttgctaggtgctcaccactagcatagtgccctccatcggcagttagagt
22
359
DNA
Tr序列
22
ctgatattgaaggagcacttttgggcttggctggagctagtggaggtcaacaatgaatgcctattttggtttagtcgtccaggcggtgagcacaaaatttgtgtcgtttgacaagatggttcatttaggcaactggtcagatcagccccacttgtagcagtagcggcggcgctcgaagtgtgactcttattagcagacaggaacgaggacattattatcatctgctgcttggtgcacgataacttggtgcgtttgtcaagcaaggtaagtgaacgacccggtcataccttcttaagttcgcccttcctccctttatttcagattcaatctgacttacctattctacccaagcatcgat
23
1834
DNA
P450序列
23
atgcccttcttcactgggcttctggcgatttaccatagtctcatactcgacaacctagtccaaaccctgagcaccattgtcgtattggcggcagcgtactggctcgcaacgctccagccgagcgaccttcctgagctgaatcccgccaaaccattcgagttcaccaatcgtcgtcgtgttcatgagtttgttgaaaatagtaagagcttgcttgctcgggggagggaattgcgcgggcacgagccgtacagactcatgtctgaatggggatccttgattgtcctgcccccagagtgcgccgacgagctgcgcaacgacccaagaatggactttgagacgcccaccaccgacgtaagtaggtcccagtaagccttttatgctggaaatagaggcttacaggagcgtggctgcaggactcccacggatatatccctggcttcgacgctctcaacgcagacccgaacctgactaaagtggtcaccaagtacctcacaaaagcattgagtaagcaatatgtgcataacagcatgagagatcacgatgattagagcgactgacgaacaatatgtccgcagacaagcttactgctccgatctcgcatgaagcgtccatcgccatgaaagcggtgctgggtgacgatccaggtatgatgcataaataacccaagagctcggcagcccgcgggtccttcctgtattagaagctgatctgctattttattctagattggcgtgagatctacccagccagagacttgctccagctcgtcgcccggatgtcgacaagagtgttccttggcgaggaaatgtgcaataaccaggattggatccaaacctcatcacaatacgcggcccttgccttcggtgtcggtgacaagattagaatatacccgagaatgatcagaccgatagtacattggttcatgccatcctgttgggagctgcgccgatcgctgcgacgctgcctacagattctcacgccgtacattcacaaacgcaagtccctgaaggggaccacggacgagcagggcaagccccttatgtttgatgattccatcgagtggttcgagcgagagctgggtcccaaccacgacgcggtcctgaagcaggtcacgctctccatagttgctatccacaccacgagtgacctactcttgcaggccatgagcgatctcgcgcagaacccgaaaatttcacaagcagtgcgcgaggaggtggtccgagtgctgagcaccgaggggctcagcaaggtctcgcttcacagtctcaagctcatggacagcgcgttgaaggaaagccagcgtctcaggcctacgcttctcggtatgtgatgtcccttcttttcttagtttctcacctctcgccatctccctgtccgcgtgctcacatgatatcaaggctcctttcgtcggcaggcaacgaatgacatcaagctgaagagcgggtttgtcataaagaaagggactagagtcgtgatcgacagcacccatatgtggaatcccgagtattacactgaccctctccagtacgacgggtaccgctacttcaacaagcggcagacacccggcgaggacaagaacgcgttgctcgtcagcacaagcgccaaccacatgggattcggtcacggcgttcacgcctgtcctggcagattcttcgcctccaacgagatcaagattgccttgtgtcatatcatcttaaattatgagtggcgtcttccagacggcttcaagccccagcctctcaacatcgggatgacttatctggcggatcccaataccaggatgctgatcaggccacgcaaggcggagatcgatatggcgagtttaactgtgtag
24
1908
DNA
Hyg序列
24
ctgatattgaaggagcactttttgggcttggctggagctagtggaggtcaacaatgaatgcctattttggtttagtcgtccaggcggtgagcacaaaatttgtgtcgtttgacaagatggttcatttaggcaactggtcagatcagccccacttgtagcagtagcggcggcgctcgaagtgtgactcttattagcagacaggaacgaggacattattatcatctgctgcttggtgcacgataacttggtgcgtttgtcaagcaaggtaagtgaacgacccggtcataccttcttaagttcgcccttcctccctttatttcagattcaatctgacttacctattctacccaagcatcgatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagagtagatgccgaccggatcgatccacttaacgttactgaaatcatcaaacagcttgacgaatctggatataagatcgttggtgtcgatgtcagctccggagttgagacaaatggtgttcaggatctcgataagatacgttcatttgtccaagcagcaaagagtgccttctagtgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacgcgtttcgggtttacctcttccagatacagctcatctgcaatgcattaatgcattggacctcgcaaccctagtacgcccttcaggctccggcgaagcagaagaatagcttagcagagtctattttcattttcgggagacgagatcaagcagatcaacggtcgtcaagagacctacgagactgaggaatccgctcttggctccacgcgactatatatttgtctctaattgtactttgacatgctcctcttctttactctgatagcttgactatgaaaattccgtcaccagcccctgggttgcggccgctctagaacta
25
1370
DNA
UT序列
25
ggtgatacaatgattcggagattttgcctctatcagcgcgtcagatagatccaacgcccagcaaccacgtcgcgcaagttcactgatcgagcaatagtaaccaacagctcccactcacaagaacgaagcttctcattgatatcacttgctgtccttgctgtatagagggatttagcattgcatttaagtccggccggtgtaaataacggttacggaattaatcaatttgccattctgtacataccaccaaagaaaaagggattcaagctctgaaagccgcgagttatggcgagacccgagaaatatttacaccggacacagaatacacaaatcgtagtcgattttagagagcgggtcggtgttttctggtagccggatgccgtgaccacgttgagccatattttccgcaactacctcctgatatgctcgccccattcgacgtttaacatggcccaaacacagaacagcatggcaagattgctgacaggctaaattgcgatgtttcggaacctcgattgtgccggacgcgctgggacagatatgctggtgggcgtgatcgggagatatatcggggattcgcggtttcgggatcccagagatccccggaagatggttcaatctcagagataaagcgacgataacgacctgtttagccaaccgggatgaacgggcctgatttcccgaaataccgcttggggcttccgatggctttcatttcacacgctccttagtagcaatgctgatcgtcgtgccggacattcgggacgttcctgcagcgacatgccgggctcttacacgcaccagttggatgggcggatcaagtagtgttgaaggtcccgcaatgtcgggctcaggggtcgtctccgtggaagtttttacacttattatgccggagccgaaagattctgagtcgaggggttggggaacaacactataagacctacaaccacttggatttggtgaatttacacgggcattatcaaaacagccacaagctgacagctcattatcctgatattgaaggagcacttttgggcttggctggagctagtggaggtcaacaatgaatgcctattttggtttagtcgtccaggcggtgagcacaaaatttgtgtcgtttgacaagatggttcatttaggcaactggtcagatcagccccacttgtagcagtagcggcggcgctcgaagtgtgactcttattagcagacaggaacgaggacattattatcatctgctgcttggtgcacgataacttggtgcgtttgtcaagcaaggtaagtgaacgacccggtcataccttcttaagttcgcccttcctccctttatttcagattcaatctgacttacctattctacccaagcatcgat
26
3204
DNA
UTP序列
26
ggtgatacaatgattcggagattttgcctctatcagcgcgtcagatagatccaacgcccagcaaccacgtcgcgcaagttcactgatcgagcaatagtaaccaacagctcccactcacaagaacgaagcttctcattgatatcacttgctgtccttgctgtatagagggatttagcattgcatttaagtccggccggtgtaaataacggttacggaattaatcaatttgccattctgtacataccaccaaagaaaaagggattcaagctctgaaagccgcgagttatggcgagacccgagaaatatttacaccggacacagaatacacaaatcgtagtcgattttagagagcgggtcggtgttttctggtagccggatgccgtgaccacgttgagccatattttccgcaactacctcctgatatgctcgccccattcgacgtttaacatggcccaaacacagaacagcatggcaagattgctgacaggctaaattgcgatgtttcggaacctcgattgtgccggacgcgctgggacagatatgctggtgggcgtgatcgggagatatatcggggattcgcggtttcgggatcccagagatccccggaagatggttcaatctcagagataaagcgacgataacgacctgtttagccaaccgggatgaacgggcctgatttcccgaaataccgcttggggcttccgatggctttcatttcacacgctccttagtagcaatgctgatcgtcgtgccggacattcgggacgttcctgcagcgacatgccgggctcttacacgcaccagttggatgggcggatcaagtagtgttgaaggtcccgcaatgtcgggctcaggggtcgtctccgtggaagtttttacacttattatgccggagccgaaagattctgagtcgaggggttggggaacaacactataagacctacaaccacttggatttggtgaatttacacgggcattatcaaaacagccacaagctgacagctcattatcctgatattgaaggagcacttttgggcttggctggagctagtggaggtcaacaatgaatgcctattttggtttagtcgtccaggcggtgagcacaaaatttgtgtcgtttgacaagatggttcatttaggcaactggtcagatcagccccacttgtagcagtagcggcggcgctcgaagtgtgactcttattagcagacaggaacgaggacattattatcatctgctgcttggtgcacgataacttggtgcgtttgtcaagcaaggtaagtgaacgacccggtcataccttcttaagttcgcccttcctccctttatttcagattcaatctgacttacctattctacccaagcatcgatatgcccttcttcactgggcttctggcgatttaccatagtctcatactcgacaacctagtccaaaccctgagcaccattgtcgtattggcggcagcgtactggctcgcaacgctccagccgagcgaccttcctgagctgaatcccgccaaaccattcgagttcaccaatcgtcgtcgtgttcatgagtttgttgaaaatagtaagagcttgcttgctcgggggagggaattgcgcgggcacgagccgtacagactcatgtctgaatggggatccttgattgtcctgcccccagagtgcgccgacgagctgcgcaacgacccaagaatggactttgagacgcccaccaccgacgtaagtaggtcccagtaagccttttatgctggaaatagaggcttacaggagcgtggctgcaggactcccacggatatatccctggcttcgacgctctcaacgcagacccgaacctgactaaagtggtcaccaagtacctcacaaaagcattgagtaagcaatatgtgcataacagcatgagagatcacgatgattagagcgactgacgaacaatatgtccgcagacaagcttactgctccgatctcgcatgaagcgtccatcgccatgaaagcggtgctgggtgacgatccaggtatgatgcataaataacccaagagctcggcagcccgcgggtccttcctgtattagaagctgatctgctattttattctagattggcgtgagatctacccagccagagacttgctccagctcgtcgcccggatgtcgacaagagtgttccttggcgaggaaatgtgcaataaccaggattggatccaaacctcatcacaatacgcggcccttgccttcggtgtcggtgacaagattagaatatacccgagaatgatcagaccgatagtacattggttcatgccatcctgttgggagctgcgccgatcgctgcgacgctgcctacagattctcacgccgtacattcacaaacgcaagtccctgaaggggaccacggacgagcagggcaagccccttatgtttgatgattccatcgagtggttcgagcgagagctgggtcccaaccacgacgcggtcctgaagcaggtcacgctctccatagttgctatccacaccacgagtgacctactcttgcaggccatgagcgatctcgcgcagaacccgaaaatttcacaagcagtgcgcgaggaggtggtccgagtgctgagcaccgaggggctcagcaaggtctcgcttcacagtctcaagctcatggacagcgcgttgaaggaaagccagcgtctcaggcctacgcttctcggtatgtgatgtcccttcttttcttagtttctcacctctcgccatctccctgtccgcgtgctcacatgatatcaaggctcctttcgtcggcaggcaacgaatgacatcaagctgaagagcgggtttgtcataaagaaagggactagagtcgtgatcgacagcacccatatgtggaatcccgagtattacactgaccctctccagtacgacgggtaccgctacttcaacaagcggcagacacccggcgaggacaagaacgcgttgctcgtcagcacaagcgccaaccacatgggattcggtcacggcgttcacgcctgtcctggcagattcttcgcctccaacgagatcaagattgccttgtgtcatatcatcttaaattatgagtggcgtcttccagacggcttcaagccccagcctctcaacatcgggatgacttatctggcggatcccaataccaggatgctgatcaggccacgcaaggcggagatcgatatggcgagtttaactgtgtag
27
2518
DNA
HD序列
27
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Claims (10)

1.一种高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株，其特征在于，重组片段包括细胞色素P450单加氧酶编码基因及其上、下游DNA序列，启动子，终止子和抗生素抗性基因；该基因片段与赭曲霉原始菌株MF018染色体中细胞色素P450单加氧酶基因发生同源重组；该赭曲霉突变菌株MF010现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年8月8日，保藏编号为CCTCC NO：M2019616。
2.权利要求1所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：克隆扩增赭曲霉细胞色素P450单加氧酶基因上、下游DNA序列；
步骤2)：克隆启动子序列；
步骤3)：克隆赭曲霉细胞色素P450单加氧酶编码基因；
步骤4)：克隆选择性标记基因；
步骤5)：利用巢式PCR依次构建赭曲霉细胞色素P450单加氧酶上游DNA序列、启动子序列、赭曲霉细胞色素P450单加氧酶编码基因、启动子序列、选择性标记基因和赭曲霉细胞色素P450单加氧酶下游DNA序列融合基因，并将融合基因插入质粒构建重组质粒；
步骤6)：制备赭曲霉MF018原生质体细胞；
步骤7)：步骤5)构建的重组质粒转化赭曲霉MF018原生质体；
步骤8)：培养和筛选转化后的赭曲霉阳性转化子；
步骤9)：赭曲霉阳性转化子进行基因水平验证，获得同源重组菌株。
3.如权利要求2所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中启动的子序列为glaA、tef1、Tr、gpdA。
4.如权利要求2所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)-5)中所用的质粒包括pSilent-Dual1、pBC-Hygro、pAg1-H3和pMD18-T。
5.如权利要求2所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤1)-5)中筛选大肠杆菌转化子所用抗性标记为氨苄，浓度为10-60μg/mL。
6.如权利要求2所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤8)中筛选赭曲霉阳性转化子所用的抗性标记为博来霉素或潮霉素，其浓度为20-150μg/mL。
7.如权利要求2所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤9)具体为：复筛赭曲霉阳性转化子；提取赭曲霉阳性转化子基因组DNA；依据赭曲霉染色体上融合基因上、下游DNA序列设计引物；利用PCR扩增验证是否发生同源重组。
8.一种采用权利要求2-7任意一项所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的构建方法构建的重组质粒或重组菌或由该重组菌表达的细胞色素P450单加氧酶。
9.一种利用权利要求1所述的高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株在以坎利酮为底物发酵生产11α-羟基-坎利酮中的应用，其特征在于，在PDA斜面培养基中划取所述高表达细胞色素P450单加氧酶赭曲霉菌株的孢子接种于种子培养基中，20-30℃、150-250rpm条件下培养15-20h；再按照发酵培养基质量2-5％的接种量转接至发酵培养基中，20-30℃、150-250rpm条件下培养15-20h后，添加10-30g/L坎利酮，调整转速至200-250rpm进行发酵培养。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述PDA培养基中含有：PDA 46g/L，酵母提取物2g/L，琼脂粉10g/L，pH值为自然值；所述种子培养基中含有：葡萄糖5-10g/L，可溶性淀粉2-5g/L，玉米浆15-30g/L，蛋白胨5-10g/L，磷酸二氢铵0.5-2.0g/L，氯化镁1-3g/L，pH值为6.0-6.5；所述发酵培养基中含有：葡萄糖10-30g/L，可溶性淀粉5-20g/L，玉米浆10-30g/L，蛋白胨5-20g/L，磷酸二氢铵0.5-2.0g/L，氯化镁1-3g/L，pH值为自然值。
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