CN112980910B - 一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α‑羟基坎利酮的方法,其特征在于,以赭曲霉为菌种,以坎利酮为底物,在相转移催化剂体系中,完成坎利酮的C11α‑羟基化生物转化过程,获得11α‑羟基坎利酮。在坎利酮投料浓度为30g/L的条件下,11α‑羟基坎利酮的质量转化率达到95.0%以上,转化时间低于60h。本发明操作工艺简单,生产成本低,具有较高的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的制备工艺,属于微生物制备技术领域。
背景技术
11α-羟基坎利酮,分子式C22H28O4,是甾体化合物坎利酮的C11羟基化衍生物,它是降压药依普利酮依普利酮合成中必不可少的中间体。
11α-羟基坎利酮的可通过化学合成法和微生物转化法合成。微生物转化法主要利用微生物胞内羟化酶将坎利酮进行11α-羟基化,相比化学合成法,微生物法操作条件简单,反应条件温,副产物少(CNKI:CDMD:2.1018.837963)。
关于11α-羟基坎利酮的微生物生物转化研究,现有专利主要集中在工艺控制这一层面(CN103255192A;CN1727494)。赵玉金等通过调节发酵培养基的pH和接种量,改变菌球直径和松散程度,在10g/L投料浓度下54h转化率可达92.0%(10.3969/j.issn.1672-6510.2006.03.003);Contente等在生物反应器中通入富氧空气,当投料浓度为10g/L时,72h转化率>95.0%(10.1016/j.steroids.2016.09.013);刘晓等利用高密度培养法,在17g/L的投料浓度下,72h转化率达到86.1%(10.3969/j.issn.1004-311X.2011.05.134)。综上可知,高投料浓度下,坎利酮转化周期加长。
在11α-羟基化坎利酮的生物转化过程中,底物坎利酮的羟基化速率主要取决于两方面因素:一是底物在水相中的溶解度,二是微生物的转化活性。坎利酮在水中溶解度极低,溶解范围在10-6-10-5mol/L,这成为坎利酮生物转化过程中的限速步骤。根据目前甾体微生物转化研究进展可知,对于甾体底物的低水溶性,现有技术大多通过在转化体系中加入促溶剂或者粉末投料方式解决。但是常用促溶剂如丙酮、二甲基亚砜等有机溶剂毒性高,高投料浓度下依靠提高溶剂加入量来增加底物溶解度会对细胞结构及微生物转化活性产生负面影响(10.3969/j.issn.1001-6678.2008.02.012);虽然粉末投料方式可以保持菌体高活性,且底物溶出速率快于结晶投料,但产物和底物会产生混结晶现象,导致转化中后期转化停滞(10.1016/0141-0229(92)90138-E)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:11α-羟基化坎利酮的生物转化过程中,因底物低水溶性以及产物和底物的混结晶,所造成的的转化率低的问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,其特征在于,以赭曲霉为菌种,以坎利酮为底物,在相转移催化剂体系中,完成坎利酮的C11α-羟基化生物转化过程,获得11α-羟基坎利酮。
优选地,上述方法包括如下步骤:
步骤1):菌体培养和收集:在PDA斜面培养基上活化菌种,在一级发酵培养基中进行种子液培养,二级发酵培养基中进行菌体培养,菌体培养至对数生长期后将抽滤所得菌体用无菌磷酸缓冲液洗涤3次,冷藏备用;
步骤2):制备相转移催化剂体系:在无菌磷酸缓冲液中加入相转移催化剂,制备相转移催化剂体系;
步骤3):底物的生物转化:将步骤1)冷藏的菌体重悬于相转移催化剂体系中,加入底物坎利酮,进行生物转化。
优选地,所述的赭曲霉(Aspergillus ochraceus),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2019186。
更优选地,所述步骤1)中PDA斜面培养基含有葡萄糖20-25g/L、琼脂20-25g/L、马铃薯浸出粉10-12g/L,其pH5.4-5.8,配制后121℃蒸汽灭菌15min;所述一级发酵培养基含有葡萄糖10-15g/L、玉米浆15-20g/L、大豆蛋白胨10-15g/L、硫酸铵1.5-2.0g/L,其pH5.0-5.4,配制后121℃蒸汽灭菌15min;所述二级发酵培养基含有葡萄糖25-35g/L、玉米浆15-20g/L、大豆蛋白胨10-15g/L、硫酸铵1.5-2.0g/L,其pH4.8-5.2,配制后121℃蒸汽灭菌15min。
更优选地,所述步骤1)中菌体培养具体为:将3.0-3.5g/L的种子液以体积百分比10%的接种量接入二级发酵培养基,放入摇床进行培养,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,菌体培养18-24h;菌体冷藏的温度为4℃。
更优选地,所述步骤2)所得相转移催化剂体系为pH6.5的磷酸钠缓冲水溶液、相转移催化剂和葡萄糖的混合物;在磷酸钠缓冲水溶液中,相转移催化剂的添加浓度为2-15g/L,葡萄糖的添加浓度为15g/L。
更优选地,所述步骤2)中的相转移催化剂包含四丁基溴化铵2-15g/L,1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐2-15g/L,四丁基溴化铵与1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐的质量比为2:1-6:1,两者的总浓度为10g/L。
更优选地,所述步骤3)中菌体于相转移催化剂体系中的浓度为10.0-20.0g/L;所述底物坎利酮的加入浓度为5-40g/L;所述生物转化的工艺条件为:温度28℃,转速180rpm,转化总时长48-60h。
更优选地,所述步骤3)中生物转化后的转化液经醇提后进行HPLC测定,计算转化率。
更优选地,所述醇提时无水乙醇与转化液的体积比为2:1;所述HPLC所采用的色谱柱为Agilent 5HC-C18 250×4.6mm,柱温30℃,流动相为甲醇与水以体积比8:2的混合物,流速0.8mL/min。
本发明提供的相转移催化剂体系能够提升底物坎利酮的溶出速率及水相中的溶解度,且相转移催化剂的正电荷结构能够与细胞外膜结合,适度增加细胞的通透性能,从而加快底物分子从水相到胞内的转运。同时季铵盐和咪唑盐这具有不易挥发、毒性低、操作安全等优点,与传统有机溶剂相比,在较高的添加浓度下可保持微生物优良的转化活性,减少包埋等步骤,操作简单,利于产物的后期提取与纯化。因此与传统甾体微生物转化技术相比,在相转移催化剂体系中进行坎利酮的11α-羟基化生物转化,具有更高的应用前景。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)将相转移催化体系应用到11α-羟基坎利酮的生物转化中;
(2)相转移催化剂的双亲性结构能够增加底物坎利酮溶解度、提高赭曲霉细胞通透性,且在较高添加浓度下赭曲霉菌体可保持较高的羟基化酶活性,在投料浓度为30g/L的条件下,11α-羟基坎利酮的质量转化率达到95.0%以上,转化时间低于60h。
附图说明
图1为实施例1中四丁基溴化铵添加浓度对坎利酮转化速率的影响关系图;
图2为实施例1中1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐添加浓度对坎利酮转化速率的影响关系图;
图3为实施例3中30/L投料浓度下11α-羟基坎利酮54h转化率的HPLC测定结果图谱。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,并配合附图作详细说明如下。
本发明中转化率测量方法:底物转化过程中,每隔12h进行取样,每种相转移催化剂各取样点取样50mL,3组平行。以无水乙醇:转化液=2:1(v/v)的比例将转化液溶解,使用超声法对溶解液中的产物和底物进行充分溶解。吸取2mL乙醇溶解液,0.22μm有机滤膜过滤,HPLC法测定转化率,HPLC色谱柱为Agilent 5HC-C18 250×4.6mm,柱温30℃,流动相为甲醇:水=8:2,流速0.8mL/min。
实施例1
一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法:
(1)斜面培养基:葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,马铃薯浸出粉10g/L,pH5.4,121℃高压湿热灭菌15min。
(2)一级发酵培养基:葡萄糖10g/L,玉米浆15g/L,大豆蛋白胨10g/L,硫酸铵1.5g/L,pH5.0,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(3)二级发酵培养基:葡萄糖25g/L,玉米浆15g/L,大豆蛋白胨10g/L,硫酸铵1.5g/L,pH4.8,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(4)种子培养:无菌条件下,用接种环刮取两环斜面赭曲霉菌种至2mL无菌生理盐水中,旋涡震荡仪充分震荡2min,将菌悬液全部转接至装液50mL一级发酵培养基中,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长18h。
(5)菌体培养:无菌条件下,将菌浓为3.0g/L种子液以10%(v/v)添加量接入二级发酵培养基,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长18h。
(6)菌体收集:无菌条件下抽滤获得菌体,以磷酸缓冲液:发酵液=3:1的体积比清洗菌体,清洗次数为3次,4℃冰箱冷藏备用。
(7)制备相转移催化剂体系:在含有15g/L葡萄糖的pH6.5的磷酸缓冲液中,分别加入2种相转移催化剂:四丁基溴化铵,1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐,添加浓度梯度均为2g/L、5g/L、10g/L、15g/L,制备2种相转移催化剂体系。同时将冷藏菌体以10.0g/L的浓度重悬于50mL的相转移催化剂体系中。
(8)在相转移催化剂体系中加入5g/L的底物坎利酮,转化条件为摇床温度28℃、转速180rpm,转化总时长48h。
(9)从图1可知,在5g/L的投料浓度下,对照组48h质量转化率仅93.7%,四丁基溴化铵添加量为10g/L时,坎利酮转化速率提升最快,48h质量转化率为102.0%;从图2可知,1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐添加浓度为2g/L时,坎利酮转化速率提升最快,48h质量转化率转化率为99.8%。
实施例2
复配相转移催化剂(复配比2:1)对10g/L投料浓度下坎利酮11α-羟基化的影响,具体内容如下:
(1)斜面培养基:葡萄糖20g/L,琼脂25g/L,马铃薯浸出粉11g/L,pH5.8,121℃高压湿热灭菌15min。
(2)一级发酵培养基:葡萄糖10g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵1.5g/L,pH5.4,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(3)二级发酵培养基:葡萄糖30g/L,玉米浆18g/L,大豆蛋白胨12g/L,硫酸铵1.8g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(4)种子培养:无菌条件下,用接种环刮取两环斜面赭曲霉菌种至2mL无菌生理盐水中,旋涡震荡仪充分震荡2min,将菌悬液全部转接至装液50mL一级发酵培养基中,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长18h。
(5)菌体培养:无菌条件下,将菌浓为3.2g/L种子液以10%(v/v)添加量接入二级发酵培养基,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长20h。
(6)菌体收集:无菌条件下抽滤获得菌体,以磷酸缓冲液:发酵液=3:1的体积比清洗菌体,清洗次数为3次,4℃冰箱冷藏备用。
(7)制备相转移催化剂体系:在含有15g/L葡萄糖的pH6.5的磷酸缓冲液中,加入总浓度10g/L的复配相转移催化剂,复配类型为四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐,复配比(w/w)为2:1,制备相转移催化剂体系。同时将冷藏菌体以15.0g/L的浓度重悬于50mL的相转移催化剂体系中。
(8)在相转移催化剂体系中加入10g/L的底物坎利酮,转化条件为摇床温度28℃、转速180rpm,转化总时长60h。
(9)根据转化结果可知,在10g/L的投料浓度及10g/L复配相转移催化剂添加浓度下,当四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐复配比例为2:1时,坎利酮11α-羟基化速率比对照组快,对照组60h质量转化率仅83.2%,而相转移催化剂体系组60h质量转化率达94.7%。
实施例3
复配相转移催化剂(复配比4:1)对30/L投料浓度下坎利酮11α-羟基化的影响,具体内容如下:
(1)斜面培养基:葡萄糖25g/L,琼脂25g/L,马铃薯浸出粉12g/L,pH5.6,121℃高压湿热灭菌15min。
(2)一级发酵培养基:葡萄糖15g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵2.0g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(3)二级发酵培养基:葡萄糖35g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵2.0g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(4)种子培养:无菌条件下,用接种环刮取两环斜面赭曲霉菌种至2mL无菌生理盐水中,旋涡震荡仪充分震荡2min,将菌悬液全部转接至装液50mL一级发酵培养基中,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长18h。
(5)菌体培养:无菌条件下,将菌浓为3.5g/L种子液以10%(v/v)添加量接入二级发酵培养基,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长24h。
(6)菌体收集:无菌条件下抽滤获得菌体,以磷酸缓冲液:发酵液=3:1的体积比清洗菌体,清洗次数为3次,4℃冰箱冷藏备用。
(7)制备相转移催化剂体系:在含有15g/L葡萄糖的pH6.5的磷酸缓冲液中,加入总浓度10g/L的复配相转移催化剂,复配类型为四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐,复配比(w/w)为4:1,制备相转移催化剂体系。同时将冷藏菌体以20.0g/L的浓度重悬于50mL的相转移催化剂体系中。
(8)在相转移催化剂体系中加入30g/L的底物坎利酮,转化条件为摇床温度28℃、转速180rpm,转化总时长54h。
(9)根据转化结果可知,在30g/L的投料浓度及10g/L复配相转移催化剂添加浓度下,当四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐复配比例为4:1时,坎利酮11α-羟基化速率比对照组快,对照组54h质量转化率仅78.3%,而相转移催化剂体系组54h质量转化率为95.5%。
实施例4
复配相转移催化剂(复配比6:1)对40/L投料浓度下坎利酮11α-羟基化的影响,具体内容如下:
(1)斜面培养基:葡萄糖25g/L,琼脂25g/L,马铃薯浸出粉12g/L,pH5.6,121℃高压湿热灭菌15min。
(2)一级发酵培养基:葡萄糖15g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵2.0g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(3)二级发酵培养基:葡萄糖35g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵2.0g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(4)种子培养:无菌条件下,用接种环刮取两环斜面赭曲霉菌种至2mL无菌生理盐水中,旋涡震荡仪充分震荡2min,将菌悬液全部转接至装液50mL一级发酵培养基中,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长18h。
(5)菌体培养:无菌条件下,将菌浓为3.5g/L种子液以10%(v/v)添加量接入二级发酵培养基,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长24h。
(6)菌体收集:无菌条件下抽滤获得菌体,以磷酸缓冲液:发酵液=3:1的体积比清洗菌体,清洗次数为3次,4℃冰箱冷藏备用。
(7)制备相转移催化剂体系:在含有15g/L葡萄糖的pH6.5的磷酸缓冲液中,加入总浓度10g/L的复配相转移催化剂,复配类型为四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐,复配比(w/w)为6:1,制备相转移催化剂体系。同时将冷藏菌体以20.0g/L的浓度重悬于50mL的相转移催化剂体系中。
(8)在相转移催化剂体系中加入40g/L的底物坎利酮,转化条件为摇床温度28℃、转速180rpm,转化总时长60h。
(9)根据转化结果可知,在40g/L的投料浓度及10g/L复配相转移催化剂添加浓度下,当四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐复配比例为6:1时,坎利酮11α-羟基化速率比对照组快,对照组60h质量转化率仅62.0%,而相转移催化剂体系组60h质量转化率达76.8%。
实施例5
复配相转移催化剂(复配比4:1)对40/L投料浓度下坎利酮11α-羟基化的影响,具体内容如下:
(1)斜面培养基:葡萄糖25g/L,琼脂25g/L,马铃薯浸出粉12g/L,pH5.6,121℃高压湿热灭菌15min。
(2)一级发酵培养基:葡萄糖15g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵2.0g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(3)二级发酵培养基:葡萄糖35g/L,玉米浆20g/L,大豆蛋白胨15g/L,硫酸铵2.0g/L,pH5.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
(4)种子培养:无菌条件下,用接种环刮取两环斜面赭曲霉菌种至2mL无菌生理盐水中,旋涡震荡仪充分震荡2min,将菌悬液全部转接至装液50mL一级发酵培养基中,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长18h。
(5)菌体培养:无菌条件下,将菌浓为3.5g/L种子液以10%(v/v)添加量接入二级发酵培养基,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,培养时长24h。
(6)菌体收集:无菌条件下抽滤获得菌体,以磷酸缓冲液:发酵液=3:1的体积比清洗菌体,清洗次数为3次,4℃冰箱冷藏备用。
(7)制备相转移催化剂体系:在含有15g/L葡萄糖的pH6.5的磷酸缓冲液中,加入总浓度10g/L的复配相转移催化剂,复配类型为四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐,复配比(w/w)为4:1,制备相转移催化剂体系。同时将冷藏菌体以20.0g/L的浓度重悬于50mL的相转移催化剂体系中。
(8)在相转移催化剂体系中加入40g/L的底物坎利酮,转化条件为摇床温度28℃、转速180rpm,转化总时长60h。
(9)根据转化结果可知,在40g/L的投料浓度及10g/L复配相转移催化剂添加浓度下,当四丁基溴化铵/1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐复配比例为4:1时,坎利酮11α-羟基化速率比对照组快,对照组60h质量转化率仅62.0%,而相转移催化剂体系组60h质量转化率达80.3%。
Claims (5)
1. 一种在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,其特征在于,以赭曲霉为菌种,以坎利酮为底物,在相转移催化剂体系中,完成坎利酮的C11α-羟基化生物转化过程,获得11α-羟基坎利酮;所述的赭曲霉,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2019186;所述的在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,包括如下步骤:
步骤1):菌体培养和收集:在PDA斜面培养基上活化菌种,在一级发酵培养基中进行种子液培养,二级发酵培养基中进行菌体培养,菌体培养至对数生长期后将抽滤所得菌体用无菌磷酸缓冲液洗涤3次,冷藏备用;
步骤2):制备相转移催化剂体系:在无菌磷酸缓冲液中加入相转移催化剂,制备相转移催化剂体系;所得相转移催化剂体系为pH6.5的磷酸钠缓冲水溶液、相转移催化剂和葡萄糖的混合物;在磷酸钠缓冲水溶液中,相转移催化剂的添加浓度为10g/L,葡萄糖的添加浓度为15g/L;所述相转移催化剂包含四丁基溴化铵2-10g/L,1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐2-10g/L,四丁基溴化铵与1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐的质量比为2:1-4:1,两者的总浓度为10g/L;
步骤3):底物的生物转化:将步骤1)冷藏的菌体重悬于相转移催化剂体系中,加入底物坎利酮,进行生物转化;所述菌体于相转移催化剂体系中的浓度为10.0-20.0g/L;所述底物坎利酮的加入浓度为5-40g/L;所述生物转化的工艺条件为:温度28℃,转速180rpm,转化总时长48-60h。
2.如权利要求1所述的在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,其特征在于,所述步骤1)中PDA斜面培养基含有葡萄糖20-25g/L、琼脂20-25g/L、马铃薯浸出粉10-12g/L,其pH5.4-5.8,配制后121℃蒸汽灭菌15min;所述一级发酵培养基含有葡萄糖10-15g/L、玉米浆15-20g/L、大豆蛋白胨10-15g/L、硫酸铵1.5-2.0g/L,其pH5.0-5.4,配制后121℃蒸汽灭菌15min;所述二级发酵培养基含有葡萄糖25-35g/L、玉米浆15-20g/L、大豆蛋白胨10-15g/L、硫酸铵1.5-2.0g/L,其pH4.8-5.2,配制后121℃蒸汽灭菌15min。
3.如权利要求1所述的在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,其特征在于,所述步骤1)中菌体培养具体为:将3.0-3.5g/L的种子液以体积百分比10%的接种量接入二级发酵培养基,放入摇床进行培养,培养条件为摇床温度28℃、转速180rpm,菌体培养18-24h;菌体冷藏的温度为4℃。
4.如权利要求1所述的在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,其特征在于,所述步骤3)中生物转化后的转化液经醇提后进行HPLC测定,计算转化率。
5. 如权利要求4所述的在相转移催化剂体系中微生物转化11α-羟基坎利酮的方法,其特征在于,所述醇提时无水乙醇与转化液的体积比为2:1;所述HPLC所采用的色谱柱为Agilent 5 HC-C18 250×4.6mm,柱温30℃,流动相为甲醇与水以体积比8:2的混合物,流速0.8mL/min。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1167380A2 (en) * | 1995-12-11 | 2002-01-02 | G.D. Searle & Co. | 11.alpha.-hydroxy-steroid-4,6-dien-3-one compounds and a process for their preparation |
CN1727494A (zh) * | 2005-07-29 | 2006-02-01 | 天津科技大学 | 微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法 |
CN102286596A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-12-21 | 天津科技大学 | 一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法 |
CN108823275A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-11-16 | 浙江大学 | 一种含季铵盐离子液体体系中植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的方法 |
CN110713941A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-01-21 | 上海应用技术大学 | 高表达细胞色素p450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7235655B2 (en) * | 2002-03-22 | 2007-06-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Processes to prepare eplerenone |
-
2021
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1167380A2 (en) * | 1995-12-11 | 2002-01-02 | G.D. Searle & Co. | 11.alpha.-hydroxy-steroid-4,6-dien-3-one compounds and a process for their preparation |
CN1727494A (zh) * | 2005-07-29 | 2006-02-01 | 天津科技大学 | 微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法 |
CN102286596A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-12-21 | 天津科技大学 | 一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法 |
CN108823275A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-11-16 | 浙江大学 | 一种含季铵盐离子液体体系中植物甾醇生物转化制备雄烯二酮的方法 |
CN110713941A (zh) * | 2019-10-22 | 2020-01-21 | 上海应用技术大学 | 高表达细胞色素p450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
姚芳,赵贵平,赵邦蓉.植物生长激素中间体――2α,3α,22R,23R-四乙酰氧基-6-甾酮的合成.现代化工.2000,(03),全文. * |
张晓丽 ; 张莉 ; 丁保妹 ; 荣绍丰 ; .乳化剂对坎利酮增溶及生物转化的影响.上海应用技术学院学报(自然科学版).2012,(02),全文. * |
程兆鹏 ; 汤丹丹 ; 徐志南 ; .离子液体双相体系中的生物催化维生素D_3羟基化反应.中国科学技术大学学报.2018,(07),全文. * |
许正宏 ; 吴燕 ; 李会 ; 李恒 ; 史劲松 ; .甾体生物转化技术研究的现状与进展.生物加工过程.2013,(02),全文. * |
陈华明 ; 张琴 ; 李晓敦 ; 胡海峰 ; 朱宝泉 ; .微生物转化法合成15-羟基坎利酮.中国天然药物.2006,(02),全文. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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