CN114395494B - 一株塞伯林德纳氏酵母t52及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株塞伯林德纳氏酵母T52及其应用。该菌株名称为Cyberlindner a saturnus T52，已于2021年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211432。本发明发现了一株塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnera s aturnus T52，该菌株能够将CDCA转化为UDCA，且对高浓度CDCA具有一定耐受性，能够满足工业化应用的要求。
Description
技术领域
本发明属于熊去氧胆酸合成领域，具体涉及一株塞伯林德纳氏酵母T52及其应用。
背景技术
熊去氧胆酸（英文名:Ursodesoxycholic acid,UDCA）是传统的中药的有效成分，有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值，能在肝脏中调节新陈代谢。研究结果显示，熊去氧胆酸在体内的生物功能主要有以下几个方面：能够增加低密度脂蛋白的结合；能够刺激肝细胞的增值；能够加强干扰素治疗慢性病毒性肝炎的治疗作用；能够促使糖皮质激素的受体激活，抑制肿瘤启动以及肿瘤细胞的迁移；在治疗胆结石、胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化、药物诱发的肝炎和促进肝移植等方面有非常好的疗效，市场用量很大。熊去氧胆酸，起初主要是从天然熊胆中提取，但是活熊资源十分有限，且违反了动物保护法。
人工合成熊去氧胆酸可使用能够大量获取且价格低廉的鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic acid,CDCA）（在人、畜、禽的胆汁中广泛存在，是鸡、鸭、鹅等家禽胆汁中的主要有机成分）化学法合成UDCA。鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸是一对差向异构体，两者之间的结构区别在于，鹅去氧胆酸的2个羟基分别在3α，7α位，而熊去氧胆酸的羟基在3α，7β位，将甾环骨架上7α位羟基转变为7β位羟基，就可以实现从鹅去氧胆酸到熊去氧胆酸的转变，从有机合成的角度来看，可以通过C7位羟基发生翻转来实现这个转化过程。通过氧化还原的方法使7-OH发生构型反转，但是存在着反应过程复杂、选择性低、反应条件苛刻、能耗大和污染大等一系列问题，尤其是保护和脱保护过程中需要有毒和危险试剂，严重限制了化学法的工业化应用。
目前使用化学法生产的UDCA约占到市场份额的30%，而且制备高纯度较低，约80%左右，还远不能满足市场对UDCA的用量及质量的需求。与化学差向异构化相比，生物转化CDCA得到UDCA具有高效性和相对环境友好性。
目前报道能转化CDCA为UDCA微生物有泥渣梭菌Clostridiumlimosum、绝对梭菌clostridium absonum、巴氏梭菌clostridiumbaratii、嗜麦芽黄单胞菌xanthomonasmaltophilia、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）。但是，上述菌多为厌氧菌，且高浓度的CDCA会抑制上述菌的生物量的积累，导致产物浓度低，产品回收过程中存在困难。
发明内容
本发明为了解决现有技术的不足，采用CDCA做为唯一碳源筛选到一株耐受CDCA且能转化CDCA为UDCA的塞伯林德纳氏酵母T52，所述塞伯林德纳氏酵母T52名称为Cyberlindnera saturnusT52，已于2021年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211432。其26S rDNA的基因序列SEQ ID No：1所示。CDCA的浓度为20g/L时，转化率最高，达到82.8%，该菌株能耐受50g/L的CDCA，达到了工业化应用的要求。
本发明的有益效果为：本发明发现了一株塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnera saturnusT52，该菌株能够将CDCA转化为UDCA，且对高浓度CDCA具有一定耐受性，能够满足工业化应用的要求。
附图说明
图1所示为塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnera saturnusT52的菌落形态图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：
一、塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnera saturnusT52的筛选和相关实验：
（1）筛选培养基：
平板筛选培养基：CH3COONH35g/L、NaNO35g/L、CDCA 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、Na2HPO425g/L、NaH2PO44.4g/L、吐温80 1mL/L、琼脂 20g/L。
转化培养基：CH3COONH35g/L、KCl22g/L、K2HPO42 g/L、CDCA 1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCl20.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、CuSO4·5H2O 0.01g/L、Na2MoO4·2H2O 0.01 mg/L、FeSO4·7H2O 0.01mg/L、吐温80 1mL/L。
发酵培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、吐温80 1mL/L，CDCA1g/L。
碳源优化培养基：不同的碳源5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、吐温80 1mL/L，CDCA 1g/L。不同的碳源包括乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、牛肉提取物、柠檬酸、蔗糖和甘油。
碳源优化培养基：不同的氮源5g/L、最佳碳源5g/L、氯化钠10g/L、吐温80 1mL/L，CDCA 1g/L。不同的氮源包括牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、草酸铵和柠檬酸氢二铵。
（2）筛选方法：
1.称取抚州市临川区河东乡范家村养鸭塘污泥10 g，放入装有90 mL无菌水的三角瓶中，置于摇床150 rpm振荡60ｍin后取出，逐级稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的6种浓度，将6种浓度的稀释液分别涂布于平板筛选，于27 ℃静置培养3-6d。挑平皿上的单菌落接入转化培养基培养基中，27 ℃、 200rpm培养14 d。
2.TCL检测UDCA：用1：1体积的乙酸乙酯萃取，跑TCL进行初步鉴定。层析剂为三氯甲烷：甲醇：冰乙酸=40：2：1，显色剂：10%硫酸乙醇。
3.放大实验：把所有可能的菌株接到装有5 mL发酵培养基培养基的试管中27 ℃、200rpm培养2 d后用（50 mL离心管）离心收集菌体，用PBS洗涤菌体。
每个离心管（带菌体）装入40 mL转化培养基，混均，27 ℃、200rpm培养14 d。
把40 mL液体分成两份，分别用等体积的乙酸乙酯萃取，晾干后用色谱纯甲醇溶解，用于液相色谱检测。
4.液相色谱检测UDCA：C18柱，甲醇：磷酸水溶液（pH=2）=80：20，流速：0.8mL/min，波长：210nm，柱温：35 ℃。
5.发酵条件优化：对不同碳源、氮源、温度（15-40℃）和pH值（3-10）进行了不同发酵条件的优化，用液相色谱检测优化结果。
6.转化条件优化：在不同的温度（20-60℃）和不同pH值（3-10）的转化培养基中进行转化条件优化，用液相色谱检测优化结果。
7. 不同浓度CDCA对Cyberlindnera saturnusT52转化CDCA得到UDCA的影响。
二、结果
（1）利用CDCA做为唯一碳源筛选到一株能转化CDCA得到UDCA的菌株塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnera saturnus T52，菌落中等大小，白色，圆形隆起，镜检菌体有出芽现象，为酵母菌所特有，菌落形态见图1。
提取T52基因组，用26S rDNA通用引物1（NL1）：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和通用引物2（NL4）：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’进行PCR扩增，测序后在NCBI上BLAST的结果为Cyberlindnera saturnus，故命名为：塞伯林德纳氏酵母Cyberlindnera saturnusT52。其26S rDNA的基因序列SEQ ID No：1所示：
GCTCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTTGGTGCCCGAGTTGTAATTTGAAGATAGTTTTCTGGTGCTGGCCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGCGGGGTGTCCAGTGCTTTGTAGATTTCTATCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTAGATCAGACTTGGTGTTTTGTGATTATCTTCCCTTCTTGGGTTGTGCACTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCGGTTCGGGTGGTAAGATAATGACATTGGAACGTGGCACTGCCTTCGGGTGGTGTGTTATAGCCCTTGTTGATGTTGCCTACCTGGACCGAGGACTGCGGCTTTGCCTAGGATGC。
（2）不同碳源对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
发酵培养基以蛋白胨10g/L为氮源，按5 g/L浓度分别添加下列碳源: 乳糖、淀粉、葡萄糖、牛肉膏、柠檬酸、蔗糖和甘油。结果见表1。由表1可以看出：碳源对菌体的生物量有明显影响，对转化率都影响较大，以葡萄糖和蔗糖为碳源时，菌体都生长旺盛，生物量较比较高，转化率分别达到82.1%和78.2%，最佳碳源是葡萄糖。
表1
| 碳源 | 乳糖 | 淀粉 | 葡萄糖 | 牛肉膏 | 柠檬酸 | 蔗糖 | 木糖 | 甘油 |
| OD值 | 0.469 | 0.475 | 0.550 | 0.457 | 0.362 | 0.574 | 0.399 | 0.406 |
| 转化率 | 67.3% | 69.3% | 82.1% | 58.5% | 57.2% | 78.2% | 50.2% | 67.8% |
（3）不同氮源对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
产酶培养基以5 g/L葡萄糖为碳源，按10 g/L分别添加下列氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、磷酸氢二铵、草酸铵和柠檬酸氢二铵。27℃、220 rpm/min 培养2 d的菌体进行转化实验。结果见表2。由表2可见氮源对菌体的生物量和转化率都影响都较大，其中以蛋白胨和硫酸铵为碳源时菌体都生长旺盛，生物量较比较高，转化率分别达到85.8%和82.8%，其中最佳氮源是蛋白胨。
表2
| 氮源 | 牛肉膏 | 蛋白胨 | 尿素 | 硫酸铵 | 磷酸氢二铵 | 草酸铵 | 柠檬酸氯二铵 |
| OD值 | 0.531 | 0.611 | 0.492 | 0.583 | 0.530 | 0.466 | 0.512 |
| 转化率 | 67.9% | 81.8% | 57.1% | 72.3% | 63.7% | 62.9% | 58.6% |
（4）不同培养温度对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
温度是影响细胞生长和发酵产酶的一个重要因素，考察了不同发酵温度对Cyberlindnera saturnusT52菌株的菌体产量和转化率的影响，结果温度对生物量和转化率均有一定的影响，当菌体培养温度为30℃时，生物量和转化率最高，转化率达到83.1%，故以30℃为最适发酵温度，见表3。
表3
| 温度 | 20 ℃ | 25 ℃ | 30 ℃ | 35 ℃ | 40 ℃ |
| OD | 0.435 | 0.550 | 0.590 | 0.550 | 0.450 |
| 转化率 | 43.8% | 67.1% | 83.1% | 77.1% | 67.1% |
（5）培养基初始pH对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
细胞生长以及菌体各种酶的活性都会受到培养基的初始pH的调节作用。为考察初始pH对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响。将发酵培养基调至不同的pH，对培养获得的菌体进行转化CDCA得到UDCA的实验。结果从pH4.0～10.0的培养基菌体都能生长，生物量和转化率以PH7最高，转化率达到83.4%，见表4。
表4
| pH值 | PH=3 | PH=4 | PH=5 | PH=6 | PH=7 | PH=8 | PH=9 | PH=10 |
| OD值 | 0 | 0.045 | 0.216 | 0.381 | 0.598 | 0.568 | 0.487 | 0.360 |
| 转化率 | 19.8% | 35.7% | 52.5% | 83.4% | 79.8% | 61.8% | 49.7% |
（6）转化温度对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
转化温度对Cyberlindnera saturnusT52转化CDCA得到UDCA的影响的影响结果见表5，30℃是最适宜的转化温度，超过30℃随着温度的逐渐升高，转化率逐渐下降。
表5
| 温度 | 20 ℃ | 30 ℃ | 40 ℃ | 50 ℃ | 60 ℃ |
| 转化率 | 69.5% | 83.7% | 76.8% | 68.8% | 47.8% |
（7）转化培养基pH值对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
pH值对Cyberlindnera saturnusT52转化CDCA得到UDCA的影响的结果见表6。由表6可见转化培养基pH值的最适pH为8，略偏碱性的条件下催化效果最好，过高或过低pH都对转化不利。
表6
| 转化 | pH=3 | pH=4 | pH=5 | pH=6 | pH=7 | pH=8 | pH=9 | pH=10 |
| 转化率 | 38.2% | 42.4% | 58.6% | 64.9% | 78.2% | 83.8% | 75.5% | 52.5% |
（8）不同浓度CDCA对Cyberlindnera saturnusT52生物量和转化CDCA得到UDCA的影响：
不同浓度CDCA对Cyberlindnera saturnusT52转化CDCA得到UDCA的影响的结果见表7。由表7可见CDCA的浓度为20g/L时，转化率较高，达到82.8%，当CDCA的浓度超过20g/L，随着CDCA浓度的提高，转化率逐渐下降，但能耐受50g/L的CDCA。
表7
| 转化 | 3g/L | 5g/L | 10g/L | 20g/L | 30g/L | 40g/L | 50g/L |
| 转化率 | 83.9% | 83.1% | 83.8% | 82.8% | 65.2% | 56.8% | 36.8% |
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一株塞伯林德纳氏酵母T52及其应用
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 533
<212> DNA
<213> 塞伯林德纳氏酵母T52
<400> 1
gctcagtacg gcgagtgagc ggcaaaagct caaatttgaa atctggtacc tttggtgccc 60
gagttgtaat ttgaagatag ttttctggtg ctggcccttg tctatgttcc ttggaacagg 120
acgtcacaga gggtgagaat cccgtctggc ggggtgtcca gtgctttgta gatttctatc 180
gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg gtaaattcca tctaaagcta 240
aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg gaaagatgaa aagaactttg 300
aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaagggaa gggtattaga tcagacttgg 360
tgttttgtga ttatcttccc ttcttgggtt gtgcactcgc atttcactgg gccagcatcg 420
gttcgggtgg taagataatg acattggaac gtggcactgc cttcgggtgg tgtgttatag 480
cccttgttga tgttgcctac ctggaccgag gactgcggct ttgcctagga tgc 533
Claims (4)
1.一株塞伯林德纳氏酵母T52，其特征在于，所述塞伯林德纳氏酵母T52名称为Cyberlindnera saturnus T52，已于2021年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211432。
2.根据权利要求1所述的塞伯林德纳氏酵T52，其特征在于，其26S rDNA的基因序列如SEQ ID No：1所示。
3.权利要求1-2任一项所述的塞伯林德纳氏酵母T52在转化鹅去氧胆酸为熊去氧胆酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，鹅去氧胆酸的浓度为20g/L。
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2022
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