CN102816825B - 用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是用微生物发酵转化甾醇制备去氢表雄酮的方法，包括如下步骤：（1）将甾醇的3位羟基进行保护的步骤，得保护物；（2）将保护物用菌株Mycobacteriumsp.NRRLB-3683或3805进行发酵的步骤；（3）将目的物进行水解的步骤；（4）提纯的步骤；本发明提供了一种从植物甾醇制备去氢表雄酮的新的路径，极大的降低了去氢表雄酮的生产成本，提高了去氢表雄酮的质量收率。
Description
技术领域
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是用微生物发酵转化甾醇制备去氢表雄酮的方法。
背景技术
去氢表雄酮（dehyroepiandrosterone，DHEA）是一种C19类固醇载体化合物，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C19H28O2，结构如下：
。
DHEA最早于1944年从尿中分离得到，1954年发现的人硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）是人体内血浆中含量最多的皮质类固醇激素。二氢胆固醇在肾上腺皮质王状层细胞内经以细胞色素P450为主的酶系作用下转变为DHEA，DHEA经硫代激酶催化转化成DHEAS。与其它甾体类激素不同，血浆中DHEA及DHEAS随着年龄的增长浓度下降明显。而大量研究证明，DHEA是人血浆中大量共存在的肾上腺甾体化合物，具有抗炎、抗增殖及抗抑郁等活性，其衍生物在动物实验中能促进免疫应答，而且具有很好的神经保护作用。
此外，DHEA还是合成甾体药物的重要中间体，如: 甾体避孕药屈螺酮等。传统的DHEA的生产大多采用化学方法，如中国专利申请号为201210010445.9文献，采用醋酸妊娠双烯醇酮为原料，原料市场价格高昂，且分为3步化学反应完成，反应剂大多是有机溶液，且每次反应都要提纯，反应过程繁琐，对环境伤害较大。
文献中没有报道以微生物发酵来直接制备去氢表雄酮的方法。《微生物学通报》2006年33（2）中由天津大学化工学院化学工程系的张裕卿和王东青写的《植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展》中提到，Dias等将从油脂脱臭溜出物中富集的植物甾醇混合物用分枝杆菌NRRL-3805处理得到4-AD和ADD；《生物加工过程》2010年9月第8卷第5期的《微生物发酵降解植物甾醇侧链生产17-酮甾体研究进展》中提到，可利用分枝杆菌NRRL B-3683和3805来转化植物甾醇生产AD和ADD；中国专利申请201210038094.2中公开了利用4-AD制备去氢表雄酮的方法。即植物甾醇先发酵生产为4-AD，然后利用化学方法得到去氢表雄酮。这是现在研究利用植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其存在反应路线较长，多步反应使得去氢表雄酮的生产成本较大；且由于反应的多步的，各步损耗较大，总收率较小，环保压力较大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用微生物发酵技术直接从甾醇制备去氢表雄酮的新路径，极大的降低了去氢表雄酮的生产成本，提高了去氢表雄酮的质量收率。
本发明的技术方案是，包括如下步骤：
（1）将甾醇的3位羟基进行保护的步骤，得保护物；
（2）将保护物用菌株Mycobacterium sp. NRRL B-3683或3805进行发酵的步骤；
（3）将发酵产物进行水解的步骤；
（4）提纯的步骤。
本发明的甾醇为植物甾醇、动物甾醇或/和霉菌甾醇，优选为植物甾醇，可以为谷甾醇、麦角甾醇、豆甾醇、菜油甾醇或菜籽甾醇中的一种或多种，步骤（1）的植物甾醇可为单纯的一种，也可为多种的混合物，其物质是纯净物还是混合物并不影响反应的进行。植物甾醇之所以更适合作为发酵底物，是因为价格便宜，来源广泛，而且更适合作为底物用菌株Mycobacterium sp.NRRL B-3683或3805进行发酵。
下面是5种最主要的植物甾醇的结构式，
本发明使用的菌株Mycobacterium sp. NRRL 3683和3805，记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究只是通过控制反应条件如何提高4-AD和ADD的收率。
步骤（1）的目的是对3位羟基进行保护，我们在实验和文献中发现，如果不对3位羟基进行保护，菌株直接对植物甾醇进行发酵生产的话，产物将会是4-AD或ADD，达不到实验的目的，为了菌株能够对17位侧链进行专一性切除而不对3位羟基进行切除，我们实验了多种办法，包括进行菌株的特异性诱变、筛选，加入特异性的酶制剂等等，最后我们惊奇发现，如果首先对3位羟基进行保护，然后再进行发酵，其能够达到相当好的效果。为此我们实验了多种保护剂，发现采用甲缩醛的效果最好。同时，我们发现，对3位羟基进行保护后，产物的极性变小，其在植物油中的溶解度变大，有利于发酵反应的进行，增大发酵反应的效率和产品收率。
植物甾醇和甲缩醛的反应式如下：
本发明的甲缩醛作为反应溶剂和反应剂，只要能保证反应的进行，反应剂的量没有特别要求，优选的甾醇和甲缩醛的摩尔比为1:20-100即可。
为了推动反应向正向进行，需要除去反应产生的甲醇和体系中少量的水分，因此需要加入催化剂五氧化二磷和无机酸酐，五氧化二磷吸收甲醇或水分变成磷酸酯或磷酸在甲缩醛中溶解度不好，呈油状物，最好是通过加入助滤剂吸附后，过滤除去。助滤剂优选硅藻土或硅胶。过滤剂和催化剂的加入量以能达到目的为标准，经过研究人员常规的实验即可得到，本发明优选的过滤剂加入量为植物甾醇重量的1倍，催化剂的加入量为植物甾醇重量的0.5倍。
得到产物之后需要进行提纯，本发明的提纯方法可用常规方法进行。如以10g植物甾醇为反应物，将反应完成后的液体趁热过滤，滤饼和反应瓶用少量甲缩醛洗涤。减压浓缩至干，加入40ml质量浓度为1%的弱碱溶液，优选为碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐等溶液，略微搅拌分散，甩滤，水洗，50℃烘干，得淡黄色固体，称之为“保护物”。
本发明的菌株经过斜面培养、种子培养得到发酵用的菌。斜面培养、种子培养可以通过常规的实验技术得到。
（1）斜面培养
斜面培养基：营养肉汤琼脂斜面；培养条件：30℃，培养6～7天。
（2）种子培养
液体种子培养基：
| 名称 | 用量（g/L） |
| 蛋白胨 | 10 |
| 牛肉膏 | 3 |
| 氯化钠 | 5 |
pH为7.4 ± 0.05。
摇瓶种子培养：用接种环将菌体从斜面上刮下，接种到种子药瓶，180rpm，30℃，培养40～48 h，菌体湿重为培养基总重量的2%～3%，所述菌体湿重为：种子培养结束后，抽滤至无液体滴下，将菌丝体称重，即菌体湿重。
10升种子罐：火圈保护下，将培养好的摇瓶种子接种到种子罐，接种量10%，150rpm，空气流量：0.2Nm3/h，罐压：0.05MPa，种子罐装样量为70%，即7升，培养36～40 h，菌体湿重为培养基总重量的2%～3%。
得到发酵用菌后，步骤（2）是进行发酵，步骤（2）的发酵用的培养基为植物油、酵母膏或酵母粉、葡萄糖、硝酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物，植物油优选为大豆油、菜籽油、玉米油或葵花籽油中的一种或多种，以培养基总量为1L，保护物重量为20g计算，培养基组分的优选配比为：植物油140-160g、酵母膏或酵母粉9-11g、葡萄糖9-11g、硝酸盐4.5-5.5g、磷酸氢二盐4.5-5.5g和磷酸二氢盐4.5-5.5g，培养基组分的最合适的配比为：植物油150g、酵母膏或酵母粉10g、葡萄糖10g、硝酸盐5g、磷酸氢二盐5g和磷酸二氢盐5g。硝酸盐优选为硝酸钠或硝酸钾，磷酸氢二盐优选为磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，磷酸二氢盐优选为磷酸二氢钠和磷酸二氢钾，本发明使用植物油作为转化载体，提高了发酵底物的溶解性，加快了转化速度。选用磷酸氢二盐和磷酸二氢盐为pH缓冲体系，可以较好的控制pH值。
发酵用的培养基的pH值优选为6.8-7.2，发酵转化过程对体系的pH值进行控制，可以减少发酵底物的3位保护基团的降解，降低杂质含量，提高收率。
发酵培养的接种量优选为9-11%，优选10%，罐压为0.045-0.055MPa，优选0.05MPa，空气流量为0.45-0.55VVM，优选0.5VVM。空气流量单位VVM表示每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积。通过一系列的实验能了解到，按照以上参数进行发酵的收率是较高的。
步骤（3）的水解反应的反应剂为质量浓度为5-20%的硫酸或盐酸。
水解反应为常规实验，其过程可为：将发酵产物用乙酸乙酯萃取，分层，将乙酸乙酯层减压浓缩，将浓缩后的油样加入5倍油样体积的5-20%的盐酸或硫酸，搅拌下60℃水解1小时。
多次萃取可提高产物的收率，如发酵产物90℃灭活30min，冷却至室温，分层，油层加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，分层，取上清；下层再用2倍体积的乙酸乙酯萃取，分层，取上清，并与前面的有机层合并，有机层减压浓缩至只剩油。得到的油用2-5倍体积的5-20%盐酸或硫酸水解，60℃水解1小时。
水解完成后已经得到含有DHEA的混合物，需要进行提纯，提纯方法为常规实验。提纯DHEA的方法可为：把产物分层，油层减压浓缩，将少量的水浓缩掉，加入4倍体积的甲醇，室温下搅拌30 min，静止，分层，大部分产物被萃取到甲醇中，油层再用4倍体积的甲醇萃取两次，合并甲醇层，将甲醇浓缩干，得黄色固体，烘干，加入2倍体积的石油醚，70℃回流打浆2小时，冷却至室温，抽滤，得淡黄色固体粉末，烘干，得DHEA粗品，粗品用1倍体积的甲苯重结晶，得类白色晶体。
油层产物提纯前先用酸性试剂水解，脱3位保护，增加了产物的极性，有利于产物提纯。
本发明的有益效果是，本发明对现有技术的主要贡献在于，提供了一种从植物甾醇制备去氢表雄酮的新的路径。
现有文献中，存在这样一种认识，即去氢表雄酮的制备，是先用植物甾醇发酵生产为4-AD，然后利用化学方法得到去氢表雄酮。《微生物学通报》2006年33（2）中由天津大学化工学院化学工程系的张裕卿和王东青的《植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展》中提到，Dias等将从油脂脱臭溜出物中富集的植物甾醇混合物用分枝杆菌NRRL-3805处理得到4-AD和ADD；《生物加工过程》2010年9月第8卷第5期的《微生物发酵降解植物甾醇侧链生产17-酮甾体研究进展》中提到，可利用分枝杆菌NRRL B-3683和3805来转化植物甾醇生产AD或ADD；《天津科技大学学报》第23卷第4期的《反应介质对植物甾醇侧链生物降解的影响》考察了有机溶剂、表面活性剂和超分子等反应介质对分枝杆菌BRRL B-3683降解植物甾醇生产AD(D)的生物转化反应的影响等。这在一定程度上形成了只有先制备4-AD，然后制备去氢表雄酮的方法的认识，阻碍了其他研究方向的进行，本发明将植物甾醇的3位羟基保护起来，然后进行发酵后水解直接制得去氢表雄酮，打破了这种常规惯例，有利于更多向的研究。
本发明制备的去氢表雄酮的成本较低，相对于从植物甾醇发酵到4-AD，然后合成为去氢表雄酮，本发明的路线更短，省掉了许多反应步骤和后处理步骤，反应路线的缩短也有利于反应收率的提高，减少中间损耗。本发明采取3位羟基保护的步骤在前，发酵反应在后，直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度，有利于发酵的进行，可提高产物的收率。本发明的去氢表雄酮通过2步化学反应和一步生物发酵反应制得，减少了环境污染，有利于环境保护。
具体实施方式
实施例1
步骤1 保护反应
配料比：
| 名称 | 用量 | 名称 | 用量 |
| 植物甾醇（购买自郑州荔诺生物科技有限公司） | 10克 | 五氧化二磷 | 5克 |
| 甲缩醛（CAS号：109-87-5） | 150毫升 | 1%碳酸钠溶液 | 40 毫升 |
| 硅藻土（CAS号：61790-53-2） | 10克 |
操作方法：
按上述比例投入植物甾醇，甲缩醛，升温至25℃左右，搅拌至完全溶清，加入硅藻土，再缓慢加入五氧化二磷，加入过程中控制温度不超30℃，25℃左右搅拌1～1.5h，薄层色谱即TLC检测反应完全（TLC检测使用苯：丙酮=4：1为展开剂，20%硫酸乙醇溶液喷板，高温烘干显色，如少许未完补加少量五氧化二磷）。升温至30℃以上，趁热过滤，滤饼和反应瓶用少量甲缩醛洗涤。减压浓缩至干，加入40ml质量浓度为1%的碳酸钠溶液略微搅拌分散，甩滤，水洗，50℃烘干。得淡黄色固体，称之为“保护物”。质量收率：105%，熔点：68℃左右。TLC显示转化完全，HPLC检测无植物甾醇残留。
步骤2 发酵转化
（1）斜面培养
斜面培养基：营养肉汤琼脂斜面（购买自上海楚柏实验室设备有限公司，货号：022021）；培养条件：30℃，培养6～7天；菌株：Mycobacterium sp. NRRL B-3683。
（2）液体种子培养
液体种子培养基：
| 名称 | 用量（g/L） |
| 蛋白胨 | 10 |
| 牛肉膏 | 3 |
| 氯化钠 | 5 |
pH为7.4 ± 0.05。
摇瓶种子培养：用接种环将菌体从斜面上刮下，接种到种子药瓶，180rpm，30℃，培养40～48 h，菌体湿重为培养基总重量的2%～3%，所述菌体湿重为种子培养结束后，抽滤至无液体滴下，将菌丝体称重，即菌体湿重。
10升种子罐：火圈保护下，将培养好的摇瓶种子接种到种子罐，接种量10%，150rpm，空气流量：0.2Nm3/h，罐压：0.05MPa，种子罐装样量为70%，即7升，培养36～40 h，菌体湿重为培养基总重量的2%～3%。
（3）发酵制备
1L水中保护物为20g，转化培养基配方为：
| 名称 | 用量(g/L) | 名称 | 用量(g/L) |
| 大豆油 | 147.2 | 葡萄糖 | 10 |
| 酵母膏 | 10 | 硝酸钠 | 5 |
| 磷酸二氢钠 | 5 | 磷酸氢二钠 | 5 |
pH= 7.5；接种量：10%；摇瓶转化：30℃，150rpm，转化时间：120小时；50升罐转化：装样量70%，即35L，罐压0.05 MPa，空气流量：0.5 VVM，转化率达94%。
步骤3 水解
取样TLC分析，转化基本完全，上述发酵产物用乙酸乙酯萃取，分层，将乙酸乙酯层减压浓缩，油样送液相，原料残留6.1%。将浓缩后的油样加入5倍体积的5%的盐酸，搅拌下60℃水解1小时，样品送液相，其中DHEA（去氢表雄酮）90.23%，4-AD 0.92%，ADD 0.31%，植物甾醇4.73%。
步骤4 提纯
提纯DHEA的方法是：把上述产物分层，油层减压浓缩，将少量的水浓缩掉，加入4倍体积的甲醇，室温下搅拌30 min，静止，分层，大部分产物被萃取到甲醇中，油层再用4倍体积的甲醇萃取两次，合并甲醇层，将甲醇浓缩干，得黄色固体，烘干，加入2倍体积的石油醚，70℃回流打浆2小时，冷却至室温，抽滤，得淡黄色固体粉末，烘干，得DHEA粗品312克，粗品用1倍体积的甲苯重结晶，得类白色晶体283克，重量收率40.4%，样品送液相，DHEA归一法检测含量98.86%，主杂质4-AD含量0.25%，熔点148.9℃。
实施例2
步骤1 保护反应
配料比：
| 名称 | 用量 | 名称 | 用量 |
| 谷甾醇 | 10克 | 五氧化二氮 | 5克 |
| 甲缩醛 | 110毫升 | 1%碳酸氢钠溶液 | 50 毫升 |
| 硅胶 | 10克 |
操作方法同实施例1相当，收率：103%。
步骤2 发酵转化
斜面培养、种子培养方法同实施例1相当，发酵菌株为：Mycobacterium sp. NRRL B-3805。
1L水中保护物为20g，转化培养基配方为：
| 名称 | 用量(g/L) | 名称 | 用量(g/L) |
| 菜籽油 | 140 | 葡萄糖 | 11 |
| 酵母粉 | 9 | 硝酸钾 | 5.5 |
| 磷酸二氢钾 | 5.5 | 磷酸氢二钾 | 5.5 |
pH= 7.2；接种量：11%；摇瓶转化：30℃，180rpm，转化时间：144小时；50升罐转化：装样量70%，罐压0.05 MPa，空气流量：0.5 VVM，转化率达91%。
步骤3 水解
以5倍体积5%的硫酸代替盐酸，其他步骤同实施例1相当，样品送液相，其中DHEA 89.23%，4-AD 5.23%，ADD 1.41%，植物甾醇2.37%。
步骤4 提纯
方法同实施例1，得类白色晶体271克，重量收率38.7%，样品送液相，DHEA归一法检测含量98.01%，主杂质4-AD含量0.91%，熔点147.1℃。
实施例3
步骤1 保护反应
配料比：
| 名称 | 用量 | 名称 | 用量 |
| 麦角甾醇 | 10克 | 五氧化二氮 | 14克 |
| 甲缩醛 | 160毫升 | 1%磷酸一氢钠溶液 | 50 毫升 |
| 硅胶 | 15克 |
操作方法同实施例1相当，收率：105%。
步骤2 发酵转化
斜面培养、种子培养方法同实施例1相当，发酵菌株为：Mycobacterium sp. NRRL B-3683。
1L水中含20保护物，转化培养基配方为：
| 名称 | 用量(g/L) | 名称 | 用量(g/L) |
| 玉米油 | 147.2 | 葡萄糖 | 10 |
| 酵母膏 | 10 | 硝酸钠 | 5 |
| 磷酸二氢钠 | 5 | 磷酸氢二钠 | 5 |
pH= 6.8；接种量：9%；摇瓶转化：30℃，180rpm，转化时间：140小时；
50升罐转化：装样量70%，罐压0.045 MPa，空气流量：0.55VVM，转化率达92%。
步骤3 水解
以4倍体积20%的硫酸代替盐酸，其他步骤同实施例1相当，样品送液相，其中DHEA 86.33%，4-AD 4.27%，ADD 0.66%，植物甾醇7.24%。
步骤4 提纯
方法同实施例1，得类白色晶体269克，重量收率38.4%，样品送液相，DHEA归一法检测含量97.87%，主杂质4-AD含量1.02%，熔点147.3℃。
实施例4
步骤1 保护反应
配料比：
| 名称 | 用量 | 名称 | 用量 |
| 豆甾醇 | 10克 | 五氧化二磷 | 12克 |
| 甲缩醛 | 150毫升 | 2%磷酸二氢钠溶液 | 45 毫升 |
| 硅藻土 | 13克 |
操作方法同实施例1相当，收率：105%。
步骤2 发酵转化
斜面培养、种子培养方法同实施例1相当，发酵菌株为：Mycobacterium sp. NRRL B-3805。
1L水中含20g保护物，转化培养基配方为：
| 名称 | 用量(g/L) | 名称 | 用量(g/L) |
| 葵花籽油 | 147.2 | 葡萄糖 | 10 |
| 酵母粉 | 10 | 硝酸钾 | 5 |
| 磷酸二氢钠 | 5 | 磷酸氢二钠 | 5 |
pH= 7.0；接种量：10%；摇瓶转化：30℃，180rpm，转化时间：134小时；
50升罐转化：装样量70%，罐压0.05 MPa，空气流量：0.5 VVM，转化率达92%。
步骤3 水解
以5倍体积质量浓度10%的盐酸代替5%的盐酸，其他步骤相当，样品送液相，其中DHEA 89.35%，4-AD 5.13%，ADD 1.63%，植物甾醇2.32%。
步骤4 提纯
方法同上，得类白色晶体272克，重量收率39.3%，样品送液相，DHEA归一法检测含量98.51%，主杂质4-AD含量0.88%，熔点147.2℃。
Claims (7)
1.一种用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，使用甾醇为原料，包括如下步骤：
（1）利用甲缩醛作为保护剂，将甾醇的3位羟基进行保护，得到保护物；反应过程中加入催化剂和助滤剂，所述催化剂为五氧化二磷；
（2）利用编号为NRRL B-3683或NRRL B-3805的分枝杆菌（Mycobacterium sp.）对步骤（1）得到的保护物进行发酵；
（3）将步骤（2）的发酵产物用乙酸乙酯萃取分层，将乙酸乙酯层减压浓缩，将浓缩后的油样加入2-5倍油样体积的5-20%的盐酸或硫酸进行水解；
（4）将步骤（3）的水解产物进行提纯。
2.如权利要求1所述的用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，所述甾醇为植物甾醇。
3.如权利要求1所述的用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，所述助滤剂为硅藻土或硅胶。
4.如权利要求1所述的用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，所述甾醇和甲缩醛的摩尔比为1:20-100。
5.如权利要求1所述的用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，步骤（2）的发酵用的培养基为在1L水中，植物油140-160g、酵母膏或酵母粉9-11g、葡萄糖9-11g、硝酸钠或硝酸钾4.5-5.5g、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾4.5-5.5g、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾4.5-5.5g。
6.如权利要求1或5所述的用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，发酵用的培养基的pH值为6.8-7.6。
7.如权利要求1或5所述的用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，其特征是，步骤（2）的发酵培养的接种量为9-11%。
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