CN100376685C

CN100376685C - 微生物转化法制备雌酚酮的方法

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Publication number: CN100376685C
Application number: CNB2005100130966A
Authority: CN
Inventors: 杜连祥; 路福平; 王敏; 别松涛
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2025-01-14
Also published as: CN1680582A

Abstract

微生物转化法制备雌酚酮的方法，属于微生物制备技术。涉及以简单节杆菌为菌种，甾体(I和II)为底物，制备雌酚酮技术。本发明解决了甾体A环芳构化的难题，为生物发酵法制备雌激素药物提供一种新的路线和方法。其技术方案是：采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取工序，其中底物投料量为12～20g/L发酵液，溶氧水平在30%～50%，转化36～60h；并采用丙酮-水法特异性的分离产物使获得的产物雌酚酮符合USP26版标准。本发明工艺简单、经济实用，提高了雌酚酮的活性和质量，缩短了生产周期，降低了生产成本，促进绿色化工业的发展，既有经济效益又有社会效益。

Description

微生物转化法制备雌酚酮的方法

技术领域

本发明属于微生物制备技术，涉及一种以简单节杆菌为菌种，甾体I或II为底物，用微生物转化法制备雌酚酮的方法。

背景技术

雌酚酮(estrone)是合成19-去甲基甾体等雌激素类药物(如雌二醇及雌二醇苯甲酸酯、炔诺雌二醇、雌三醇等)的重要中间体。制备雌酚酮的关键是19-去甲和A环芳构环，目前，国内外大多采用化学合成法，如用双烯酮在600℃高温下脱去19-甲基使A环芳构化，收率仅有20％；当双烯酮有C₆位双键时，得率可增至40％；接着，Tsuda等发现以使双烯酮A环芳构化的新方法，反应条件相对温和简单，即在锌粉及含水的砒啶存在下，回流反应5-8小时，收率达75％，但该法必须要求C环上含有△^9，11-位双键，否则收率极低。化学法存在着一定的缺点，反应条件剧烈，而且收率很低，要求原料有特殊的结构，需进行相应的结构改造。

1965年Sih等用微生物(CSD-10)将一步反应生成雌酚酮，这是由于该微生物含有的酶系统能够使△⁵-19-羟基-3β-乙酰氧基胆甾烯通过连续发生乙酸酯的水解、氧化、双键异构化，C_1，2位脱氢、重排、和侧连降解而成雌酚酮的结果。现有报道的微生物法存在着投料浓度低，工业化成本高的缺点，由于微生物自身存在着复杂的酶系统，不可避免的会形成一些副产物，给进一步的分离纯化带来一定的麻烦，进而增加了生产成本。

综上所述，不难看出，影响生物发酵法生产雌酚酮推广应用的关键问题是投料浓度、生产规模、生产成本以及操作的难易程度。为此，研究和开发一种工艺简单、经济实用的雌酚酮制备及其分离提取方法是当务之急。

发明内容

本发明目的是为了解决上述技术中存在的问题，克服现有微生物法制备雌酚酮，其投料浓度低、分离纯化麻烦、生产成本高的缺点，提供一种操作简单、生产环境达到环保要求，同时投料浓度高、转化率高、收率高、成本低的微生物转化法生产雌酚酮的工艺，而且产物单一，易于分离纯化。

技术方案：

采用微生物转化法制备雌酚酮，即采用简单节杆菌(Arthrobacter simplexAS1.94^*)为菌种，经制备悬液、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用丙酮和水分离产物雌酚酮，获得符合USP 26版标准的雌酚酮；具体步骤如下：

一、制备用于转化底物的发酵液

·菌种悬液的制备

生产菌种为简单节杆菌，将该生产菌株在琼脂斜面上生长1-2天后，4℃保藏待用，保藏时间在20d之内为宜；其中，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为：121℃，灭菌时间20～25min；

·一级种子培养

将上述制好的种子悬液加入到含碳源、氮源和无机磷组成的种子培养基中，在摇床上150～180r/min转速下，30～33℃培养18～22h，即得适合接种的种子培养物；

·二级发酵培养

将生长良好的种子按2％～5％(v/v)的接种量接入到含有玉米浆、蛋白胨，葡萄糖、磷酸二氢钾的发酵培养基中；在发酵过程中控制溶氧水平在30％～50％，pH值保持在6.7～7.2，培养18～22h，即得菌体培养液；

·底物的转化

底物为I或II，

底物I的结构式为：

其中R₁为CH₃CO-、HCO-或H-；

底物II的结构式为：

其中R₁为CH₃CO-、HCO-或H-；

R₂为CH₃CO-或HCO-；

将底物I或II粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为12～20g/L发酵液体积，并加入消泡剂，在转化过程中控制溶氧水平在20％～40％，pH值为7.0左右，转化36～60h，通过薄层层析或高效液相来测定转化率，当转化率在70～95％时作为发酵终点；

底物I或II的微生物转化反应式分别为：

二、从发酵液中提取、分离雌酚酮

该步骤包括：发酵液过滤、将固型物滤饼在丙酮中回流、过滤得粗品，保留滤液、去除菌体，再在滤液中加入纯水后得到固型产物。具体做法如下：

(1)、发酵液去除菌体

底物转化结束后，将发酵液减压过滤，取固型物滤饼、烤干，然后加入丙酮，回流溶解至澄清，再经过滤，保留滤液，除去菌体；

(2)、产物的分离与精制

在上述滤液中，加入相当于滤液体积2-4倍的水，有固体产物析出后，减压过滤，然后用水洗涤上述固体产物、水量为相当于固体产物重量8～10倍，再经烘干，即得质量符合USP 26版标准的雌酚酮成品III。

需要说明的是：

在菌种悬液制备时，琼脂斜面菌种在30℃恒温培养。在从发酵液中提取、分离雌酚酮步骤中，当固型物滤饼于丙酮中回流时，丙酮重量为固型物滤饼的10～15倍，回流时间1～2h。

在产物的分离与精制时，当固体产物析出后，经减压过滤，用水洗涤固体产物，水量为固体产物重量的8～10倍，最后于60-80℃烘干。

所加消泡剂为聚醚类，加入量为相对于发酵液体积的万分之一至万分之三。

有益效果

本发明包括雌酚酮的微生物转化和雌酚酮的提取、分离两方面技术。其有益效果是利用微生物转化法生产雌酚酮所采用的工艺与化学法制备相比较，微生物法的收率较高，所得产品雌酚酮同样都达到USP 26版标准的情况下，原料成本降低了40％以上，成品收率提高了30％以上。同时，微生物转化法生产工艺对周围环境污染非常轻微，几乎没有污染，生产中为常压工作，操作工序简单，无其它危险。本发明制备雌酚酮的方法，其生产环境达到环保要求，同时投料浓度高、周期短、收率高，而且产物单一，易于分离纯化，可带来较高的社会和经济效益。微生物法制备雌酚酮其提取分离过程中采用丙酮-水法，一次完成，无需重结晶，专一性强，提取分离率高。所得的雌酚酮外观蓬松，洁白，纯度高，核磁共振显示活性高于化学合成法制备的雌酚酮。

具体实施方式：

实施例1：

生产菌种为简单节杆菌(Arthrobacter simplex AS1.94^*)，将该生产菌株在琼脂斜面上30℃恒温培养2天，菌体在斜面上已完全长好，从外观上看呈淡乳黄色，丰满而有光泽；在光学显微镜下菌体形状多数呈杆状，有部分呈折角状。4℃保藏5d使用。其中，制作菌体种子悬液采用的液体为新鲜种子培养基，灭菌条件为：121℃20min。

种子培养基由碳源、氮源和无机磷组成，即：

葡萄糖 8g/L

玉米浆 10g/L

KH₂PO₄ 1.5g/L

pH 7.0

将制备好的种子悬液加入到上述种子培养基中，在摇床转速150r/min下，32℃培养18h，即得适合接种的种子培养物。

发酵培养基组成：

葡萄糖 15g/L

玉米浆 20g/L

KH₂P0₄ 2.8g/L

pH 7.2

将生长良好的种子培养液80mL接入到4L上述发酵培养基中；在发酵过程中控制发酵液中溶氧水平在30％，发酵过程中pH值总保持在7.0～7.2培养18h，即得适宜于投料的菌体培养液。

将底物(I，其中R₁＝CH₃CO-)，即19-乙酰氧基-3，17-二酮-孕甾-4-烯粉碎，粒度为14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为60g，并加入聚醚类消泡剂0.4g。在转化过程中控制发酵液中溶氧水平在30％，控制pH值在7.0左右，转化36h；在转化阶段后期，通过高效液相来测定转化率，当转化率在85％时作为发酵终点。

转化结束后，将发酵液减压过滤，取固型物滤饼、烤干，重72g。然后加入720mL丙酮，回流溶解至澄清，回流时间1h，再经过滤、保留滤液、除去菌体，再向滤液中加入1728mL的纯水，有固体产物析出，经减压过滤，然后用400mL水洗涤上述固体产物，最后于60℃烘干，即得质量符合USP 26版标准的雌酚酮成品。称重、计算，结果如下：转化率＝85％、粗品率＝80％、分离率＝88％、精制率＝78％。

实施例2：

将菌株在琼脂斜面上培养1天，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水。

一级种子培养时，在摇床转速为170r/min下，30℃培养22h，即得适合接种的种子培养物；

二级种子培养时，将生长良好的种子培养液120mL接入到4L上述发酵培养基中；在发酵过程中控制发酵液中溶氧水平在40％，发酵过程中pH值总保持在7.0～7.2培养20h，即得适宜于投料的菌体培养液。

将底物(I，其中R₁＝HCO-)，即19-甲酰氧基-3，17-二酮-孕甾-4-烯粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为72g，并加入0.8g聚醚类消泡剂。在转化过程中控制发酵液中溶氧水平在35％，转化48h；在转化阶段后期，通过薄层层析测定转化率在87％作为发酵终点。

转化结束后，将发酵液减压过滤，滤饼烤干。加入1000mL丙酮，回流溶解至澄清，回流时间1.5h，过滤除去菌体，再向滤液中加入2400mL的纯水，有固体产物析出，经减压过滤，然后用600mL水洗涤上述固体产物，最后于70℃烘干，即得质量符合USP 26版标准的雌酚酮成品。称重、计算，其它同实施例1。最终结果如下：转化率＝85％、粗品率＝90％、分离率＝85％、精制率＝81％。

实施例3：

将菌株在琼脂斜面上培养2天，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水.

一级种子培养时，在摇床转速180r/min下，32℃培养20h，即得适合接种的种子培养物；

二级种子培养时，将生长良好的种子培养液200mL接入到4L上述发酵培养基中；在发酵过程中控制发酵液中溶氧水平在40％，发酵过程中pH值总保持在7.0～7.2培养22h，即得适宜于投料的菌体培养液。

将底物(I，其中R₁＝H)即19-羟基-3，17-二酮-孕甾-4-烯粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为80g，并加入1.2g聚醚类消泡剂。在转化过程中控制发酵液中溶氧水平在50％，转化60h；在转化阶段后期，通过薄层层析测定转化率在90％作为发酵终点。

转化结束后，将发酵液减压过滤，滤饼烤干。加入1425mL丙酮，回流溶解至澄清，回流时间2h，过滤除去菌体，再向滤液中加入3420mL的纯水，有固体产物析出，经减压过滤，然后用720mL水洗涤上述固体产物，最后于80℃烘干，即得质量符合USP 26版标准的雌酚酮成品。其它同实施例1。称重、计算，最终结果如下：转化率＝90％、粗品率＝85％、分离率＝92％、精制率＝82％。

实施例4：

将底物(II，其中R₁＝H，R₂＝H)即3，19-二羟基-17-酮-孕甾-5-烯粉碎，粒度14～16μ，进行转化，其它同实施例1。经分离提取的产物雌酚酮III最终结果如下：转化率＝85％、粗品率＝80％、分离率＝88％、精制率＝78％。

实施例5：

将底物(II，其中R₁＝H，R₂＝CH₃CO-)即19-羟基-3-乙酰氧基-17-酮-孕甾-5-烯粉碎，粒度14～16μ，进行转化，其它同实施例1。经分离提取的产物雌酚酮III最终结果如下：转化率＝90％、粗品率＝85％、分离率＝92％、精制率＝82％。

实施例6：

将底物(II，其中R₁＝CH₃CO-，R₂＝H)即19-乙酰氧基-3-羟基-17-酮-孕甾-5-烯粉碎，粒度14～16μ进行转化，其它同实施例2。经分离提取的产物雌酚酮III最终结果如下：转化率＝90％、粗品率＝85％、分离率＝92％、精制率＝82％。

实施例7：

将底物(II，其中R₁＝CH₃CO-，R₂＝CH₃CO-)即19-乙酰氧基-3-乙酰氧基-17-酮-孕甾-5-烯粉碎，粒度14～16μ，进行转化，其它同实施例2。经分离提取的产物雌酚酮III最终结果如下：转化率＝90％、粗品率＝85％、分离率＝92％、精制率＝82％。

实施例8：

将底物(II，其中R₁＝HCO-，R₂＝CH₃CO-)即19-甲酰氧基-3-乙酰氧基-17-酮-孕甾-5-烯粉碎，粒度14～16μ，进行转化，其它同实施例3。经分离提取的产物雌酚酮III最终结果如下：转化率＝85％、粗品率＝80％、分离率＝88％、精制率＝78％。

实施例9：

将底物(II，其中R₁＝HCO-，R₂＝H)即19-甲酰氧基-3-羟基-17-酮-孕甾-5-烯粉碎，粒度14～16μ，进行转化，其它同实施例3。经分离提取的产物雌酚酮III最终结果如下：转化率＝90％、粗品率＝85％、分离率＝92％、精制率＝82％。

Claims

1.微生物转化法制备雌酚酮的方法，其特征是采用微生物转化法制备雌酚酮，即采用简单节杆菌AS1.94^*(Arthrobacter simplexAS1.94^*)为菌种，经制备悬液、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用丙酮和水分离产物雌酚酮，获得符合USP 26版标准的雌酚酮；具体步骤如下：

一、制备用于转化底物的发酵液

·菌种悬液的制备

生产菌种为简单节杆菌，将该生产菌株在琼脂斜面上生长1-2天后，4℃保藏待用，保藏时间在20d之内；其中，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为：121℃，灭菌时间20～25min；

·一级种子培养

·二级发酵培养

·底物的转化

底物为(I)或(II)，

底物(I)的结构式为：

其中R₁为CH₃CO-、HCO-或H-；

底物(II)的结构式为：

其中R₁为CH₃CO-、HCO-或H-；

R₂为CH₃CO-或HCO-；

将底物(I)或(II)粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，投料量为12～20g/L发酵液体积，并加入消泡剂，在转化过程中控制溶氧水平在20％～40％，pH值为7.0左右，转化36～60h，通过薄层层析或高效液相来测定转化率，当转化率在70～95％时作为发酵终点；

二、从发酵液中提取、分离雌酚酮

该步骤包括：发酵液过滤、将固型物滤饼在丙酮中回流、过滤得粗品，保留滤液、去除菌体，再在滤液中加入纯水后得到固型产物，具体做法如下：

(1)、发酵液去除菌体

(2)、产物的分离与精制

在上述滤液中，加入相当于滤液体积2-4倍的水，有固体产物析出后，减压过滤，然后用水洗涤上述固体产物，再经烘干，即得质量符合USP 26版标准的雌酚酮成品(III)。

2.按照权利要求1所述的微生物转化法制备雌酚酮的方法，其特征是在菌种悬液制备时，琼脂斜面菌种于30℃恒温培养；另外，在从发酵液中提取、分离雌酚酮步骤中，当固型物滤饼于丙酮中回流时，丙酮重量为固型物滤饼的10～15倍，回流时间1～2h。

3.按照权利要求1所述的微生物转化法制备雌酚酮的方法，其特征是在产物的分离与精制时，当固体产物析出后，经减压过滤，用水洗涤固体产物，水量为固体产物重量的8～10倍，最后于60-80℃烘干。

4.按照权利要求1所述的微生物转化法制备雌酚酮的方法，其特征是所加消泡剂为聚醚类，加入量为发酵液体积的万分之一至万分之三。