CN105779554A - 微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以17α‑羟基黄体酮为起始物,利用赭曲霉和简单节杆菌混合一步发酵制备11α,17α‑二羟基‑孕甾‑1,4‑二烯‑3,20‑二酮。
Description
技术领域
本发明涉及甾体类药物的生产方法,具体来说是利用微生物联合转化发酵17α-羟基黄体酮制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法。
背景技术
甾体药物是药物中重要的一类,具有抗炎、抗免疫、避孕、抗癌、调节内分泌等多种作用,广泛应用于风湿、心血管病、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病、激素依赖性肿瘤等疾病的治疗。
甾体激素药物生产中,甾体母核的多个基团需要经过化学法和微生物进行修饰,其中C11α-羟基化和C1,2脱氢引入双键是重要的甾体转化反应,对于甾体药物的合成及结构改造具有重要意义,目前工业上此两类转化反应主要通过微生物分步转化。
目前,用于甾体C11α-羟基化反应的微生物主要有黑根霉、绿僵菌、赭曲霉、黄曲霉、青霉、诺卡氏菌等。黑根霉、赫曲霉、绿僵菌是近年国内研究较多的甾体C11α-羟基化微生物。但是文献报道(赵玮玮,2012年硕士论文《赭曲霉发酵法催化甾体11α-羟基化反应研究》、微生物学通报1999年26(6)P417)赭曲霉在转化后期产生与产物难以分离的砖红色色素,绿僵菌也存在活性不稳定、转化不专一的缺点,限制了其工业化应用。工业生产上,国内普遍使用黑根霉进行C11α-羟基化反应,但是现有工艺转化率不高。
目前,用于甾体C1,2脱氢引入双键反应的微生物主要有:简单节杆菌、分支杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌等。
17α-羟基黄体酮(17α-hydroxyprogesterone)全称17α-羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮,又名羟孕酮。以17α-羟基黄体酮为底物利用微生物进行C11α-羟基化是甾体生物转化中的一个重要反应,得到的C11α-羟基化产物11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮是甾体合成重要中间体。11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮或其衍生物经过微生物C1,2脱氢等反应可以合成地塞米松、强的松龙、强的松和肤轻松等药物。
目前现有技术中甾体微生物C11位羟基化反应和C1,2位脱氢主要是分两步进行的,前一步反应完成后需要进行后处理,加大了产品后处理成本及发酵能耗,而且降低了产品收率。中国专利CN201210316179.2报道了利用赭曲霉和简单节杆菌微生物联合转化发酵4-AD制备11α-OH-ADD的方法,但是经多次试验发现该方法不易重复,目标产物的收率和含量均未超过50%。联合转化发酵在技术上存在很大难度,主要是由于不同菌的生长和发酵条件,例如:温度、培养基、pH值不同,很难在同一发酵条件下使两种菌各自发挥最大酶活力。因此,寻找适合不同菌发酵的培养基非常重要。
目前尚无以17α-羟基黄体酮为底物利用微生物联合转化发酵一步制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种发酵能耗较小,节约成本并提高产品收率的微生物联合转化发酵17α-羟基黄体酮(I)制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(II)的方法。
本发明的反应路线如下:
本发明涉及一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是经赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500和简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94混合一步发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是1L水中,发酵培养基的组分和重量为葡萄糖10g-30g,蚕蛹粉2g-7g,玉米浆20g-30g,硫酸铵0.5g-5g,磷酸二氢钾2g-5g,磷酸二氢钠2g-5g,泡敌0.1g-0.4g。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是1L水中,发酵培养基的组分和重量为葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是发酵培养基的pH为5.7-6.5。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是简单节杆菌的接种量为15%-20%,赭曲霉的接种量为25%-30%。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是简单节杆菌的接种量为15%,赭曲霉的接种量为30%。
本发明的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500和节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94通过常规的斜面培养和种子培养,得到发酵用菌。
赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500
斜面培养
斜面培养基:土豆培养基
培养条件:28℃
培养时间:5-7天
液体种子培养基
名称 | 用量(g/L) |
葡萄糖 | 20 |
蚕蛹粉 | 0.5 |
硫酸铵 | 1.1 |
玉米浆 | 35 |
pH=6.5,孢子悬浮液:用无菌水洗孢子斜面,制成孢子悬液,镜检计数,孢子浓度4~5×107个/Ml;摇瓶种子培养:接种量10%,180rpm,28℃,培养24小时;400L种子罐:接种量10%,180rpm,空气流量:20m3/hr,罐压:0.05MPa,培养20小时,种子湿重为7%~10%。种子湿重的计算方法为:4000rpm离心10min,弃上清液,收集菌体,称重,菌体重量占培养基总重量的百分数。
简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94
斜面培养
斜面培养基:土豆培养基
培养条件:31℃
培养时间:5-7天
液体种子培养基
名称 | 用量(g/L) |
葡萄糖 | 20 |
磷酸二氢钾 | 1 |
玉米浆 | 20 |
pH=7.0,孢子悬浮液:用无菌水洗孢子斜面,制成孢子悬液,镜检计数,孢子浓度4~5×107个/Ml;摇瓶种子培养:接种量10%,180rpm,33℃,培养24小时;400L种子罐:接种量10%,180rpm,空气流量:20m3/hr,罐压:0.05MPa,培养22小时,种子湿重为2%~3%。种子湿重的计算方法为:4000rpm离心10min,弃上清液,收集菌体,称重,菌体重量占培养基总重量的百分数。
由于真菌和细菌的发酵条件完全不同,简单节杆菌为细菌,生长和转化的适宜温度为30-34℃,适宜的pH为7.0-7.5;赭曲霉是真菌,生长转化的适宜温度为25-28℃,适宜的pH为5.5-6.5。因此,联合转化的技术难点和关键点是优化到适合的发酵培养基配方,在该发酵培养基中,赭曲霉可以产生C11α羟化酶,同时简单节杆菌可生成脱氢酶,并且酶活力不亚于单独转化时的酶活力,从而完成脱氢和上羟的生物联合转化。
通过大量实验发现,本发明的发酵条件,对于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94C1,2位脱氢单步反应或赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500C11位上羟单步反应来说并非最优条件,但是却适用于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94和赭曲霉Aspergillus ochraceusATCC18500混合发酵,参见对照实施例1~8。相对于单独使用上述的两种菌分步进行上羟反应和脱氢反应,本发明通过两菌联合发酵17α-羟基黄体酮得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮,总收率提高,减少了操作步骤、能耗和生产周期,降低了生产成本和劳动强度,有利于科学管理,符合现在的低能耗高输出要求。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述,这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。相关技术人员应理解,对本发明的技术特征所作的等同替换,或相应的改进,仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1发酵培养基的选择
在下面的实施例中考查了发酵培养基对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例1-1
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.6%,17α-羟基黄体酮含量2.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.6%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩得到白色晶体,粗品收率90.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.6%。
实施例1-2
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖30g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.1%,17α-羟基黄体酮含量2.6%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.9%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.2%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.7%。
实施例1-3
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉7g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.6%,17α-羟基黄体酮含量2.7%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.8%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.9%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.9%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.3%。
实施例1-4
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆20g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.1%,17α-羟基黄体酮含量3.0%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.1%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.8%。
实施例1-5
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵5g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.8%,17α-羟基黄体酮含量2.9%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.6%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率90.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.9%。
实施例1-6
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾5g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.2%,17α-羟基黄体酮含量3.0%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.4%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.4%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.4%。
实施例1-7
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠2g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.5%,17α-羟基黄体酮含2.8%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.7%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率90.1%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.4%。
实施例1-8
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.1g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.9%,17α-羟基黄体酮含量2.8%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.4%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.9%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率90.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.5%。
实施例1-9
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖10g,蚕蛹粉2g,玉米浆15g,硫酸铵0.5g,磷酸二氢钾3g,磷酸二氢钠3g,泡敌0.2g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量91.9%,17α-羟基黄体酮含量2.6%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.9%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量1.0%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.2%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.7%。
实施例2接种量的选择
在下面的实施例中考查了两种菌的接种量对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例2-1
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量20%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.9%,17α-羟基黄体酮含量2.8%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.9%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率88.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.6%。
实施例2-2
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照25%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.1%,17α-羟基黄体酮含量2.9%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.6%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.9%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率88.6%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.8%。
实施例2-3
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.2%,17α-羟基黄体酮含量2.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.6%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.7%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.1%。
实施例2-4
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量20%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照25%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.6%,17α-羟基黄体酮含量2.7%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.7%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率88.8%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.8%。
实施例3发酵培养基pH的选择
在下面的实施例中考查了发酵培养基pH对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例3-1
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为5.7。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量10%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量15%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.3%,17α-羟基黄体酮含量2.6%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.3%。
实施例3-2
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为6.5。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量15%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量20%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.2%,17α-羟基黄体酮含量2.7%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.4%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.6%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率90.2%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.4%。
实施例3-3
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为5.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量15%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量20%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量78.4%,17α-羟基黄体酮含量9.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量4.5%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量5.6%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率89.7%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量80.7%。
实施例3-4
在1L水中,发酵底物17α-羟基黄体酮30g,发酵培养基的组分葡萄糖15g,蚕蛹粉5g,玉米浆30g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾2g,磷酸二氢钠5g,泡敌0.4g,pH为7.0。简单节杆菌二级培养,一级种子培养24小时后,按接种量15%接入到二级种子培养基中,二级培养22小时后,按照接种量20%接入到上述发酵培养基中;赭曲霉一级种子培养24小时后,按照30%接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化,装液量80%,罐压0.05MPa,空气流量40m3/hr,温度28℃,搅拌180rpm,转化72小时,取样TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层送HPLC,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量75.6%,17α-羟基黄体酮含量10.6%,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量6.5%,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量6.6%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到白色晶体,粗品收率90.5%,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量79.5%。
对比实施例1
在本发明微生物联合发酵条件下,以17α-羟基黄体酮为底物利用赭曲霉Aspergillusochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮
实验:斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如实施例1-1所述,发酵培养基底物为17α-羟基黄体酮,含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化,28℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量75%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮粗品,收率86.5%。
对比实施例2
在赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500单菌优化发酵条件下,以17α-羟基黄体酮为底物利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮
实验:斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如下:1L水中,葡萄糖30g,蚕蛹粉0.5g,硫酸铵1.1g,玉米浆35g,pH6.5,发酵培养底物为17α-羟基黄体酮,含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化,28℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量83.2%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮粗品,收率88%。
对比实施例3
在本发明微生物联合发酵条件下,以17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮为底物利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如实施例1-1所述,发酵培养基底物由17α-羟基黄体酮替换为17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮,含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化,28℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量48.6%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品,收率85.9%。
对比实施例4
在赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500单菌优化发酵条件下,以17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮为底物利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如下:1L水中,葡萄糖35g,蚕蛹粉0.2g,硫酸铵1.0g,玉米浆40g,pH6.5,发酵培养基底物由17α-羟基黄体酮替换为17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮,含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化,28℃,180rpm,转化72小时,其他条件不变,取样送HPLC检测,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量57.4%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品,收率87.2%。
对比实施例5
在本发明微生物联合发酵条件下,以17α-羟基黄体酮为底物利用简单节杆菌Arthrobactersimplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如实施例1-1所述,发酵培养底物为17α-羟基黄体酮,含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化,33℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量72.1%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品,收率85.2%。
对比实施例6
在简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94单菌优化发酵条件下,以17α-羟基黄体酮为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如下:1L水中,葡萄糖20g,玉米浆20g,磷酸氢二钾1g,pH7.3,底物为17α-羟基黄体酮,含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化,33℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量82.3%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品,收率87.8%。
对比实施例7
在本发明微生物联合发酵条件下,以11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如实施例1-1所述,底物由17α-羟基黄体酮替换为11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮,含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化,33℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量80.5%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品,收率86.1%。
对比实施例8
在简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94单菌优化发酵条件下,以11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述,发酵培养基如下:1L水中,1L水中,葡萄糖25g,玉米浆22g,磷酸氢二钾1.5g,pH7.5,发酵培养基底物由17α-羟基黄体酮替换为11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮,含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化,33℃,180rpm,转化72小时,取样送HPLC检测,11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量84.4%。
转化完毕,85℃发酵液灭活,冷却到室温,抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取,浓缩,得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品,收率88.2%。
以17α-羟基黄体酮为底物,通过微生物两步转化制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的途径有两种:(1)17α-羟基黄体酮利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500微生物上羟基,然后将得到的11α,17α-二羟基黄体酮利用简单节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94C1,2位脱氢得到目标产物,例如对照实施例2和对照实施例8的结合。(2)17α-羟基黄体酮利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94C1,2位脱氢,然后将得到的17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500微生物上羟得到目标产物,例如对照实施例6和对照实施例4的结合。
对照实施例2、4、6、8的发酵条件为针对不同底物下简单节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94C1,2位脱氢或赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500C11位上羟的优化条件。每个分步转化在优化发酵条件下,转化效果好于本发明所述的联合转化发酵条件(参见对照实施例1、3、5、7)。虽然本发明的发酵条件,对于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94C1,2位脱氢单步反应或赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500C11位上羟单步反应来说并非最优条件,但是却适用于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94和赭曲霉Aspergillus ochraceusATCC18500联合转化发酵。相对于单独使用上述的两种菌分步进行上羟反应和脱氢反应(例如对照实施例2和对照实施例8的结合),本发明通过两菌联合发酵17α-羟基黄体酮得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮,总收率提高,减少了一步培养基消毒,减少了一步后处理的过滤、提取以及精制,减少了能耗和生产周期,降低了生产成本和劳动强度。
Claims (6)
1.一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是经赭曲霉Aspergillus ochraceusATCC18500和简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94混合一步发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
2.根据权利要求1所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是1L水中,发酵培养基的组分和重量为葡萄糖20g-30g,蔗糖10g-20g,蚕蛹粉5g-10g,玉米浆20g-30g,磷酸氢二铵2g-5g,磷酸二氢铵2g-5g,泡敌0.1g-0.4g。
3.根据权利要求2所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是1L水中,发酵培养基的组分和重量为葡萄糖20g,蔗糖20g,蚕蛹粉5g,玉米浆20g,磷酸氢二铵5g,磷酸二氢铵2g,泡敌0.2g。
4.根据权利要求2~3任一所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是发酵培养基的pH为5.7-6.5。
5.根据权利要求1~3任一所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是简单节杆菌的接种量为15%-20%,赭曲霉的接种量为25%-30%。
6.根据权利要求5所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物,利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法,其特征是简单节杆菌的接种量为15%,赭曲霉的接种量为30%。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160720 |