CN105779554A - 微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法 - Google Patents

微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法 Download PDF

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赵春霞
王淑丽
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Abstract

本发明以17α‑羟基黄体酮为起始物，利用赭曲霉和简单节杆菌混合一步发酵制备11α,17α‑二羟基‑孕甾‑1,4‑二烯‑3,20‑二酮。

Description

微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法
技术领域
本发明涉及甾体类药物的生产方法，具体来说是利用微生物联合转化发酵17α-羟基黄体酮制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法。
背景技术
甾体药物是药物中重要的一类，具有抗炎、抗免疫、避孕、抗癌、调节内分泌等多种作用，广泛应用于风湿、心血管病、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病、激素依赖性肿瘤等疾病的治疗。
甾体激素药物生产中,甾体母核的多个基团需要经过化学法和微生物进行修饰，其中C11α-羟基化和C1,2脱氢引入双键是重要的甾体转化反应，对于甾体药物的合成及结构改造具有重要意义，目前工业上此两类转化反应主要通过微生物分步转化。
目前，用于甾体C11α-羟基化反应的微生物主要有黑根霉、绿僵菌、赭曲霉、黄曲霉、青霉、诺卡氏菌等。黑根霉、赫曲霉、绿僵菌是近年国内研究较多的甾体C11α-羟基化微生物。但是文献报道(赵玮玮，2012年硕士论文《赭曲霉发酵法催化甾体11α-羟基化反应研究》、微生物学通报1999年26(6)P417)赭曲霉在转化后期产生与产物难以分离的砖红色色素，绿僵菌也存在活性不稳定、转化不专一的缺点，限制了其工业化应用。工业生产上，国内普遍使用黑根霉进行C11α-羟基化反应，但是现有工艺转化率不高。
目前，用于甾体C1,2脱氢引入双键反应的微生物主要有：简单节杆菌、分支杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌等。
17α-羟基黄体酮(17α-hydroxyprogesterone)全称17α-羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮，又名羟孕酮。以17α-羟基黄体酮为底物利用微生物进行C11α-羟基化是甾体生物转化中的一个重要反应，得到的C11α-羟基化产物11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮是甾体合成重要中间体。11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮或其衍生物经过微生物C1,2脱氢等反应可以合成地塞米松、强的松龙、强的松和肤轻松等药物。
目前现有技术中甾体微生物C11位羟基化反应和C1,2位脱氢主要是分两步进行的，前一步反应完成后需要进行后处理，加大了产品后处理成本及发酵能耗，而且降低了产品收率。中国专利CN201210316179.2报道了利用赭曲霉和简单节杆菌微生物联合转化发酵4-AD制备11α-OH-ADD的方法，但是经多次试验发现该方法不易重复，目标产物的收率和含量均未超过50％。联合转化发酵在技术上存在很大难度，主要是由于不同菌的生长和发酵条件，例如：温度、培养基、pH值不同，很难在同一发酵条件下使两种菌各自发挥最大酶活力。因此，寻找适合不同菌发酵的培养基非常重要。
目前尚无以17α-羟基黄体酮为底物利用微生物联合转化发酵一步制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种发酵能耗较小，节约成本并提高产品收率的微生物联合转化发酵17α-羟基黄体酮(I)制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(II)的方法。
本发明的反应路线如下：
本发明涉及一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是经赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500和简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94混合一步发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖10g-30g，蚕蛹粉2g-7g，玉米浆20g-30g，硫酸铵0.5g-5g，磷酸二氢钾2g-5g，磷酸二氢钠2g-5g，泡敌0.1g-0.4g。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是发酵培养基的pH为5.7-6.5。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％-20％，赭曲霉的接种量为25％-30％。
所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％，赭曲霉的接种量为30％。
本发明的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500和节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94通过常规的斜面培养和种子培养，得到发酵用菌。
赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500
斜面培养
斜面培养基：土豆培养基
培养条件：28℃
培养时间：5-7天
液体种子培养基
名称 用量(g/L)
葡萄糖 20
蚕蛹粉 0.5
硫酸铵 1.1
玉米浆 35
pH＝6.5，孢子悬浮液：用无菌水洗孢子斜面，制成孢子悬液，镜检计数，孢子浓度4～5×107个/Ml；摇瓶种子培养：接种量10％，180rpm，28℃，培养24小时；400L种子罐：接种量10％，180rpm，空气流量：20m3/hr，罐压：0.05MPa，培养20小时，种子湿重为7％～10％。种子湿重的计算方法为：4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，称重，菌体重量占培养基总重量的百分数。
简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94
斜面培养
斜面培养基：土豆培养基
培养条件：31℃
培养时间：5-7天
液体种子培养基
名称 用量(g/L)
葡萄糖 20
磷酸二氢钾 1
玉米浆 20
pH＝7.0,孢子悬浮液：用无菌水洗孢子斜面，制成孢子悬液，镜检计数，孢子浓度4～5×107个/Ml；摇瓶种子培养：接种量10％，180rpm，33℃，培养24小时；400L种子罐：接种量10％，180rpm，空气流量：20m3/hr，罐压：0.05MPa，培养22小时，种子湿重为2％～3％。种子湿重的计算方法为：4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，称重，菌体重量占培养基总重量的百分数。
由于真菌和细菌的发酵条件完全不同，简单节杆菌为细菌，生长和转化的适宜温度为30-34℃，适宜的pH为7.0-7.5；赭曲霉是真菌，生长转化的适宜温度为25-28℃，适宜的pH为5.5-6.5。因此，联合转化的技术难点和关键点是优化到适合的发酵培养基配方，在该发酵培养基中，赭曲霉可以产生C11α羟化酶，同时简单节杆菌可生成脱氢酶，并且酶活力不亚于单独转化时的酶活力，从而完成脱氢和上羟的生物联合转化。
通过大量实验发现，本发明的发酵条件，对于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94C1,2位脱氢单步反应或赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500C11位上羟单步反应来说并非最优条件，但是却适用于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94和赭曲霉Aspergillus ochraceusATCC18500混合发酵，参见对照实施例1～8。相对于单独使用上述的两种菌分步进行上羟反应和脱氢反应，本发明通过两菌联合发酵17α-羟基黄体酮得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，总收率提高，减少了操作步骤、能耗和生产周期，降低了生产成本和劳动强度，有利于科学管理，符合现在的低能耗高输出要求。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。相关技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1发酵培养基的选择
在下面的实施例中考查了发酵培养基对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例1-1
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.6％，17α-羟基黄体酮含量2.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩得到白色晶体，粗品收率90.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.6％。
实施例1-2
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖30g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.1％，17α-羟基黄体酮含量2.6％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.9％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.2％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.7％。
实施例1-3
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉7g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.6％，17α-羟基黄体酮含量2.7％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.8％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.9％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.3％。
实施例1-4
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.1％，17α-羟基黄体酮含量3.0％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.1％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.8％。
实施例1-5
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵5g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.8％，17α-羟基黄体酮含量2.9％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.6％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.9％。
实施例1-6
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾5g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.2％，17α-羟基黄体酮含量3.0％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.4％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.4％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.4％。
实施例1-7
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠2g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.5％，17α-羟基黄体酮含2.8％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.7％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.1％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.4％。
实施例1-8
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.1g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.9％，17α-羟基黄体酮含量2.8％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.4％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.5％。
实施例1-9
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖10g，蚕蛹粉2g，玉米浆15g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾3g，磷酸二氢钠3g，泡敌0.2g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量91.9％，17α-羟基黄体酮含量2.6％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.9％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量1.0％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.2％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量92.7％。
实施例2接种量的选择
在下面的实施例中考查了两种菌的接种量对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例2-1
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.9％，17α-羟基黄体酮含量2.8％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.9％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.6％。
实施例2-2
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照25％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.1％，17α-羟基黄体酮含量2.9％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.6％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.6％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.8％。
实施例2-3
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.2％，17α-羟基黄体酮含量2.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.7％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.1％。
实施例2-4
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照25％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量93.6％，17α-羟基黄体酮含量2.7％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.7％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.8％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.8％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量94.8％。
实施例3发酵培养基pH的选择
在下面的实施例中考查了发酵培养基pH对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例3-1
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为5.7。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.3％，17α-羟基黄体酮含量2.6％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.5％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.7％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.3％。
实施例3-2
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为6.5。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量15％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量95.2％，17α-羟基黄体酮含量2.7％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量0.4％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量0.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.2％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量96.4％。
实施例3-3
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为5.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量15％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量78.4％，17α-羟基黄体酮含量9.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量4.5％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量5.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.7％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量80.7％。
实施例3-4
在1L水中，发酵底物17α-羟基黄体酮30g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蚕蛹粉5g，玉米浆30g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾2g，磷酸二氢钠5g，泡敌0.4g，pH为7.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量15％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；赭曲霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用5吨发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量75.6％，17α-羟基黄体酮含量10.6％，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量6.5％，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的含量6.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.5％，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量79.5％。
对比实施例1
在本发明微生物联合发酵条件下，以17α-羟基黄体酮为底物利用赭曲霉Aspergillusochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮
实验：斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如实施例1-1所述，发酵培养基底物为17α-羟基黄体酮，含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化，28℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量75％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮粗品，收率86.5％。
对比实施例2
在赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500单菌优化发酵条件下，以17α-羟基黄体酮为底物利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮
实验：斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如下：1L水中，葡萄糖30g，蚕蛹粉0.5g，硫酸铵1.1g，玉米浆35g，pH6.5，发酵培养底物为17α-羟基黄体酮，含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化，28℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮含量83.2％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮粗品，收率88％。
对比实施例3
在本发明微生物联合发酵条件下，以17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮为底物利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如实施例1-1所述，发酵培养基底物由17α-羟基黄体酮替换为17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化，28℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量48.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品，收率85.9％。
对比实施例4
在赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500单菌优化发酵条件下，以17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮为底物利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如下：1L水中，葡萄糖35g，蚕蛹粉0.2g，硫酸铵1.0g，玉米浆40g，pH6.5，发酵培养基底物由17α-羟基黄体酮替换为17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，含量30g/L,接种赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500进行C11α羟基化，28℃,180rpm，转化72小时，其他条件不变，取样送HPLC检测，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量57.4％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品，收率87.2％。
对比实施例5
在本发明微生物联合发酵条件下，以17α-羟基黄体酮为底物利用简单节杆菌Arthrobactersimplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如实施例1-1所述，发酵培养底物为17α-羟基黄体酮，含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化，33℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量72.1％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品，收率85.2％。
对比实施例6
在简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94单菌优化发酵条件下，以17α-羟基黄体酮为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如下：1L水中，葡萄糖20g，玉米浆20g，磷酸氢二钾1g，pH7.3，底物为17α-羟基黄体酮，含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化，33℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量82.3％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品，收率87.8％。
对比实施例7
在本发明微生物联合发酵条件下，以11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如实施例1-1所述，底物由17α-羟基黄体酮替换为11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮，含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化，33℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量80.5％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品，收率86.1％。
对比实施例8
在简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94单菌优化发酵条件下，以11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如下：1L水中，1L水中，葡萄糖25g，玉米浆22g，磷酸氢二钾1.5g，pH7.5，发酵培养基底物由17α-羟基黄体酮替换为11α,17α-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮，含量30g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化，33℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮含量84.4％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮粗品，收率88.2％。
以17α-羟基黄体酮为底物，通过微生物两步转化制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的途径有两种：(1)17α-羟基黄体酮利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500微生物上羟基，然后将得到的11α,17α-二羟基黄体酮利用简单节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94C1,2位脱氢得到目标产物，例如对照实施例2和对照实施例8的结合。(2)17α-羟基黄体酮利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94C1,2位脱氢，然后将得到的17α-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮利用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500微生物上羟得到目标产物，例如对照实施例6和对照实施例4的结合。
对照实施例2、4、6、8的发酵条件为针对不同底物下简单节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94C1,2位脱氢或赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500C11位上羟的优化条件。每个分步转化在优化发酵条件下，转化效果好于本发明所述的联合转化发酵条件(参见对照实施例1、3、5、7)。虽然本发明的发酵条件，对于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94C1,2位脱氢单步反应或赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500C11位上羟单步反应来说并非最优条件，但是却适用于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94和赭曲霉Aspergillus ochraceusATCC18500联合转化发酵。相对于单独使用上述的两种菌分步进行上羟反应和脱氢反应(例如对照实施例2和对照实施例8的结合)，本发明通过两菌联合发酵17α-羟基黄体酮得到11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，总收率提高，减少了一步培养基消毒，减少了一步后处理的过滤、提取以及精制，减少了能耗和生产周期，降低了生产成本和劳动强度。

Claims (6)

1.一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是经赭曲霉Aspergillus ochraceusATCC18500和简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94混合一步发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮。
2.根据权利要求1所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖20g-30g，蔗糖10g-20g，蚕蛹粉5g-10g，玉米浆20g-30g，磷酸氢二铵2g-5g，磷酸二氢铵2g-5g，泡敌0.1g-0.4g。
3.根据权利要求2所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖20g，蔗糖20g，蚕蛹粉5g，玉米浆20g，磷酸氢二铵5g，磷酸二氢铵2g，泡敌0.2g。
4.根据权利要求2～3任一所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是发酵培养基的pH为5.7-6.5。
5.根据权利要求1～3任一所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％-20％，赭曲霉的接种量为25％-30％。
6.根据权利要求5所述的一种以17α-羟基黄体酮为起始物，利用微生物联合发酵制备11α,17α-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％，赭曲霉的接种量为30％。
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