CN108085359B - 一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法 - Google Patents

一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种11α‑羟基‑4‑烯‑3,17‑雄甾二酮的生产方法，所述方法包括使用真菌将底物4‑烯‑3,17‑雄甾二酮转化为11α‑羟基‑4‑烯‑3,17‑雄甾二酮，包括以下步骤：1)收集所需菌种的孢子并进行种子培养；2)将步骤1)得到的种子置于转化罐中使用转化培养基发酵培养；3)将底物粉碎并使用30‑60％(v/v)的乙醇水溶液打浆为膏体；4)向步骤2)的转化罐内的转化培养基中分批连续添加步骤3)的底物，每次添加的量为转化罐中发酵液体积的1～3％(w/v)，每次添加的时间为4‑5小时，添加次数为2～5次；与现有技术相比，本发明提供的方法提高了底物的投料量，利用率和转化时间大大缩短了生产周期，是一种高效、环保的生产方法。

Description

一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，涉及一种甾体药物中间体的转化方法，更具体地涉及使用微生物发酵法将4-烯-3,17-雄甾二酮转化为11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的方法。
背景技术
微生物可以选择性地修饰或改造甾体化合物分子结构，这是通过微生物产生的酶催化进行的。1952年，美国普强药厂的生物化学家D.H.彼得森和微生物学家H.C.默里发现少根根霉能使孕酮的11碳位羟基化，生成11α-羟基孕酮，科学家们又相继发现细菌、真菌、放线菌中的某些种，可以使一定结构的甾体化合物在一定的部位上发生分子结构的改变。这种酶促反应具有严格的底物特异性，一般能使底物分子上1个或2个基团起反应。至今已发现微生物转化甾体化合物的反应类型几乎包括任何已知的微生物酶促反应和已经发现的化学反应，如氧化、还原、水解、缩合、异构化、新的碳碳键的形成以及杂基团的导入等。通常，一个酶促反应可以代替几个化学反应步骤，这就使甾体药物的合成工艺变得更有效并更经济。
4-烯-3,17-雄甾二酮(4-ene-3,17-androst dione，简称为雄烯二酮或4-AD结构式如下式Ⅰ所示)是一种重要的甾体药物中间体，对机体起着非常重要的调节作用，并且其被称为万能中间体，绝大多数的甾体药物都能以4-AD为底物进行合成，如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，还可以用于合成氢化可的松、氢化泼尼松、黄体酮、地塞米松等100多种药物。而在目前的世界范围内，4-AD的应用领域日益拓宽，使用4-AD作为原材料生产的医药品种不断增加。
Figure GDA0002498120770000011
11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮(结构式如下式Ⅱ所示)是合成激素药物的重要原料。在申请号为201310321321的专利中报道了11-酮基雄烯二酮和11-酮基睾酮可用于生产雄激素替代治疗药物，糖皮质激素过多症治疗药物，以及性腺功能减退性功能障碍和/或不育治疗药物，该两种药物可由11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮经过化学法制得。
Figure GDA0002498120770000021
现有技术中，主要使用两种方法生产11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮，一种是化学法，在申请号为200610027376的专利中公开了以化工副产物表氢化可的松为初始原料经过降解制得11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮，该方法收率达到了94％。该化学法虽然收率高，但是反应过程中使用大量溶剂不利于环保，同时反应底物表氢化可的松价格波动较大，而且产量不稳定，因此不利于大规模的工业化生产。另外一种是微生物发酵法，在申请号为201410174391的专利中公开了以4-AD为原料通过微生物在11位上进行羟基化，然后经过提取制得11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮。微生物发酵法虽然有利于环保，但是存在投料量低，收率低的缺点，并且由于在实际的生产过程中对发酵的控制和优化程度不够，可能极大的增加了产品的成本，并因此降低了公司的竞争力。
因此，当前对用于生产11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的高收率的生物发酵法存在需求。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法，本发明提供的方法为可以连续补充底物的微生物发酵法，通过将底物分批补加到微生物转化罐中，解决了现有技术中使用微生物发酵法生产11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮投料量低和收率低的问题。
一方面，本发明提供了一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法，所述方法包括使用真菌将底物4-烯-3,17-雄甾二酮转化为11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)收集所需菌种的孢子并进行种子培养；
2)将步骤1)得到的种子置于转化罐中使用转化培养基发酵培养；
3)将底物粉碎并使用30-60％(v/v)的乙醇水溶液打浆为膏体；
优选地，所述乙醇水溶液的浓度为40-55％(v/v)，更优选地50％(v/v)；
4)向步骤2)的转化罐内的转化培养基中分批连续添加步骤3)的底物，每次添加的量为转化罐中发酵液体积的1～3％(w/v)，每次添加的时间为4-5小时，添加次数为2～5次；
5)成品提取。
优选地，在步骤1)中，使用的菌种为赭曲霉或黑根霉；更优选地，所述菌种为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，其保藏号为ATCC18500，可以购自位于北京市海淀区中关村南大街12号的中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。
优选地，在步骤1)中，种子培养使用种子罐进行；更优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现：
a.将菌种接种于固体斜面培养基，并置于28℃的温度下，培养7-10天；优选地，所述固体斜面培养基包括以下组分：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨0.5-2g/L，麦芽提取物10-30g/L，琼脂粉10-30g/L；更优选地，所述固体斜面培养基包括以下组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨1.0g/L，麦芽提取物20g/L，琼脂粉20g/L；
优选地，在所述固体斜面培养基的制备过程中，消毒前将pH调节到5.5-6.0；
b.收集孢子，并接种到一级种子罐中培养；
优选地，所述种子罐的转速50-100rpm，通气比为0.3-0.6；
优选地，所述培养周期为35-40小时；
优选地，在种子罐中的培养基包括以下组分：葡萄糖4-7g/L，酵母粉10-20g/L，硝酸钠5-6g/L，磷酸氢二铵0.5-1.0g/L；更优选地，所述培养基包括以下组分：葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L；
优选地，在所述培养基的配制中，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟；
优选地，在一级种子罐中培养至菌浓达到3％；
c.任选地，当一级种子罐中培养至菌浓达到3％，将一级罐种子中的培养液移入二级种子罐中培养，二级种子罐接种量为10-20％(v/v)；
优选地，所述二级种子罐的转速30-50rpm，通气比为0.3-0.6，培养周期20-25h；
优选地，培养基包括以下组分：葡萄糖4-7g/L，酵母粉10-20g/L，硝酸钠5-6g/L，磷酸氢二铵0.5-1.0g/L；更优选地，培养基包括以下组分：葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L；
优选地，在所述培养基的配制中，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟；
优选地，在二级种子罐中培养至菌浓达到5％；
在一个优选的实施方案中，所述菌浓的测定方法为：
取10mL发酵液利用布氏漏斗抽滤，抽到不再有水滴漏下，测滤饼湿重：菌浓计算公式为
Figure GDA0002498120770000041
优选地，在步骤2)中，所述发酵培养在转化罐中进行，所述转化罐的接种量为10-20％(v/v)；
更优选地，在步骤2)中，所述转化罐的条件为：
初始转速为20-40rpm，优选30rpm；
风量为100-300m3/h，优选为200m3/h；
罐压为0.01-0.10MPa，优选为0.05MPa；
优选地，所述述转化罐的标定溶氧电极为100％；
优选地，所述培养温度为26-30℃；更优选地为28℃；
优选地，在步骤2)中，在发酵过程中，使溶氧保持在发酵开始时溶氧的20-30％；
优选地，在步骤2)中，所述发酵时间为20-25h；
优选地，在步骤2)中，所述转化培养基包括以下组分：葡萄糖15-40g/L，酵母膏2-10g/L，硫酸铵0.5-3g/L，磷酸氢二铵0.5-3g/L；更优选地，所述转换培养基包括以下组分：葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸氢二铵1g/L。
优选地，在步骤3)中，将底物4-烯-3,17-雄甾二酮加入到30-60％(v/v)乙醇水溶液，优选地为50％(v/v)的乙醇水溶液中，其中底物与所述溶液的质量体积之比为1-3:1-4(g/ml)，优选地为2:3g/ml；
更优选地，将所述底物与溶液的混合物在30～35℃的温度下搅拌均匀；
优选地，在底物使用前，将其粉碎至粒径为10-20μm；更优选地，所述粉碎使用气流粉碎机进行。
优选地，在步骤4)中，当转化罐中葡萄糖浓度与初始的葡萄糖浓度相比，减少1g/L及以上时，准备添加底物；
每次补充的底物的量为转化罐中发酵液体积1％-3％(w/v)；优选地为1％-2％(w/v)，更优选地为2％(w/v)；补充次数为2～5次，优选地为2次或3次，更优选地为3次。
优选地，每次补充底物的时间控制在4-5小时；
优选地，在补充底物后，补充葡萄糖，使发酵过程中葡萄糖浓度为1-5g/L；
优选地，在每次补料完成后检测转化进程，当转化率达到60-70％时，进行下一次补料；优选地，所述检测的间隔时间为4-8小时；优选地，所述检测使用HPLC进行；
优选地，在步骤5)中，所述成品提取采用板框过滤并萃取获得成品。该步骤为本领域的常规技术手段，是本领域技术人员所熟知的。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括以下步骤:
1.收集所需菌种的孢子并进行种子培养：
1.1孢子茄形瓶生产
将保存的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500的种子接种到固体斜面培养基上，放置于28℃的培养箱中，培养7-10天后，斜面表层孢子为灰白色，斜面背面为暗红色有褶皱；然后，放到4度冷藏备用。
所述固体斜面培养基包括：葡萄糖20g/L，蛋白胨1.0g/L，麦芽提取物
20g/L，琼脂粉20g/L，消毒前pH调节到5.5-6.0
1.2一级种子罐
将步骤1的孢子铲到无菌水中，然后接种于一级种子罐中培养；接种后，所述一级种子罐的转速为50-100rpm，通气比为0.3-0.6，培养周期为35-40小时；
其中，所述一级种子罐为500L体积；
所述培养基包括以下组分：葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟。
1.3二级种子罐
当一级种子罐的菌浓达到3％时，将一级种子罐中的培养液移入二级种子罐，二级种子罐接种量为10-20％(v/v)；移完后，所述二级种子罐转速30-50rpm，通气比为0.3-0.6，周期20-25h。二级种子罐规格为3吨，培养基组分为葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟。
菌浓测定方法为取10mL发酵液利用布氏漏斗抽滤，抽到不再有水滴漏下，测滤饼湿重。
2.将步骤1得到的种子置于转化培养基中发酵培养；
当二级种子罐菌浓达到5％时移入转化罐中，接种量为10-20％(v/v),转化罐规格为15吨；
移完种子后，转化罐的初始转速为30rpm，风量为200m3/h，罐压为0.05MPa，标定溶氧电极为100％，培养温度为28℃；
随着种子的生长，转化罐中溶氧逐渐降低，保持风量不变逐渐提高转速使溶氧保持在20-30％，种子生长大约20-25h，发酵液中葡萄糖降低到5g/L以下时准备进行第一次补料；
3.将底物粉碎并使用50％(v/v)的乙醇水溶液打浆为膏体；
在1吨补料罐中投入150L乙醇和150L无菌水，搅拌均匀后投入200kg底物4-烯-3,17-雄甾二酮，夹套升温到30-35℃，继续搅拌使混合均匀；
底物使用前经过气流粉碎机粉碎，粒度在10-20μm；
4.底物转化
将混合好的底物缓慢补入转化罐中，每次补充底物的量为转化罐中发酵液体积的2％(v/v)，控制补充底物的速度，将补充底物的时间控制在4-5小时；
本发明人发现，在该时间段中，可以避乙醇对种子产生毒害，抑制种子生长；
此时通过另外补充底物罐补入葡萄糖，使整个发酵过程中葡萄糖浓度在1-5g/L
第一次补充底物后每隔4-8小时HPLC检测转化进程，当转化率达到60-70％准备进行第二次；
5.成品提取。
与现有技术相比，本发明提供的方法具有以下有益效果：
1.提高了底物的投料量，通过连续几次补料最终的底物投料量可以达到5％-6％，远高于专利201410174391中描述的1.5％-3％的投料量。
2.提高了底物的利用率和设备的利用率，本工艺最终转化率达到了95％以上，周期为160±24h，放罐效价达到了50g/L以上；
3.与传统化学合成方法相比，本发明的方法稳定，并且有利于环保；
4.本发明的方法大大缩短了生产周期，转化效率高；
5.本发明的成品提取的操作简单、高效、环保，所得产品的纯度达到了99％以上。
具体实施方式
实施例1使用微生物发酵法生产11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮
1.1孢子茄形瓶生产
将保存的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500的种子接种到固体斜面培养基上，放置于28℃的培养箱中，培养7-10天后，斜面表层孢子为灰白色，斜面背面为暗红色有褶皱；然后，放到4度冷藏备用。
所述固体斜面培养基包括以下组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨1.0g/L，麦芽提取物20g/L，琼脂粉20g/L，消毒前pH调节到5.5-6.0
1.2一级种子罐
将步骤1的孢子铲到无菌水中，然后接种于一级种子罐中培养；接种后，所述一级种子罐的转速为50-100rpm，通气比为0.3-0.6，培养周期为35-40小时；
其中，所述一级种子罐为500L体积；
所述培养基包括以下组分：葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟。
1.3二级种子罐
当一级种子罐的菌浓达到3％时，将一级种子罐中的培养液移入二级种子罐，二级种子罐接种量为10-20％(v/v)；移完后，所述二级种子罐转速30-50rpm，通气比为0.3-0.6，周期20-25h。二级种子罐规格为3吨，培养基组分为葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟。
菌浓测定方法为取10mL发酵液利用布氏漏斗抽滤，抽到不再有水滴漏下，测滤饼湿重。
2.将步骤1得到的种子置于转化培养基中发酵培养；
当二级种子罐菌浓达到5％时移入转化罐中，接种量为10-20％(v/v),转化罐规格为15吨；
移完种子后，转化罐的初始转速为30rpm，风量为200m3/h，罐压为0.05MPa，标定溶氧电极为100％，培养温度为28℃；
随着种子的生长，转化罐中溶氧逐渐降低，保持风量不变逐渐提高转速使溶氧保持在20-30％，种子生长大约20-25h，发酵液中葡萄糖降低到5g/L以下时准备进行第一次补料；
3.将底物粉碎并使用50％(v/v)的乙醇水溶液打浆为膏体；
在1t补料罐中投入150L乙醇和150L无菌水，搅拌均匀后投入200kg底物4-烯-3,17-雄甾二酮，夹套升温到30-35℃，继续搅拌使混合均匀；
底物使用前经过气流粉碎机粉碎，粒度在10-20μm；
4.底物转化
将混合好的底物缓慢补入转化罐中，每次补充底物的量为为转化罐中发酵液体积的2％(v/v)，控制补充底物的速度，将补充底物的时间控制在4-5小时；
本发明人发现，在该时间段中，可以避乙醇对种子产生毒害，抑制种子生长；
此时通过另外补充底物罐补入葡萄糖，使整个发酵过程中葡萄糖浓度在1-5g/L
第一次补充底物后每隔4-8小时HPLC检测转化进程，当转化率达到60-70％准备进行第二次；
5.成品提取。
通过3次的连续补料后，底物转化率为95％以上时，周期大约为160±24h，效价达到50g/L以上时放罐，发酵液通过板框过滤，得到滤饼。滤饼在萃取罐中利用丙酮萃取4-5次到滤饼中产物浓度低于1g/L，对萃取液脱色浓缩得到粗品，粗品再经过氯仿、苯、甲苯等溶剂精制2-3次，得到纯度在99％以上的精品。
实施例2对比例
1)与专利201410174391使用的方法相比，本发明的方法底物的投料量达到了5-6％，效价达到了50g/L；而专利201410174391中为底物投料量为1.5％-3％，放罐效价为14.38g/L。
2)在产品质量方面该发酵工艺减少了杂质的生成使最后的产品纯度达到了99％以上，而专利201410174391中产品纯度为98.5％。
尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

Claims (1)

1.一种11α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:
( 1) .收集所需菌种的孢子并进行种子培养：
( 1.1) 孢子茄形瓶生产
将保存的赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC18500的种子接种到固体斜面培养基上，放置于28℃的培养箱中，培养7-10天后，斜面表层孢子为灰白色，斜面背面为暗红色有褶皱；然后，放到4度冷藏备用；
所述固体斜面培养基包括以下组分：
葡萄糖20g/L，蛋白胨1.0g/L，麦芽提取物20g/L，琼脂粉20g/L，消毒前pH调节到5.5-6.0；
( 1.2) 一级种子罐
将步骤1的孢子铲到无菌水中，然后接种于一级种子罐中培养；接种后，所述一级种子罐的转速为50-100rpm，通气比为0.3-0.6，培养周期为35-40小时；
其中，所述一级种子罐为500L体积；
所述培养基包括以下组分：葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟；
( 1.3) 二级种子罐
当一级种子罐的菌浓达到3％时，将一级种子罐中的培养液移入二级种子罐，二级种子罐接种量为10-20v/v％；移完后，所述二级种子罐转速30-50rpm，通气比为0.3-0.6，周期20-25h；二级种子罐规格为3吨，培养基组分为葡萄糖6g/L，酵母粉15g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，消毒前调节pH7.5-8.0，121℃-125℃消毒30-40分钟；
( 2) .将步骤1得到的种子置于转化培养基中发酵培养；
当二级种子罐菌浓达到5％时移入转化罐中，接种量为10-20v/v％,转化罐规格为15吨；
移完种子后，转化罐的初始转速为30rpm，风量为200m3/h，罐压为0.05MPa，标定溶氧电极为100％，培养温度为28℃；
随着种子的生长，转化罐中溶氧逐渐降低，保持风量不变逐渐提高转速使溶氧保持在20-30％，种子生长大约20-25h，发酵液中葡萄糖降低到5g/L以下时准备进行第一次补料；
( 3) .将底物粉碎并使用50v/v％的乙醇水溶液打浆为膏体；
在1吨补料罐中投入150L乙醇和150L无菌水，搅拌均匀后投入200kg底物4-烯-3,17-雄甾二酮，夹套升温到30-35℃，继续搅拌使混合均匀；
底物使用前经过气流粉碎机粉碎，粒度在10-20μm；
( 4) .底物转化
将混合好的底物缓慢补入转化罐中，每次补充底物的量为转化罐中发酵液体积的2v/v％，控制补充底物的速度，将补充底物的时间控制在4-5小时；
此时通过另外补充底物罐补入葡萄糖，使整个发酵过程中葡萄糖浓度在1-5g/L；
第一次补充底物后每隔4-8小时HPLC检测转化进程，当转化率达到60-70％准备进行第二次；
( 5) .成品提取。
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