CN110656146A - 一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。发明内容包括3位羟基保护反应、生长细胞生物转化、水解、精制步骤。本发明以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮，原料易得，降低了生产成本，收率更高；采取3位羟基保护的步骤在前，生长细胞生物发酵反应在后，直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度，有利于发酵的进行，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤；从原料上减少了废油的产生，造成的污染小。

Description

一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法
技术领域
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。
背景技术
去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，简称为DHEA)，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式为C19H28O2，是一种C19肾上腺甾类化合物，主要由肾上腺皮质分泌，性腺如睾丸、卵巢也有少量分泌，其生理活性作用研究范围涉及到抗癌、延缓衰老及免疫调节、抗糖尿病、防治肿瘤等。此外，DHEA在甾体类药物合成中具有非常重要的地位，以DHEA为初始化合物，通过对其母核或侧链进行修饰可以到很多具有重要生理活性和医用价值的药物。
目前，去氢表雄酮的制备方法主要包括化学方法和微生物转化法。化学方法主要依靠多步化学反应完成，传统的制备工艺是以雄烯二酮为原料，用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基，但使用化学合成方法得到的产品，常常带有一定量的3位α羟基异构体及其它杂质，收率低且步骤繁琐，使用多种有机试剂容易带来污染。专利号为CN201210316197.0的专利公开了一种用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，以植物甾醇为原料，使用保护剂保护3位β羟基，并利用分枝杆菌发酵制备去氢表雄酮，此方法有效提高了去氢表雄酮的收率，但其分枝杆菌发酵步骤中采用的是有油发酵转化，产品发酵时间长，易产生多种产物，处理分离纯化困难，值得进一步改进。专利号为CN201410414313.1的专利公开了一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，敲除了耻垢分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶编码基因MSMEG_5228，利用重组耻垢分枝杆菌单水相发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮，提高了转化率，解决了微生物发酵中所产生的废油对环境的影响，但敲除基因，构建重组菌株，涉及基因工程领域，投入大，要求高，过程繁琐。
菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种高收率，高质量，低污染，易操作的生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，包括以下步骤：
(1)3位羟基保护反应：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；
(2)生长细胞生物转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；
(3)水解：将所述发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；
(4)精制：将所述水解产物进行精制提纯，得到去氢表雄酮产品。
优选地，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为10-20:1。
优选地，所述步骤(2)中B-NRRL 3683菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；
(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。
优选地，步骤(2)中转化培养基配方包括以质量百分比计的以下成分：玉米浆1-6％，硝酸钠0.1-0.6％，磷酸氢二铵0.01-0.08％，PPE 0.1-0.2％，植物甾醇醚化物1-10％，羟丙基环糊精0.1-40％，pH＝7.5-8.0。
优选地，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。
优选地，所述步骤(2)中的生长细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化培养基，121℃灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件下接种质量百分比为10-20％的B-NRRL 3683菌种二级种子液，于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。
优选地，所述步骤(3)中盐酸的质量分数为5％，所用物料配比以体积计乙酸乙酯1-20份，5％盐酸1.5-30份；减压升温条件为-0.08MPa、45℃、5h，加入盐酸后升温至60℃，水解1-2h。
优选地，所述步骤(4)精制方法具体为：将所述水解产物70℃烘干，使用甲醇溶解、抽滤，滤液减压浓缩至小体积，降温至4℃左右抽滤、烘干，得到粗品；将所述粗品加入石油醚，70℃回流打浆2-3h，降至25℃，过滤得类白色固体，烘干，加入甲醇，升温至70℃溶解，减压浓缩至糊状，缓慢降温至0-4℃，养晶2小时，抽滤，烘干。
优选地，所述步骤(4)精制过程所用物料配比为以体积计甲醇3-6份，石油醚0.5-1份，甲醇共加入2次，第一次用量为1-2份，第二次用量为2-4份，减压升温条件为-0.08MPa、45℃、8h，养晶后干燥温度为60℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮，原料易得，降低了生产成本.
2.本发明的生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法转化时间短，产品收率和HPLC纯度高，减少废油产生，造成的污染小，经济效益好，更适合产业化生产。
3.植物甾醇的3位羟基的活性很高，在转化过程中很容易被氧化导致转化失败，本发明采用保护剂对植物甾醇3位羟基进行官能团保护，发酵后水解可直接制得去氢表雄酮，副产物少，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的分枝杆菌(mycobacterium sp.)NRRLB-3683购于上海抚生实业有限公司，所用的植物甾醇为Β-谷甾醇，购自四川省维克奇生物科技有限公司。
实施例1
斜面种子培养
菌种名称：mycobacterium sp.B-NRRL 3683
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0。
121℃灭菌30分钟。凝固成型后，在无菌条件下接种。
接种后，30℃培养4天，入4℃冰箱保存，保存时间不超过1个月。
实施例2
摇瓶种子培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0。121℃灭菌30分钟。冷却至室温。
1.2.1一级培养
在无菌条件下接种，接种量：每100毫升刮取1环斜面菌体。接种后，30℃，200rpm摇床培养48小时。
1.2.2二级培养
在无菌条件下接种，接种量：10％。接种后，30℃，200rpm摇床培养48小时。
实施例3
植物甾醇3位醚化保护
(1)物料配比：甲缩醛1500克，植物甾醇100克，硅藻土100克，五氧化二磷50克，碳酸钠4克(配成1％水溶液使用)，水200克。
(2)按比例投入植物甾醇，甲缩醛，升温到25℃，搅拌至完全溶清，加入硅藻土，再缓慢加入五氧化二磷，加入过程中控制温度不超过30℃，25℃左右搅拌1-1.5小时，薄层色谱检测反应完全，升温至30℃以上，趁热过滤，滤饼和反应瓶用少量水洗，50℃烘干。得淡黄色固体121克，称之为醚化物。
得到的醚化物粗品，加入2V丙酮，升温至50-60℃，搅拌回流30分钟，冷却至-10℃，抽滤，滤饼使用-10℃丙酮淋洗，滤饼40-50℃烘干至恒重，收白色粉末102克。
实施例4
发酵转化
(1)按照实施例1进行斜面种子培养；
(2)按照实施例2进行摇瓶种子培养；
(3)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛2000克，植物甾醇100克，硅藻土100克，五氧化二磷50克，碳酸钠4克(配成1％水溶液使用)，水200克。
(4)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。
转化培养基配方：玉米浆5.4％，硝酸钠0.54％，磷酸氢二铵0.06％，PPE 0.1％，200目植物甾醇醚化物1％，羟丙基环糊精0.1％，pH＝7.5-8.0。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5VVM，罐压0.05MPa，转化时间96小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
生物转化的反应式如下所示：
Figure BDA0002235613500000051
(5)提取
转化结束，停搅拌，静置分层2小时。
上层菌液抽入烧杯中，加入500毫升氯仿，常温搅拌萃取30分钟，静置8小时以上，分出下层氯仿层，减压浓缩至干。
下层固体抽滤干，滤出液入与上层分出的水相合并处理。
(6)水解
物料配比：乙酸乙酯1升，5％盐酸1.5升。
抽滤及减压浓缩得到的固体产物再用乙酸乙酯溶解，搅拌1h，抽滤，滤饼淋洗，作为固废，合并滤液，45℃减压浓缩至无馏分，加入5％盐酸，升温至60℃，水解1-2h，HPLC跟踪至反应完全，抽滤，弃滤液，收集滤饼。
(7)精制工序
物料配比：甲醇3升，石油醚0.5升。
水解得到的滤饼70℃烘干，使用甲醇1升溶解，抽滤，滤液减压浓缩至小体积，降温至4℃左右，抽滤，烘干。得到的产品加入石油醚，70℃回流打浆2-3h，降至25℃，过滤得类白色固体，烘干，加入2升甲醇，升温至70℃溶解，减压浓缩至糊状，缓慢降温到0-4℃，养晶2小时，抽滤，烘干，得产物DHEA精品21.5克，液相归一含量：98.19％。
实施例5发酵转化
(1)按照实施例1进行斜面种子培养；
(2)按照实施例2进行摇瓶种子培养；
(3)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛3000克，植物甾醇200克，硅藻土200克，五氧化二磷110克，碳酸钠8克(配成1％水溶液使用)，水400克。
(4)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。
转化培养基配方：玉米浆6％，硝酸钠0.6％，磷酸氢二铵0.08％，PPE 0.2％，200目植物甾醇醚化物2％，羟丙基环糊精1％，pH＝7.5-8.0。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5VVM，罐压0.05MPa，转化时间126小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(5)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，提取步骤使用的氯仿的量与实施例4相同，其他相关试剂用量为实施例3用量的2倍，减压浓缩体积为实例3的2倍。得DHEA精品43.1克，液相归一含量：98.57％。
实施例6发酵转化
(1)按照实施例1进行斜面种子培养；
(2)按照实施例2进行摇瓶种子培养；
(3)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛5000克，植物甾醇500克，硅藻土510克，五氧化二磷520克，碳酸钠40克(配成1％水溶液使用)，水1000克。
(4)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。
转化培养基配方：玉米浆1％，硝酸钠0.1％，磷酸氢二铵0.01％，PPE 0.1％，200目植物甾醇醚化物5％，羟丙基环糊精5％，pH＝7.5-8.0。
转化条件：32℃，200rpm，空气流量1vvm，罐压0.055MPa，转化时间156h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(5)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，提取步骤使用的氯仿的量与实施例4相同，其他相关试剂用量为实施例3用量的5倍，减压浓缩体积为实例3的5倍。得DHEA精品107.8g，液相归一含量：98.69％。
实施例7发酵转化
(1)按照实施例1进行种子培养；
(2)按照实施例2进行摇瓶种子培养；
(3)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛15000克，植物甾醇1000克，硅藻土1000克，五氧化二磷500克，碳酸钠40克(配成1％水溶液使用)，水2000克。
(4)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。
转化培养基配方：玉米浆6％，硝酸钠0.6％，磷酸氢二铵0.08％，PPE 0.2％，200目植物甾醇醚化物10％，羟丙基环糊精40％，pH＝7.5-8.0。
转化条件：32℃，200rpm，空气流量1vvm，罐压0.055MPa，转化时间188h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(5)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，提取步骤使用的氯仿的量与实施例4相同，其他相关试剂用量为实施例3用量的10倍，减压浓缩体积为实例3的10倍。得DHEA精品213.6g，液相归一含量：98.45％。

Claims (9)

1.一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)3位羟基保护反应：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；
(2)生长细胞生物转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；
(3)水解：将所述发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；
(4)精制：将所述水解产物进行精制提纯，得到去氢表雄酮产品。
2.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为10-20:1。
3.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL 3683菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；
(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。
4.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，步骤(2)中转化培养基配方包括以质量百分比计的以下成分：玉米浆1-6％，硝酸钠0.1-0.6％，磷酸氢二铵0.01-0.08％，PPE 0.1-0.2％，植物甾醇醚化物1-10％，羟丙基环糊精0.1-40％，pH＝7.5-8.0。
5.根据权利要求1或4所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。
6.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的生长细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化培养基，121℃灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件下接种质量百分比为10-20％的B-NRRL 3683菌种二级种子液，于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。
7.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(3)中盐酸的质量分数为5％，所用物料配比以体积计乙酸乙酯1-20份，5％盐酸1.5-30份；减压升温条件为-0.08MPa、45℃、5h，加入盐酸后升温至60℃，水解1-2h。
8.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(4)精制方法具体为：将所述水解产物70℃烘干，使用甲醇溶解、抽滤，滤液减压浓缩至小体积，降温至4℃左右抽滤、烘干，得到粗品；将所述粗品加入石油醚，70℃回流打浆2-3h，降温至25℃，过滤得类白色固体，烘干，加入甲醇，升温至70℃溶解，减压浓缩至糊状，缓慢降温至0-4℃，养晶2小时，抽滤，烘干。
9.根据权利要求1所述一种生长细胞无油转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(4)精制过程所用物料配比为以体积计甲醇3-6份，石油醚0.5-1份，甲醇共加入2次，第一次用量为1-2份，第二次用量为2-4份，减压升温条件为-0.08MPa、45℃、8h，养晶后干燥温度为60℃。
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CN115786292A (zh) * 2022-08-25 2023-03-14 福州大学 一种3α-羟基甾体脱氢酶及其在制备去氢表雄酮中的应用

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