CN105779555B - 犁头霉和节杆菌联合发酵制备11β-羟基-1,4-二烯-3,20-二酮甾体化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明以4‑烯‑3,20‑二酮甾体化合物为起始物，利用犁头霉和节杆菌联合发酵一步制备11β羟基‑1,4‑二烯‑3,20‑二酮甾体化合物。
Description
技术领域
本发明涉及甾体类药物的生产方法，具体来说是利用犁头霉和节杆菌联合发酵一步制备11β-羟基-1,4-二烯-3,20-二酮甾体化合物。
背景技术
甾体药物是药物中重要的一类，具有抗炎、抗免疫、避孕、抗癌、调节内分泌等多种作用，广泛应用于风湿、心血管病、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病、激素依赖性肿瘤等疾病的治疗。
甾体激素药物生产中,甾体母核的多个基团需要经过化学法和微生物进行修饰，其中C11β羟基化和C1,2脱氢引入双键是重要的甾体转化反应，对于甾体药物的合成及结构改造具有重要意义。
微生物的C11β羟基化反应是甾体化合物在工业上采用发酵生产的代表，也是以薯蓣皂素为原料合成氢化可的松类皮质激素药物的重要途径。目前，用于甾体C11β-羟基化反应的微生物主要有蓝色犁头霉和新月弯孢霉，两者各有所长，其中新月弯孢霉的羟化酶专一性较强，但是容易生成C14α羟基副产物，且该菌种对于底物的转化能力低，一般投料浓度仅为0.05％，如果提高投料量，则转化周期明显延长。蓝色犁头霉生长繁殖速度快，生产周期短，生产能力强，但是产生的羟化酶专一性差，在转化反应中生成的副产物多。
目前，用于甾体C1,2脱氢引入双键反应的微生物主要有：简单节杆菌、分支杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌等。
很多甾体药物都具有C11β羟基和C1，2双键官能团，在全部合成过程中可能涉及多步微生物转化。如对每步反应的产物进行提取、分离，势必造成人力、物力和时间的浪费。例如从化合物RSA(17α-羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯)开始合成泼尼松龙，需要连续的两步微生物转化反应。第一步先由霉菌导入C11β羟基，得到氢化可的松，然后再由细菌在其C1，2位上引入双键。如果能把上述提及的两步微生物转化反应一步完成，就会使整个工艺简化，并可节约大量提取用的有机溶剂，降低成本。但是联合转化发酵在技术上存在很大难度，主要是由于不同菌的生长和发酵条件，例如：温度、培养基、pH值不同，很难在同一发酵条件下使两种菌各自发挥最大酶活力。因此，寻找一种适合的微生物组合及发酵方法能够一步制备11β-羟基-1,4-二烯-3,20-二酮甾体化合物非常重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种发酵能耗较小，节约成本并提高产品收率的微生物联合转化发酵化合物(I)制备11β-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(II)的方法。
本发明涉及一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是经蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65和简单节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94混合一步发酵制备化合物II,
R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝H、OH或OCOR5，R5为六个碳以内的烷基,
R2＝α-OH或α-OCOR6，R6为六个碳以内的烷基，
R3＝H或α-OH,
或R2和R3可一起形成具有式I的部分、式II部分或者环氧结构，
其中X和Y独立地选自氢或烷基，条件是当X或Y之一是氢时，另一个是烷基；
R4＝H或甲基。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OH或OCOR5，R5为3个碳以内的烷基,
R2＝α-OH或α-OCOR6，R6为3个碳以内的烷基，
R3＝H，
R4＝H或甲基。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OH或OCOCH3,
R2＝α-OH或α-OCOCH3，
R3＝H，
R4＝H或甲基。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OH或OCOCH3,
R2＝α-OH,
R3＝H，
R4＝H。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OCOCH3,
R2＝α-OH,
R3＝H，
R4＝H。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖10-30g，蛋白胨2-8g，玉米浆20-30g，硝酸铵2-8g，磷酸二氢钾2-5g，泡敌0.1-0.4g。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是发酵培养基的pH为5.5-6.5。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％-20％，蓝色犁头霉的接种量为25％-30％。
所述的一种以化合物I为起始物，利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％，蓝色犁头霉的接种量为30％。
本发明的蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65和节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94通过常规的斜面培养和种子培养，得到发酵用菌。
蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65
斜面培养
斜面培养基：土豆培养基
培养条件：28℃
培养时间：5-7天
液体种子培养基
| 名称 | 用量(g/L) |
| 葡萄糖 | 10 |
| 蛋白胨 | 2 |
| 硫酸铵 | 5 |
| 玉米浆 | 20 |
pH＝5.5，孢子悬浮液：用无菌水洗孢子斜面，制成孢子悬液，镜检计数，孢子浓度4～5×107个/Ml；摇瓶种子培养：接种量10％，180rpm，28℃，培养24小时；400L种子罐：接种量10％，180rpm，空气流量：20m3/hr，罐压：0.05MPa，培养20小时，种子湿重为7％～10％。种子湿重的计算方法为：4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，称重，菌体重量占培养基总重量的百分数。
简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94
斜面培养
斜面培养基：土豆培养基
培养条件：31℃
培养时间：5-7天
液体种子培养基
| 名称 | 用量(g/L) |
| 葡萄糖 | 20 |
| 磷酸二氢钾 | 1 |
| 玉米浆 | 20 |
pH＝7.0,孢子悬浮液：用无菌水洗孢子斜面，制成孢子悬液，镜检计数，孢子浓度4～5×107个/Ml；摇瓶种子培养：接种量10％，180rpm，33℃，培养24小时；400L种子罐：接种量10％，180rpm，空气流量：20m3/hr，罐压：0.05MPa，培养22小时，种子湿重为2％～3％。种子湿重的计算方法为：4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，称重，菌体重量占培养基总重量的百分数。
由于真菌和细菌的发酵条件完全不同，简单节杆菌为细菌，生长和转化的适宜温度为30-34℃，适宜的pH为7.0-7.5；犁头霉是真菌，生长转化的适宜温度为25-28℃，适宜的pH为5.3-5.8。因此，联合转化的技术难点和关键点是优化到适合的发酵培养基配方，在该发酵培养基中，犁头霉可以产生C11β羟化酶，同时简单节杆菌可生成脱氢酶，并且酶活力不亚于单独转化时的酶活力，从而完成脱氢和上羟的生物联合转化。
通过大量实验发现，本发明的发酵条件，对于简单节杆菌Arthrobacter simplexAS1.94 C1,2位脱氢单步反应或蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65 C11位上羟单步反应来说并非最优条件，但是却适用于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94和蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65混合发酵，参见对照实施例1～4。相对于单独使用上述的两种菌分步进行上羟反应和脱氢反应，本发明通过两菌联合发酵制备11β-羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮甾体化合物，总收率提高，减少了操作步骤、能耗和生产周期，降低了生产成本和劳动强度，有利于科学管理，符合现在的低能耗高输出要求。
在本专利中RSA为17α-羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯；RS为17α,21-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；RS-17α,21-二醋酸酯为17α,21-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-17α，21-二醋酸酯；RS-17α醋酸酯为17α,21-二羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-17α-醋酸酯。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。相关技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1发酵培养基的选择
在下面的实施例中考查了发酵培养基对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。
实施例1-1
在1L水中，发酵底物RSA 10g，发酵培养基的组分葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g，pH为6.0。简单节杆菌二级培养，一级种子培养24小时后，按接种量10％接入到二级种子培养基中，二级培养22小时后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；蓝色犁头霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。使用30L发酵罐进行转化，装液量80％，罐压0.05MPa，空气流量40m3/hr，温度28℃，搅拌180rpm，转化72小时，取样TLC分析，底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量79.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩得到白色晶体，粗品收率90.5％，泼尼松龙含量81.2％。
实施例1-2
发酵培养基的组分为葡萄糖30g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量77.1％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.2％，泼尼松龙含量78.4％。
实施例1-3
发酵培养基的组分为葡萄糖15g，蛋白胨8g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.2％，泼尼松龙含量77.9％。
实施例1-4
发酵培养基的组分为葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆20g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.5％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.1％，泼尼松龙含量77.8％。
实施例1-5
发酵培养基的组分为葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵8g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.8％，泼尼松龙含量77.5％。
实施例1-6
发酵培养基的组分为葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾2g，泡敌0.4g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量78.1％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.3％，泼尼松龙含量79.1％。
实施例1-7
发酵培养基的组分为葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.1g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量77.7％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.9％，泼尼松龙含量78.9％。
实施例1-8
发酵培养基的组分为葡萄糖10g，蛋白胨2g，玉米浆15g，硝酸铵5g，磷酸二氢钾3.5g，泡敌0.25g，pH为6.0。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.2％，泼尼松龙含量78.0％。
实施例2接种量的选择
在下面的实施例中考查了两种菌的接种量对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。发酵底物为RSA。
实施例2-1
简单节杆菌二级培养后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；犁头霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.5％，泼尼松龙含量78.6％。
实施例2-2
简单节杆菌二级培养后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；犁头霉一级种子培养24小时后，按照25％接种量接入上述发酵培养基中。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量77.1％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.6％，泼尼松龙含量78.8％。
实施例2-3
简单节杆菌二级培养后，按照接种量15％接入到上述发酵培养基中；犁头霉一级种子培养24小时后，按照30％接种量接入上述发酵培养基中。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量80.2％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.7％，泼尼松龙含量81.1％。
实施例2-4
简单节杆菌二级培养后，按照接种量20％接入到上述发酵培养基中；犁头霉一级种子培养24小时后，按照25％接种量接入上述发酵培养基中。其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量77.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.8％，泼尼松龙含量78.8％。
实施例3发酵培养基pH的选择
在下面的实施例中考查了发酵培养基pH对目标产物转化率的影响。斜面、种子培养方法如发明内容部分所述。发酵底物为RSA。
实施例3-1
发酵培养基pH调整为6.5，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量79.3％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.5％，泼尼松龙含量80.3％。
实施例3-2
发酵培养基pH调整为5.5，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量79.2％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.5％，泼尼松龙含量80.4％。
实施例3-3
发酵培养基pH调整为5.0，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量71.4％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.7％，泼尼松龙含量72.7％。
实施例3-4
发酵培养基pH调整为7.0，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量70.6％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.7％，泼尼松龙含量71.7％。
实施例4
将发酵底物RSA替换为RS，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量77.4％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.7％，泼尼松龙含量78.6％。
实施例5
将发酵底物RSA替换为RS17α,21-二醋酸酯，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.0％，泼尼松龙含量78.1％。
实施例6
将发酵底物RSA替换为RS17α-醋酸酯，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，泼尼松龙含量76.1％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.1％，泼尼松龙含量77.5％。
实施例7
将发酵底物RSA替换为化合物7A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，甲泼尼龙含量76.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.0％，甲泼尼龙含量77.9％。
实施例8
将发酵底物RSA替换为化合物8A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物8B含量75.8％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.4％，化合物8B含量76.9％。
实施例9
将发酵底物RSA替换为化合物9A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物9B含量74.3％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.6％，化合物9B含量75.4％。
实施例10
将发酵底物RSA替换为化合物10A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物10B含量73.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.2％，化合物10B含量74.7％。
实施例11
将发酵底物RSA替换为化合物11A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物11B含量76.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.9％，化合物11B含量78.1％。
实施例12
将发酵底物RSA替换为化合物12A—17α-羟基黄体酮，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物12B含量75.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.1％，化合物12B含量76.8％。
实施例13
将发酵底物RSA替换为化合物13A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物13B含量77.1％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率89.0％，化合物13B含量78.7％。
实施例14
将发酵底物RSA替换为化合物14A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，化合物14B含量75.7％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率88.5％，化合物化合物14B含量76.7％。
实施例15
将发酵底物RSA替换为化合物15A，其他条件同实施例1-1。
经TLC分析底物转化完全，样品用乙酸乙酯萃取，将上层送HPLC，布地奈德含量74.9％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率90.0％，布地奈德含量75.7％。
对比实施例1
在本发明微生物联合发酵条件下，以RSA为底物利用蓝色犁头霉Absidiacoerulea AS3.65进行C11β羟基化制备氢化可的松
实验：斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如实施例1-1所述，发酵培养基底物为RSA，含量10g/L,接种蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65进行C11β羟基化，28℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，氢化可的松含量55％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到氢化可的松粗品，收率86.5％。
对比实施例2
在蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65单菌优化发酵条件下，以RSA为底物利用蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65进行C11β羟基化制备氢化可的松
实验：斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如下：1L水中，葡萄糖10g，蛋白胨2g，硫酸铵5g，玉米浆20g，pH5.5，发酵培养底物为RSA，含量10g/L,接种蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65进行C11β羟基化，28℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，氢化可的松含量70.2％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到氢化可的松粗品，收率88％。
对比实施例3
在本发明微生物联合发酵条件下，以氢化可的松为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备泼尼松龙。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如实施例1-1所述，底物为氢化可的松，含量10g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化，33℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，泼尼松龙含量80.5％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到泼尼松龙粗品，收率86.1％。
对比实施例4
在简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94单菌优化发酵条件下，以氢化可的松为底物利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行C1,2位脱氢制备泼尼松龙。
斜面、种子培养方法如发明内容部分所述，发酵培养基如下：1L水中，1L水中，葡萄糖25g，玉米浆22g，磷酸氢二钾1.5g，pH7.5，发酵培养基底物由RSA替换为氢化可的松，含量10g/L,接种简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94进行脱氢转化，33℃,180rpm，转化72小时，取样送HPLC检测，泼尼松龙含量84.4％。
转化完毕，85℃发酵液灭活，冷却到室温，抽滤。滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到泼尼松龙粗品，收率88.2％。
目前工业上以RSA为底物，通过微生物两步转化制备泼尼松龙的途径为RSA利用蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65微生物上羟基，然后将得到的氢化可的松利用简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94 C1,2位脱氢得到目标产物，例如对照实施例2和对照实施例8的结合。
对照实施例2为蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65 C11位上羟的优化条件。对照实施例4为简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94 C1,2位脱氢的优化条件。每个分步转化在优化发酵条件下，转化效果好于本发明所述的联合转化发酵条件(参见对照实施例1、3)。虽然本发明的发酵条件，对于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94 C1,2位脱氢单步反应或蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65 C11位上羟单步反应来说并非最优条件，但是却适用于简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94和蓝色犁头霉Absidia coeruleaAS3.65联合转化发酵。相对于单独使用上述的两种菌分步进行上羟反应和脱氢反应(例如对照实施例2和对照实施例8的结合)，本发明通过两菌联合发酵RSA得到泼尼松龙，总收率提高，减少了一步培养基消毒，减少了一步后处理的过滤、提取以及精制，减少了能耗和生产周期，降低了生产成本和劳动强度。
Claims (9)
1.一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是经蓝色犁头霉Absidia coerulea AS3.65和简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94混合一步发酵制备化合物II,
R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝H、OH或OCOR5，R5为六个碳以内的烷基,
R2＝α-OH或α-OCOR6，R6为六个碳以内的烷基，
R3＝H或α-OH,
或R2和R3可一起形成具有式I的部分、式II部分或者环氧结构，
其中X和Y独立地选自氢或烷基，条件是当X或Y之一是氢时，另一个是烷基； R4＝H或甲基；
发酵所用的培养基的组分和重量为：发酵1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖10-30g，蛋白胨2-8g，玉米浆20-30g，硝酸铵2-8g，磷酸二氢钾2-5g，泡敌 0.1-0.4g。
2.根据权利要求1所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是
R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OH或OCOR5，R5为3个碳以内的烷基,
R2＝α-OH或α-OCOR6，R6为3个碳以内的烷基，
R3＝H，
R4＝H或甲基。
3.根据权利要求1所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是
R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OH或OCOCH3,
R2＝α-OH或α-OCOCH3，
R3＝H，
R4＝H或甲基。
4.根据权利要求1所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是
R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OH或OCOCH3,
R2＝α-OH,
R3＝H，
R4＝H或甲基。
5.根据权利要求1所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是
R1、R2、R3、R4彼此独立地选择且其中：
R1＝OCOCH3,
R2＝α-OH,
R3＝H，
R4＝H。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是1L水中，发酵培养基的组分和重量为葡萄糖15g，蛋白胨5g，玉米浆30g，硝酸铵2g，磷酸二氢钾5g，泡敌0.4g。
7.根据权利要求6所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是发酵培养基的pH为5.5-6.5。
8.根据权利要求6所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％-20％，蓝色犁头霉的接 种量为25％-30％。
9.根据权利要求8所述的一种以化合物I为起始物利用微生物联合发酵制备化合物II的方法，其特征是简单节杆菌的接种量为15％，蓝色犁头霉的接种量为30％。
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