CN103343155B - 一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法，所述方法包括利用偶发分枝杆菌ATCC35855对植物甾醇进行发酵培养，使之转化为9a-羟基雄烯二酮的步骤。该方法利用偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855，以及相应的发酵液和发酵工艺制备9a-羟基雄烯二酮，可采用价格低廉的植物甾醇作为底物，且制得的9a-羟基雄烯二酮产率高，副产物少，发酵时间短，为高效率工业化生产9a-羟基雄烯二酮提供了良好的途径。

Description

一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法

技术领域

本发明涉及一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法，尤其涉及一种利用偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855制备9a-羟基雄烯二酮的方法。

背景技术

9a-羟基雄烯二酮(9a-hydroxy androstenedione),简称9a-OH AD，分子结构如下式1所示,是最早由R.M.Dodson于1958年从诺卡氏菌（Nocardia）A20-10发酵液中分离出一种甾体物质(J.Amer.Chem.Soc80：6148，1958)。

[式1]

9a-OH AD是一种重要的甾体激素类药物合成的中间体，可用于合成皮质激素(corticoids）(J.Org.Chem.,57:961-965，1992)，抗雄性激素（antiandrogenic）、抗雌性激素（antiestrogenic）以及避孕（antifertility）功能药物。此外，由于C9a-羟基很容易与C11进行脱氢生成C9,11-脱氢甾体，更利于合成9a-卤代-11β-羟基甾体（美国专利No.2,852,511），如9a-氟氢化可地松，以及其他相关甾体衍生物。因此，9a-OHAD作为一种甾体药物中间体的重要性越来越明显。并且越来越多的研究者对于高效率制备9a-OH AD进行了大量的研究。

目前制备9a-OH AD主要包括以下两种途径制备：第一种途径采用诺卡氏菌（Nocardia）、红球菌(Rhodococcus)、棒杆菌（Corynebacterium）以及Cylindrocarpon radicicola，对底物雄烯二酮（AD）进行9a-羟基化，生成9a-羟基雄烯二酮(9a-OH AD)。第二种途径采用偶发分枝杆菌（Mycobacteriumsp）对单一的植物甾醇底物进行侧链降解以及9a-羟基化等一系列生化反应生成9a-OH AD。

可以看出，第一种途径的反应步骤简单，但是该途径存在两个缺陷：1）雄烯二酮（AD）转化率不高，产物浓度低；2）底物雄烯二酮（AD）成本高。第二种途径由于可以采用谷甾醇、菜油甾醇或者豆甾醇等天然甾醇化合物，在底物价格方面明显优于第一种途径。但目前第二种途径通常需要采用高纯度的谷甾醇、菜油甾醇或者豆甾醇，原料来源受到限制，无论是直接购买单一种类的甾醇化合物作为底物，还是对普通市售植物甾醇(三种或更多种植物甾醇的混合产物)进行分离提纯得到要求的底物，都难以做到使制备9a-OH AD过程的底物成本有效降低，而且存在整个制备过程周期长，底物转化率低，副产物高的问题。

如英国专利GB1,530,730公开的以亚硝基胍（NTG）诱变处理偶发分枝杆菌ATCC6842选育出具有9a-羟基化酶的突变菌株：偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）NRRL B-8119，该突变菌株能够生物转化谷甾醇（sitosterol）、胆固醇（cholesterol）或豆甾醇（stigmasterol）生成9a-OH AD，但转化周期长达336小时，且底物转化率极低，10g/L的底物谷甾醇（sitosterol），最终只得到微量产物9a-OH AD。

M.V.Donova等（Appl Microbiol Biotechnol67:671–678，2005）报道了使用Mycobacterium sp.2-4M生物转化谷甾醇（sitosterol）生成9a-OH AD，转化120小时后，虽然底物转化率可高达95-97%以上，但是9a-OHAD得率仅为48-50%，副产物AD得率达到21-22%，不利于后序分离纯化。

无论是从发酵工艺，还是从产物收率和纯度，目前已经公开的方法都不适合工业化生产9a-OH AD的应用。

发明内容

本发明提供一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法，利用偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855，以及相应的发酵液和发酵工艺，能在较短发酵时间内，获得高产率的9a-羟基雄烯二酮，且副产物少，特别适合工业化生产的需要。

本发明提供的一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法，所述方法包括利用偶发分枝杆菌ATCC35855对植物甾醇进行发酵培养，使之转化为9a-羟基雄烯二酮的步骤，其中，所用发酵液的成分，基于该发酵液的总质量，包括：植物甾醇0.5-2.0wt%，葡萄糖0.5-1.0wt%，酵母粉0.5-2wt%，氯化钠0.5-1.0wt%，黄豆饼粉1.0-3.0wt%，蛋白胨0.5-1.0wt%，磷酸二氢钠0.1-0.5wt%，硫酸铵0.1-0.5wt%，七水合硫酸镁0.001-0.005wt%，七水合硫酸亚铁0.001-0.005wt%，七水合硫酸锌0.001-0.005wt%，以及碳酸钙0.05-0.2wt%，余量为水，且该发酵液的pH6.5-7.5；

所述发酵培养过程中，基于所述发酵液的体积，偶发分枝杆菌ATCC35855菌液以10-12%体积接种,且所接种的菌液中离心菌体的质量与菌液的体积比为1.0-1.5g/100mL，发酵培养温度为28-35℃，转速为220-250rpm，发酵培养时间为72-120小时。

在本发明的方案中，所述偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855是可以商购获得的菌株，例如可以购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),简称ATCC。

在本发明的一个具体实施方式中，所述发酵液包括：植物甾醇1.0-1.5wt%，葡萄糖0.5-0.75wt%，酵母粉1.0-1.5wt%，氯化钠0.5-0.75wt%，黄豆饼粉1.5-2.0wt%，蛋白胨0.75-1.0wt%，磷酸二氢钠0.2-0.4wt%，硫酸铵0.2-0.4wt%，七水合硫酸镁0.0015-0.002wt%，七水合硫酸亚铁0.0015-0.002wt%，七水合硫酸锌0.0015-0.002wt%，以及碳酸钙0.075-0.1wt%，余量为水，且该发酵液的pH7.0-7.2。

进一步的，所述发酵培养温度可以为30-32℃，转速为230-240rpm，发酵培养时间为96-100小时。

在本发明的另一个具体实施方式中，在发酵培养之前还包括利用种子培养基扩大化培养偶发分枝杆菌ATCC35855收取偶发分枝杆菌ATCC35855菌液的步骤，所述种子培养基包括：基于该培养基的总质量，植物甾醇0.05-0.1wt%，葡萄糖0.1-0.5wt%；硫酸铵0.2-0.6wt%，七水合硫酸镁0.001-0.005wt%，磷酸氢二钾0.1-0.5wt%，酵母粉0.5-1.5wt%，蛋白胨0.5-1.5wt%，氯化钠0.1-0.5wt%，以及碳酸钙0.1-0.3wt%,余量为水；且该种子培养基的pH6.5-7.5。

进一步的，所述种子培养基包括：植物甾醇0.05wt%，葡萄糖0.2-0.3wt%；硫酸铵0.3-0.5wt%，七水合硫酸镁0.0015-0.0025wt%，磷酸氢二钾0.2-0.3wt%，酵母粉0.75-1.0wt%，蛋白胨0.75-1.0wt%，氯化钠0.2-0.3wt%，以及碳酸钙0.15-0.2wt%，余量为水；且该种子培养基的pH7.0-7.2。

作为本发明的一个具体实施方式，在利用种子培养基扩大化培养偶发分枝杆菌ATCC35855的过程，扩大化培养温度为28-35℃，转速为200-230rpm，扩大化培养时间为18-24小时。更进一步的，所述扩大化培养温度为30-32℃，转速为210-220rpm，扩大化培养时间为20-22小时。

在本发明的方案中，在使用所述种子培养基培养偶发分枝杆菌ATCC35855之前，还包括对偶发分枝杆菌ATCC35855进行活化培养，例如可采用斜面培养基将冷冻保藏的偶发分枝杆菌ATCC35855进行活化培养。该斜面培养基的配方例如可以是，基于斜面培养基的总质量，酵母浸粉1wt%；牛肉浸膏0.5%；葡萄糖0.1wt%；氯化钠0.9wt%；琼脂2wt%；余量为水；控制pH6.8-7.0。活化培养条件例如可以是：30℃恒温培养4-5天。用接种环刮取生长良好的单菌落接入种子培养基进行扩大化培养。所述发酵液或种子培养基的pH值可以在配制好后，根据需要使用常规pH调节试剂如酸溶液或碱溶液进行调节。

本发明提供的方案具有以下优点：

1）本发明提供的方法，利用偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855，使用特定的发酵液、接种浓度和发酵培养条件，显著提高了偶发分枝杆菌ATCC35855将植物甾醇转化为9a-羟基雄烯二酮的效率，并缩短发酵时间，同时还能显著减少副产物的产生，有利于9a-OH AD的后期分离纯化，特别适合工业化生产。

2）本发明方法中使用的种子培养基以特定比例添加了作为底物的植物甾醇，能在扩大化培养偶发分枝杆菌ATCC35855的同时，使得偶发分枝杆菌ATCC35855中的9a-羟基化酶的活性达到最高，为后续在发酵液中高效将植物甾醇转化为9a-羟基雄烯二酮提供良好的条件。

3）本发明提供的方法对底物植物甾醇的纯度要求不高，可以选择市售的混合型植物甾醇作为底物，能在获得产率高9a-羟基雄烯二酮、低副产物的同时，降低生产成本。

具体实施方式

本发明的具体实施例中，偶发分枝杆菌（Mycobacteriumfortuitum）ATCC35855购自美国典型培养物保藏中心；市售的植物甾醇、各培养基的组成成分均可商购获得。

实施例1

活化菌株：将偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855接种到无菌斜面培养基（酵母浸粉1wt%；牛肉浸膏0.5wt%；葡萄糖0.1wt%；氯化钠0.9wt%；琼脂2wt%；pH6.8-7.0），在30℃恒温培养4天至整个斜面长满菌体。

扩大化培养：用接种环刮取生长良好单菌落，接种进装有30ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中，在培养温度为30℃、转速200rpm条件下，培养24h。所述种子培养基包括：基于该种子培养基的总质量，植物甾醇0.05wt%，葡萄糖0.1wt%；硫酸铵0.2wt%，七水合硫酸镁0.001wt%，磷酸氢二钾0.1wt%，酵母粉0.5wt%，蛋白胨0.5wt%，氯化钠0.1wt%，碳酸钙0.1wt%，余量为水；且该发酵液的pH6.5-7.5。

发酵培养：以10%体积的接种量吸5ml菌液接中进装有50ml发酵液的500ml三角瓶中，然后在培养温度32℃，转速230rpm条件振荡培养时间96h后，获得发酵培养物，采用HPLC法进行测定发酵培养物中9a-OH AD和副产物AD的浓度。所述发酵液包括：植物甾醇0.75wt%，葡萄糖0.75wt%，酵母粉0.8wt%，氯化钠1.0wt%，黄豆饼粉2.0wt%，蛋白胨0.75wt%，磷酸二氢钠0.25wt%，硫酸铵0.35wt%，七水合硫酸镁0.003wt%，七水合硫酸亚铁0.003wt%，七水合硫酸锌0.003wt%，碳酸钙0.15wt%，余量为水；且该发酵液的pH7.0。

将发酵培养后获得的发酵培养物使用HPLC分析测定，基于相应的标准品，得到的底物转化率、发酵培养物中9a-OH AD浓度以及副产物AD的浓度列于表1中。

HPLC分析的具体操作如下：取1ml发酵培养物，用甲醇稀释至10ml，混合均匀后，再经超声3分钟，再经4000转/分离心10分钟，将上清液通过0.45μm有机膜过滤后得高压液相样品液，所用的HPLC条件为：柱子：C18柱（250×4.6mm）；流动相水：甲醇：乙腈=40：30：30（v/v/v）；检测波长：242nm；流速：0.8ml/min；柱温：室温。

实施例2

扩大化培养：将生长状态良好的偶发分枝杆菌ATCC35855斜面菌体接入装有30ml无菌种子培养基的250ml三角瓶，然后在培养温度35℃、转速230rpm条件下振荡培养18小时；

发酵培养：然后按10体积%接种量吸取5ml种子液接入装有50ml无菌发酵液的500ml三角瓶中，然后在培养温度35℃、转速250rpm，发酵培养时间120小时。

然后采用实施例1所述的HPLC法测定发酵培养物中植物甾醇转化率、9a-OH AD、以及副产物AD的浓度。

本实施例中使用的种子培养基和发酵液分别如下：

种子培养基中包括：植物甾醇0.075wt%，葡萄糖0.5wt%；硫酸铵0.6wt%，七水合硫酸镁0.005wt%，磷酸氢二钾0.5wt%，酵母粉1.5wt%，蛋白胨1.5wt%，氯化钠0.5wt%，碳酸钙0.3wt%，余量为水；且该种子培养基的pH7.5。

发酵液中包括：植物甾醇1.0wt%，葡萄糖1.0wt%，酵母粉2wt%，氯化钠1.0wt%，黄豆饼粉3.0wt%，蛋白胨1.0wt%，磷酸二氢钠0.5wt%，硫酸铵0.5wt%，七水合硫酸镁0.005wt%，七水合硫酸亚铁0.005wt%，七水合硫酸锌0.005wt%，碳酸钙0.2wt%，余量为水；且该发酵液的pH7.5。

HPLC分析方法同实施例1，9a-OH AD浓度、副产物AD浓度，以及植物甾醇转化率如表1所示。

实施例3

扩大化培养：将生长状态良好的偶发分枝杆菌ATCC35855斜面菌体接入装有30ml无菌种子培养基的250ml三角瓶，然后在培养温度32℃、转速230rpm条件下振荡培养24小时；

发酵培养：然后按10体积%接种量吸取5ml种子液接入装有50ml无菌发酵液的500ml三角瓶中，然后在培养温度32℃、转速250rpm，发酵培养时间110小时。

然后采用实施例1所述的HPLC法测定发酵培养物中植物甾醇转化率、9a-OH AD、以及副产物AD的浓度。

本实施例中使用的种子培养基和发酵液分别如下：

种子培养基中包括：植物甾醇0.1wt%，葡萄糖0.25wt%；硫酸铵0.3wt%，七水合硫酸镁0.0025wt%，磷酸氢二钾0.25wt%，酵母粉0.75wt%，蛋白胨0.75wt%，氯化钠0.25wt%，以及碳酸钙0.15wt%，余量为水；且该种子培养基的pH7.0。

发酵液中包括：植物甾醇1.5wt%，葡萄糖0.5wt%，酵母粉1wt%，氯化钠0.5wt%，黄豆饼粉2.0wt%，蛋白胨0.5wt%，磷酸二氢钠0.25wt%，硫酸铵0.25wt%，七水合硫酸镁0.0025wt%，七水合硫酸亚铁0.0025wt%，七水合硫酸锌0.0025wt%，以及碳酸钙0.1wt%，余量为水；且该发酵液的pH7.0。

HPLC分析方法同实施例1，9a-OH AD浓度、副产物AD浓度，以及植物甾醇转化率如表1所示。

实施例4

扩大化培养：将生长状态良好的偶发分枝杆菌ATCC35855斜面菌体分别接入装有30ml无菌种子培养基的250ml三角瓶，然后在培养温度30℃、转速220rpm条件下振荡培养20小时；

发酵培养：然后按10体积%接种量吸取5ml种子液接入装有50ml无菌发酵液的500ml三角瓶中，然后在培养温度30℃、转速240rpm，发酵培养时间100小时。

然后采用实施例1所述的HPLC法测定发酵培养物中植物甾醇转化率、9a-OH AD、以及副产物AD的浓度。在此所用到的种子培养基和发酵液分别如下：

种子培养基中包括：植物甾醇0.05wt%，葡萄糖0.15wt%；硫酸铵0.25wt%，七水合硫酸镁0.001wt%，磷酸氢二钾0.3wt%，酵母粉1.05wt%，蛋白胨1.0wt%，氯化钠0.20wt%，碳酸钙0.1wt%，余量为水；且该种子培养基的pH7.2。

发酵液中包括：植物甾醇2.0wt%，葡萄糖0.5wt%，酵母粉1.5wt%，氯化钠0.5wt%，黄豆饼粉2.5wt%，蛋白胨1.0wt%，磷酸二氢钠0.25wt%，硫酸铵0.5wt%，七水合硫酸镁0.0015wt%，七水合硫酸亚铁0.001wt%，七水合硫酸锌0.001wt%，碳酸钙0.05wt%，余量为水；且该发酵液的pH7.2。

HPLC分析方法同实施例1，9a-OH AD浓度、副产物AD浓度，以及植物甾醇转化率如表1所示。

比较例5

为了更好地说明本发明方法(采用特定发酵液和发酵培养条件利用偶发分枝杆菌ATCC35855将植物甾醇转化为9a-羟基雄烯二酮)在提高底物转化率、产物9a-OH AD浓度以及降低副产物AD浓度方面的明显优势，申请人还将本申请实施例中使用的偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）ATCC35855分别按照英国专利GB1,530,730，英国专利GB2,197,869，美国专利US5,166,055中实施例1的发酵液和发酵条件，以及L.Seidel等（J.BasicMicrobiol.32：49-55，1992）与M.V.Donova等（Appl Microbiol Biotechnol67:671–678，2005）文献中记载的发酵液和优化发酵条件，进行植物甾醇到9a-羟基雄烯二酮转化的对比试验。控制各比较例中使用的植物甾醇的量相同、偶发分枝杆菌ATCC35855的接种量，以及发酵液的体积均相同。

HPLC分析9a-OH AD浓度、副产物AD浓度，以及植物甾醇转化率的方法同实施例1，结果如表1所示。

表1

从表1数据可以看出，采用相同的植物甾醇，本发明方法相比于现有技术大大提高了植物甾醇的转化率和单位体积发酵培养物中产物9a-羟基雄烯二酮（9a-OH AD）的浓度，同时大大降低了单位体积发酵培养物中副产物AD的浓度。并且相比于GB1,530,730、L.Seidel等（J.Basic Microbiol.32：49-55，1992），本发明方法制备9a-羟基雄烯二酮发酵时间显著缩短。

以下是按照上述专利实施例1和文献的优选方案的记载制备9a-羟基雄烯二酮过程的实验数据。

表2

表2中：

英国专利GB1,530,730是利用偶发分枝杆菌（Mycobacteriumfortuitum）NRRL B-8119，生物转化谷甾醇（sitosterol）、胆固醇（cholesterol）或豆甾醇,底物浓度为10g/L。

英国专利GB2,197,869，利用Mycobacterium roseum sp.nov.1108/1（NCAIM B（P）000339）菌，生物转化2%β-谷甾醇（β-sitosterol）-菜油甾醇（campesterol）(2:1)混合物,底物浓度为10g/L。

美国专利US5,166,055利用分枝杆菌（Mycobacterium species）CBS482.86生物转化α-谷甾醇（α-sitosterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、菜油甾醇（campesterol）、麦角固醇（ergosterol）或者胆固醇（cholest-4-en-3-one）,底物浓度为20g/L。

L.Seidel等（J.Basic Microbiol.32：49-55，1992）利用Mycobacteriumvaccae ZIMET11052and11053两株突变菌株生物转化谷甾醇，底物浓度为7g/L。

M.V.Donova等（Appl Microbiol Biotechnol67:671–678，2005）利用Mycobacterium sp.2-4M生物转化谷甾醇,底物浓度为5g/L。

从表2的数据可以看出，GB1,530,730方案发酵时间长达336小时时，也只能获得微量产物；GB2,197,869，US5,166,055虽然发酵时间显著缩短，但得到产物的浓度仍然较低；L.Seidel在一定程度上提高了底物浓度和底物转化率，但提高程度有限，并且得到该结果的前提是限定发酵底物仅来自谷甾醇，发酵成本显然很高；M.V.Donova等虽然提高了底物转化率，但副产物的浓度相对偏高，相应的产物9a-OH AD浓度较低。

所以，从表2的数据比较结果可以认为，所列出的现有技术在具有各自的技术缺陷前提下，产物浓度普遍偏低，因此导致后期分离难度大，成本高，而起产率难以保证，不适合工业化应用。

本发明的方案能在获得较高产率的9a-OH AD同时，降低副产物AD，缩短发酵时间，并且可以利用成本低、易于获得的普通市售植物甾醇作为底物，非常适合应用于工业化生产。

Claims (7)

1.一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法，所述方法包括利用偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC35855对植物甾醇进行发酵培养，使之转化为9a-羟基雄烯二酮的步骤，其中，所用发酵液由以下成分组成：基于该发酵液的总质量，植物甾醇0.5-2.0wt％，葡萄糖0.5-1.0wt％，酵母粉0.5-2wt％，氯化钠0.5-1.0wt％，黄豆饼粉1.0-3.0wt％，蛋白胨0.5-1.0wt％，磷酸二氢钠0.1-0.5wt％，硫酸铵0.1-0.5wt％，七水合硫酸镁0.001-0.005wt％，七水合硫酸亚铁0.001-0.005wt％，七水合硫酸锌0.001-0.005wt％，以及碳酸钙0.05-0.2wt％，余量为水，且该发酵液的pH6.5-7.5；

所述发酵培养过程中，基于所述发酵液的体积，偶发分枝杆菌ATCC35855菌液以10-12％体积接种，且所接种的菌液中离心菌体的质量与菌液的体积比为1.0-1.5g/100mL，发酵培养温度为28-35℃，转速为220-250rpm，发酵培养时间为72-120小时。

2.根据权利要求1所述的方法，所述发酵液由以下成分组成：植物甾醇1.0-1.5wt％，葡萄糖0.5-0.75wt％，酵母粉1.0-1.5wt％，氯化钠0.5-0.75wt％，黄豆饼粉1.5-2.0wt％，蛋白胨0.75-1.0wt％，磷酸二氢钠0.2-0.4wt％，硫酸铵0.2-0.4wt％，七水合硫酸镁0.0015-0.002wt％，七水合硫酸亚铁0.0015-0.002wt％，七水合硫酸锌0.0015-0.002wt％，以及碳酸钙0.075-0.1wt％，余量为水，且该发酵液的pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述发酵培养温度为30-32℃，转速为230-240rpm，发酵培养时间为96-100小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在发酵培养之前还包括利用种子培养基扩大化培养偶发分枝杆菌ATCC35855收取偶发分枝杆菌ATCC35855菌液的步骤，所述种子培养基由以下成分组成：基于该培养基的总质量，植物甾醇0.05-0.1wt％，葡萄糖0.1-0.5wt％，硫酸铵0.2-0.6wt％，七水合硫酸镁0.001-0.005wt％，磷酸氢二钾0.1-0.5wt％，酵母粉0.5-1.5wt％，蛋白胨0.5-1.5wt％，氯化钠0.1-0.5wt％，以及碳酸钙0.1-0.3wt％,余量为水；且该种子培养基的pH6.5-7.5。

5.根据权利要求4所述的方法，所述种子培养基由以下成分组成：植物甾醇0.05wt％，葡萄糖0.2-0.3wt％，硫酸铵0.3-0.5wt％，七水合硫酸镁0.0015-0.0025wt％，磷酸氢二钾0.2-0.3wt％，酵母粉0.75-1.0wt％，蛋白胨0.75-1.0wt％，氯化钠0.2-0.3wt％，以及碳酸钙0.15-0.2wt％，余量为水；且该种子培养基的pH7.0-7.2。

6.根据权利要求4或5所述的方法，利用种子培养基扩大化培养偶发分枝杆菌ATCC35855的过程，扩大化培养温度为28-35℃，转速为200-230rpm，扩大化培养时间为18-24小时。

7.根据权利要求6所述的方法，所述扩大化培养温度为30-32℃，转速为210-220rpm，扩大化培养时间为20-22小时。