CN110656148A - 一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法 - Google Patents

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曾春玲
赵小娟
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Abstract

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。发明内容包括3位羟基保护反应、静息细胞生物转化、水解、精制步骤。本发明以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮，原料易得，降低了生产成本，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤；采用静息细胞转化法，转化体系营养单一，染菌风险低，菌体量可调节，可保证良好的转化能力。

Description

一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法
技术领域
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。
背景技术
去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，简称为DHEA)，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式为C19H28O2，是一种C19肾上腺甾类化合物，主要由肾上腺皮质分泌，性腺如睾丸、卵巢也有少量分泌，其生理活性作用研究范围涉及到抗癌、延缓衰老及免疫调节、抗糖尿病、防治肿瘤等。此外，DHEA在甾体类药物合成中具有非常重要的地位，以DHEA为初始化合物，通过对其母核或侧链进行修饰可以到很多具有重要生理活性和医用价值的药物。
目前，去氢表雄酮的制备方法主要包括化学方法和微生物转化法。化学方法主要依靠多步化学反应完成，传统的制备工艺是以雄烯二酮为原料，用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基，但使用化学合成方法得到的产品，常常带有一定量的3位α羟基异构体及其它杂质，收率低且步骤繁琐，使用多种有机试剂容易带来污染。专利号为CN201210316197.0的专利公开了一种用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法，以植物甾醇为原料，使用保护剂保护3位β羟基，并利用分枝杆菌发酵制备去氢表雄酮，此方法有效提高了去氢表雄酮的收率，但其分枝杆菌发酵步骤中采用的是有油发酵转化，产品发酵时间长，易产生多种产物，处理分离纯化困难，值得进一步改进。专利号为CN201410414313.1的专利公开了一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，敲除了耻垢分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶编码基因MSMEG_5228，利用重组耻垢分枝杆菌单水相发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮，提高了转化率，解决了微生物发酵中所产生的废油对环境的影响，但敲除基因，构建重组菌株，涉及基因工程领域，投入大，要求高，过程繁琐。
菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种高收率，高质量，低污染，易操作的静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，包括以下步骤：
(1)3位羟基保护反应：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；
(2)静息细胞生物转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683菌种经过斜面培养和液体种子培养后接种后，种子过滤分离，加入到PBS缓冲体系中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；
(3)水解：将所述发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；
(4)精制：将所述水解产物进行精制提纯，得到去氢表雄酮产品。
优选地，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为20-30:1。
优选地，所述步骤(2)中B-NRRL 3683菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；
(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。
(4)种子罐培养：
培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，按上述配方配制培养基，121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96小时。
优选地，步骤(2)中转化配方包括的以下成分：植物甾醇醚化物10-100g/L，羟丙基环糊精10-400g/L，菌20-200g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)
优选地，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。
优选地，所述步骤(2)中的静息细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化体系，于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。
优选地，所述步骤(3)中盐酸的质量分数为5％，所用物料配比以体积计乙酸乙酯1-20份，5％盐酸1-30份；减压升温条件为-0.08MPa、45℃、5h，加入盐酸后升温至60℃，水解1-2h。
优选地，所述步骤(4)精制方法具体为：将所述水解产物烘干，加入甲醇溶解、抽滤，滤液减压升温浓缩至小体积，降温、抽滤、烘干得到粗品；将所述粗品加入石油醚，升温、回流打浆、冷却、过滤得类白色固体，烘干后，加入甲醇升温溶解，减压升温浓缩至小体积，降温至0-4℃养晶2小时后抽滤烘干。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮，原料易得，降低了生产成本，
2.植物甾醇的3位羟基的活性很高，在转化过程中很容易被氧化导致转化失败，本发明采用保护剂对植物甾醇3位羟基进行官能团保护，发酵后水解可直接制得去氢表雄酮，副产物少，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤。
3.本发明采用静息细胞转化法，其转化体系营养单一，染菌风险低，菌体量可调节，可增大底物投料浓度，缩短转化反应时间，磷酸盐的缓冲体系可调节pH，转化过程酶活比较稳定，保证了良好的转化能力，同时所需环糊精和菌体可以重复多次的利用，且与产物及环糊精之间分离方便。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的分枝杆菌(mycobacterium sp.)NRRLB-3683购于江南大学微生物研究中心，所用的植物甾醇为豆甾醇，购自四川省维克奇生物科技有限公司。
实施例1
种子培养
菌种名称：mycobacterium sp.B-NRRL 3683
(1)斜面种子培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂：20g/L，pH＝7.5-8.0。
121℃灭菌30分钟。凝固成型后，在无菌条件下接种。
接种后，30℃培养4天，入4℃冰箱保存，保存时间不超过1个月。
(2)摇瓶种子培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0。121℃灭菌30分钟。冷却至室温。
一级培养：在无菌条件下接种，接种量：每100毫升刮取1环斜面菌体。接种后，30℃，200rpm摇床培养48小时。
二级培养：在无菌条件下接种，接种量：10％。接种后，30℃，200rpm摇床培养48小时。
种子罐培养：
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0
在无菌条件下接种，将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间48小时。
实施例2
植物甾醇3位醚化保护
物料配比：甲缩醛1500克，植物甾醇100克，硅藻土100克，五氧化二磷50克，碳酸钠4克(配成1％水溶液使用)，水200克。
按比例投入植物甾醇，甲缩醛，升温到25℃，搅拌至完全溶清，加入硅藻土，再缓慢加入五氧化二磷，加入过程中控制温度不超过30℃，25℃左右搅拌1-1.5小时，薄层色谱检测反应完全，升温至30℃以上，趁热过滤，滤饼和反应瓶用少量水洗，50℃烘干。得淡黄色固体，称之为醚化物。
得到的醚化物粗品，加入2V丙酮，升温至50-60℃，搅拌回流30分钟，冷却至-10℃，抽滤，滤饼使用-10℃丙酮淋洗，滤饼40-50℃烘干至恒重。
实施例3
发酵转化
(1)按照实施例1进行种子培养并过滤，得到静息转化所需的菌体；
(2)底物制备
物料配比：甲缩醛3000克，植物甾醇100克，硅藻土200克，五氧化二磷100克，碳酸钠8克(配成1％水溶液使用)，水400克。
具体步骤按照实施例2进行。
(3)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积，6升。
转化培养基配方：植物甾醇醚化物10g/L，羟丙基环糊精10g/L，菌20g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5VVM，罐压0.05MPa，转化时间84小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取工序
转化结束，停搅拌，静置分层2小时。上层菌液抽入烧杯中，加入500毫升氯仿，常温搅拌萃取30分钟，静置8小时以上，分出下层氯仿层，减压浓缩至干。下层固体抽滤干，滤出液与上层分出的水相合并处理。
(5)水解工序
物料配比：乙酸乙酯0.5升，5％盐酸0.75升。
抽滤及减压浓缩得到的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌1h，抽滤，滤饼淋洗，作为固废，合并滤液，45℃减压浓缩至无馏分，加入5％盐酸，升温至60℃，水解1-2h，HPLC跟踪至反应完全，抽滤，弃滤液，收集滤饼。
(6)精制工序
物料配比：甲醇1升，石油醚0.5升。
水解得到的滤饼70℃烘干，使用甲醇0.5升溶解，抽滤，滤液减压浓缩至小体积，降温至4℃左右，抽滤，烘干。得到的产品加入石油醚，70℃回流打浆2-3h，降至25℃，过滤得类白色固体，烘干，加入0.5升甲醇，升温至70℃溶解，减压浓缩至糊状，缓慢降温到0-4℃，养晶2小时，抽滤，烘干得DHEA精品20.5克，液相归一含量：99.35％。
实施例4
(1)按照实施例1进行种子培养并过滤，得到静息细胞转化所需的菌体；
(2)物料配比：甲缩醛24000克，植物甾醇600克，硅藻土1600克，五氧化二磷8800克，碳酸钠60克(配成1％水溶液使用)，水3200克。
具体步骤按照实例2进行。
(3)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积，6升。
转化培养基配方：植物甾醇醚化物100g/L，羟丙基环糊精400g/L，菌200g/L，PPE5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.5VVM，罐压0.05MPa，转化时间186小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例3提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例3的10倍，减压浓缩体积为实例3的10倍。得DHEA精品206克，液相归一含量：99.21％。
实施例5发酵转化
(1)按照实施例1进行种子培养并过滤，得到静息细胞转化所需的菌体；
(2)按照实施例2进行底物制备，物料配比：甲缩醛18000克，植物甾醇600克，硅藻土1600克，五氧化二磷8800克，碳酸钠60克(配成1％水溶液使用)，水3200克。
(3)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。
转化体系配方：植物甾醇醚化物100g/L，羟丙基环糊精100g/L，菌100g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)
转化条件：32℃，200rpm，空气流量1vvm，罐压0.055MPa，转化时间220h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(5)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例3的10倍，减压浓缩体积为实例3的10倍。得DHEA精品214g，液相归一含量：98.74％。
实施例6发酵转化
(1)按照实施例1进行种子培养并过滤，得到静息细胞转化所需的菌体；
(2)按照实施例2进行底物制备，物料配比：甲缩醛3800克，植物甾醇200克，硅藻土320克，五氧化二磷200克，碳酸钠15克(配成1％水溶液使用)，水3200克。
(3)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。
转化体系配方：植物甾醇醚化物20g/L，羟丙基环糊精20g/L，菌40g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)
转化条件：32℃，200rpm，空气流量1vvm，罐压0.055MPa，转化时间120h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(5)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例3的2倍，减压浓缩体积为实例3的2倍。得DHEA精品42g，液相归一含量：98.55％。
实施例7发酵转化
(1)按照实施例1进行种子培养并过滤，得到静息细胞转化所需的菌体；
(2)按照实施例2进行底物制备，物料配比：甲缩醛9000克，植物甾醇400克，硅藻土800克，五氧化二磷4400克，碳酸钠30克(配成1％水溶液使用)，水1600克。
(3)10升罐发酵转化
转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。
转化体系配方：植物甾醇醚化物50g/L，羟丙基环糊精50g/L，菌100g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0)
转化条件：32℃，200rpm，空气流量1vvm，罐压0.055MPa，转化时间144h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(5)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，除水相提取用的氯仿外，其它试剂用量为实例3的5倍，减压浓缩体积为实例3的5倍。得DHEA精品105g，液相归一含量：98.74％。

Claims (8)

1.一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)3位羟基保护反应：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；
(2)静息细胞生物转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683菌种经过斜面培养和液体种子培养后，种子过滤分离，加入到PBS缓冲体系中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；
(3)水解：将所述发酵产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；
(4)精制：将所述水解产物进行精制提纯，得到去氢表雄酮产品。
2.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为10-40:1。
3.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL 3683菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；
(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。
(4)种子罐培养：
培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，按上述配方配制培养基，121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96小时。
4.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，步骤(2)中转化培养基配方包括以质量百分比计的以下成分：植物甾醇醚化物10-100g/L，羟丙基环糊精10-400g/L，菌20-200g/L，PPE 5g/L，余量为20mM PBS(pH＝8.0) 。
5.根据权利要求1或4所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。
6.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的静息细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化体系，于28-32℃，搅拌速度50-500rpm,空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。
7.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(3)中盐酸的质量分数为5％，所用物料配比以体积计乙酸乙酯1-20份，5％盐酸1-30份；减压升温条件为-0.08MPa、45℃、5h，加入盐酸后升温至60℃，水解1-2h。
8.根据权利要求1所述一种静息细胞转化植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其特征在于，所述步骤(4)精制方法具体为：将所述水解产物烘干，加入甲醇溶解、抽滤，滤液减压升温浓缩至小体积，降温、抽滤、烘干得到粗品；将所述粗品加入石油醚，升温、回流打浆、冷却、过滤得类白色固体，烘干后，加入甲醇升温溶解，减压升温浓缩至小体积，降温至0-4℃养晶2小时后抽滤烘干。
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