CN112375118A - 以植物甾醇为原料制备胆固醇及其衍生物的方法 - Google Patents

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CN112375118A
CN112375118A CN202011274002.1A CN202011274002A CN112375118A CN 112375118 A CN112375118 A CN 112375118A CN 202011274002 A CN202011274002 A CN 202011274002A CN 112375118 A CN112375118 A CN 112375118A
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邹元
甘红星
谢来宾
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Abstract

本发明公开一种以植物甾醇为原料制备胆固醇及其衍生物的方法。包括如下步骤：以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，经生物发酵、氧化、GM‑2氧化、witting反应、氢化、水解得到胆固醇及其衍生物。本发明对这些甾醇进行开发利用，不仅解决了原料来源问题，更是解决了废水废渣的环保问题。

Description

以植物甾醇为原料制备胆固醇及其衍生物的方法
技术领域
本发明属于胆固醇制备领域，具体涉及一种以植物甾醇为原料制备胆固醇及其衍生物的方法。
背景技术
胆固醇又称胆甾醇，其是一种环戊烷多氢菲的衍生物，广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D以及许多甾体激素的原料。其衍生物25-羟基胆固醇则是合成25羟基维生素D3的原料。
胆固醇的传统的来源中最主要的方式是从各种动物的脑、内脏、脊髓中或羊毛酯中提取，提取工艺及分离技术也比较复杂，如已有报道的专利文献CN101270141和CN108640961。目前最大的胆固醇提取及分离企业为花园生物从羊毛酯中提取，采用分子精馏的方式进行胆固醇提纯，设备及技术门槛相对较高；动物体内器官提取，存在安全风险，如疯牛病、猪链球菌病等感染。
从其他非动物源合成方法报道相对较少，现有技术CN1772760A报道了从皂素出发合成，经过水解、磺酰化、还原、水解等步骤合成胆固醇的方法，具体路径如下：
Figure BDA0002778567520000011
然而该方法存在原料资源的枯竭、收率低，工艺复杂，生产污染大，成本高等问题。
发明内容
本发明提供一种胆固醇及其衍生物的制备方法，包括如下步骤：以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，经生物发酵、氧化、GM-2氧化、witting反应、氢化、水解得到胆固醇及其衍生物。
进一步地，所述胆固醇及其衍生物的制备方法包括如下步骤：
(1)以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，得到GM-1；
(2)所述GM-1经生物发酵，得到GM-2；
(3)所述GM-2与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)发生氧化反应，得到GM-3；
(4)所述GM-3与异戊基三苯基溴化膦通过witting反应合成GM-4；
(5)所述GM-4经氢化、水解，得到胆固醇及其衍生物。
本发明方法采用的的合成路线如下：
Figure BDA0002778567520000021
进一步地，所述植物甾醇具有如式1所示的结构：
Figure BDA0002778567520000022
即，所示植物甾醇可以选自菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇。
进一步地，步骤(1)中，所述醚化保护的过程包括：将植物甾醇与二甲氧基甲烷混合，然后加入硅藻土、五氧化二磷，搅拌反应，待反应完全后升温，趁热过滤，洗涤，烘干，得到植物甾醇醚化物粗品；采用丙酮对所述植物甾醇醚化物粗品进行纯化，得到所述植物甾醇醚化物GM-1。
优选地，所述植物甾醇与二甲氧基甲烷的质量比为1:(10-20)，例如1:15。
优选地，所述植物甾醇、硅藻土和五氧化二磷的质量比为1:1:(0.2-1)，例如1:1:0.5。
优选地，所述五氧化二磷加入时需要缓慢加入，且控制体系温度不超过30℃。
优选地，所述搅拌反应的温度为20-27℃，例如25℃；所述搅拌反应的时间为1-1.5小时。
优选地，所述升温为将温度升至30℃以上，例如为35℃。
优选地，所述洗涤为用少量水或盐溶液洗涤滤饼和反应瓶。
优选地，所述烘干的温度为40-50℃。
优选地，所述纯化过程包括：将所述植物甾醇醚化物粗品与丙酮混合，升温至50-60℃，搅拌回流，冷却至-12℃～-5℃(例如-10℃)，抽滤，滤饼用-12℃～-5℃(例如-10℃)的丙酮淋洗，烘干滤饼，得到所述植物甾醇醚化物GM-1。
进一步地，步骤(2)中，所述生物发酵的过程包括：(a)种子培养；(b)将步骤(a)培养得到的种子GM-1接种在含有GM-1的培养基中，进行发酵转化，经后处理，回收提取，得到GM-2。
优选地，步骤(a)中，所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养。其中，所述一级种子培养包括如下步骤：在冷却且灭菌的培养基的斜面上接种Mycobacteriumsp.NRRL B-3805菌种进行培养，得到一级种子；所述培养基含有
酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸钠0.54％、磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5。其中，所述培养包括：将100毫升所述培养基装入500毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟，冷却后从斜面接种Mycobacterium sp.NRRL B-3805菌种，200rpm、30℃培养48小时。
其中，所述二级种子培养包括如下步骤：在冷却且灭菌的培养基的斜面上接种一级种子进行培养，得到二级种子；所述培养基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸钠0.54％、磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5。其中，所述培养包括：将500毫升所述培养基装入2000毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟，冷却后从一级摇瓶接种，一级种子的接种量为10％，200rpm、30℃培养48小时。
优选地，步骤(b)中，所述发酵转化包括如下过程：在发酵罐内装入含有GM-1的培养基，灭菌，冷却，接种二级种子，进行发酵转化，转化结束后调节pH值至5-6，加热搅拌(加热温度70-90℃，搅拌时间0.5-2小时)，静置，分层，得到油层。其中，含有GM-1的培养基含有GM-1 2％、大豆油16％、玉米浆6％、硝酸钠5.4％、磷酸氢二铵0.06％，培养基的pH＝8.0。其中，所述转化的条件包括：转速400rpm，空气流量0.2Nm3/h,罐压0.05MPa，转化时间110-130小时。
优选地，步骤(b)中，将转化得到的油层用甲醇提取，减压浓缩干溶剂，再加入乙酸乙酯回流打浆，冷却，过滤，滤液回收提取，得到GM-2。其中，所述甲醇的用量为2-4倍体积。其中，所述乙酸乙酯的用量为1.5-3倍体积。其中，所述回流打浆的温度为40-60℃，时间为1-3小时。
优选地，所述滤液回收提取的过程包括：所得滤液减压浓缩干，加入二氯甲烷(用量为2倍体积)溶解，减压浓缩，加入甲醇置换，再次浓缩(至2倍体积)，缓慢降温(至10℃左右)析晶，过滤，用少量甲醇淋洗固体，得到GM-2。
进一步地，步骤(3)中，所述GM-2与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)的质量比为(90-110):1。
优选地，所述氧化反应包括如下步骤：将GM-1和TEMPO在室温下溶解于二氯甲烷中，降温至0-5℃，加入溴化钠溶液，搅拌，保持温度0-5℃，而后滴加次氯酸钠溶液，滴加过程控温0-5℃，滴加完后保持0-5℃反应，TLC监测，原料反应完后，搅拌下滴加硫代硫酸钠溶液；滴加完后搅拌，静置分液，得到的有机层减压浓缩，甲醇置换浓缩至稠状，降温析晶，过滤，滤饼少量甲醇淋洗，干燥得GM-3。
其中，所述溴化钠溶液的浓度为10％。
其中，所述次氯酸钠溶液的浓度为10％。
其中，所述硫代硫酸钠溶液的浓度为20％。
其中，所述溴化钠溶液、次氯酸钠溶液、硫代硫酸钠溶液和二氯甲烷的体积比为1:(8-12):(3-6):(15-20)。
进一步地，步骤(4)中，室温下将异戊基三苯基溴化膦和甲苯搅拌混合，氮气置换，加入叔丁醇钾，升温后反应；而后降温，氮气保护下加入GM-3，保温反应；反应完成后向反应瓶中加入水，分液，有机相水洗；减压浓缩，甲醇置换至稠状，降温析晶，过滤，干燥滤饼，得到GM-4。
其中，所述异戊基三苯基溴化膦和GM-3的质量比为(1.5-3):1。
其中，所述叔丁醇钾和GM-3的质量比为1:(5-3)。
其中，所述甲苯与GM-3的质量比为1:(2-4)。
其中，升温反应的温度为45-55℃，反应时间为2-3小时。
其中，降温至温度为28-35℃，保温反应的时间为1.8-2.5小时。
其中，所述异戊基三苯基溴化膦的制备过程包括：三苯基膦、溴代异戊烷和甲苯混合，无氧气氛下反应，制备得到异戊基三苯基溴化膦。
进一步地，步骤(5)中，在钯碳存在条件下，将GM-4加入甲醇中，先用氮气置换，再用氢气置换，在氢气气氛下升温反应(反应温度为35-45℃，反应时间为8-15小时)，反应完毕后，降至室温，排掉氢气，过滤，少量甲醇冲洗滤饼，合并母液；向母液中加入稀盐酸，加热进行水解反应(反应温度为35-45℃，反应时间为1-2小时)，反应完成后调节pH至中性，减压浓缩，水析出料，过滤得到胆固醇。
其中，所述钯碳为5％钯碳。
其中，所述钯碳和GM-4的质量比为1:(80-120)。
其中，所述GM-4和甲醇的质量体积比为1g:(3-6)ml。
其中，所述稀盐酸与甲醇的体积比为(3-6):1。
本发明的有益效果：
本发明采用植物甾醇作为原料，植物甾醇是具有甾体环戊烷多氢菲的骨架结构，侧链可以是不同的烷烃取代基团，是一种由多个类似物组成的混合物，主要的成分结构如下图：
Figure BDA0002778567520000061
植物甾醇(Phytosterols)]广泛存在于植物的根茎叶及果实中，在大自然中其储量惊人，其资源储量比皂素更加的丰富，并且现代商业产品的生产中的废渣都含有高含量的植物甾醇，如油脂产业中压榨后的残渣或馏出物，制糖业中的甜菜渣和甘蔗渣，还有造纸的废液废水中均含有一定含量的植物甾醇，本发明对这些甾醇进行开发利用，不仅解决了原料来源问题，更是解决了废水废渣的环保问题。
具体具有以下三方面优势：
1、将3位羟基进行保护，然后进行生物发酵，避免了被氧化，从而保留了甾醇原有结构，是胆固醇及其衍生物的合成更加简单方便。
2、发酵物无需进一步纯化，直接一锅法氧化合成中间体GM-3，简单、环保、节能。
3、本发明提供了一条可同时轻易获得胆固醇的路线，工艺简单，安全环保。
附图说明
图1为实施例1制备的胆固醇的1H NMR。
图2为实施例1制备的胆固醇的13C NMR。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
Figure BDA0002778567520000071
1、菌种
Mycobacterium sp.NRRL B-3805。
2、转化工艺
2.1、底物醚化
Figure BDA0002778567520000072
物料配比：二甲氧基甲烷1500g，植物甾醇100g，硅藻土100g,五氧化二磷50g，碳酸钠4g(配成1％水溶液使用)，水200g。
反应釜中按比例投入植物甾醇和二甲氧基甲烷，升温到25℃，搅拌至完全溶清，加入硅藻土，再缓慢加入五氧化二磷，加入过程中控制温度不超过30℃，25℃左右搅拌1-1.5小时，薄层色谱检测反应完全，升温至30℃以上，趁热过滤，滤饼和反应瓶用1％碳酸钠溶液洗涤，50℃烘干。得淡黄色固体，在烘箱中于40-50℃烘干至恒重，重量117.1g，即得到所述植物甾醇醚化物粗品。
将得到的醚化物粗品，2倍体积的丙酮，升温至50-60℃，搅拌回流30min，冷却至-10℃，抽滤，滤饼使用-10℃丙酮淋洗，滤饼40-50℃烘干至恒重，收白色粉末100.3g，即得到所述植物甾醇醚化物GM-1。
2.2、种子培养
Figure BDA0002778567520000081
一级种子：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠0.54％，磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5,100毫升培养基装入500毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟。冷却后从斜面接种Mycobacterium sp.NRRL B-3805菌种，200rpm、30℃培养48小时。
二级种子：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠0.54％，磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5,500毫升培养基装入2000毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟。冷却后从一级摇瓶接种，一级种子的接种量10％，200rpm、30℃培养48小时。
2.2、转化
10升发酵罐，装样7升，培养基：植物甾醇GM-1 2％，大豆油16％，玉米浆6％，硝酸钠5.4％，磷酸氢二铵0.06％，调pH＝8.0,121℃，灭菌30分钟，冷却到30℃，接种二级种子，接种量20％。
转化控制：转速400rpm，空气流量0.2Nm3/h，罐压0.05MPa。
转化约120小时，转化结束，用磷酸调pH至5.0～6.0，加热到80℃，搅拌1小时，静置2小时，分层。
2.3后处理(发酵副产物GM-2有3-5％左右)
分层得到的油层，加入甲醇提取三次，每次用油层3倍体积的甲醇，减压浓缩干溶剂，加入2V乙酸乙酯50℃回流打浆2小时，冷却到30℃，过滤得
Figure BDA0002778567520000091
2.4目标产物(发酵副产物)的回收提取：
上述滤液50℃减压浓缩干，加入2体积二氯甲烷溶解，减压浓缩，加入甲醇置换，浓缩至剩余2体积，缓慢降温至10℃析晶，过滤，固体用少量甲醇淋洗得GM-2
Figure BDA0002778567520000092
3、GM-3合成
室温下，反应瓶中投入二氯甲烷350ml，GM-2 100g，2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)1.0g，搅拌溶清后降温至0-5℃，加入20ml 10％溴化钠溶液，搅拌10min，保持温度0-5℃，滴加10％次氯酸钠溶液200ml，滴加过程控温0-5℃，滴加完后保持0-5℃反应，TLC监测，原料反应完后，搅拌下滴加100ml20％硫代硫酸钠溶液；滴加完后搅拌10min，静置分液，有机层减压浓缩，甲醇置换浓缩至稠状，降温析晶，过滤，滤饼少量甲醇淋洗，50℃干燥得GM-3精品95g。
4、GM-4合成
室温下，反应瓶中投入三苯基膦190g，溴代异戊烷120g，甲苯200ml，搅拌10min，氮气置换，升温至90℃反应，TLC监测，约10h反应完毕，过滤，固体用甲苯冲洗，滤饼50℃干燥得异戊基三苯基溴化膦300g。
室温下，反应瓶中加入异戊基三苯基溴化膦150g，甲苯250ml，搅拌下氮气置换，加入40g叔丁醇钾，升温至50℃反应2-3h，而后降温至30℃左右，氮气保护下加入GM-3，保持30度左右反应，TLC监测反应，约2h反应完毕；反应完后向反应瓶中加入200ml水，分液，有机相水洗。减压浓缩，甲醇置换至稠状，降温析晶，过滤，滤饼50℃干燥得GM-4精品。
5、胆固醇合成
室温下，反应瓶中加入5％钯碳0.5g，GM-4 50g，甲醇200ml，氮气置换3次，最后氢气置换，套氢气球，升温至40℃左右反应12h，反应完毕后，降至室温，排掉氢气，过滤，少量甲醇冲洗，合并母液，向其中加入50ml 15％稀盐酸，加热至40℃左右保温反应1-2h，水解完毕后加入10％氢氧化钠溶液调至中性，减压浓缩，水析出料，过滤得胆固醇粗品。
胆固醇NMR图谱：
图1为1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(t,J＝2.8Hz,1H),3.02-3.43(m,1H),2.36-2.27(m,2H),2.00-1.82(m,5H),1.56-0.87(m,28H),0.86(d,J＝1.6Hz,6H),0.68(s,3H).
图2为13C NMR(101MHz,CDCl3)δ140.78,121.71,71.80,56.78,56.18,50.15,42.33,39.80,39.53,37.27,36.51,36.21,35.80,31.92,31.68,28.24,28.02,24.31,23.85,22.83,22.57,21.10,19.41。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胆固醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，经生物发酵、氧化、GM-2氧化、witting反应、氢化、水解得到胆固醇及其衍生物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胆固醇及其衍生物的制备方法包括如下步骤：
(1)以植物甾醇为起始原料，对植物甾醇的3位羟基进行醚化保护，得到GM-1；
(2)所述GM-1经生物发酵，得到GM-2；
(3)所述GM-2与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)发生氧化反应，得到GM-3；
(4)所述GM-3与异戊基三苯基溴化膦通过witting反应合成GM-4；
(5)所述GM-4经氢化、水解，得到胆固醇及其衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述植物甾醇具有如式1所示的结构：
Figure FDA0002778567510000011
即，所示植物甾醇选自菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇或β-谷甾醇。
4.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醚化保护的过程包括：将植物甾醇与二甲氧基甲烷混合，然后加入硅藻土、五氧化二磷，搅拌反应，待反应完全后升温，趁热过滤，洗涤，烘干，得到植物甾醇醚化物粗品；采用丙酮对所述植物甾醇醚化物粗品进行纯化，得到所述植物甾醇醚化物GM-1。
5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物发酵的过程包括：(a)种子培养；(b)将步骤(a)培养得到的种子GM-1接种在含有GM-1的培养基中，进行发酵转化，经后处理，回收提取，得到GM-2。
6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养；
所述一级种子培养包括如下步骤：在冷却且灭菌的培养基的斜面上接种Mycobacterium sp.NRRL B-3805菌种进行培养，得到一级种子；所述培养基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸钠0.54％、磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5；
其中，所述二级种子培养包括如下步骤：在冷却且灭菌的培养基的斜面上接种一级种子进行培养，得到二级种子；所述培养基含有酵母膏粉10g/L、葡萄糖15g/L、硝酸钠0.54％、磷酸氢二氨0.06％，pH＝7.5。
7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，在发酵罐内装入含有GM-1的培养基，灭菌，冷却，接种二级种子，进行发酵转化，转化结束后调节pH值至5-6，加热搅拌，静置，分层，得到油层；将转化得到的油层用甲醇提取，减压浓缩干溶剂，再加入乙酸乙酯回流打浆，冷却，过滤，滤液回收提取，得到GM-2；
其中，含有GM-1的培养基含有GM-1 2％、大豆油16％、玉米浆6％、硝酸钠5.4％、磷酸氢二铵0.06％，培养基的pH＝8.0。
8.根据权利要求2-任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述GM-2与2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)的质量比为(90-110):1；
所述氧化反应包括如下步骤：将GM-1和TEMPO在室温下溶解于二氯甲烷中，降温至0-5℃，加入溴化钠溶液，搅拌，保持温度0-5℃，而后滴加次氯酸钠溶液，滴加过程控温0-5℃，滴加完后保持0-5℃反应，TLC监测，原料反应完后，搅拌下滴加硫代硫酸钠溶液；滴加完后搅拌，静置分液，得到的有机层减压浓缩，甲醇置换浓缩至稠状，降温析晶，过滤，滤饼少量甲醇淋洗，干燥得GM-3。
9.根据权利要求2-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，室温下将异戊基三苯基溴化膦和甲苯搅拌混合，氮气置换，加入叔丁醇钾，升温后反应；而后降温，氮气保护下加入GM-3，保温反应；反应完成后向反应瓶中加入水，分液，有机相水洗；减压浓缩，甲醇置换至稠状，降温析晶，过滤，干燥滤饼，得到GM-4。
10.根据权利要求2-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，在钯碳存在条件下，将GM-4加入甲醇中，先用氮气置换，再用氢气置换，在氢气气氛下升温反应，反应完毕后，降至室温，排掉氢气，过滤，少量甲醇冲洗滤饼，合并母液；向母液中加入稀盐酸，加热进行水解反应，反应完成后调节pH至中性，减压浓缩，水析出料，过滤得到胆固醇。
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