CN115637281A - 制3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制3β,7β‑二羟基‑5α‑H的UDCA异构体方法，所述方法包括：第一步，使用如化合物I所示的3,7‑二酮‑5α‑胆甾烷‑24‑酸在7β‑类固醇脱氢酶存在下生成如中间态I所示的化合物3‑酮‑5α‑H‑7β‑羟基‑胆甾烷‑24‑酸；第二步，再在3β‑类固醇脱氢酶存在下生成如化合物II所示的3β,7β‑二羟基‑5α‑H的UDCA异构体。本发明选择特定的原料和方法步骤，并用酶催化代替繁琐的化学合成步骤，酶催化反应专一性强，副产物极少，获得的目标产物纯度高，步骤简便，反应条件温和，极大地减少了有毒有害化学试剂的使用；整个过程反应步骤少，物料的损失少，收率高。
Description
技术领域
本发明属于有机化学领域，具体属于一种制备3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体的方法。
背景技术
熊去氧胆酸，化学名为3α，7β-二羟基-5β-胆烷酸，英文名为Ursodeoxycholicacid，化学式为C24H40O4，简称UDCA，其结构式如下：
熊去氧胆酸是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性地抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子与蛋白激酶C组成的信号网络，激活分裂活性蛋白激酶来增强胆汁淤积肝细胞的分泌能力，使血液及肝细胞中的内源性疏水胆酸浓度降低，达到抗胆汁淤积的作用。
熊去氧胆酸的全球市场需求量大，中国每年以中间体或原料药形式出口国外达到500吨以上，产值15亿人民币以上。
熊去氧胆酸广泛应用于医药保健品，其中用于制药的比例最大，2019年约占78％，而杂质对药品的安全性和有效性至关重要，药监部门对其也越来越重视，对药品杂质进行研究已成为目前药品生产研发必不可少的一步。
从动物内脏中提取的熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸及胆酸结构中5位氢原子为β位，但是以植物源发酵产物BA(21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮)经过一系列合成制备的3,7-二酮-5β-胆甾烷-24-酸存在异构体3,7-二酮-5α-胆甾烷-24-酸，其制备路线的最后几步如下所示：
在由上述3,7-二酮-5β-胆甾烷-24-酸继续反应制备UDCA的过程中，上述3,7-二酮-5α-胆甾烷-24-酸会引入新的杂质，而该杂质会对UDCA的质量产生影响。因而对于植物源发酵产物BA制备UDCA的方法来说，制备出高纯度的相应杂质以及确认其结构，对标定产品UDCA的纯度能起到关键性的作用。
但现有技术中制备高纯度的UDCA异构体存在诸多困难，其制备步骤繁琐，花费的人力物力成本高；精制过程麻烦，收率特别低；且过程中需使用多种对人体有害的化学试剂，如甲醇、二氯甲烷、乙酸酐等。
因此，本领域需要一种便捷环保地制备高纯度的3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体的方法。
发明内容
本发明提供一种制3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体方法，所述方法包括：第一步，使用如化合物I所示的3,7-二酮-5α-胆甾烷-24-酸在7β-类固醇脱氢酶存在下生成如中间态I所示的化合物3-酮-5α-H-7β-羟基-胆甾烷-24-酸；第二步，再在3β-类固醇脱氢酶存在下生成如化合物II所示的3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体；
在一种具体的实施方式中，所述第一步中，先在反应容器中加入异丙醇、水、化合物Ⅰ和葡萄糖，用碱调节pH至6.5-7.5，调节反应温度为25-40℃，待充分混匀后，再加入葡萄糖脱氢酶、7β-类固醇脱氢酶、辅酶，搅拌混匀后，用碱调节pH＝6.5-7.5反应，且第一步的反应时间为5～12h；优选所述碱为氢氧化钠溶液，优选反应温度为30-35℃。
在一种具体的实施方式中，所述第二步中，包括向第一步的反应液中加入葡萄糖脱氢酶、3β-类固醇脱氢酶、葡萄糖、辅酶，用碱调节pH＝6.5-7.5继续保温反应2～8h，优选3～6h。
在一种具体的实施方式中，在所述第二步反应后，先在35～42℃下负压旋蒸浓缩除去其中的异丙醇，再在0～10℃的低温下打浆，使产物析晶，固液分离，所述固体用水清洗并干燥后为异构体粗品，优选打浆温度为2～6℃，优选干燥温度为40～60℃。
在一种具体的实施方式中，在所述异构体粗品中加入异丙醇萃取，常温打浆后固液分离，所得固体用异丙醇淋洗；所得液体在25～35℃下进行负压旋蒸浓缩，再用水置换异丙醇，然后在0～10℃低温下打浆，使产物尽可能析晶，再固液分离并用水清洗，所得固体烘干后即为所述3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体，优选低温下打浆温度为2～6℃，优选烘干温度为40～60℃。
在一种具体的实施方式中，所述固液分离均为过滤，所述低温下打浆时间均在2h以内，优选30～60min，所述常温打浆时间为2h以内，优选20～40min。
在一种具体的实施方式中，所述第一步和第二步中的辅酶均包括辅酶I即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和辅酶II即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐。
有益效果：本发明所述方法操作简单，反应条件温和安全，且专一性强，无明显副产物产生，收率高且产品纯度高。
附图说明
图1为本发明所述3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体的核磁氢谱图。
具体实施方式
在生产和销售UDCA的过程中，需要相应提供其异构体杂质3α,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体以及3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体的含量，而要清楚地得知这两种异构体的含量以及标定产品UDCA的纯度，则当然需要先制备出高纯度的3α,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体以及3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体。但以现有技术中的化学法制备高纯度的UDCA异构体存在上述诸多困难。
因此，本发明选用合适的原料和方法步骤，且利用酶的专一性制备出高纯度的3β,7β-二羟基-5α-H-胆甾烷-24-酸。
本发明合成路线如下：
其中，化合物I先经7β-类固醇脱氢酶还原得到中间态I；中间态I再经3β-类固醇脱氢酶还原得到化合物II。
关于化合物I，本申请的发明人在先研发的专利一种植物源7-酮基石胆酸异构体杂质的制备方法(CN202111345128.8)中提供的如下式III所示中间体即3,7-二酮-5α-胆甾烷-24-酸，也即本发明中的化合物I。此外，化合物3,7-二酮-5α-胆甾烷-24-酸属于本领域技术人员公知的化合物，其CAS号为115224-60-7。
关于本发明合成路线中的酶：其中3β还原酶是3β-类固醇脱氢酶的简称，由申请人自行构建，例如按照专利申请CN202110870850.7中氨基酸序列1所示的酮还原酶制备3β-类固醇脱氢酶。而7β还原酶是7β-类固醇脱氢酶的简称，由申请人自行构建，例如按照专利申请CN201780001726.9中氨基酸序列2所示制备7β-类固醇脱氢酶。葡萄糖脱氢酶：购自上海麦克林生化科技有限公司。辅酶一(NAD)：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，购自上海跃腾生物技术有限公司。辅酶二(NADP)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，购自杭州唯泰生物药业有限公司。
相对于现有技术，本发明选择特定的原料和方法步骤，并用酶催化代替繁琐的化学合成步骤，酶催化反应专一性强，副产物极少，获得的目标产物纯度高，步骤简便，反应条件温和，极大地减少了有毒有害化学试剂的使用；整个过程反应步骤少，物料的损失少，收率高。
实施例1
化合物I先经7β-类固醇脱氢酶还原得到中间态I；中间态I再经3β-类固醇脱氢酶还原得到化合物II。
具体地，在洁净的反应瓶中加入150ml异丙醇和60ml清水，搅拌混匀后加入30.0g化合物Ⅰ和30.0g葡萄糖，用2M氢氧化钠水溶液调节pH至6.5-7.5，调节反应温度为30-35℃，待体系充分混匀后，向体系中加入6.0g葡萄糖脱氢酶、15.0g 7β-类固醇脱氢酶、1.0g辅酶I和1.0g辅酶II。搅拌混匀后，用2M氢氧化钠水溶液调节pH＝6.5-7.5反应，反应8h。TLC检测底物残留较少时加入6.0g葡萄糖脱氢酶、15.0g 3β-类固醇脱氢酶、30.0g葡萄糖、1.0g辅酶I和1.0g辅酶II。用2M氢氧化钠水溶液调节pH＝6.5-7.5继续保温搅拌反应4h，TLC检测底物残留较少时停止反应。反应结束后将反应体系进行40℃，0.1MPa负压旋蒸浓缩，除去其中异丙醇，体系中产物大量析晶。然后将体系于4℃低温低速打浆30-60min，使产物析晶，过滤，用少量清水顶洗，滤饼于50℃热风循环烘箱中干燥，烘干后的滤饼重44.6g。加入200ml异丙醇萃取滤饼，常温打浆30min后过滤，滤饼用少量异丙醇淋洗。将滤液进行30℃，0.1MPa负压旋蒸浓缩，浓缩到小体积时用水置换异丙醇，将体系4℃低温低速打浆30-60min，使产物尽可能析晶，过滤，用少量清水顶洗，滤饼于50℃热风循环烘箱中干燥，烘干后的滤饼重29.0g，重量收率96.67％，液相色谱纯度：98.8％。
对比例1
化合物I先经3β-类固醇脱氢酶还原，再经7β-类固醇脱氢酶还原得到化合物II。
具体地，在洁净的反应瓶中加入150ml异丙醇和60ml清水，搅拌混匀后加入30.0g化合物Ⅰ和30.0g葡萄糖，用2M氢氧化钠水溶液调节pH至6.5-7.5，调节反应温度为30-35℃，待体系充分混匀后，加入6.0g葡萄糖脱氢酶、15.0g 3β-类固醇脱氢酶、1.0g辅酶I和1.0g辅酶II，搅拌混匀后用2M氢氧化钠水溶液调节pH＝6.5-7.5保温反应20h。TLC检测底物残留较少时，向体系中加入6.0g葡萄糖脱氢酶、15.0g 7β-类固醇脱氢酶、30.g葡萄糖、1.0g辅酶I和1.0g辅酶II。搅拌混匀后，用2M氢氧化钠水溶液调节pH＝6.5-7.5继续保温反应8h。TLC检测底物残留较少时停止反应。反应结束后将反应体系进行40℃，0.1MPa负压旋蒸浓缩，除去其中异丙醇，体系中产物大量析晶。然后将体系于4℃低温低速打浆30-60min，使产物析晶，过滤，用少量清水顶洗，滤饼于50℃热风循环烘箱中干燥，烘干后的滤饼重42.5g。加入200ml异丙醇萃取滤饼，常温打浆30min后过滤，滤饼用少量异丙醇淋洗。将滤液进行30℃，0.1MPa负压旋蒸浓缩，浓缩到小体积时用水置换异丙醇，将体系4℃低温低速打浆30-60min，使产物尽可能析晶，过滤，用少量清水顶洗，滤饼于50℃热风循环烘箱中干燥，烘干后的滤饼重28.4g，重量收率94.67％，液相色谱纯度：98.1％。
从实施例1和对比例1的比较可见，使用本发明所述方法“化合物I先经7β-类固醇脱氢酶还原得到中间态I，中间态I再经3β-类固醇脱氢酶还原得到化合物II”制备3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体收率高且该异构体的纯度高，该方法不仅明显优于现有技术中的化学合成法，还比对比例1中“化合物I先经3β-类固醇脱氢酶还原，再经7β-类固醇脱氢酶还原得到化合物II”的方法也明显更优，对比例1中的第一步和第二步的反应时间都比实施例1更长，且其产物的收率和纯度均低于实施例1。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.制3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体方法，其特征在于，所述方法包括：第一步，使用如化合物I所示的3,7-二酮-5α-胆甾烷-24-酸在7β-类固醇脱氢酶存在下生成如中间态I所示的化合物3-酮-5α-H-7β-羟基-胆甾烷-24-酸；第二步，再在3β-类固醇脱氢酶存在下生成如化合物II所示的3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一步中，先在反应容器中加入异丙醇、水、化合物Ⅰ和葡萄糖，用碱调节pH至6.5-7.5，调节反应温度为25-40℃，待充分混匀后，再加入葡萄糖脱氢酶、7β-类固醇脱氢酶、辅酶，搅拌混匀后，用碱调节pH＝6.5-7.5反应，且第一步的反应时间为5～12h；优选所述碱为氢氧化钠溶液，优选反应温度为30-35℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二步中，包括向第一步的反应液中加入葡萄糖脱氢酶、3β-类固醇脱氢酶、葡萄糖、辅酶，用碱调节pH＝6.5-7.5继续保温反应2～8h，优选3～6h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述第二步反应后，先在35～42℃下负压旋蒸浓缩除去其中的异丙醇，再在0～10℃的低温下打浆，使产物析晶，固液分离，所述固体用水清洗并干燥后为异构体粗品，优选打浆温度为2～6℃，优选干燥温度为40～60℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述异构体粗品中加入异丙醇萃取，常温打浆后固液分离，所得固体用异丙醇淋洗；所得液体在25～35℃下进行负压旋蒸浓缩，再用水置换异丙醇，然后在0～10℃低温下打浆，使产物尽可能析晶，再固液分离并用水清洗，所得固体烘干后即为所述3β,7β-二羟基-5α-H的UDCA异构体，优选低温下打浆温度为2～6℃，优选烘干温度为40～60℃。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述固液分离均为过滤，所述低温下打浆时间均在2h以内，优选30～60min，所述常温打浆时间为2h以内，优选20～40min。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述第一步和第二步中的辅酶均包括辅酶I即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和辅酶II即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐。
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