CN112280818A - 一种循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙酮/异丙醇循环在酶法制备熊去氧胆酸（UDCA）中的应用，为两步酶法制备UDCA提供了一种环保、经济、高效的新思路。第一步利用酮还原酶将丙酮还原为异丙醇，同时将NADPH/NADH转化成NADP+/NAD+，为7‑α类固醇脱氢酶（7‑αHSDH）催化鹅去氧胆酸（CDCA）生成7‑羰基石胆酸（7‑KLCA）提供NADP+/NAD+；第二步利用异丙醇脱氢酶将异丙醇氧化为丙酮，同时将NADP+/NAD+转化成NADPH/NADH，为7‑β类固醇脱氢酶（7‑βHSDH）催化7‑KLCA生成UDCA提供NADPH/NADH。此两步酶法利用固定化酶，工艺简单，在第一步反应结束后简单处理就可以进行第二步反应，不需要中间提纯；反应中NADP+/NAD+加量少，且丙酮和异丙醇可以回收利用，极大降低了生产成本和环保压力。

Description

一种循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法

技术领域

本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法。

背景技术

熊去氧胆酸（UDCA），化学名称为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，为有机化合物，无臭，味苦。医学上用于增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解，用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。

近几年国内UDCA市场呈爆炸式增长，目前的生产工艺普遍为化学工艺，从动物胆汁中提取到CDCA，再利用化学法做到UDCA，化学法工艺复杂，收率低，成本高，环保和安全性差。这几年随着国内酶催化市场的普及，不少厂家及科研单位开始尝试酶催化生产UDCA，比较常见的从CDCA到UDCA主要有化学法-酶法和两步酶法两种应用。专利CN106086149A公开了一种化学-酶法制备UDCA的方法，CDCA到7-KLCA用次氯酸钠氧化，7-KLCA到UDCA用酶法催化，化学氧化存在的问题就是氧化剂残留会影响下一步酶催化，虽然利用亚硫酸钠处理，但仍存在不稳定因素，不利于大规模稳定生产，第二步酶催化的辅酶再生用的葡萄糖，反应后生成大量的葡萄糖酸钠，虽然对反应本身没什么影响，但是造成的污水处理成本却是非常大，不符合当前越来越严格的环保政策，专利CN107995929A、CN109055473A、CN110643584A等均用的葡萄糖的辅酶再生体系，而有些专利用的乳酸、苹果酸钠等辅酶再生体系，也均有一定的污水处理压力。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明通过采用助溶剂丙酮与酶之间的反应与转化，实现提供了丙酮-异丙醇循环辅助固定化酶制备熊去氧胆酸的方法，该方法的工艺简单，成本低，转化率高，后处理更容易，更加环保。同时丙酮和异丙醇易蒸馏回收，降低成本及减少后续处理工序。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案。

一种循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，包括以下步骤：

（1）第一步酶催化反应：利用酮还原酶将丙酮还原为异丙醇，同时将NADPH/NADH转化成NADP+/NAD+，为7-α类固醇脱氢酶7-αHSDH催化鹅去氧胆酸CDCA生成7-羰基石胆酸7-KLCA提供NADP+/NAD+；获得第一步酶反应液；

（2）第二步酶催化反应：利用异丙醇脱氢酶将异丙醇氧化为丙酮，同时将NADP+/NAD+转化成NADPH/NADH，为7-β类固醇脱氢酶7-βHSDH催化7-KLCA生成熊去氧胆酸UDCA提供NADPH/NADH。

优选地，步骤（1）的过程为：丙酮溶于水中，然后加入CDCA搅拌溶解，然后加入NADP+/NAD+，控制反应体系温度及pH，再加入酮还原酶和7-αHSDH，反应，生成产物7-KLCA。

更优选地，所述的酮还原酶和7-αHSDH为固定化酶。

优选地，第一步酶催化反应的各物料质量比例为酮还原酶:丙酮:NADP+/NAD+:7-αHSDH:CDCA = 0.1-0.2:2-3:0.0001-0.0005:0.2-0.5:1；其中CDCA的质量浓度为5%-20%。

优选地，反应条件为温度25-37℃，pH 6-7.5；反应过程中液相检测CDCA和7-KLCA的含量，当底物反应98%以上时结束反应。

优选地，反应结束后，从第一步酶反应液中过滤回收固定化酶，剩下的反应液准备第二步酶反应。

优选地，步骤（2）的过程为：向第一步酶反应液中添加异丙醇，控制反应体系温度及pH，再加入异丙醇脱氢酶和7-βHSDH，生成产物UDCA。

优选地，所述的异丙醇脱氢酶和7-βHSDH为固定化酶。

优选地，第二步酶催化反应中，物料添加的质量比例为异丙醇脱氢酶:异丙醇:7-βHSDH:7-KLCA=0.2-0.5:1:0.2-0.5:1。

优选地，反应条件为温度25-37℃，pH 6-7.5；反应过程中用液相检测7-KLCA和UDCA的含量，当底物反应98%以上时结束反应。

优选地，反应结束后过滤回收固定化酶，剩下的反应液，抽真空，将反应体系中的丙酮、异丙醇去掉；然后用等体积乙酸乙酯萃取，合并有机相，抽真空去溶剂，得到熊去氧胆酸UDCA。

本发明通过酮还原酶、异丙醇脱氢酶实现丙酮与异丙醇的转化，实现NADP+/NAD+与NADPH/NADH的转化，再结合7-αHSDH与7-βHSDH的催化作用，从鹅去氧胆酸CDCA先生成7-羰基石胆酸7-KLCA，最后得到熊去氧胆酸UDCA。丙酮与异丙醇在作为溶剂的同时，通过转化作用实现促进反应的作用，另外丙酮与异丙醇溶剂沸点低，易于回收处理，实现反应的循环，降低整体的成本。

附图说明

图1为本发明的酶催化反应过程图。

本发明的有益效果

1）本技术所涉及的酶反应均采用了固定化酶，反应结束后均可回收反复利用，从而降低了生产成本，而且不会对反应体系添加杂蛋白，从而简化了后提取的步骤；

2）由于两步酶反应中均含有大量丙酮或者异丙醇，因此不需要再向反应体系中添加助溶剂，反应底物均能很好的溶解于体系中，从而加快了反应速度；

3）第一步反应的产物异丙醇可以直接套用到第二步反应中作为底物，节省了生产成本；

4）丙酮和异丙醇能够很容易蒸馏回收套用，既节约了生产成本，又减轻了环保压力。

具体实施方式

实施例1：反应体系500ml，先将120ml丙酮和250ml纯水加入1L的三孔反应瓶中搅拌混溶，反应瓶置于25℃恒温水浴锅中，然后加入50.16g CDCA继续搅拌半小时，让其充分溶解至混溶液中，然后加入0.02g NADP+，调节pH至6.0-6.2，再加入5.42g酮还原酶和15.28g 7-αHSDH，用纯水补足体积，300rpm反应12-15h，反应期间控制温度和pH在工艺要求范围内，并用液相检测CDCA和7-KLCA的含量，当底物反应超过98%时终止反应，反应液过60目滤网回收固定化酶，其余体系等待进入第二步酶反应。

实施例2：反应体系约550ml，先将实施例1制备的第一步酶反应液加入1L的三孔反应瓶中，反应瓶置于30℃恒温水浴锅中，打开搅拌300rpm搅拌半小时后，向反应液中加入50ml异丙醇，调节pH至7.0-7.2，再加入15.31g异丙醇脱氢酶和25.22g 7-βHSDH， 300rpm反应，反应期间控制温度和pH在工艺要求范围内，并用液相检测7-KLCA和UDCA的含量，当底物反应超过98%时终止反应，反应液过60目滤网回收固定化酶，剩下的反应液56℃抽真空冷凝回收丙酮，得到丙酮108.3ml，82℃抽真空回收异丙醇，得异丙醇45.5ml。

反应液去掉有机相后，用380ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，80℃恒温水浴抽真空去溶剂，得到UDCA干粉46.65g，纯度98.3%，总收率93.0%。

实施例3：反应体系1000L，先将240L丙酮和500L纯水加入1.5T的不锈钢反应罐中，打开搅拌200rpm，夹套控温30℃，然后加入100.09kg CDCA继续搅拌半小时，让其充分溶解至混溶液中，然后加入0.05kg NADP+，调节pH至7.0-7.2，再加入15.35kg酮还原酶和50.07kg 7-αHSDH，用纯水补足体积至1000L，恒温反应，反应期间控制温度和pH在工艺要求范围内，并用液相检测CDCA和7-KLCA的含量，当底物反应超过98%时终止反应，反应液过60目滤网回收固定化酶，其余体系等待进入第二步酶反应。

实施例4：反应体系1100L，先将实施例3制备的第一步酶反应液加入1.5T的不锈钢反应罐中，打开搅拌200rpm，夹套控制反应液温度29-30℃，搅拌半小时后向反应液中加入100L异丙醇，调节pH至6.0-6.2，再加入40.11kg异丙醇脱氢酶和50.15kg 7-βHSDH，恒温反应12-15h，反应期间控制温度和pH在工艺要求范围内，并用液相检测7-KLCA和UDCA的含量，当底物反应超过98%时终止反应。

实施例5：实施例4的第二步酶催化反应后，反应液过60目滤网回收固定化酶，剩下的反应液56℃抽真空冷凝回收丙酮,得到丙酮203.6L，82℃抽真空回收异丙醇，得到异丙醇82.4L。反应液去掉有机相后导入萃取罐，用800L乙酸乙酯萃取，萃取三次合并有机相导入真空蒸馏罐，打开搅拌，夹套蒸汽加热去溶剂，待到膏状粘稠状态后加入少量纯水继续抽真空去溶，彻底去溶后进三足离心机甩干去水，可用少量纯水冲洗蒸馏罐。离心机甩干后，收集UDCA进行双锥干燥，得到UDCA干粉87.29kg，纯度98.1%，总收率87.2%。

实施例6：反应体系500ml，先将120ml丙酮和250ml纯水加入1L的三孔反应瓶中搅拌混溶，反应瓶置于37℃恒温水浴锅中，然后加入50.32g CDCA继续搅拌半小时，让其充分溶解至混溶液中，然后加入0.02g NADP+，调节pH至7.2-7.5，再加入6.22g酮还原酶和15.18g 7-αHSDH，用纯水补足体积，300rpm反应12-15h，反应期间控制温度和pH在工艺要求范围内，并用液相检测CDCA和7-KLCA的含量，当底物反应超过98%时终止反应，反应液过60目滤网回收固定化酶，其余体系等待进入第二步酶反应。

实施例7：反应体系约550ml，先将实施例6的第一步酶反应液加入1L的三孔反应瓶中，反应瓶置于37℃恒温水浴锅中，打开搅拌300rpm搅拌半小时后，向反应液中加入50ml异丙醇，调节pH至7.2-7.5，再加入15.07g异丙醇脱氢酶和24.89g 7-βHSDH， 300rpm反应，反应期间控制温度和pH在工艺要求范围内，并用液相检测7-KLCA和UDCA的含量，当底物反应超过98%时终止反应，反应液过60目滤网回收固定化酶，剩下的反应液56℃抽真空冷凝回收丙酮，得到丙酮99.3ml，82℃抽真空回收异丙醇，得到异丙醇43.5ml。

反应液去掉有机相后，用380ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，80℃恒温水浴抽真空去溶剂，得到UDCA干粉45.93g，纯度98.2%，总收率91.3%。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）第一步酶催化反应：利用酮还原酶将丙酮还原为异丙醇，同时将NADPH/NADH转化成NADP+/NAD+，为7-α类固醇脱氢酶7-αHSDH催化鹅去氧胆酸CDCA生成7-羰基石胆酸7-KLCA提供NADP+/NAD+；获得第一步酶反应液；

（2）第二步酶催化反应：利用异丙醇脱氢酶将异丙醇氧化为丙酮，同时将NADP+/NAD+转化成NADPH/NADH，为7-β类固醇脱氢酶7-βHSDH催化7-KLCA生成熊去氧胆酸UDCA提供NADPH/NADH。

2.根据权利要求1所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（1）的过程为：丙酮溶于水中，然后加入CDCA搅拌溶解，然后加入NADP+/NAD+，控制反应体系温度及pH，再加入酮还原酶和7-αHSDH，反应，生成产物7-KLCA。

3.根据权利要求2所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述的酮还原酶和7-αHSDH为固定化酶。

4. 根据权利要求1或2所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，第一步酶催化反应的各物料质量比例为酮还原酶:丙酮:NADP+/NAD+:7-αHSDH:CDCA = 0.1-0.2:2-3:0.0001-0.0005:0.2-0.5:1；其中CDCA的质量浓度为5%-20%。

5. 根据权利要求2所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，反应条件为温度25-37℃，pH 6-7.5；反应过程中液相检测CDCA和7-KLCA的含量，当底物反应98%以上时结束反应。

6.根据权利要求1所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，反应结束后，从第一步酶反应液中过滤回收固定化酶，剩下的反应液准备第二步酶反应。

7.根据权利要求1所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（2）的过程为：向第一步酶反应液中添加异丙醇，控制反应体系温度及pH，再加入异丙醇脱氢酶和7-βHSDH，生成产物UDCA；优选地，所述的异丙醇脱氢酶和7-βHSDH为固定化酶。

8.根据权利要求1或7所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，第二步酶催化反应中，物料添加的质量比例为异丙醇脱氢酶:异丙醇:7-βHSDH:7-KLCA=0.2-0.5:1:0.2-0.5:1。

9. 根据权利要求7所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，反应条件为温度25-37℃，pH 6-7.5；反应过程中用液相检测7-KLCA和UDCA的含量，当底物反应98%以上时结束反应。

10.根据权利要求1所述的循环酶催化制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，反应结束后过滤回收固定化酶，剩下的反应液，抽真空，将反应体系中的丙酮、异丙醇去掉；然后用等体积乙酸乙酯萃取，合并有机相，抽真空去溶剂，得到熊去氧胆酸UDCA。

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