CN105368828A - 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法；一种7a-类固醇脱氢酶(7a-HSDH)和一种用于辅酶NAD⁺再生的乳酸脱氢酶(LDH)在大肠杆菌里的高效共表达，上述大肠杆菌全细胞用于催化鹅去氧胆酸(CDCA)生成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸(7-KLCA)；将上述全细胞催化鹅去氧胆酸得到的反应液调酸7-KLCA粗品；上述重组细胞可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产。

Description

一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法

技术领域：

本发明提供一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。本发明属于生物工程技术领域。

背景技术：

熊去氧胆酸(I,UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对映异构体鹅去氧胆酸(II，CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。

(I)熊去氧胆酸(UDCA)

(II)鹅去氧胆酸(CDCA)

(III)胆酸(CA)

(IV)3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸(7KLCA)

UDCA的经典化学合成方法如下。因为化学氧化是非选择性的，所以必须借助酯化来保护3α-和7α-羟基。此外，7-酮基石胆酸(7-KLCA)的还原用到金属钠或者Pd/C催化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。

PCT/EP2009/002190里描述(如下)使用12α-类固醇脱氢酶(12α-HSDH)选择性地将胆酸(CA)氧化成12酮-去氧胆酸(12酮-CDCA)，避免了两个保护步骤，但是仍然需要7-KLCA的还原步骤。

胆酸→12-酮-CDCA→CDCA→7-KLCA→UDCA

Monti,D.,等(AdvancedSynthesis&Catalysis2009,351,1303-1311)描述了另外一种酶促转化方法。首先通过来自脆弱杆菌ATCC25285的7α-HSDH和12α-HSDH(Tetrahedron,2006,62(18):4535-4539)将CA氧化成7，12-二酮-LCA，然后通过梭菌ATCC27555的7β-HSDH(BiochimBiophysActa,1981,665(2):262-269)的还原而形成12-酮-UDCA，最后通过wolff-kishner还原反应获得终产物。整个反应需要三种酶的参与，以及相关辅酶的再生系统(乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)，使得整个过程比较复杂。而且因为催化反应的平衡问题，完全转化是不可能的。

CA→7，12-二酮-LCA→12-酮-UDCA→UDCA

Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC25986的NADP+依赖性的7β-HSDH(ApplEnvironMicrobiol,1982,43(5):1057-1063),但是没有公开序列信息。2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年RolfD.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7，12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(ApplMicrobiolBiotechnol,2011,90:127-135),发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化得到了活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680),重组产生的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌RuminococcustorquesATCC35915克隆并高效表达了其7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。尽管如此，上述由不同来源的7β-HSDH催化的UDCA的合成反应，使用低的底物浓度(4～40g/L),而且在40g/L的底物浓度下转化率只有90％,产品收率仅71％。一般情况下，酶转化工艺使用100g/L或者更高底物浓度，且转化率要接近100％,才可视为具有工业化生产的意义，故表明此酶促反应离工业化大规模生产还有一定的距离。此外，上述不同的UDCA的酶促合成反应中使用的底物7-KLCA依然依赖于鹅去氧胆酸的化学氧化；反应中使用游离酶，因为整个反应需要多种酶与辅酶德的参与，使得整个过程比较复杂而在工业化生产中难以实现。

发明内容

本发明的目的是获得一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。涉及一种在大肠肝菌细胞中高效表达双酶的方法，使用这种方法构建的共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的重组大肠杆菌，以及构建的共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变子和醇脱氢酶(LKADH)的重组大肠杆菌；本发明也包括上述酶基因序列、编码的酶蛋白序列、产生此类酶的方法，以及上述重组大肠杆菌全细胞在胆酸化合物的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸(UDCA)合成中的用途；此外，本发明也包括使用全细胞合成UDCA的新方法，以及UDCA的后提取方法。

技术方案

一种串联形成双基因表达模块，其特征在于双基因表达模块为模块1或模块

2；其中所述模块1的序列依次由SeqIDNO：1，SeqIDNO:5，SeqIDNO:

2，SeqIDNO:3组成；所述模块2的序列依次由SeqIDNO：1，SeqIDNO:

9，SeqIDNO:2，SeqIDNO:7组成。

一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求1所述的模块1。

一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求2所述的模块2.

一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于由如下步骤实现：

A、采用含有模块1的重组大肠杆菌细胞催化底物鹅去氧胆酸CDCA合成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应液酸化后得到3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，同时采用乳酸脱氢酶及丙酮酸钠使得辅酶循环再生；

B、采用含有模块2的重组大肠杆菌细胞催化步骤A中所述的3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。

所述的一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于所述的熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。

具体介绍如下：

一种如附图2所示，使用单一启动子和双核糖体结合位点(RibosomeBindingsite,RBS)在大肠杆菌中实现双基因高效共表达的方法,其特征在于所述的每个基因前有一段包含核糖体结合位点的序列以实现双基因的高效表达，此序列如SeqIDNO:1和SeqIDNO:2。使用上述方法构建的共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)基因和乳酸脱氢酶(LDH)基因的重组大肠杆菌,其中7α-类固醇脱氢酶基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)K-12，基因序列如SeqIDNO:3所示，其编码的蛋白序列如SeqIDNO：4；乳酸脱氢酶基因来源于魏斯氏菌(Weissellasp.),基因序列如SeqIDNO:5所示，其编码的蛋白序列如SeqIDNO：6。

上述重组大肠杆菌细胞的应用，其特征在于所述的使用全细胞催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前体3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应中所需要的辅酶由细胞自身的乳酸脱氢酶催化丙酮酸钠而合成，从而实现辅酶的循环再生。

使用上述方法构建的共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)基因和醇脱氢酶(LKADH)基因的重组大肠杆菌，其中7β-类固醇脱氢酶基因为来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)的突变子，基因序列如SeqIDNO:7所示，其编码的蛋白序列如SeqIDNO：8；密码子优化的醇脱氢酶基因来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)，基因序列如SeqIDNO:9所示，其编码的蛋白序列如SeqIDNO:10。

上述重组大肠杆菌细胞的应用，其特征在于所述的使用全细胞催化3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA,反应中所需要的辅酶由细胞自身的醇脱氢酶催化异丙醇而合成，从而实现辅酶的循环再生。

一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于采用上述重组大肠杆菌细胞催化底物鹅去氧胆酸CDCA合成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应液酸化后得到7-KLCA粗品，同时采用所述乳酸脱氢酶(LDH)及丙酮酸钠使得辅酶循环再生；其特征也在于采用所述的重组大肠杆菌细胞催化如上所述的3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用上述醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。

所述的一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于获得熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。

本发明原理：

本发明提供的用于熊去氧胆酸UDCA合成的方法如附图1所示。以鹅去氧胆酸为底物，通过使用共表达来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)K-12的7α-类固醇脱氢酶基因和来源于魏斯氏菌(Weissellasp.)的乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌细胞，将鹅去氧胆酸氧化成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，同时使用细胞自带的乳酸脱氢酶/丙酮酸钠体系来实现辅酶NAD⁺的循环再生。进一步通过使用共表达来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)的7β-类固醇脱氢酶突变子基因和来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)的醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌细胞，将3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA一步还原成熊去氧胆酸UDCA，同时使用细胞自带的醇脱氢酶/异丙醇体系来实现辅酶NADP⁺的循环再生。上述的重组大肠杆菌全细胞催化体系能高效地、专一地将高浓度底物鹅去氧胆酸转化成UDCA，从而能实现酶法UDCA合成的工业化生产。

本发明的目的是具体通过以下技术方案实现的：

1、共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的重组大肠杆菌细胞的构建以及摇瓶发酵和酶活鉴定

如附图2所示，来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)K-12的7α-类固醇脱氢酶基因(基因序列：SeqNO:3,编码的蛋白序列：SeqIDNO：4)和来源于魏斯氏菌(Weissellasp.)的乳酸脱氢酶基因(基因序列：SeqIDNO:5,编码的蛋白序列：SeqIDNO：6)通过特定的连接序列(SeqIDNO:1)串联后。将上述合成的串联的双基因插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和XhoI位点得到含双基因表达模块的重组DNApET21a(+)-LDH-7αHSDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，30～37℃过夜培养后，以5-10％的接种量接入相应体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，继续在30～37℃培养直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.1～0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在25～30℃下诱导表达3～5小时后离心收集细胞。细胞悬浮于1/20发酵液体积的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)并超声破碎，离心后得到重组的7α-HSDH和LDH混合粗酶液。7α-HSDH酶活测定以鹅去氧胆酸为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.89mL的0.2mMNAD⁺(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),10μL的150mM鹅去氧胆酸,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值增加。LDH酶活测定以丙酮酸钠为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.8mL的0.2mMNADH(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),100μL的34mM丙酮酸钠,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值减少。二者酶活性单位(单位/mL)计算公式为：[△A340/分钟×3(mL)×粗酶稀释倍数]/[6.22×0.1(mL)]。

表一大肠杆菌共表达双酶7α-HSDH和LDH的摇瓶发酵酶活

酶名称	酶活(单位/mL酶液)
		7α-HSDH	698.8±67.9
LDH	1069.2±114.3

2、共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和醇脱氢酶(LKADH)的重组大肠杆菌细胞的构建以及摇瓶发酵和酶活鉴定

如附图2所示，来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)的密码子优化的7β-类固醇脱氢酶突变子基因(基因序列：SeqIDNO:7,编码的蛋白序列：SeqIDNO：8)和来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)的醇脱氢酶基因(基因序列：SeqIDNO:9,编码的蛋白序列：SeqIDNO：10)通过特定的连接序列(SeqNO:1)串联。将上述合成的串联的双基因插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和HindIII位点得到含双基因表达模块的重组DNApET21a(+)-LKADH-7βHSDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，30～37℃过夜培养后，以5-10％的接种量接入相应体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，继续在30～37℃培养直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.1～0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在25～30℃下诱导表达3～5小时后离心收集细胞。细胞悬浮于1/20发酵液体积的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)并超声破碎，离心后得到重组的7β-HSDH和LKADH混合粗酶液。7β-HSDH酶活测定以熊去氧胆酸为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.89mL的0.2mMNADP⁺(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),10μL的150mM熊去氧胆酸,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值增加。酶活性单位(单位/mL)计算公式为：[△A340/分钟×3(mL)×粗酶稀释倍数]/[6.22×0.1(mL)]。醇脱氢酶LKADH酶活测定方法见US8257952。

表二大肠杆菌共表达双酶7β-HSDH和LKADH的摇瓶发酵酶活

酶名称	酶活(单位/mL酶液)
		7β-HSDH	114.0±28.8
LKADH	33.4±4.5

3、共表达双酶(LDH-7αHSDH或者LKADH-7βHSDH)的重组大肠杆菌细胞的高密度发酵产酶

将平板上单菌落接种到250～500mLLB培养基(100μg/mL氨苄)中,在30～37℃下振荡培养12～16小时。由此方法得到的种子液以5～10％的量接种到5L的起始培养基中,起始培养基含有:15～30g/L的甘油,25～30g/L的磷酸二氢钾,10～15g/L的硫酸胺,5-10g/L的七水硫酸镁,0.2～0.5g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30～37℃，pH6.0～7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30％。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基(乳糖：40～50g/L，甘油：200-250g/L)诱导酶的产生。流加速度逐步增加，范围为60-250mL/小时。温度30～37℃，pH6.0～7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30％，总的诱导时间为8-12小时，直至细胞湿重达到100g/L以上。离心收集细胞于-20℃保存，用于催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前体7-KLCA或者催化7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA。取少量细胞悬浮于同体积发酵液的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组混合酶液后用于酶活测定。

表三大肠杆菌共表达双酶7α-HSDH和LDH的高密度发酵酶活

酶名称	酶活(单位/mL酶液)
		7α-HSDH	482.0±72.1
LDH	938.1±172.4

表四大肠杆菌共表达双酶7β-HSDH和LKADH的高密度发酵酶活

酶名称	酶活(单位/mL酶液)
		7β-HSDH	141.9±9.8
LKADH	44.7±7.1

4、重组大肠杆菌全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸以及熊去氧胆酸的提取和精制

全细胞催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前体7-KLCA:将鹅去氧胆酸悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)中，用2NNaOH调节pH至8.0。加入共表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的的大肠杆菌BL21(DE3)湿细胞(25％总反应体积，W/V)、0.1～0.5mMNAD⁺和340mM丙酮酸钠补充50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)至最终反应体积。底物终浓度在100g/L，反应在25℃、300～400rpm和pH7.8～8.0下进行,反应时间20～24小时。每隔一定时间取样在甲醇里稀释50～100倍，微孔过滤后10μL进样液相分析。液相检测使用安捷伦C-18柱为分析柱，1mM磷酸二氢钾：乙腈＝45:55(体积比)为洗脱剂，柱温35℃，检测波长210nm。反应结束后，用2NNaOH调节反应液pH至产物全部溶解，然后加入0.5～1.0％硅藻土在50～60℃搅拌0.5～1小时后过滤。滤液在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌20～30分钟后过滤得到7-KLCA粗品。

全细胞催化7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA：将7-KLCA悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用2NNaOH调节pH至8.0。加入共表达7β-类固醇脱氢酶和醇脱氢酶的的大肠杆菌BL21(DE3)湿细胞(25％总反应体积，W/V)、0.1～0.5mMNADP⁺和20～35％异丙醇后补充50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)至最终反应体积。底物终浓度在100g/L，反应在25℃、300～400rpm和pH7.8～8.0下进行,反应时间20～24小时。每隔一定时间取样，按照上述方法进行样品处理和液相分析。反应结束后，用2NNaOH调节反应液pH至产物全部溶解，然后加入0.5～1.0％硅藻土在50～60℃搅拌0.5～1小时后过滤。滤液在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌20～30分钟后过滤得到熊去氧胆酸粗品。

熊去氧胆酸粗品的精制：在有机溶剂如乙酸乙酯里加入25-30％(重量比)的熊去氧胆酸粗品，加热到60～70℃用碱(如三乙胺)溶解后，继续搅拌回流1～2小时。待上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2.0左右,过滤得到的结晶真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸。

表五重组大肠杆菌全细胞催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA

有益效果

1、使用高效共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的重组大肠杆菌,以及高效共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和醇脱氢酶(LKADH)的重组大肠杆菌全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸，反应体系无需额外添加辅酶再生用酶，各步反应底物浓度高达100g/L，转化率大于99.5％，熊去氧胆酸总的重量收率88-94％；

2、大肠杆菌细胞可以通过发酵方法廉价易得，无需酶的提取和纯化，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产；

3、酶促反应条件温和，不使用化学法用到的金属钠或者Pd/C等催化氢化还原剂，工业化放大生产容易控制而且安全。产生的废水容易处理，环境友好；

4、酶促反应选择性高，与化学法比较副产物少，产品后提取和精制简单。

附图说明

图1重组大肠杆菌全细胞催化的熊去氧胆酸的合成以及辅酶NAD⁺/NADP⁺的循环再生。

图2使用单一启动子和双核糖体结合位点(RibosomeBindingsite,RBS)在大肠杆菌中实现双基因的高效共表达。

具体实施方式

实施例1

将含有重组DNApET21a(+)-LDH-7αHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)接种到含有50mLLB培养基(100μg/mL氨苄)的250mL三角摇瓶中，37℃和300转/份过夜培养后，以10％的接种量接入装有400mLLB培养基(100μg/mL氨苄)的2L摇瓶中，继续在37℃和300转/分下培养2小时直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.2mM的IPTG，在25℃下诱导表达4小时后离心收集细胞。细胞悬浮于20mL100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中超声破碎，离心后得到重组混合粗酶液，7α-HSDH和LDH酶活分别为747.0单位/mL、1083单位/mL。

实施例2

使用和实施例1同样的方法来对含有重组DNApET21a(+)-LKADH-7βHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶发酵。诱导时间为4小时。离心收集细胞。细胞悬浮于20mL100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中超声破碎，离心后得到重组混合粗酶液，7β-HSDH和LKADH酶活分别为131.8单位/mL、32.0单位/mL。

实施例3

将含有重组DNApET21a(+)-LDH-7αHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)平板上单菌落接种到两个装有250mLLB培养基(100μg/mL氨苄)的1L摇瓶中,在37℃和300转/分下振荡培养15小时。将两个摇瓶里的种子液合并成500mL，接种到5L的起始培养基中,起始培养基含有:30g/L的甘油,25g/L的磷酸二氢钾,10g/L的硫酸胺,10g/L的七水硫酸镁,0.4g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30℃，pH7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25％。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基(乳糖：50g/L，甘油：200g/L)诱导酶的产生。流加速度为60-250mL/小时，在3小时内逐步达到最大流速。温度30℃，pH7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25％。总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到115g/L。离心收集细胞，并于-20度保存用于后续合成反应。称取50g湿细胞，悬浮于440mL的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组混合酶液。7α-HSDH和LDH酶活分别为431.0单位/mL、816.2单位/mL。

实施例4

使用和实施例3同样的方法来对含有重组DNApET21a(+)-LKADH-7βHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为9小时，细胞湿重达到110g/L。离心收集细胞，并于-20℃保存用于后续合成反应。称取50g湿细胞，悬浮于450mL的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组混合酶液。7β-HSDH和LKADH酶活分别为148.8单位/mL、49.7单位/mL。

实施例5

取100g含量为99.89％的鹅去氧胆酸,悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)中，用2NNaOH调节pH至8.0。加入实施例3的重组大肠杆菌湿细胞25g、500mg辅酶NAD⁺二钠盐和37.4g丙酮酸钠后开始反应。总的反应体积为1000mL，底物终浓度在100g/L。反应在25℃、350rpm和pH7.8～8.0下进行,6小时后转化率为99.8％。反应液用2NNaOH调节其pH至产物全部溶解。加入1.0％硅藻土在50～60℃搅拌1小时后过滤。滤液冷却后，在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌30分钟后过滤得到7-KLCA粗品。

实施例6

将实施例5得到的全部7-KLCA粗品,悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用2NNaOH调节pH至8.0。加入实施例4的重组大肠杆菌湿细胞25g、300mg辅酶NADP⁺二钠盐和330mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为1000mL，底物终浓度约100g/L。反应在25℃、350rpm和pH7.8～8.0下进行,20小时后转化率为99.6％。反应液用2NNaOH调节其pH至产物全部溶解。加入1.0％硅藻土在50～60℃搅拌1小时后过滤。滤液冷却后，在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌30分钟后过滤得到熊去氧胆酸，初步烘干后得到131.0g熊去氧胆酸粗品

实施例7

在330mL乙酸乙酯中加入实施例6得到的全部熊去氧胆酸粗品，加热到60～70℃滴加三乙胺溶解后，继续搅拌回流2小时。待上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2.0左右,过滤得到的结晶真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸93.95g，从鹅去氧胆酸CDCA的重量收率约为94％，经检测符合欧洲药典标准。

SEQUENCELISTING

<110>南京普瑞特生物科技有限公司

刘志斌

<120>一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法

<130>

<160>10

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>14

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>串联双基因含RBS的前导序列

<220>

<221>Unsure

<222>(1)..(14)

<400>1

aaggagatatacat14

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>串联双基因之间含RBS的连接序列

<220>

<221>Unsure

<222>(1)..(14)

<400>2

aaggagatatatat14

<210>3

<211>768

<212>DNA

<213>大肠杆菌（Escherichiacoli）K-12

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(768)

<400>3

atgtttaattctgacaacctgagactcgacggaaaatgcgccatcatc48

MetPheAsnSerAspAsnLeuArgLeuAspGlyLysCysAlaIleIle

151015

acaggtgcgggtgcaggtattggtaaagaaatcgccattacattcgcg96

ThrGlyAlaGlyAlaGlyIleGlyLysGluIleAlaIleThrPheAla

202530

acagctggcgcatctgtggtggtcagtgatattaacgccgacgcagct144

ThrAlaGlyAlaSerValValValSerAspIleAsnAlaAspAlaAla

354045

aaccatgttgtagacgaaattcaacaactgggtggtcaggcatttgcc192

AsnHisValValAspGluIleGlnGlnLeuGlyGlyGlnAlaPheAla

505560

tgccgttgtgatattacttccgaacaggaactctctgcactggcagac240

CysArgCysAspIleThrSerGluGlnGluLeuSerAlaLeuAlaAsp

65707580

tttgctatcagtaagctgggtaaagttgatattctggttaacaacgcc288

PheAlaIleSerLysLeuGlyLysValAspIleLeuValAsnAsnAla

859095

ggtggcggtggacctaaaccgtttgatatgccaatggcggattttcgc336

GlyGlyGlyGlyProLysProPheAspMetProMetAlaAspPheArg

100105110

cgtgcttatgaactgaatgtgttttcttttttccatctgtcacaactt384

ArgAlaTyrGluLeuAsnValPheSerPhePheHisLeuSerGlnLeu

115120125

gttgcgccagaaatggaaaaaaatggcggtggcgttattctgaccatc432

ValAlaProGluMetGluLysAsnGlyGlyGlyValIleLeuThrIle

130135140

acttctatggcggcagaaaataaaaatataaacatgacttcctatgca480

ThrSerMetAlaAlaGluAsnLysAsnIleAsnMetThrSerTyrAla

145150155160

tcatctaaagctgcggccagtcatctggtcagaaatatggcgtttgac528

SerSerLysAlaAlaAlaSerHisLeuValArgAsnMetAlaPheAsp

165170175

ctgggtgaaaaaaatattcgggtaaatggcattgcgccgggggcaata576

LeuGlyGluLysAsnIleArgValAsnGlyIleAlaProGlyAlaIle

180185190

ttaaccgatgccctgaaatccgttattacaccagaaattgaacaaaaa624

LeuThrAspAlaLeuLysSerValIleThrProGluIleGluGlnLys

195200205

atgttacagcacacgccgatcagacgtctgggccaaccgcaagatatt672

MetLeuGlnHisThrProIleArgArgLeuGlyGlnProGlnAspIle

210215220

gctaacgcagcgctgttcctttgctcgcctgctgcgagctgggtaagc720

AlaAsnAlaAlaLeuPheLeuCysSerProAlaAlaSerTrpValSer

225230235240

ggacaaattctcaccgtctccggtggtggggtacaggagctcaattaa768

GlyGlnIleLeuThrValSerGlyGlyGlyValGlnGluLeuAsn

245250255

<210>4

<211>255

<212>PRT

<213>大肠杆菌（Escherichiacoli）K-12

<400>4

MetPheAsnSerAspAsnLeuArgLeuAspGlyLysCysAlaIleIle

151015

ThrGlyAlaGlyAlaGlyIleGlyLysGluIleAlaIleThrPheAla

202530

ThrAlaGlyAlaSerValValValSerAspIleAsnAlaAspAlaAla

354045

AsnHisValValAspGluIleGlnGlnLeuGlyGlyGlnAlaPheAla

505560

CysArgCysAspIleThrSerGluGlnGluLeuSerAlaLeuAlaAsp

65707580

PheAlaIleSerLysLeuGlyLysValAspIleLeuValAsnAsnAla

859095

GlyGlyGlyGlyProLysProPheAspMetProMetAlaAspPheArg

100105110

ArgAlaTyrGluLeuAsnValPheSerPhePheHisLeuSerGlnLeu

115120125

ValAlaProGluMetGluLysAsnGlyGlyGlyValIleLeuThrIle

130135140

ThrSerMetAlaAlaGluAsnLysAsnIleAsnMetThrSerTyrAla

145150155160

SerSerLysAlaAlaAlaSerHisLeuValArgAsnMetAlaPheAsp

165170175

LeuGlyGluLysAsnIleArgValAsnGlyIleAlaProGlyAlaIle

180185190

LeuThrAspAlaLeuLysSerValIleThrProGluIleGluGlnLys

195200205

MetLeuGlnHisThrProIleArgArgLeuGlyGlnProGlnAspIle

210215220

AlaAsnAlaAlaLeuPheLeuCysSerProAlaAlaSerTrpValSer

225230235240

GlyGlnIleLeuThrValSerGlyGlyGlyValGlnGluLeuAsn

245250255

<210>5

<211>996

<212>DNA

<213>魏斯氏菌（Weissellasp.）

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(996)

<400>5

atgaagatttttgcatacggaattcgtgaagacgaacaacctgctttg48

MetLysIlePheAlaTyrGlyIleArgGluAspGluGlnProAlaLeu

151015

aaggcctggattgctgcacatccagaggttactgttgaatttactgac96

LysAlaTrpIleAlaAlaHisProGluValThrValGluPheThrAsp

202530

caacttttggaccctgaaactgctaagttagcagaaggtttcgatgct144

GlnLeuLeuAspProGluThrAlaLysLeuAlaGluGlyPheAspAla

354045

gttaatgtatatcaacaattggactacacacgtgagactttgacagcc192

ValAsnValTyrGlnGlnLeuAspTyrThrArgGluThrLeuThrAla

505560

ttgcatgagttgggaattaacaagatgtcattgcgtaatgttggaact240

LeuHisGluLeuGlyIleAsnLysMetSerLeuArgAsnValGlyThr

65707580

gacaacattgactttgatgctgcacgtgagtttgatttttcaatctca288

AspAsnIleAspPheAspAlaAlaArgGluPheAspPheSerIleSer

859095

aatgtcccagtttactcacctaatgcaattgctgaacactcaatcatc336

AsnValProValTyrSerProAsnAlaIleAlaGluHisSerIleIle

100105110

caaatgtcacgtttgcttcgtcggactaaggcaatggatgctaaggtt384

GlnMetSerArgLeuLeuArgArgThrLysAlaMetAspAlaLysVal

115120125

gctaagcatgacttgcgctgggcaccaacaattggtcgcgagatgcgg432

AlaLysHisAspLeuArgTrpAlaProThrIleGlyArgGluMetArg

130135140

atgcaaacagttggtgttatcggaactggtaacatcggccgtgttgca480

MetGlnThrValGlyValIleGlyThrGlyAsnIleGlyArgValAla

145150155160

atgaagattctaaagggctttggggctaaggtcattgcttatgacttg528

MetLysIleLeuLysGlyPheGlyAlaLysValIleAlaTyrAspLeu

165170175

taccacaatgctgaagttgaagctgaaggtctatacgtagatactttg576

TyrHisAsnAlaGluValGluAlaGluGlyLeuTyrValAspThrLeu

180185190

gaagagttgtatgcacaagctgacgtaattactttgtacgttccaggt624

GluGluLeuTyrAlaGlnAlaAspValIleThrLeuTyrValProGly

195200205

gtaccagctaaccaccacatgattaatgctgattcaatcgctaagatg672

ValProAlaAsnHisHisMetIleAsnAlaAspSerIleAlaLysMet

210215220

aaagatggcgttgtaatcgtaaattgctcacgtggaaacttgatggat720

LysAspGlyValValIleValAsnCysSerArgGlyAsnLeuMetAsp

225230235240

attgacgatgtaatcgctggtttggactcaggtaagatttctgacttc768

IleAspAspValIleAlaGlyLeuAspSerGlyLysIleSerAspPhe

245250255

gcaatggatgtttacgaagaagaagttggtttgttcaatgttgattgg816

AlaMetAspValTyrGluGluGluValGlyLeuPheAsnValAspTrp

260265270

tcaaacaaagaattcccagatgctaagattgctgatttgattgctcgt864

SerAsnLysGluPheProAspAlaLysIleAlaAspLeuIleAlaArg

275280285

gagaacgttttggttacaccacacactgctttctacacaactaaggct912

GluAsnValLeuValThrProHisThrAlaPheTyrThrThrLysAla

290295300

gtattggaaatggttactcaatcaatgaatgcttcattggctttcatt960

ValLeuGluMetValThrGlnSerMetAsnAlaSerLeuAlaPheIle

305310315320

aatggtgagaagccatcaatcgctgttgaatactaa996

AsnGlyGluLysProSerIleAlaValGluTyr

325330

<210>6

<211>331

<212>PRT

<213>魏斯氏菌（Weissellasp.）

<400>6

MetLysIlePheAlaTyrGlyIleArgGluAspGluGlnProAlaLeu

151015

LysAlaTrpIleAlaAlaHisProGluValThrValGluPheThrAsp

202530

GlnLeuLeuAspProGluThrAlaLysLeuAlaGluGlyPheAspAla

354045

ValAsnValTyrGlnGlnLeuAspTyrThrArgGluThrLeuThrAla

505560

LeuHisGluLeuGlyIleAsnLysMetSerLeuArgAsnValGlyThr

65707580

AspAsnIleAspPheAspAlaAlaArgGluPheAspPheSerIleSer

859095

AsnValProValTyrSerProAsnAlaIleAlaGluHisSerIleIle

100105110

GlnMetSerArgLeuLeuArgArgThrLysAlaMetAspAlaLysVal

115120125

AlaLysHisAspLeuArgTrpAlaProThrIleGlyArgGluMetArg

130135140

MetGlnThrValGlyValIleGlyThrGlyAsnIleGlyArgValAla

145150155160

MetLysIleLeuLysGlyPheGlyAlaLysValIleAlaTyrAspLeu

165170175

TyrHisAsnAlaGluValGluAlaGluGlyLeuTyrValAspThrLeu

180185190

GluGluLeuTyrAlaGlnAlaAspValIleThrLeuTyrValProGly

195200205

ValProAlaAsnHisHisMetIleAsnAlaAspSerIleAlaLysMet

210215220

LysAspGlyValValIleValAsnCysSerArgGlyAsnLeuMetAsp

225230235240

IleAspAspValIleAlaGlyLeuAspSerGlyLysIleSerAspPhe

245250255

AlaMetAspValTyrGluGluGluValGlyLeuPheAsnValAspTrp

260265270

SerAsnLysGluPheProAspAlaLysIleAlaAspLeuIleAlaArg

275280285

GluAsnValLeuValThrProHisThrAlaPheTyrThrThrLysAla

290295300

ValLeuGluMetValThrGlnSerMetAsnAlaSerLeuAlaPheIle

305310315320

AsnGlyGluLysProSerIleAlaValGluTyr

325330

<210>7

<211>792

<212>DNA

<213>活波瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(792)

<400>7

atgaccatgcgtgaaaaatacggcgaatggggcattatcctgggcgct48

MetThrMetArgGluLysTyrGlyGluTrpGlyIleIleLeuGlyAla

151015

acggaaggtgttggtaaagcattctgtgaacgtctggcaaaagaaggc96

ThrGluGlyValGlyLysAlaPheCysGluArgLeuAlaLysGluGly

202530

atgaacgtggttatggtgggtcgtcgcgaagaaaaactgaaagaactg144

MetAsnValValMetValGlyArgArgGluGluLysLeuLysGluLeu

354045

ggcgaagaactgaaaaacacctatgaaatcgattacaaagtcgtgaaa192

GlyGluGluLeuLysAsnThrTyrGluIleAspTyrLysValValLys

505560

gcggacttttctctgccggatgccaccgacaaaatcttcgcggccacg240

AlaAspPheSerLeuProAspAlaThrAspLysIlePheAlaAlaThr

65707580

gaaaacctggatatgggctttatggcgtatgtggcttgcctgcatagc288

GluAsnLeuAspMetGlyPheMetAlaTyrValAlaCysLeuHisSer

859095

ttcggtaaaattcaggacaccccgtgggaaaaacacgaagccatgatc336

PheGlyLysIleGlnAspThrProTrpGluLysHisGluAlaMetIle

100105110

aacgtgaacgttgtcacgttcatgaaatgtttctaccattacatgaaa384

AsnValAsnValValThrPheMetLysCysPheTyrHisTyrMetLys

115120125

atctttgcagctcaggatcgtggtgcggtcattaacgtgagcagcatg432

IlePheAlaAlaGlnAspArgGlyAlaValIleAsnValSerSerMet

130135140

accggcatcagttcctcaccgtggaatggtcaatacggcgcgggtaaa480

ThrGlyIleSerSerSerProTrpAsnGlyGlnTyrGlyAlaGlyLys

145150155160

gccttcattctgaaaatgacggaagcggttgcctgcgaaaccgaaaaa528

AlaPheIleLeuLysMetThrGluAlaValAlaCysGluThrGluLys

165170175

acgaacgtcgatgtggaagttatcaccctgggcaccacgctgacgccg576

ThrAsnValAspValGluValIleThrLeuGlyThrThrLeuThrPro

180185190

tcgctgctgagcaatctgccgggcggtccgcagggtgaagcagtgatg624

SerLeuLeuSerAsnLeuProGlyGlyProGlnGlyGluAlaValMet

195200205

aaaaacgctcaaacgccggaagaagtggttgatgaagcgtttgaaaaa672

LysAsnAlaGlnThrProGluGluValValAspGluAlaPheGluLys

210215220

ctgggcaaagaactgtctgttattagtggtgaacgtaacaaagcatcc720

LeuGlyLysGluLeuSerValIleSerGlyGluArgAsnLysAlaSer

225230235240

gtccatgactggaaagctaatcacactgaagatgactatatccgctac768

ValHisAspTrpLysAlaAsnHisThrGluAspAspTyrIleArgTyr

245250255

atgggcagcttctatcaagaataa792

MetGlySerPheTyrGlnGlu

260

<210>8

<211>263

<212>PRT

<213>活波瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)

<400>8

MetThrMetArgGluLysTyrGlyGluTrpGlyIleIleLeuGlyAla

151015

ThrGluGlyValGlyLysAlaPheCysGluArgLeuAlaLysGluGly

202530

MetAsnValValMetValGlyArgArgGluGluLysLeuLysGluLeu

354045

GlyGluGluLeuLysAsnThrTyrGluIleAspTyrLysValValLys

505560

AlaAspPheSerLeuProAspAlaThrAspLysIlePheAlaAlaThr

65707580

GluAsnLeuAspMetGlyPheMetAlaTyrValAlaCysLeuHisSer

859095

PheGlyLysIleGlnAspThrProTrpGluLysHisGluAlaMetIle

100105110

AsnValAsnValValThrPheMetLysCysPheTyrHisTyrMetLys

115120125

IlePheAlaAlaGlnAspArgGlyAlaValIleAsnValSerSerMet

130135140

ThrGlyIleSerSerSerProTrpAsnGlyGlnTyrGlyAlaGlyLys

145150155160

AlaPheIleLeuLysMetThrGluAlaValAlaCysGluThrGluLys

165170175

ThrAsnValAspValGluValIleThrLeuGlyThrThrLeuThrPro

180185190

SerLeuLeuSerAsnLeuProGlyGlyProGlnGlyGluAlaValMet

195200205

LysAsnAlaGlnThrProGluGluValValAspGluAlaPheGluLys

210215220

LeuGlyLysGluLeuSerValIleSerGlyGluArgAsnLysAlaSer

225230235240

ValHisAspTrpLysAlaAsnHisThrGluAspAspTyrIleArgTyr

245250255

MetGlySerPheTyrGlnGlu

260

<210>9

<211>759

<212>DNA

<213>高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(759)

<400>9

atgaccgatcgtctgaagggcaaagtagccatcgtaaccggcgggact48

MetThrAspArgLeuLysGlyLysValAlaIleValThrGlyGlyThr

151015

ctgggtatcggtttggcaatcgccgataaatttgtagaggagggtgcg96

LeuGlyIleGlyLeuAlaIleAlaAspLysPheValGluGluGlyAla

202530

aaagtagttattactggtcgtcacgcggatgtaggtgaaaaggccgcc144

LysValValIleThrGlyArgHisAlaAspValGlyGluLysAlaAla

354045

aaatcaatcggcggcactgatgttattcgctttgtccagcacgatgca192

LysSerIleGlyGlyThrAspValIleArgPheValGlnHisAspAla

505560

tccgatgaagcaggctggacgaaactgttcgacaccaccgaggaggca240

SerAspGluAlaGlyTrpThrLysLeuPheAspThrThrGluGluAla

65707580

ttcggcccggttacgaccgtcgtgaacaatgcagggattgcagtttcc288

PheGlyProValThrThrValValAsnAsnAlaGlyIleAlaValSer

859095

aaaagcgttgaagacactaccacggaggaatggcgtaaactgctgtcc336

LysSerValGluAspThrThrThrGluGluTrpArgLysLeuLeuSer

100105110

gttaatctggatggtgtttttttcggcacccgtctgggcattcagcgc384

ValAsnLeuAspGlyValPhePheGlyThrArgLeuGlyIleGlnArg

115120125

atgaaaaataaaggcttgggcgctagcatcatcaatatgagcagtatt432

MetLysAsnLysGlyLeuGlyAlaSerIleIleAsnMetSerSerIle

130135140

gaggggttcgtaggcgatccgacgctgggggcatacaacgcttccaag480

GluGlyPheValGlyAspProThrLeuGlyAlaTyrAsnAlaSerLys

145150155160

ggggcggtacgtatcatgtcgaaaagcgcagcgctggattgcgcactg528

GlyAlaValArgIleMetSerLysSerAlaAlaLeuAspCysAlaLeu

165170175

aaggactacgatgtgcgtgtcaacacagtacatccgggctatatcaag576

LysAspTyrAspValArgValAsnThrValHisProGlyTyrIleLys

180185190

accccgctggtcgatgatctggaaggtgctgaggaaatgatgtcacag624

ThrProLeuValAspAspLeuGluGlyAlaGluGluMetMetSerGln

195200205

cgtacgaaaacccctatgggccacattggcgaaccgaatgacatcgca672

ArgThrLysThrProMetGlyHisIleGlyGluProAsnAspIleAla

210215220

tggatctgtgtgtacctggcatctgacgaatcgaaatttgcgacgggt720

TrpIleCysValTyrLeuAlaSerAspGluSerLysPheAlaThrGly

225230235240

gcagaatttgtggtcgacggcgggtataccgcacagtga759

AlaGluPheValValAspGlyGlyTyrThrAlaGln

245250

<210>10

<211>252

<212>PRT

<213>高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)

<400>10

MetThrAspArgLeuLysGlyLysValAlaIleValThrGlyGlyThr

151015

LeuGlyIleGlyLeuAlaIleAlaAspLysPheValGluGluGlyAla

202530

LysValValIleThrGlyArgHisAlaAspValGlyGluLysAlaAla

354045

LysSerIleGlyGlyThrAspValIleArgPheValGlnHisAspAla

505560

SerAspGluAlaGlyTrpThrLysLeuPheAspThrThrGluGluAla

65707580

PheGlyProValThrThrValValAsnAsnAlaGlyIleAlaValSer

859095

LysSerValGluAspThrThrThrGluGluTrpArgLysLeuLeuSer

100105110

ValAsnLeuAspGlyValPhePheGlyThrArgLeuGlyIleGlnArg

115120125

MetLysAsnLysGlyLeuGlyAlaSerIleIleAsnMetSerSerIle

130135140

GluGlyPheValGlyAspProThrLeuGlyAlaTyrAsnAlaSerLys

145150155160

GlyAlaValArgIleMetSerLysSerAlaAlaLeuAspCysAlaLeu

165170175

LysAspTyrAspValArgValAsnThrValHisProGlyTyrIleLys

180185190

ThrProLeuValAspAspLeuGluGlyAlaGluGluMetMetSerGln

195200205

ArgThrLysThrProMetGlyHisIleGlyGluProAsnAspIleAla

210215220

TrpIleCysValTyrLeuAlaSerAspGluSerLysPheAlaThrGly

225230235240

AlaGluPheValValAspGlyGlyTyrThrAlaGln

245250

Claims (5)

1.一种串联形成双基因表达模块，其特征在于双基因表达模块为模块1或模块2；其中所述模块1的序列依次由SeqIDNO：1，SeqIDNO:5，SeqIDNO:2，SeqIDNO:3组成；所述模块2的序列依次由SeqIDNO：1，SeqIDNO:9，SeqIDNO:2，SeqIDNO:7组成。

2.一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求1所述的模块1。

3.一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求2所述的模块2。

4.一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于由如下步骤实现：

A、采用权利要求2所述的重组大肠杆菌细胞催化底物鹅去氧胆酸CDCA合成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应液酸化后得到3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，同时采用乳酸脱氢酶及丙酮酸钠使得辅酶循环再生；

B、采用权利要求3所述的重组大肠杆菌细胞催化步骤A中所述的3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。

5.根据权利要求4所述的一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于所述的熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。