CN114107237A - 一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法,通过原始菌种大肠杆菌二级培养发酵,并结合异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖吡喃糖苷(以下简称IPTG)诱导,制备得到酶活较高的7α‑羟基类固醇脱氢酶和维生素B2还原酶,可进一步用于酶法制备7‑酮石胆酸(7K‑LCA),降低生产成本,工业应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域,具体涉及一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法。
背景技术
熊去氧胆酸(UDCA)是一种利胆药物,能够增加胆汁酸分泌,并使胆汁成分改变,降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂的化合物,有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解,临床常用于胆结石的防治、胆囊炎等疾病的治疗。
鹅去氧胆酸氧化物(7-酮石胆酸,7K-LCA)是酶法生产UDCA的重要生产原料。然而,常用的化学法生产7K-LCA的过程需使用大量有机溶剂,存在环境污染和爆炸风险,且反应过程会出现双氧化等杂质,不易去除,甚至会残留到后续的UDCA原料药中,为生产带来负担。
酶法制备7K-LCA相比于化学方法具有突出的优势,鹅去氧胆酸在鹅去氧胆酸氧化酶的作用下,能够发挥酶自身能与底物高效结合的优势,发生氧化反应将原料鹅去氧胆酸直接催化,脱去7-位羟基可经氧化为酮基,生成7K-LCA。鹅去氧胆酸氧化酶主要成分为:7α-羟基类固醇脱氢酶(以下简称7位氧化酶)和维生素B2还原酶(以下简称B2还原酶)及少量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称NAD)),
反应具体如下:
鹅去氧胆酸氧化酶主要靠基因工程菌发酵培养获得。为了提高酶的表达量和活性,研究人员不断尝试筛选发酵性能优越的菌株,或者构建基因工程菌株。但目前鲜有对发酵工艺改进的报道,主要是因为鹅去氧胆酸氧化酶的发酵过程非常复杂,涉及培养基、发酵温度调节控制(包括温度和对应时间)、诱导时机、溶氧等诸多条件相互配合,优化出恰当的发酵方法较非常困难。
因此,提供一种能够通过常见菌株发酵制备鹅去氧胆酸氧化酶的方法,可以大大降低基因工程改造的成本,有利于工业生产应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法。
本发明提供了一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法,包括如下步骤:
(1)制备种子:将重组大肠杆菌接种至摇瓶培养基培养,得到摇瓶种子液;所述重组大肠杆菌为含有表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因的大肠杆菌;所述表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)种子罐发酵:将步骤(1)制得的摇瓶种子液接种至种子罐培养得一级种子液;培养温度:33℃~38℃,溶氧量:15%~35%;
(3)发酵罐发酵:取步骤(2)培养的一级种子液接种至发酵培养基培养,培养温度:25℃~30℃,溶氧量:15%~35%,期间使用IPTG诱导。
进一步地,步骤(1)所述摇瓶培养基含有:蛋白胨0.5%~1.5%、酵母粉0.5%~0.8%、氯化钠0.5%~1.5%;
步骤(2)所述发酵培养基含有有:蛋白胨1.5~2.5%、酵母浸膏0.5%~1.0%、氯化钠0.3%~0.5%、七水硫酸镁0.15%~0.30%、磷酸二氢钾1.0%~2.0%、葡萄糖1.0%~2.0%、消泡剂0.02%~0.06%;
步骤(3)所述发酵培养基含有:蛋白胨1.5%~2.5%、氯化钠0.4%~0.6%、磷酸氢二钾三水合物0.5%~1.0%、磷酸二氢钾1.5%~2.0%、七水硫酸镁0.01%~0.03%、甘油1.5%~2.0%、消泡剂0.02%~0.08%。
进一步地,步骤(1)所述摇瓶种子液的OD600值为2.0~3.0。
更进一步地,步骤(1)所述培养的条件是:转速180r/min~220r/min,于33℃~40℃在pH 6.80~7.20条件下培养6h-15h。
进一步地,步骤(2)所述培养温度:33℃~36℃,溶氧量:20%~35%。
更进一步地,步骤(2)所述的接种量为1.00%~1.25%(v/v),培养条件为:pH为6.80~7.20,搅拌转速150r/min~350r/min,培养周期:4h~8h。
进一步地,步骤(3)所述培养温度28℃~30℃,搅拌转速150r/min~350r/min,溶氧量20%~35%。
更进一步地,步骤(3)所述的接种量为1.5%~3.0%(v/v),培养条件为:pH为6.80~7.20,搅拌转速150r/min~350r/min,发酵周期:16h~24h;所述IPTG的诱导工艺是:培养4h~6h且10≤OD600值≤15时一次性加入IPTG50ppm~100ppm。
本发明提供了一种鹅去氧胆酸氧酶,所述鹅去氧胆酸氧酶中7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活不低100u/ml,维生素B2还原酶的酶活不低于30u/ml。
进一步地,上述鹅去氧胆酸氧酶由上述的方法制备而成。
实验结果表明,本发明发酵方法能够以简单的生物发酵工艺制得酶活较高7位氧化酶和B2还原酶,发酵周期短,生产效率高,制备得到的鹅去氧胆酸氧化酶可进一步用于酶法转化生产7-酮石胆酸生产,节能环保,大大降低生产成本,工业应用前景良好。
本发明所述OD600值是指在波长600nm下检测的光密度值;IPTG是指异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明使用的生产菌种为含有表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因的BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株,外源基因序列如SEQ ID NO.1所示;具体是将SEQ ID NO.1所示的外源基因序列插入PET-28A(+)大肠杆菌蛋白表达载体,将该含有外源基因的载体导入宿主菌株BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株所得。
除另有说明外,本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明方法制备鹅去氧胆酸氧化酶
(1)制备摇瓶种子液
摇瓶培养基含有:蛋白胨:0.5%~1.5%,酵母粉:0.1%~0.8%;氯化钠:0.5%~1.5%。
生产菌种由甘油管接种至装有摇瓶培养基的无菌摇瓶,在pH6.80-7.20条件下,转速180r/min~220r/min,于33℃~38℃培养6h~15h,直至OD600值到达2.0~3.0。
(2)制备一级种子
一级种子培养基配比:蛋白胨:1.5%~2.5%;酵母浸膏:0.5%~1.0%;氯化钠:0.3%~0.5%;七水硫酸镁:0.15%~0.30%;磷酸二氢钾:1.0%~2.0%;葡萄糖:1.0%~2.0%;消泡剂:0.02%~0.06%。接纯种摇瓶种子液体积1.25%(v/v)接种至种子罐,培养温度:33℃~38℃;调节空气流量,调整搅拌速度150r/min~350r/min,控制溶氧在15%~35%,pH在6.80~7.20条件下培养4h~8h。
(3)发酵
发酵培养基配比:蛋白胨:1.5%~2.5%;氯化钠:0.4%~0.6%;磷酸氢二钾三水合物:0.5%~1.0%;磷酸二氢钾:1.5%~2.0%,七水硫酸镁:0.01%~0.03%;甘油:1.5%~2.0%;消泡剂:0.02%~0.08%。
将步骤(2)所得的一级种子经移种管道以1.5%~3.0%(v/v)的量移种至发酵培养基中于33℃~38℃,pH6.80~7.20条件下培养,培养4h~6h且10≤OD600≤15时一次性补入IPTG50ppm~100ppm,完成诱导后,控制培养温度在25℃~30℃,培养期间调节空气流量,调整搅拌速度150r/min~350r/min,控制溶氧在20%~35%之间,直至发酵结束。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、酶活检测
1、实验方法
取实施例1发酵结束后的发酵液1ml,在小型高速离心机10000r/min转速离心3min。倾倒上清液,底部菌体用纯化水重悬,倒入5ml一次性塑料离心管中,在超声波细胞破碎机破碎。细胞破碎完毕后,破碎好的发酵液倒入1.5ml一次性塑料离心管中,在小型高速离心机10000r/min转速离心3min,上清稀释,上清稀释液使用多功能酶标仪于340nm波长条件下与氧化性辅酶Ⅰ/还原性辅酶Ⅰ底物反应,检测7位氧化酶、B2还原酶酶活。
2、实验结果
表1展示了本发明2组平行实验的发酵结果,本发明对应的7位氧化酶100u/ml以上,B2还原酶酶活:30u/ml以上,说明本发明方法能够成功制备得到酶活很高的鹅去氧胆酸氧化酶。
表1
试验例2、本发明发酵工艺的筛选:
发酵工艺筛选研究:
为了使本发酵工艺稳定,对鹅去氧胆酸氧化酶种子罐、发酵罐发酵控制工艺进行了筛选优化,主要研究内容如下:
A、种子罐发酵生产工艺中针对溶氧控制、培养温度进行了筛选研究,确定了该步骤主要参数的优选范围。
实验1:种子罐发酵过程溶氧控制范围条件的筛选优化:
针对种子罐发酵培养过程溶氧控制,进行了10%~15%、15%~25%、25%~35%、条件下发酵培养筛选试验,结果见表2
表2种子罐发酵溶氧控制范围选择表
批号 | 试验目的 | 条件 | 培养时间(h) | OD<sub>600</sub> |
SCA-021 | 优化溶氧条件 | 10%~15% | 6 | 3.80 |
SCA-022 | 优化溶氧条件 | 15%~25% | 6 | 4.83 |
SCA-023 | 优化溶氧条件 | 25%~35% | 6 | 4.91 |
结论:当溶氧控制条件为10%~15%时,OD600相对偏低;提升溶氧控制至15%~25%,OD600有较大的提高,继续提高25%~35%,OD600稳定,结合种子罐发酵过程控制情况,将种子罐发酵培养过程溶氧控制在15%~35%范围。
实验2:种子罐发酵培养温度的筛选优化:
针对种子罐发酵培养温度考察了28℃、30℃、33℃、35℃、38℃时对发酵效果的影响结果见表3。
表3种子罐发酵培养温度选择表
批号 | 试验目的 | 条件 | 培养时间(h) | OD<sub>600</sub> |
SCA-036 | 优化温度条件 | 28℃ | 6 | 2.96 |
SCA-037 | 优化温度条件 | 30℃ | 6 | 3.25 |
SCA-038 | 优化温度条件 | 33℃ | 6 | 5.03 |
SCA-039 | 优化温度条件 | 35℃ | 6 | 5.11 |
SCA-040 | 优化温度条件 | 38℃ | 6 | 5.00 |
结论:当培养温度为28℃、30℃时,放罐OD600值相对偏低,提升发酵温度至33℃,OD600值有明显的提高,继续提高温度至35℃、38℃,OD600值相对保持稳定,综合大肠杆菌最适发酵温度及实验情况,发酵培养温度优选为33-38℃。
B、发酵罐培养过程中对培养温度、培养溶氧控制范围进行工艺筛选优化
实验3:发酵罐培养温度筛选试验:
针对种子罐发酵诱导过程,根据大肠杆菌发酵特性,选择发酵培养对数期进行诱导,根据发酵控制情况选择接种后培养4h且10≤OD600值≤15时进行诱导,诱导后对发酵培养温度进行25℃、28℃、30℃、35℃、38℃不同温度条件的梯度筛选试验,结果见表4。
表4发酵罐发酵过程培养温度选择表
结论:当发酵培养温度从25℃升高值38℃时,OD600值呈增长的趋势,温度控制较低时相对OD600值略低,但B2还原酶酶活、7位氧化酶酶活相对较高,在培养温度35℃、38℃条件下,酶活反而成降趋势,因此发酵过程培养温度控制优选25℃~30℃范围内。
实验4:发酵罐培养过程溶氧控制范围条件的筛选优化:
针对发酵罐培养过程溶氧控制,进行了10%~15%、15%~20%、20%~25%、25%~30%、30%~35%条件下发酵培养筛选试验,结果见表5
表5发酵罐发酵过程溶氧控制范围选择表
结论:当溶氧控制条件为10%~15%时,放罐OD600值相对偏低,B2还原酶酶活、7位氧化酶酶活相对较低,考虑可能受罐体体积不同影响;提升溶氧控制至15%~20%,OD600略有提高,继续提高25%~35%,OD600稳定,因此,结合以上数据,将发酵罐发酵培养过程溶氧控制在20%~35%范围。
试验例3、实施例1的优化工艺重复试验结果
根据试验例1和试验例2的内容,种子罐发酵生产工艺中针对溶氧控制、培养温度、发酵罐培养过程中对培养温度、培养溶氧控制参数优化后,得到实施例1的技术方案,按照该方法进行连续3批试验,发酵结果具体如表6所示:
表6实施例1的技术方案重复3次的实验结果
结论:实施例1的技术方案重复性好,得到的B2还原酶酶活与7α-羟基类固醇脱氢酶酶活均维持在较高水平。
综上,本发明提供了一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法,本发明发酵方法能够以简单的生物发酵工艺制得酶活较高7位氧化酶和B2还原酶,发酵周期短,生产效率高,制备得到的鹅去氧胆酸氧化酶可进一步用于酶法转化生产7-酮石胆酸生产,节能环保,大大降低生产成本,工业应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 伊犁川宁生物技术股份有限公司
<120> 一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法
<130> GY218-2021P0112910CCR3
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 768
<212> DNA
<213> 外源基因
<400> 1
atgttcgatc ccggattatt taggctagac ggccagattg ctttggttac cggtgcgggt 60
gcgggcattg gccgtggtat tgcggaaatg ttcgccggcg cgggtgcgag cgtggtggtt 120
tctgacctgc gtcaggatac cgcaggttcc gtggcaaccg caatcagcga cgcgggtgga 180
caggcggtgg gtattgcatg taatgtaact cgcgaagagg acttggaagc ggcggtgcaa 240
gctgccgtgg atcgttttgg tggcctaacc attttggtca acaacgcagg cggcggcgga 300
ccgaaaccgt tcgacatgcc gatggaagag ttccgttggg cgtacgagct gaacgtgttt 360
gctccgttcc gcctgaccca gctggccgtg ccgcacatgg aggcggctgg cggcggtgcc 420
gtccttaata tctcgtctat gagcggtgag aatcgcaacc agcgtatggc aagctatggt 480
tccagcaaag cagcgatctc ccatctgact agaaacatcg cgtttgacct gggtccgaag 540
aacatccgtg ttaatgccat cgcgcctggt gcgatccgca ccgatgctct cgcgacggtt 600
ctgacgccag aagttgaagc ggctatgtta aagcacaccc cgctgaaacg tttgggtgtt 660
ccggcagata ttgcggccgc cgccctgtac ctgtgcagcc cggcggctgc gtgggttagt 720
ggtcaaatcc tgaccgttag cggtggcggc gttcaagagc tggattaa 768
Claims (10)
1.一种发酵生产鹅去氧胆酸氧化酶的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备种子:将重组大肠杆菌接种至摇瓶培养基培养,得到摇瓶种子液;所述重组大肠杆菌为含有表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因的大肠杆菌;所述表达鹅去氧胆酸氧化酶的外源基因序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)种子罐发酵:将步骤(1)制得的摇瓶种子液接种至种子罐培养得一级种子液;培养温度:33℃~38℃,溶氧量:15%~35%;
(3)发酵罐发酵:取步骤(2)培养的一级种子液接种至发酵培养基培养,培养温度:25℃~30℃,溶氧量:15%~35%,期间使用IPTG诱导。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述摇瓶培养基含有:蛋白胨0.5%~1.5%、酵母粉0.5%~0.8%、氯化钠0.5%~1.5%;
步骤(2)所述发酵培养基含有有:蛋白胨1.5~2.5%、酵母浸膏0.5%~1.0%、氯化钠0.3%~0.5%、七水硫酸镁0.15%~0.30%、磷酸二氢钾1.0%~2.0%、葡萄糖1.0%~2.0%、消泡剂0.02%~0.06%;
步骤(3)所述发酵培养基含有:蛋白胨1.5%~2.5%、氯化钠0.4%~0.6%、磷酸氢二钾三水合物0.5%~1.0%、磷酸二氢钾1.5%~2.0%、七水硫酸镁0.01%~0.03%、甘油1.5%~2.0%、消泡剂0.02%~0.08%。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述摇瓶种子液的OD600值为2.0~3.0。
4.如权利要求1或3所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述培养的条件是:转速180r/min~220r/min,于33℃~40℃在pH 6.80~7.20条件下培养6h-15h。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述培养温度:33℃~36℃,溶氧量:20%~35%。
6.如权利要求1或5所述的方法,其特征在于:步骤(2)所述的接种量为1.00%~1.25%(v/v),培养条件为:pH为6.80~7.20,搅拌转速150r/min~350r/min,培养周期:4h~8h。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)所述培养温度28℃~30℃,搅拌转速150r/min~350r/min,溶氧量20%~35%。
8.如权利要求1或7所述的方法,其特征在于:步骤(3)所述的接种量为1.5%~3.0%(v/v),培养条件为:pH为6.80~7.20,搅拌转速150r/min~350r/min,发酵周期:16h~24h;所述IPTG的诱导工艺是:培养4h~6h且10≤OD600值≤15时一次性加入IPTG 50ppm~100ppm。
9.一种鹅去氧胆酸氧酶,其特征在于,所述鹅去氧胆酸氧酶中7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活不低100u/ml,维生素B2还原酶的酶活不低于30u/ml。
10.如权利要求9所述的鹅去氧胆酸氧化酶,其特征在于,它由权利要求1~8所述的方法制备而成。
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