CN111850078A - 一种头孢菌素c的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：步骤(1)取顶头孢霉活化，取质量体积浓度为25％的菌液，按照1％的接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0、29℃培养90h，获得一级种子液；步骤(2)取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％的接种量接种至种子培养基，在pH为6.5、28℃培养50h，获得二级种子液；步骤(3)取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的接种量接种至发酵培养基中发酵，在发酵30‑140h内流加全料，发酵140h后停止补全料，过滤获得发酵液；步骤(4)取步骤(3)中头孢菌素C液吸附，干燥，结晶，洗涤，干燥获得头孢菌素C；采用上述制备方法能够提高头孢菌素C的产率及效价。

Description

一种头孢菌素C的发酵方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及一种头孢菌素C的发酵方法。
背景技术
头孢菌素C由顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)产生，是继青霉素之后又一重要的β-内酰胺抗生素，其结构与青霉素的结构相似，有一酰基侧链与一双环母核上的氨基相接，与青霉素一样都具有一个四元内酰胺环，但头孢菌素C具有六元二氢噻嗪环，代替了青霉素特征五元噻唑环。头孢菌素C的分子式C16H21O8N3S，分子量为415.4。头孢菌素类抗生素由于其抗菌谱广和过敏性弱的特点，是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物。头孢菌素C是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。
发酵制备头孢菌素C的过程中，发酵培养基是影响头孢菌素C产量的重要因素，培养基中营养丰富，导致发酵前期菌体代谢旺盛，菌丝生长速度过快，不利于头孢菌素C的合成。补充合适的碳源、氮源、硫源及生长因子，是决定头孢菌素C产量极为关键的因素。段生兵等“混合碳源发酵生产头孢菌素C过程优化”，工业微生物，2014,2，采用补加混合碳源(葡萄糖+豆油)策略时，CPC终浓度最高，达到36.99g/L，达到生产要求。
目前，文献报道的发酵方法制备的头孢菌素C的效价低，难以满足工业化应用的需求。因此，如何提供一种能够提高头孢菌素C的产率及效价的发酵方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够提高头孢菌素C及效价的头孢菌素C的发酵方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
步骤(1)制备一级种子液将顶头孢霉置于茄子瓶斜面，取质量体积浓度为25％的顶头孢霉菌菌液，按照1％-2％的接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0-8.0，温度为27-29℃条件下培养90h，获得一级种子液。
步骤(2)制备二级种子液取步骤(1)中制备的一级种子液，按照8％-10％的接种量接种至种子培养基，在pH为6.5-7.5，温度为28-30℃条件下培养40-50h，获得二级种子液。
步骤(3)发酵取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％-30％的接种量接种至发酵培养基中发酵，在发酵30-140h中补全料，发酵140h后停止补全料，过滤获得发酵液；
步骤(4)分离纯化取步骤(3)中头孢菌素C液吸附，干燥，结晶，洗涤，干燥获得头孢菌素C。
本发明的有益效果：本发明中采用的发酵方法提高了头孢菌素C的效价，大幅降低了生产成本。
优选地，步骤(1)所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉菌。
优选地，步骤(1)中所述培养基包括以下重量份数的原料：玉米浆15-20份、葡萄糖13-15份、白砂糖8-10份、大豆油10-15份、碳酸钙0.7-0.8份、消泡剂0.5份。
采用上述进一步的有益效果在于：培养基中包含了碳源、氮源等营养物质，有利于菌体快速生长。
优选地，步骤(2)中所述培养基包括以下重量份数的原料：玉米浆20-30份、花生粉4-6份、黄豆粉4-6份、白砂糖3-6份、硫酸钙5-7份、葡萄糖8-20份、大豆油30-46份、碳酸钙4-5份、消泡剂0.5-0.8份。
采用上述进一步的有益效果在于：培养基中包含了碳源、氮源等营养物质，有利于菌体快速生长，这样可以使种子进入发酵培养基中能迅速适应。
优选地，步骤(3)中所述发酵培养基包括以下重量份数的原料：玉米浆25-50份、花生粉5-13份、葡萄糖5-12份、糊精15-25份、蛋氨酸3-8份、大豆油40-55份、消泡剂1.5-3份、CaSO42-5份、(NH4)2SO45-10份、FeSO40.05-0.1份、MnSO40.01-0.04份、ZnSO40.01-0.04份、CuSO40.01-0.04份、CaCO35-10份。
采用上述进一步的有益效果在于：培养基中除了菌体生长所必需的元素和化合物外，还有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
优选地，步骤(3)中发酵条件为：接种量为18～22％(v/v)；在0-40h所述发酵温度为28℃，在40-140h所述发酵温度为24-25℃；所述发酵pH为5.5-5.8；发酵时间为140h。
采用上述进一步的有益效果在于：为菌体生长代谢提供适宜的环境使产物最大化。
优选地，步骤(3)中所述补全料的过程为：在发酵30-50h内，按流加量为(6-8)g/L·h补入全料；在发酵50-70h内，按流加量为(12-14)g/L·h补入全料；在发酵70-110h内，按流加量为(8-10)g/L·h补入全料；在发酵110-140h内，按流加量为(8-10)g/L·h补入全料。
采用上述进一步的有益效果在于：在发酵过程中持续为菌体生长代谢提供营养物质。
优选地，步骤(3)中所述全料包括以下重量份数的原料：玉米浆0.5-1.0份、花生粉0.5-1.0份、葡萄糖1.0-3.0份、糊精0.5-1.0份、蛋氨酸0.5-1.0份、大豆油1.0-3.0份、CaSO40.5-1.0份、(NH4)2SO48-15份。优选地，步骤(3)中所述全料溶液的质量与发酵液的体积比为600-700g/L。
优选地，步骤(4)，分离纯化的步骤为：将步骤(3)的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯或丙酮溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液在温度为55-60℃下进行干燥35-40min，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种头孢菌素C的发酵方法，通过在发酵过程中补入本发明中各原料的复配获得的全料，满足了发酵前期菌体生长与CPC合成对氮源和硫源的需求，促进了顶头孢霉菌菌丝分化，可促进头孢菌素C的合成；从而提高了提高头孢菌素C的产率及效价，更适于工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1到实施例8的效价与流加全料量的图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0，温度为29℃培养90h，获得一级种子液。
种子培养基：玉米浆18g、葡萄糖13g、白砂糖10g、大豆油10g、碳酸钙0.8g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆20g、花生粉4g、黄豆粉4g、白砂糖3g、硫酸钙5g、葡萄糖8g、大豆油40g、碳酸钙4g、消泡剂0.5g。
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆40g、花生粉12g、葡萄糖8g、糊精22g、蛋氨酸4g、大豆油45ml、消泡剂2g、CaSO45g、(NH4)2SO410g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO36g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为8g/L·h；发酵50-70h，流加量为14g/L·h；发酵70-110h，流加量为20g/L·h；发酵110-140h，流加量为10g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(3)中获得的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇解吸附，得到的乙酸乙酯溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1mL滤液于50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为38302μg/ml。
实施例2
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0，温度为29℃培养90h，获得一级种子液。
种子培养基：玉米浆18g、葡萄糖13g、白砂糖10g、大豆油10g、碳酸钙0.8g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养55h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆25g、花生粉6g、黄豆粉4g、白砂糖4g、硫酸钙7g、葡萄糖9g、大豆油45g、碳酸钙5g、消泡剂0.8g。
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆40g、花生粉12g、葡萄糖8g、糊精22g、蛋氨酸4g、大豆油45g、消泡剂2g、CaSO45g、(NH4)2SO410g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO36g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为8g/L·h；发酵50-70h，流加量为12g/L·h；发酵70-110h，流加量为18g/L·h；发酵110-140h，流加量为9g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(3)中获得的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇解吸附，得到的乙酸乙酯溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为37621μg/ml。
实施例3
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为7.0，温度为29℃培养90h。
种子培养基：玉米浆16g、葡萄糖15g、白砂糖8g、大豆油10g、碳酸钙0.7g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆28g、花生粉5g、黄豆粉5g、白砂糖5g、硫酸钙7g、葡萄糖10g、大豆油42g、碳酸钙5g、消泡剂0.8g。
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆40g、花生粉12g、葡萄糖8g、糊精22g、蛋氨酸4g、大豆油45g、消泡剂2g、CaSO45g、(NH4)2SO410g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO36g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为7g/L·h；发酵50-70h，流加量为14g/L·h；发酵70-110h，流加量为18g/L·h；发酵110-140h，流加量为8g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(3)中获得的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇解吸附，得到的乙酸乙酯溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为41421μg/ml。
实施例4
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0，温度为29℃培养90h，获得一级种子液。
种子培养基：玉米浆20g、葡萄糖14g、白砂糖8g、大豆油15g、碳酸钙0.7g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆30g、花生粉6g、黄豆粉6g、白砂糖6g、硫酸钙7g、葡萄糖12g、大豆油46g、碳酸钙5g、消泡剂0.8g。
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆45g、花生粉12g、葡萄糖15g、糊精20g、蛋氨酸4g、大豆油42g、消泡剂2g、CaSO45g、(NH4)2SO412g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO38g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为5g/L·h；发酵50-70h，流加量为13g/L·h；发酵70-110h，流加量为20g/L·h；发酵110-140h，流加量为12g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(3)中获得的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用丙酮解吸附，得到的或丙酮溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为39731μg/ml。
实施例5
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0，温度为29℃培养90h，获得一级种子液。
种子培养基：玉米浆16g、葡萄糖15g、白砂糖8g、大豆油10g、碳酸钙0.7g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆20g、花生粉4g、黄豆粉4g、白砂糖3g、硫酸钙5g、葡萄糖8g、大豆油40g、碳酸钙4g、消泡剂0.5g。
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆45g、花生粉12g、葡萄糖15g、糊精20g、蛋氨酸4g、大豆油42g、消泡剂2g、CaSO45g、(NH4)2SO412g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO38g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为8g/L·h；发酵50-70h，流加量为14g/L·h；发酵70-110h，流加量为18g/L·h；发酵110-140h，流加量为9g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(4)的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用丙酮解吸附，得到的丙酮溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为41829μg/ml。
实施例6
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为7.0，温度为29℃培养90h。
种子培养基：玉米浆15g、葡萄糖15g、白砂糖10g、大豆油15g、碳酸钙0.7g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆25g、花生粉6g、黄豆粉6g、白砂糖6g、硫酸钙5g、葡萄糖12g、大豆油42g、碳酸钙4g、消泡剂0.5g
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆45g、花生粉14g、葡萄糖18g、糊精20g、蛋氨酸5g、大豆油45g、消泡剂2g、CaSO47g、(NH4)2SO412g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO38g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为10g/L·h；发酵50-70h，流加量为14g/L·h；发酵70-110h，流加量为18g/L·h；发酵110-140h，流加量为9g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(3)中获得的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用丙酮解吸附，得到的或丙酮溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为40219μg/ml。
实施例7
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为7.0，温度为29℃培养90h。
种子培养基：玉米浆15g、葡萄糖15g、白砂糖10g、大豆油15g、碳酸钙0.7g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆22g、花生粉5g、黄豆粉5g、白砂糖5g、硫酸钙6g、葡萄糖14g、大豆油35g、碳酸钙4g、消泡剂0.5g
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆40g、花生粉12g、葡萄糖18g、糊精20g、蛋氨酸4g、大豆油40g、消泡剂2g、CaSO49g、(NH4)2SO412g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO38g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为12g/L·h；发酵50-70h，流加量为15g/L·h；发酵70-110h，流加量为18g/L·h；发酵110-140h，流加量为9g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(3)中获得的发酵液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇解吸附，得到的乙酸乙酯溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为38762μg/ml。
实施例8
头孢菌素C的发酵方法，包括以下步骤：
(1)制备一级种子液
取保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉，活化，取质量体积浓度为25％(mg/ml)的菌液，按照1％(v/v)接种量接种至种子培养基，在pH为7.0，温度为29℃培养90h。
种子培养基：玉米浆17g、葡萄糖14g、白砂糖8g、大豆油13g、碳酸钙0.7g、消泡剂0.5g。
(2)制备二级种子液
取步骤(1)中制备的一级种子液，按照10％(v/v)接种量接种至种子培养基中培养，在pH为6.5，温度为28℃培养50h，获得二级种子液。
种子培养基：玉米浆30g、花生粉6g、黄豆粉5g、白砂糖6g、硫酸钙6g、葡萄糖20g、大豆油30g、碳酸钙4g、消泡剂0.5g
(3)发酵
取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％的(v/v)接种量接种至发酵培养基中发酵，发酵周期为140h，0-30h发酵温度为28℃，30-140h发酵温度为24℃，pH为5.5。
发酵培养基：玉米浆45g、花生粉15g、葡萄糖20g、糊精20g、蛋氨酸4g、大豆油44g、消泡剂2g、CaSO410g、(NH4)2SO413g、FeSO40.09g、MnSO40.03g、ZnSO40.03g、CuSO40.03g、CaCO38g。
发酵期间，流加全料工艺为：发酵30-50h，流加量为8g/L·h；发酵50-70h，流加量为18g/L·h；发酵70-110h，流加量为20g/L·h；发酵110-140h，流加量为8g/L·h；发酵140h后停止流加全料，全料溶液的质量与发酵液的体积比为600g/h；过滤得到发酵液。
全料：玉米浆0.6g、花生粉0.8g、葡萄糖1.5g、糊精0.8g、蛋氨酸0.7g、大豆油1.5g、CaSO40.8g(NH4)2SO49g。
(4)分离纯化：将步骤(4)的滤液用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用丙酮解吸附，得到的丙酮溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液进行干燥，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
性能测试：发酵结束后取发酵液通过微孔滤膜过滤，得滤液。效价检测：取1ml滤液于50ml的容量瓶中加水至刻度摇匀，制备得到头孢菌素C混合液，取制得的头孢菌素C，检测其效价。
色谱条件如下:色谱柱：HypersilODS5um×4.6mm×250mm，波长：254nm，流速：1ml/min，进样量：20μL。
实验结果：经检测，头孢菌素C的效价为38672μg/ml。
从附图1中可以得出，通过效价与流加全料量关系图发现对比实施例1到实施例8的效价与流加全料量，头孢菌素C的效价并非与流加全料量呈简单的线性关系，与其流加全料量和流加方式均有关联。从图上可以看出补料量在1430-1470g时效价均在40000μg/ml以上。因此，从效价与成本两方面考虑，实例5的补料方式为最佳。
综上所述，本发明的发酵方法中，同时补加培养基全料，对补加量和补加时间进行特殊选择，可以提高头孢菌素C的效价，工业应用前景良好。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)制备一级种子液取质量体积浓度为20％-25％的顶头孢霉菌，按照1％-2％的接种量接种至种子培养基中培养，在pH为7.0-8.0，温度为27-29℃条件下培养80-90h，获得一级种子液；
步骤(2)制备二级种子液取步骤(1)中制备的一级种子液，按照8％-10％的接种量接种至种子培养基，在pH为6.5-7.5，温度为28-30℃条件下培养40-50h，获得二级种子液；
步骤(3)发酵取步骤(2)中制备的二级种子液，按照20％-30％的接种量接种至发酵培养基中发酵，在发酵30-140h内流加全料，发酵140h后停止补全料，过滤获得发酵液；
步骤(4)分离纯化取步骤(3)中头孢菌素C液吸附，干燥，结晶，洗涤，干燥获得头孢菌素C。
2.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述顶头孢霉菌为保藏号为ATCC.36225的顶头孢霉菌。
3.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养基包括以下重量份数的原料：玉米浆15-20份、葡萄糖13-15份、白砂糖8-10份、大豆油10-15份、碳酸钙0.7-0.8份、消泡剂0.5份。
4.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养基包括以下重量份数的原料：玉米浆20-30份、花生粉4-6份、黄豆粉4-6份、白砂糖3-6份、硫酸钙5-7份、葡萄糖8-20份、大豆油30-46份、碳酸钙4-5份、消泡剂0.5-0.8份。
5.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养基包括以下重量份数的原料：玉米浆25-50份、花生粉5-13份、葡萄糖5-12份、糊精15-25份、蛋氨酸3-8份、大豆油40-55份、消泡剂1.5-3份、CaSO42-5份、(NH4)2SO45-10份、FeSO40.05-0.1份、MnSO40.01-0.04份、ZnSO40.01-0.04份、CuSO40.01-0.04份、CaCO35-10份。
6.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中发酵条件为：所述接种量为18～22％(v/v)；在0-40h所述发酵温度为28℃，在40-140h所述发酵温度为24-25℃；所述发酵pH为5.5-5.8；发酵时间为140h。
7.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述补全料的过程为：在发酵30-50h内，按流加量为(6-8)g/L·h流加全料；在发酵50-70h内，按流加量为(12-14)g/L·h流加全料；在发酵70-110h内，按流加量为(8-10)g/L·h流加全料；在发酵110-140h内，按流加量为(8-10)g/L·h流加全料。
8.根据权利要求1中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述全料包括以下重量份数的原料：玉米浆0.5-1.0份、花生粉0.5-1.0份、葡萄糖1.0-3.0份、糊精0.5-1.0份、蛋氨酸0.5-1.0份、大豆油1.0-3.0份、CaSO40.5-1.0份、(NH4)2SO48-15份。
9.根据权利要求1-8任一项中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述全料溶液的质量与发酵液的体积比为600-700g/L。
10.根据权利要求1-8任一项中所述一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，步骤(4)分离纯化的步骤为：将步骤(3)的发酵液pH调到2.5-3.0，温度10℃以下，用吸附剂型大孔树脂吸附，饱和的大孔树脂用乙醇或丙酮解吸附，得到的乙酸乙酯或丙酮溶液用阴离子树脂进行吸附，饱和的阴离子树脂用醋酸钠进行解吸附，得到的醋酸钠溶液在温度为55-60℃下进行干燥35-40min，然后进行结晶反应，用乙醇洗涤、干燥，最后得到头孢菌素C。
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