CN111808759A - 一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素c的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法:取顶头孢霉菌制备菌悬液,接种至一级种子培养基中,发酵培养得到一级种子液,接种于二级种子培养基中,发酵培养得到二级种子液,接种于三级种子培养基中,发酵培养得到三级种子液,接种于发酵培养基中发酵培养,并在发酵培养过程中补入混合油,得到发酵菌液经分离纯化,即得到头孢菌素C。本发明的发酵方法,通过控制发酵过程中的关键指标:接种量、pH值、培养温度、发酵培养周期从而达到提高顶头孢霉菌的发酵单位等效果,本发明通过在发酵过程中补入混合油,从而降低发酵成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵制备头孢菌素C的方法,具体涉及一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,属于微生物发酵技术领域。
背景技术
头孢菌素C(英文全称为Cephalosporin C,缩写为CPC),是由顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)产生的一类β-内酰胺抗生素,分子式为:分子式为C16H21N3O8S,分子量为415.4,结构式为:
头孢菌素C的结构与青霉素的结构相似,不同的是头孢菌素C的母核是7-氨基头孢烷酸(7-ACA),而青霉素的母核则是6-氨基青霉烷酸,正是由于这种结构上的差异,使得头孢菌素C有着更强的稳定性。头孢菌素类C因其抗菌谱广和不良反应发生率低的特点,是临床上广泛使用的消炎、抗菌药物,也是生产各种注射用半合成头孢菌素的基本原料。
目前国内头孢菌素C的发酵生产行业竞争激烈,如何提高头孢菌素C发酵产量,降低发酵成本,对提高企业效益、增强企业竞争力至关重要。头孢菌素C发酵生产原辅料成本占比较高,其中尤其以大豆油成本最高,大豆油所占原辅料总成本50%以上,如何采用质优价廉的其它油料替代成本高昂的大豆油成为目前企业迫切需要解决的课题,
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,棉籽油经脱酚、脱色处理后,替代部分大豆油用于头孢菌素C发酵生产,可以有效解决当地棉籽油的销路问题,同时大幅度降低企业成本,具有良好的经济和社会效益,具体采用如下技术方案:
一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,包括以下步骤:
(1)取顶头孢霉菌置于茄子瓶斜面,制备质量与体积比值为20%-25%的菌悬液,按照1%-2%的接种量接种至一级种子培养基中,在pH值为7.0-8.0、温度为27-29℃的环境下发酵培养40-50h,得到一级种子液;
(2)取一级种子液按照8%-10%接种量接种于二级种子培养基中,在pH值为6.5-7.5、温度为27-29℃的环境下发酵培养45-50h,得到二级种子液;
(3)取二级种子液按照6%-8%接种量接种于三级种子培养基中,在pH值为6.5-7.4、温度为27-29℃的环境下发酵培养50-60h,得到三级种子液;
(4)取三级种子液按照25%-33%接种量接种于发酵培养基中发酵培养130-140h,并在发酵培养过程中补入混合油,得到发酵菌液;
(5)将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
本发明的发酵方法,通过控制发酵过程中的关键指标:接种量、pH值、培养温度、发酵培养周期从而达到提高顶头孢霉菌的发酵单位等效果。
进一步,一级种子培养基组成为:葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L、玉米浆50-100g/L糊精7.5-15g/L、白砂糖18-36g/L、黄豆饼粉20-40g/L、花生饼粉20-40g/L、轻质碳酸钙3.6-7.2g/L;
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉22-32g/L、白砂糖22-32g/L、糊精8-12g/L、花生饼粉22-32g/L、轻质碳酸钙4-6g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L;
三级种子培养基组成为:硫酸铵9-13g/L、无水硫酸钙4-6g/L、谷朊粉9-13g/L、DL-蛋氨酸2-4g/L、玉米粉8-12g/L、糊精12-18g/L、花生饼粉12-16g/L、轻质碳酸钙4-7g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆14-18g/L、大豆油20-30g/L;
优选的,一级种子培养基组成为:葡萄糖浆20g/L、大豆油9g/L玉米浆60g/L、糊精8g/L、白砂糖22g/L、黄豆饼粉27g/L、花生饼粉26g/L、轻质碳酸钙3.8g/L;
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉26g/L、白砂糖29g/L、糊精11g/L、花生饼粉24g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆25g/L、大豆油10g/L;
三级种子培养基组成为:硫酸铵12g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉11g/L、DL-蛋氨酸3g/L、玉米粉9g/L、糊精17g/L、花生饼粉14g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆80g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
采用上述进一步的有益效果在于,本发明的培养基中包含了有机及无机氮源,有利于菌体快速生长,这样可以使种子进入发酵培养基中能迅速适应,快速生长。
进一步,步骤(4)中,发酵培养基组成为:硫酸铵10-26g/L、无水硫酸钙10-13g/L、谷朊粉20-26g/L、DL-蛋氨酸5-6g/L、玉米粉15-20g/L、糊精17-22g/L、花生饼粉16-20g/L、轻质碳酸钙5-8g/L、玉米浆50-100g/L、大豆油10-60g/L、棉籽10-60g/L。
优选的,发酵培养基组成为:硫酸铵16g/L、无水硫酸钙13g/L、谷朊粉22g/L、DL-蛋氨酸5g/L、玉米粉16g/L、糊精18g/L、花生饼粉18g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、大豆油25g/L、棉籽25g/L。
进一步,步骤(4)中混合油为棉籽油和大豆油的混合物,其中棉籽油占混合油体积的10-80%;优选的,棉籽油占混合油体积的20-70%,更优选的,棉籽油占混合油体积的50%。
采用上述进一步的有益效果在于,本发明采用的棉籽油与大豆油均属于植物油,其主要作用成分就是脂肪酸和甘油在菌体中代谢途径基本一致。
进一步,步骤(4)还包括补油,补油的操作为在发酵过程中50-140h开始补油,发酵至50-80h时的补油速率为0.1-0.5L/m3·h,发酵至80-110h时的补油速率为0.5-1.0L/m3·h,发酵至110-140h时的补油速率为0.5-1.0L/m3·h;
优选的,在发酵过程中50-140h开始补油,发酵至50-80h时的补油速率为0.2-0.4L/m3·h,发酵至80-110h时的补油速率为0.6-0.9L/m3·h,发酵至110-140h时的补油速率为0.6-0.9L/m3·h;
更优选的,在发酵过程中50-140h开始补油,发酵至50-80h时的补油速率为0.3L/m3·h,发酵至80-110h时的补油速率为0.7L/m3·h,发酵至110-140h时的补油速率为0.6L/m3·h。
采用上述进一步的有益效果在于,发酵过程中植物油的利用有特定的时间性,在发酵液中脂肪酶活较高时,植物油脂肪酸的分解率最高,可以为头孢菌素的合成提供足够的氨基酸前体。
进一步,步骤(4)中所述发酵培养140h的操作为0~40h在pH值为5.6、温度为28℃的条件下发酵培养,40~140h在pH值为5.6、温度为24℃的条件下发酵培养。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:大豆油9g/L玉米浆60g/L,葡萄糖22g/L,白砂糖25g/L,轻质碳酸钙5g/L,黄豆饼粉25g/L,花生饼粉25g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉25g/L、白砂糖26g/L、糊精10g/L、花生饼粉25g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、葡萄糖浆20g/L、大豆油9g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵10g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉11g/L、DL-蛋氨酸2g/L、玉米粉10g/L、糊精16g/L、花生饼粉12g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵15g/L、无水硫酸钙12g/L、谷朊粉24g/L、DL-蛋氨酸5g/L、玉米粉16g/L、糊精19g/L、花生饼粉17g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆60g/L、大豆油15g/L、棉籽10g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入混合油,补料油中棉籽油替代大豆油的比例为为40%,即为40%棉籽油、60%大豆油,组成混合油。
在发酵过程中50-140h开始补混合油,补油速率为50-80h补油速率为0.4L/m3·h,80-110h补油速率为0.6L/m3·h,110-140h补油速率为0.8L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵菌液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C混合液,进行检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表1:
表1效价检测结果
实施例2
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:大豆油10g/L玉米浆65g/L,葡萄糖22g/L,白砂糖25g/L,轻质碳酸钙5g/L,黄豆饼粉25g/L,花生饼粉25g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉24g/L、白砂糖23g/L、糊精10g/L、花生饼粉25g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、葡萄糖浆22g/L、大豆油10g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵10g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉12g/L、DL-蛋氨酸2g/L、玉米粉10g/L、糊精13g/L、花生饼粉13g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵13g/L、无水硫酸钙13g/L、谷朊粉25g/L、DL-蛋氨酸6g/L、玉米粉16g/L、糊精19g/L、花生饼粉17g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆60g/L、大豆油10g/L、棉籽15g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入油,补料油中棉籽油替代大豆油的比例为为50%,即为50%棉籽油、50%大豆组成混合油。
在发酵过程中50-140h开始补混合油,补油速率为50-80h补油速率为0.6L/m3·h,80-110h补油速率为0.7L/m3·h,110-140h补油速率为0.8L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵菌液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C混合液,进行检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表2:
表2效价检测结果
实施例3
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:大豆油80g/L玉米浆62g/L,葡萄糖21g/L,白砂糖23g/L,轻质碳酸钙5g/L,黄豆饼粉20g/L,花生饼粉20g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉23g/L、白砂糖22g/L、糊精12g/L、花生饼粉23g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆65g/L、葡萄糖浆23g/L、大豆油11g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵11g/L、无水硫酸钙6g/L、谷朊粉13g/L、DL-蛋氨酸2.5g/L、玉米粉11g/L、糊精12g/L、花生饼粉12g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油26g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵14g/L、无水硫酸钙13g/L、谷朊粉26g/L、DL-蛋氨酸6.5g/L、玉米粉17g/L、糊精19g/L、花生饼粉18g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆65g/L、大豆油12g/L、棉籽13g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入油,补料油中棉籽油替代大豆油的比例为为50%,即为45%棉籽油、55%大豆油,组成混合油。
在发酵过程中50-140h开始补混合油,补油速率为50-80h补油速率为0.6L/m3·h,80-110h补油速率为1.0L/m3·h,110-140h补油速率为0.8L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵菌液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C混合液,进行检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表3:
表3效价检测结果
实施例4
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:大豆油60g/L玉米浆60g/L,葡萄糖23g/L,白砂糖23g/L,轻质碳酸钙5g/L,黄豆饼粉22g/L,花生饼粉20g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉22g/L、白砂糖21g/L、糊精13g/L、花生饼粉23g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆65g/L、葡萄糖浆23g/L、大豆油11g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵10g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉11g/L、DL-蛋氨酸3g/L、玉米粉12g/L、糊精12g/L、花生饼粉12g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵15g/L、无水硫酸钙14g/L、谷朊粉27g/L、DL-蛋氨酸7g/L、玉米粉17g/L、糊精19g/L、花生饼粉19g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆65g/L、大豆油16g/L、棉籽14g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入油,补料油中棉籽油替代大豆油的比例为为20%,即为20%棉籽油、80%大豆油,组成混合油。
在发酵过程中50-140h开始补混合油,补油速率为50-80h补油速率为0.6L/m3·h,80-110h补油速率为0.8L/m3·h,110-140h补油速率为0.8L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵菌液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C,分别检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表4:
表4效价检测结果
实施例5
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:大豆油61g/L玉米浆70g/L,葡萄糖25g/L,白砂糖25g/L,轻质碳酸钙4g/L,黄豆饼粉22g/L,花生饼粉20g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉20g/L、白砂糖22g/L、糊精14g/L、花生饼粉23g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆65g/L、葡萄糖浆23g/L、大豆油11g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵11g/L、无水硫酸钙6g/L、谷朊粉15g/L、DL-蛋氨酸4g/L、玉米粉11g/L、糊精15g/L、花生饼粉15g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆75g/L、葡萄糖浆20g/L、大豆油30g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵16g/L、无水硫酸钙15g/L、谷朊粉30g/L、DL-蛋氨酸8g/L、玉米粉16g/L、糊精22g/L、花生饼粉22g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆70g/L、大豆油10g/L、棉籽油10g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入油,补料油中棉籽油替代大豆油的比例为为30%,即为30%棉籽油、70%大豆油,组成混合油。
在发酵过程中50-140h开始补混合油,补油速率为50-80h补油速率为0.7L/m3·h,80-110h补油速率为0.9L/m3·h,110-140h补油速率为0.7L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵菌液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C,分别检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表5:
表5效价检测结果
实施例6
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:葡萄糖浆20g/L、大豆油9g/L、玉米浆60g/L糊精8g/L、白砂糖22g/L、黄豆饼粉27g/L、花生饼粉26g/L、轻质碳酸钙3.8g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉22-32g/L、白砂糖22-32g/L、糊精8-12g/L、花生饼粉22-32g/L、轻质碳酸钙4-6g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵12g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉11g/L、DL-蛋氨酸3g/L、玉米粉9g/L、糊精17g/L、花生饼粉14g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆80g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵16g/L、无水硫酸钙13g/L、谷朊粉22g/L、DL-蛋氨酸5g/L、玉米粉16g/L、糊精18g/L、花生饼粉18g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、大豆油12g/L、棉籽38g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入油,补料油中棉籽油替代大豆油的比例为为50%,即为50%棉籽油、50%大豆油,组成混合油。
在发酵过程中50-140h开始补油,补油速率为50-80h补油速率为0.3L/m3·h,80-110h补油速率为0.7L/m3·h,110-140h补油速率为0.6L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C,分别检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表6:
表6效价检测结果
对比例1
顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,步骤如下:
(1)制备一级种子
取顶头孢霉菌茄子瓶斜面,制备的菌悬液25%(mg/mL)。按照1%的接种量接种至种子培养基中,在PH为7.0、27℃培养50h,得一级种子。
一级种子培养基:大豆油60g/L玉米浆60g/L,葡萄糖23g/L,白砂糖23g/L,轻质碳酸钙5g/L,黄豆饼粉22g/L,花生饼粉20g/L。
(2)制备二级种子
取一级种子按照8%接种量接种于二级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得二级种子。
二级种子培养基组成为:黄豆饼粉22g/L、白砂糖21g/L、糊精13g/L、花生饼粉23g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆65g/L、葡萄糖浆23g/L、大豆油11g/L。
(3)制备三级种子
取二级种子按照8%接种量接种于三级种子培养基中,在PH为6.5、27℃培养50h,得三级种子。
三级种子培养基:硫酸铵10g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉11g/L、DL-蛋氨酸3g/L、玉米粉12g/L、糊精12g/L、花生饼粉12g/L、轻质碳酸钙6g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
(4)发酵
取三级种子按照25%接种量接种于发酵培养基中,培养140h,0-40h 28℃,40-140h 24℃,pH为5.6,得发酵菌液。
发酵培养基:硫酸铵15g/L、无水硫酸钙14g/L、谷朊粉27g/L、DL-蛋氨酸7g/L、玉米粉17g/L、糊精19g/L、花生饼粉19g/L、轻质碳酸钙7g/L、玉米浆65g/L、大豆油30g/L。
在发酵过程的以下时间段内补入大豆油,在发酵过程中50-140h开始补混合油,补油速率为50-80h补油速率为0.6L/m3·h,80-110h补油速率为0.8L/m3·h,110-140h补油速率为0.8L/m3·h。
(5)分离纯化
将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
效价检测
取1g步骤(4)中发酵液与50mL的容量瓶中加水至刻度摇匀,制备得到头孢菌素C混合液,取制得的头孢菌素C,分别检测效价。
色谱条件如下:色谱柱:Hypersil ODS 5um×4.6mm×250mm,波长:254nm,流速:1体积份/min,进样量:20uL,
效价检测结果见表7;
表7效价检测结果
综合实施例1~6及对照例1的检测及结果,见表8:
表8效价检测结果比较
由表8可以看出:本发明通过将头孢菌素C培养基配方中及补料中大豆油的按照一定的比例替代为棉籽油,放罐效价与正常配方大幅度提高;放罐菌浓在54~57%之间,透光在42~46%之间,杂质含量DOCPC及DCPC基本相差不大,主要成分CPC均在80%以上。
因此,综合考虑生产成本及发酵收益,实施例的各项工艺参数取值更适合于工业化生产,可以显著降低生产成本,增加产量,具有非常良好的工业应用前景。
Claims (10)
1.一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取顶头孢霉菌置于茄子瓶斜面,制备质量与体积比值为20%-25%的菌悬液,按照1%-2%的接种量接种至一级种子培养基中,在pH值为7.0-8.0、温度为27-29℃的环境下发酵培养40-50h,得到一级种子液;
(2)取一级种子液按照8%-10%接种量接种于二级种子培养基中,在pH值为6.5-7.5、温度为27-29℃的环境下发酵培养45-50h,得到二级种子液;
(3)取二级种子液按照6%-8%接种量接种于三级种子培养基中,在pH值为6.5-7.4、温度为27-29℃的环境下发酵培养50-60h,得到三级种子液;
(4)取三级种子液按照25%-33%接种量接种于发酵培养基中发酵培养130-140h,并在发酵培养过程中补入混合油,得到发酵菌液;
(5)将发酵菌液依次经陶瓷膜过滤、纳滤浓缩、树脂吸附、解析分离纯化,即得到头孢菌素C。
2.根据权利要求1所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,所述一级种子培养基组成为:葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L、玉米浆50-100g/L糊精7.5-15g/L、白砂糖18-36g/L、黄豆饼粉20-40g/L、花生饼粉20-40g/L、轻质碳酸钙3.6-7.2g/L;
所述二级种子培养基组成为:黄豆饼粉22-32g/L、白砂糖22-32g/L、糊精8-12g/L、花生饼粉22-32g/L、轻质碳酸钙4-6g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆18-32g/L、大豆油8-15g/L;
所述三级种子培养基组成为:硫酸铵9-13g/L、无水硫酸钙4-6g/L、谷朊粉9-13g/L、DL-蛋氨酸2-4g/L、玉米粉8-12g/L、糊精12-18g/L、花生饼粉12-16g/L、轻质碳酸钙4-7g/L、玉米浆50-100g/L、葡萄糖浆14-18g/L、大豆油20-30g/L。
3.根据权利要求2所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,所述一级种子培养基组成为:葡萄糖浆20g/L、大豆油9g/L玉米浆60g/L、糊精8g/L、白砂糖22g/L、黄豆饼粉27g/L、花生饼粉26g/L、轻质碳酸钙3.8g/L;
所述二级种子培养基组成为:黄豆饼粉26g/L、白砂糖29g/L、糊精11g/L、花生饼粉24g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆70g/L、葡萄糖浆25g/L、大豆油10g/L;
所述三级种子培养基组成为:硫酸铵12g/L、无水硫酸钙5g/L、谷朊粉11g/L、DL-蛋氨酸3g/L、玉米粉9g/L、糊精17g/L、花生饼粉14g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆80g/L、葡萄糖浆16g/L、大豆油25g/L。
4.根据权利要求1所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,步骤(4)中所述发酵培养基组成为:硫酸铵10-26g/L、无水硫酸钙10-13g/L、谷朊粉20-26g/L、DL-蛋氨酸5-6g/L、玉米粉15-20g/L、糊精17-22g/L、花生饼粉16-20g/L、轻质碳酸钙5-8g/L、玉米浆50-100g/L、大豆油10-60g/L、棉籽10-60g/L。
5.根据权利要求4所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,步骤(4)中所述发酵培养基组成为:硫酸铵16g/L、无水硫酸钙13g/L、谷朊粉22g/L、DL-蛋氨酸5g/L、玉米粉16g/L、糊精18g/L、花生饼粉18g/L、轻质碳酸钙5g/L、玉米浆60g/L、大豆油25g/L、棉籽25g/L。
6.根据权利要求1所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,步骤(4)中所述混合油为棉籽油和大豆油的混合物,其中棉籽油占混合油体积的10-80%。
7.根据权利要求6所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,步骤(4)中所述混合油为棉籽油和大豆油的混合物,其中棉籽油占混合油体积的20-70%。
8.根据权利要求1所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,步骤(4)还包括补油,所述补油的操作为在发酵过程中50-140h开始补油,发酵至50-80h时的补油速率为0.1-0.5L/m3·h,发酵至80-110h时的补油速率为0.5-1.0L/m3·h,发酵至110-140h时的补油速率为0.5-1.0L/m3·h。
9.根据权利要求8所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,所述补油的操作为在发酵过程中50-140h开始补油,发酵至50-80h时的补油速率为0.2-0.4L/m3·h,发酵至80-110h时的补油速率为0.6-0.9L/m3·h,发酵至110-140h时的补油速率为0.6-0.9L/m3·h。
10.根据权利要求1所述的一种顶头孢霉菌发酵制备头孢菌素C的方法,其特征在于,步骤(4)中所述发酵培养140h的操作为0~40h在pH值为5.6、温度为28℃的条件下发酵培养,40~140h在pH值为5.6、温度为24℃的条件下发酵培养。
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