CN1010415B

CN1010415B - 棒酸及其盐和酯的制备方法

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Publication number: CN1010415B
Application number: CN85108444A
Authority: CN
Inventors: 何塞·路易斯·费尔南德斯·普恩特斯; 米格尔·安赫尔·莫雷诺·巴列; 弗朗西斯科·萨尔托·马尔多纳多; 托马斯·奥莱罗斯·伊萨德; 路易斯·科斯塔·普拉; 何塞·马丽亚·费尔南德斯
Original assignee: Antibioticos SA
Current assignee: Antibioticos SA
Priority date: 1984-10-27
Filing date: 1985-10-26
Publication date: 1990-11-14
Also published as: CA1307223C; IN162768B; EP0182522A1; MX7417E; EP0182522B1; CN85108444A; JPH0646949B2; AU4909085A; AR245221A1; HK26696A; EP0312813A3; IE58365B1; JPS61119195A; NZ213963A; EP0312813A2; DE3583281D1; AU600655B2; IE852699L

Abstract

本发明公开的利用繁殖微生物发酵法生产棒酸(Clavulanic acid)的方法的特点是发酵过程中至少要在培养基中加入部分可同化碳源。按本方法容易以较高的产率制得纯度较高的棒酸，尤其是制备适用于药物制剂的该酸的酯或盐。

Description

本发明涉及棒酸（Clavulanic Acid）及其可供药用的盐和酯的制备方法。

棒酸即（2R，5R，Z）-3-（2-羟亚乙基）-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环〔3，2，0〕-庚烷-2-羧酸是一种已知的化合物，其结构如下：

该化合物及其盐和酯，可作为β-内酰胺酶抑制剂，能抑制由革兰氏阳性和革兰氏阴性有机体所产生的β-内酰胺酶的活动。因此这些化合物可用在药物成份里，以防止β-内酰胺抗生素的失活。此外，棒酸本身也具有抗菌活性。

棒酸是由各种不同菌株的微生物产生的，例如，这些菌株属于链霉菌属的有：S.Clavuligerus NRRL3585（美国专利4110165），S.jumonjinensis NRRL5741（英国专利1，563，103），S.katsurahamanus IFO13716（日本专利83，009，579）和链霉菌属球菌（SP.）P6621 FERM2804（日本专利55，162，993）。

人们一直通过改进发酵过程来提高棒酸的产量。例如英国专利1，571，888透露，严格地将pH控制在6.3至6.7范围内可以显著地增加产量。

增加产量的办法，更常用的是改进纯化过程。例如，由于棒酸的盐通常比游离酸更稳定，因此，可采用其盐，例如碱金属和碱土金属的盐来增加萃提产量。

美国专利4，110，165叙述了一种基于棒酸及其盐在水相和有机相之间溶解度不同的萃取过程。在萃取之后还要用吸附剂提纯几次。因此，这种萃取方法过于沉长又不经济。

所以，直接从有机相将棒酸结晶出来更为理想。按西班牙专利494，431的办法，是在有机相中加入胺，如叔丁胺，可以使棒酸直接从有机相中结晶出来，然后与一种碱交换，就可转化成钾盐。

锂盐也被认为是一种制备棒酸的有用的中间体，因为它溶解度低而且很容易转化成可供药物制剂采用的盐和酯。例如，美国专利4，490，294透露，棒酸溶液与离子型的锂化合物的水溶液反应可生成棒酸锂。英国专利1，543，563透露了另一种制备棒酸锂的路线，该路线是采用经粒状炭过滤后的肉汤进行吸附，再用离子交换树脂处理，然后将棒酸锂进行结晶。

也有人提出，发酵的肉汤直接吸附在树脂上之后，用异丙醇作溶剂将棒酸锂结晶出来。这个过程很难实现而且产量极低。

由此看来，采用现有技术的发酵和纯化方法，只能制得不纯的棒酸，而且产量相当低。

根据本发明的第一个方面，本发明提供一种利用繁殖的微生物在培养基中发酵的方法制备棒酸的方法，按照这种方法，在发酵过程中至少要加入部分的可同化碳源。可以相信，不受理论所限制，若有控制地加入碳源就不会出现降解代谢调节。不管理论是怎么说的，现已观察到，在发酵过程的任何一个时间，小心地避免碳含量变得太高，就可以使发酵获得显著的改进。下面列举一些比较理想的实施例子：

将可同化碳源的含量保持在低于2%较为理想，低于1%则更好（对于固体碳源，百分率是以重量/体积作根据，对于液体碳源，则以体积/体积作根据）。同样道理，将碳源加入到有效培养基中时，应以少量加入为宜，可采用分批加入，也可采用连续加入。但无论采用哪种加入方式，碳源的加入量，相对于培养基来说，以不超过1%为好，不超过0.5%更好。实际上，培养基中碳含量维持在低于0.25%，例如低于0.15%比较好。任何可同化碳源都可使用，包括多羟基化合物或碳水化合物，但最好是采用一种化学结构明确的碳源（亦即是一种化学结构已知的含碳化合物）。确定的碳源的分子量一般低于500。分子中所含碳原子数目最多为12个比较合适，例如单糖或双糖，或线型多羟基化合物。这类化合物的例子包括麦芽糖和甘油。本发明另一较佳的选择，可同化碳源是糊精，淀粉或糊化淀粉，更广泛地说，碳源通常是可溶于水或可溶混于水的。

S.clavuligerus的应用，特别是S.clavligerus NRRL 3585，现在较为普及。对于这些微生物，较适合的碳源包括麦芽糖，甘油，糊精和糊化或未糊化的淀粉。葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖不太容易被S.clavuligerus同化，所以对于这类微生物不太适用。

碳源可以是连续地或间歇地掺入，最好能使它受到限制，就是使碳源含量在任何时候不会高过2%。例如，掺入过程可以是连续的，这是用少量的碳源恒定地按规定量供给培养基。连续加入最适宜的速度约为每小时0.01至0.1%每天0.5至1.5%更好，特别好的速度约为每小时0.05%。另一可选择的形式是，掺入按照预先的规定，分批逐次的进行。例如，间歇加入的时间间隔一般是由每分钟至每六小时。每天总加入量可为0.25%至1.5%，然而每天的加入量为0.5至1.5%时是最佳的。

掺入方式不必按照不变的形式进行。因此，开头60小时的掺入量可以维持在每天0.5%或1%，在其余的发酵时间，每天的加入量可分别为1%或0.5%。此外，在接种时，起初在培养基中碳源含量较适合的范围0%至2%，0%至0.5%更好，0%至0.05%则最好。

连续或间歇式的加入碳源最好是在无菌状态下进行，最好提供方法来保证及维持这种无菌状态。再者，固体碳源最好是以水溶液加入。液体碳源可以直接加入或经适当稀释后加入。

发酵介质可以包含其它适当的培养成份，包括有机氮源。这种氮源可包含含油种子，可选择的是脱脂粗面粉，蛋白质水解液或其提取物。必要时，可将天然盐（尤其是氯化物，硫酸盐，碳酸盐或磷酸盐）和无机或有机去沫剂，连同其它已知介质成份，一起加入。最佳发酵温度一般为24至30℃之间，特别是26℃至28℃，然而本发明则却不限制这些温度内，因为本发明的发酵过程可以在高于或低于这些温度进行。发酵通常是在间歇式系统中进行1至几天，更通常是由24至240小时，而多数情况是100至200小时。

对于本发明最合适的发酵容器是传统的有氧发酵容器，这种容器带有搅拌和通气装置。这种容器的容量可以由1升至225立方米不等。实用容量最好是总容量的25～75%。

在肉汤后处理中，最好采用过滤或离心的方法将固体物质从发酵肉汤中除掉。肉汤最好是酸化到pH值为1至3，pH值约为2时更好，棒酸可通过加入不与水混溶的溶剂进行萃取，将两相用例如离心法分开，由此便在不与水混溶的一相中得到棒酸。

本发明还包括制备棒酸的新方法，即以锂盐的形式获得棒酸，或可选择地将棒酸锂转变为这种酸的其它盐类或酯类。

因此，更明确地说，根据本发明的第二个方面，本发明提供一个纯化棒酸的方法，该方法包括下列三个步骤：

（Ⅰ）将已溶解的不纯的棒酸与已溶解的2-乙基己酸锂混合，酸和盐最好是各自溶于不与水混溶的溶剂中，最好是用同一种溶剂

（Ⅱ）将棒酸锂离析出来;

（Ⅲ）可选择地将锂盐转变成另一种盐或酯。

采用这种方法既可能得到较高的产量又可以提高其纯度。本方法对于棒酸发酵肉汤的纯化具有普遍的适用性，而对于纯化根据本发明第一个方面所制备的提取物则更为适用。正如上面所提到的，这种发酵可以很容易地在与水不混溶的溶剂（这种溶剂适用于步骤Ⅰ）中产生不纯的棒酸溶液。较合用的有机溶液是乙酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸戊酯，甲基异丁基酮或正丁醇，以正丁醇为最佳。肉汤的萃取在4至10℃进行较好，其目的是为了使棒酸的分解损失量减至最小。

萃取之后，加入按已知方法制备的2-乙基己酸锂溶液，进行结晶。优先的选择是，棒酸在有机溶液中的浓度应大于10毫克/毫升。结晶最好在低温下进行，一般在4至10℃之间。因为棒酸锂是与四分之一个水分子一起结晶的，所以建议在含有低浓度水，例如含2%至4%水的有机溶液中进行结晶。用过量的2-乙基己酸锂较好。2-乙基己酸锂应在搅拌和冷却下缓慢加入。当所有2-乙基己酸锂加完之后，最好再搅拌一段时间。然后，将所得到棒酸锂进行进一步的处理，最好是先经玻璃片过滤，再分别用异丙醇，丙酮和乙醚洗涤，最后在真空下干燥。

可以将棒酸锂重结晶。重结晶的办法是在棒酸锂的水溶液中加入过量的有机溶剂，而锂盐在这种溶剂中的溶解度很低，溶剂以异丙醇为佳。另一种更好的办法是将另一种锂盐的浓溶液加入到棒酸锂的水溶液中，使之重结晶。适用的锂盐包括那些在水中溶解度高的有机或无机锂盐，氯化锂最为适合。锂盐溶液的浓度大于50%比较合适，而且应加入足够的溶液以便使最后浓度大于25%。锂盐溶液最好是缓慢地加入，同时应进行搅拌。

经过重结晶的棒酸锂可进一步提纯，例如，可以是用过滤法分离，用丙酮洗涤，然后在真空下干燥，由此所得产率高于80%，纯度高于85%。

根据本发明的方法制备的棒酸锂可以用离子交换方法转变成其它盐类，树脂可采用所要求的阳离子型交换树脂，用钠型或钾型较好，洗脱液可用水。此外，该酸的酯类可采用已知方法来制备。作为制备锂盐的另一种更常用的方法，本发明还提出了一系列改进，即利用一种交换容量较高的离子交换树脂来萃取棒酸。适用的树脂的例子有，例如在英国专利1，534，563中所叙的树脂。树脂以弱碱性离子交换树脂为好，其型号为IRA-68，而且以乙酸盐的形式的树脂为佳。

发酵肉汤的初始活性以每毫升中含800微克以上的棒酸为较合适，以便肉汤在用离子交换树脂吸附并用锂盐洗脱，接着，例如用异丙醇结晶后能得到棒酸锂的良好晶体。

肉汤用树脂吸附之前，最好先进行澄清。

根据本发明的第三个方面，发酵肉汤用聚集剂处理，以便使菌丝体聚集起来。

将菌丝体聚集起来有利于过滤。过滤辅助剂Prasetol（德国Bayer AG的商标）是一种适合的聚集剂。辅助剂最好以0.1至0.5%的浓度加入到肉汤中，混合物在过滤前需要搅拌大约15分钟。过滤本身就是将混合物通过一个无机过滤材料，如Dicalite的床层比较合适（一般约6%重量∶容积）（Dicalite是Dicalite有限公司的一个商标）。如果过滤出来的首批溶液澄清不好，则可令其重新通过同样的Dicalite予备层，再次过滤。肉汤也可以在过滤之后用离心法澄清。（一般是在每分钟10，000转的速度下离心30分钟）。

本发明的另一个改进是增加离子交换树脂的吸附容量，这是利用已过滤的肉汤的脱蛋白作用来达到的。

脱蛋白作用最好通过酸化来实现，通常酸化到pH＝4，也可采用沉淀溶剂如丙酮来处理。

在本发明的一个实施例中，经过过滤的肉汤的pH值用无机酸，如盐酸或硫酸调到4左右。当pH调好后，清液层便吸附在树脂上。最好先让肉汤静置一段时间，如有混浊，可用离心法清除。为避免由于pH在4左右而使产物损失，在用树脂吸附之前，可将混合物的pH值调回到6。用这种办法可以使pH＝6的乙酸盐形式的树脂的吸附容量增加。经过过滤的肉汤∶树脂（容积/容积）的比例以不大于10∶1为宜

过滤后的肉汤也可以用沉淀溶剂，如丙酮来处理，从而脱除蛋白。在本发明的一个实施例中，一容积的肉汤与约一容积的丙酮混合。比较好的操作方法是，将肉汤与丙酮一起搅拌5至10分钟，然后令其静置20分钟，将沉淀物用离心法或过滤法分离。这样澄清过的肉汤就适合于用树脂来吸附。肉汤吸附之前，可进行减压蒸馏，以回收其中的丙酮。无论丙酮有否被除去，经过过滤的肉汤都可以用树脂来吸附，其比例由10∶1至12∶1（此比例是指经过过滤的肉汤的初始容积∶树脂容积）而且没有显著的损失。从离子交换树脂洗脱液中结晶出来的棒酸锂，首先会形成胶状，在某些情况下，纯度很低。为了解决这个问题，最好先用0.5%氯化钠清洗或预先洗脱树脂，接着用水清洗，然后才用锂盐，如5%氯化锂洗脱。用丙酮处理洗脱液可以进一步改进棒酸锂的结晶过程。例如，可把树脂洗脱液与两倍体积的丙酮一起搅拌，然后令其静置15分钟。再用离心法将沉淀物分离，除去丙酮后，用异丙醇将棒酸锂结晶出来。

总之，本发明可以很容易地制备棒酸及其的盐和酯，这些形式都适用于药物制剂。

本发明可用下列例子来说明，但并不被这些例子所限制。

例子1

先准备好下例的培养基：

鱼粉 2.0克

甘油 1.5克

可溶淀粉 1.5克

碳酸钙 0.2克

蒸馏水加至 100毫升

将pH值调到7，将40毫升的等分试样放入容量为250毫升的爱伦美氏瓶中，进行消毒。然后在培养基中接种S.clavuligerus NRRL3858孢子的悬浮体，在搅拌下于28℃培育2天。该培养物再接种到装有500毫升同样培养基的容量为2升的爱伦美氏瓶中，其浓度为2%。培养过程也是在旋转振动器中在28℃进行两天。

将由此所制得的500毫升培养物接种到一个容量为340升的不锈钢容器中，该容器装有搅拌、通气及温度控制装置。该容器装有100升由以下成份组成的无菌培养基：

大豆粉 3%

玉米糊精 3%

大豆油 0.5%

KH₂PO₄0.1%

去泡剂（乌康） 0.005

自来水加至规定体积。

已接种的培养基在28℃下培育，一边鼓入空气，一边搅拌，并维持45小时。然后，在另一个装有150升同样培养基的容积为340升的容器中接种该培养液7%。培育过程是在28℃，在搅拌及通气情况下进行30小时。

完成后，用这些培养物来接种大贮罐中的生产棒酸的培养基接种浓度为7%。大贮罐总容量达800升，内装425升由下列成份组成的培养基：

大豆粉 1.25%

花生粉 1，25%

干酒槽 0.5%

磷酸二氢钾 0.1%

去泡剂（乌康） 0.005%

自来水加至规定体积。

将pH值调到6.7，然后，在121℃进行消毒20分钟。每隔1小时加入一次甘油，加入量如下：

时间（小时）速度（毫升/小时）总甘油量

0至12 180 0.5%

13至96 190 3.7%

97至160 100 1.5%

发酵是在26℃在搅拌及通气情况下进行的。经过160小时之后，棒酸的含量相当高，可达1403微克/毫升。

例子2和3

比较例子1和2

在发酵过程中逐步加入甘油与一开始便加入所有甘油这两种作法对发酵的影响是不同的，下表说明两者比较结果：

例子＊甘油（%）棒酸

初始加入 112小时 160小时

E2 0 5.7 819 1403

E3 1 4.8 402 669

CE1 3.5 0 359 273

CE2 5.5 0 198 199

＊E，例子 CE，比较例子

在发酵中掺入可同化碳源，可使产量显著增加。

例子4

在容积为75升的发酵器中，用同样的培养液接种40升与例1相同的发酵生产培养基。然后用一种连续加料隔膜泵，不断地加入经消毒的5%的麦芽糖水溶液，加入速度为每天800毫升（1%麦芽糖/每天）历时112小时后收集肉汤准备萃取。发酵器用传统方式搅拌及曝气。经过112小时后，肉汤中棒酸的浓度为1424微克/毫升。

例子5

将7.5升正丁醇加入到7.5升由例子1所得经过过滤的肉汤，用4N冷硫酸将pH调到2，将混合物离心到16，000克，由此分成两相，水相和丁醇相。丁醇相在35℃及减压下浓缩到200毫升。用这方法，在200毫升正丁醇得到棒酸溶液的浓度为26.7毫克/毫升。加入5毫升水，使含水量达到2.52%。在搅拌下，将100毫升10%的2-乙基己酸锂的正丁醇溶液加入到上述溶液中。将总容积浓缩到150毫升，在5℃搅拌两小时，然后用一过滤片过滤。分别用100毫升异丙醇，100毫升丙酮和100毫升乙醚洗涤结晶体，接着在40℃真空下干燥，得到7.57克产品，纯度为54%，含水量为3.2%和灰份为23.5%（为硫酸锂）。

例子6

将10克由例子5所得的棒酸锂溶于50毫升水中，在搅拌下，缓慢地加入75毫升50W/V氯化锂溶液。结晶作用开始，将混合物在50℃搅拌半小时，用玻璃三角烧瓶过滤，然后用丙酮洗涤，在真空下于40℃干燥，得到5.27克产品，产率为84%，纯度为80%。

经重结晶的棒酸锂的物理性质如下：

IR〔cm^-1，Nujol（商标，一种石蜡糊）〕：3420，3010，1765，1680，1620，1400，1340，1325，1300，1220，1200，1130，1100，1060，1050，1020，990，970，950，900，880，850，730，708

〔α〕＝451（C＝145微克/毫升，于水中）

uv λ＝259（C＝10微克/毫升在0.1NNa OH中）

（摩尔消光系数，ε＝19.451）

锂含量（吸附法）＝3.3%

灰份＝26.5%为硫酸锂。

例子7

将800ml根据例子1或4的方法所制备的发酵肉汤（其活度为1280微克/毫升）与过滤辅助剂，如0.5% Praestol一同搅拌。肉汤与Dicalite按6∶1（W/V）混合，然后小心地通过在瓷漏斗瓶的过滤纸过滤。当肉汤经过过滤和澄清之后，将pH调到4.0以脱除蛋白质。将沉淀物用离心法分离。清液层在pH值为6.0的碱性IRA-68型树脂上吸附，在柱中，过滤过的肉汤/树脂的容积/容积，比例是10∶1。树脂是醋酸盐型的pH为4.0。

当肉汤被吸附后，先用0.5%氯化钠，后用水洗涤树脂。用氯化钠锂将棒酸以锂盐的形式洗脱出来。树脂洗脱液（510毫升，活度∶每毫升含棒酸4500微克）用两倍体积的丙酮处理，沉淀物用离心法分离。清液层与5倍体积的异丙醇混合，再将其沉淀物离心分离。将清液层浓缩，让锂盐在4℃结晶24小时。得产品1182毫克，产率为11.5%，纯度为96.92%。

例子8

将一个总发酵肉汤（5000毫升，活度为：每毫升含棒酸1396微克）按例7所述方法过滤。

将滤液与一体积的丙酮，在持续搅拌下混合，然后让它沉积15至20分钟。将沉积物用离心法除去，丙酮则用旋转蒸发器蒸掉。经澄清后的肉汤吸附在例7所述的IRA-68型离子交换树脂上（肉汤∶树脂＝10∶1，体积比）。按同样方法将树脂洗涤，棒酸锂被洗脱出来后用异丙醇结晶。产率是20%。洗出液分成两个级份。第一级份为650毫克，纯度69.3%，总产率9%。第二级份为770毫克，纯度98%，总产率11%。

纯度为69.3%结晶的棒酸锂含有5%锂和35.4%硫酸锂灰分。棒酸锂用55%氯化锂重结晶，其产品有以下特性：

ε＝15908（在0.1NNa OH中）

锂含量＝3.6%

灰分＝25%即硫酸锂

纯度＝95%

IR（石蜡糊cm^-1，）3430，3010，1760，1680，1615，1375，1300，1210，1130，1105，1065，1050，1030，995，980，950，900，885，855，740，710.

例子10

按例7方法，用Praestol处理肉汤（4000毫升，活度为300微克/毫升棒酸）并过滤。肉汤在pH值为6.0时澄清后，通过一个IR-68和XAD-2树脂的混合柱，其速率为：经过过滤的肉汤的体积∶树脂体积＝40∶1。

含有初始活度实际是100%棒酸的予分离柱的洗出液以肉汤∶树脂比例（V/V）＝10∶1的速率吸附在柱上。树脂先用0.5% 氯化钠，后用水洗涤。棒酸锂用氯化锂洗脱。棒酸按例7所述方法结晶后可得首批产品181毫克，纯度95.3%，产率15.08%。其物理性质与例子7的产品相似。

例子11至16

这几个例子是试图通过各种不同的处理来使肉汤在醋酸盐型的IRA-68树脂中部分吸附。例子11采取的方法是肉汤先经过过滤然后用树脂处理。在例子12中，树脂首先用氯化钠溶液清洗。在例子13中，肉汤与辅助剂一同过滤。在例子14中除采用例子13的方法外，还让肉汤在pH＝4的条件下脱除蛋白质。在例子15中除采用例子13的方法外，还采用丙酮来使肉汤脱除蛋白质。在例子16中除采用例子14的方法外，还用丙酮将洗出液进行后处理。

例子耗量清洗洗出液产率纯度

11 30-40 0-5 10-15 5 不定

12 30 5-10 10-15 5 50-80

13 0-7 0-1 50 5-10 60-80

14 0-2 0 60-70 10-20 80

15 0-2 0 70 20-22 80-90

16 0-2 0 70 20-25 90-95

产率是指第一次收集的棒酸锂结晶体。最佳方法包括采用辅助剂进行过滤，在pH＝4.0的条件下脱除蛋白质以及在结晶之前用丙酮处理。

例子17和18

前述几个例子的方法可以进一步改进，其办法是首先使经过过滤的肉汤通过一个装有树脂IRA-68或IRA-68与AS-Z混合的予分离柱，然后在pH＝4.0的条件下脱除蛋白质或不脱除蛋白质，或用丙酮脱除蛋白质，然后用离子交换树脂直接吸附，这过程在前面已经讨论过。在例子17中，予分离柱的处理包括在例子13的程序中，而在例子17，在pH＝4时脱除蛋白质的过程与用丙酮进行后处理程序则包括在例子18的程序中。

例子耗量清洗洗出液产率纯度

13 0-7 0-1 50 5-10 60-80

17 5 0 40-50 10-20 80

18 0-2 0 50 20-30 90-95

在例子17和18中，树脂的吸附容量增加，最终产品的产率和纯度也比较高。

Claims

1、一种生产棒酸的方法，该方法利用存在于棒酸产物介质中的一定量的可同化碳源经过微生物S.Clavuligerus作用进行分批发酵，接着从发酵肉汤中精制棒酸，其特征在于所述的一定量的上述可同化碳源可连续地加入到所说的介质中，或者也可以分成小量间歇地加入，其中：

a)在发酵过程中以不同次数将所述的小量加入到培养基中，

b)各小量可同化碳源的总和等于上述的一定量的可同化碳源，

c)可同化碳源的含量维持低于2%(重量/体积)，

d)所述各小量可同化碳源加入到培养基中应能使该可同化碳源以0.5-1.5%(重量/体积)/天的速率掺入。

2、按照权利要求1所述的方法，其中在产生发酵期间碳含量维持在低于0.25%。

3、按照权利要求1或2所述的方法，其中碳源包括至少一种甘油和麦芽糖。

4、按照权利要求1所述的方法，其中碳源掺入速率大致为0.05%/小时。

5、按照权利要求1所述的方法，其中采用下列步骤将棒酸从溶液中精制出来：

（ⅰ）将溶解的不纯的棒酸与溶解的2-乙基己酸锂混合;

（ⅱ）分离棒酸锂;

（ⅲ）选择性地将锂盐转变为另一种盐或酯。

6、按照权利要求1所述的方法，其中采用离子交换树脂来精制棒酸。

7、按照权利要求1所述的方法，其中用过滤辅助剂处理发酵肉汤以便使菌丝体聚集起来。

8、按照权利要求1所述的方法，其中发酵肉汤要进行过滤并脱除蛋白质。