CN1017350B - 微生物发酵正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法 - Google Patents
微生物发酵正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法Info
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Abstract
一种利用微生物发酵正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是涉及高产十六碳二羧酸的方法。把一株热带假丝酵母UH-3-9(Gandidatropicalis UH-3-9)培养成的种母液接入PH值为5.5-9.0含有5-40%(V/V)10-18个碳原子的正烷烃和95-60%(V/V)发酵培养基的混合液中。上述混合物在24-34℃下维持48-144小时，然后将获得的α·ω-二羧酸进行分离提纯。
Description
本发明是利用微生物发酵从正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是高产十六碳二羧酸的方法。
长链二羧酸是一类重要的化工原料，可用来制造耐寒性增塑剂，工程塑料、树脂、涂料以及香料。特别是十六碳二羧酸，是制造环十五烷酮的重要原料，后者具有纯麝香香味、是一种高级麝香香料。
从七十年代起，各国利用微生物氧化正烷烃生产长链二羧酸的研究和应用取得了突破性进展，八十年代起进入了工业化生产阶段。1972年日本的内尾良辅等人在《农业·生物化学》杂志（Agr.Biol.Chem.Vol.36）“微生物利用正烷烃产生长链二羧酸”的文章中，报道了他们用阴沟假丝酵母MR-12菌株在1立升发酵罐中，用醋酸钠作生长碳源，加入15%（V/V）的正十六烷发酵72小时，得到63.3克/升的十六碳二羧酸，正十六烷的转化率为54%。1978年内尾又在《石油和微生物》杂志（《石油と微生物》NO.20，1978）报导了扩大试验的结果，在300立升罐里，醋酸作为生长碳源，正十六烷作为发酵碳源发酵68小时，得到54克/升，十六碳二羧酸，正十六烷转化率70%。这是目前十六碳二羧酸产量最高，规模最大的报导。1985年，日本植村等人在《石油和微生物》NO.33（石油と微生物》NO.33）上报导用热带假丝酵母的突变菌株M2030在3升罐上发酵94-113小时从9-18个碳的正烷烃（加入量30%V/V）分别产生相应的二羧酸，其中11-15个碳二羧酸的产量分别为62克/升。82克/升，96克/升，100克/升和90克/升，正烷烃转化率在30-45%之间，而十六碳二羧酸产量较低，每升不到50克。
本发明的目的是提供一种用热带假丝酵母从10-18个碳正烷烃发酵生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是高产十六碳二羧酸的方法。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母UH-3-9高产突变菌株（Candida tropiealis UH-3-9），是以一株两端氧化正烷烃生成长链二羧酸能力较强的热带假丝酵母（见《微生物学报》20（1）：88-93，1980）为出发菌株，通过硝基胍和紫外线多次诱变，选育出来的一株ω-氧化能力更强，同化正烷烃能力和β-氧化能力更弱的突变株。本发明所用的菌株保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNO.0129。
本发明的种母培养基有（1）10个巴林的麦芽汁加2%琼脂制成的固体斜面;（2）10个巴林的麦芽汁液体培养基;（3）烷烃液体培养基包含KH2PO46-8克/升，蔗糖2-4克/升，酵母膏2-4克/升，玉米浆2-4克/升，尿素2-4克/升，重蜡40-50毫升/升，消泡剂（甘油聚醚）约400ppm，自来水配制，pH值5左右。培养种母的过程为：取一接种环UH-3-9酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上（15×180试管，每
支装液量6-7ml，放成斜面）于28-30℃培养两天。取一支上述斜面菌种，接入30ml/250ml三角瓶的麦芽汁液体培养基或25ml/500ml三角瓶烷烃培养基，于28-30℃在200转/分的旋转摇床上培养36-48小时，作为发酵种母。
用本发明的高产突变菌株热带假丝酵母UH-3-9生产长链α·ω-二羧酸，特别是十六碳二羧酸的具体方法是：将发酵种母接入pH值为5.5-8.0含有5-40%（V/V），最好为10-25%（V/V）10-18个碳原子的正烷烃和95-60%（V/V），最好为90-75%（V/V）发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4-10克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，表面活性剂吐温60 0.1-2.0克/升及其它营养源。将上述混合液在24-34℃，最好是26-32℃下维持48-144小时，然后将产生的α·ω-二羧酸进行分离提纯，其具体做法是：发酵结束后的液体加热至80-90℃加NaOH把pH值调至10-12，然后用离心机离心，收集离心清液和残存烷烃，除去菌体。含有残存烷烃的离心清液，在20℃以下静置过夜，烷烃在表面形成白色固体块，回收再用，大量大颗粒的十六碳二羧酸钠盐结晶沉于底部，倾出上清液，收集钠盐结晶，清液浓缩用同法处理收集十六碳二羧酸钠盐。把十六碳二羧酸钠盐溶解于80-90℃热水中，加入浓HCl，调pH值至2-3，静置冷却结晶过夜。最后收集白色二羧酸结晶固体，在60℃烘烤至干。
碱金属磷酸盐在发酵培养中既作为磷源又作为一种缓冲剂成分，加入NaOH后，组成一个缓冲体系，维持发酵液适宜的pH值。其含量随培养基中其它成分而变化，较适宜的磷酸盐含量为6-8克/升，最好选择KH2PO4和Na2HPO4。尿素在培养基中含量要适宜，作为所用酵母菌的唯一氮源，尿素含量高些，对菌体生长有利，但过量尿素会降低细胞色素P450的容量，影响α·ω-二羧酸的生成，因此最适宜的尿素含量为0.8-1.2克/升。丙烯酸的存在，可阻断酵母菌对二羧酸的β-氧化降解，提高α·ω-二羧酸的产量，最适宜浓度为0.5-1.2毫升/升。少量表面活性剂的加入，有利于正烷烃和水的乳化，缩短适应期，加进菌体生长，提高二羧酸产量。较好的表面活性剂是吐温60，最适宜的含量为0.3-0.7克/升。其它营养源包括酵母膏、玉米浆、蔗糖等，它们的含量通常为0.5-3克/升。
发酵培养基用自来水配制，用NaOH调pH值至6.8-7.3。在通常情况下不必加Mg、Fe、Zu、Mn等金属元素，自来水中含有的微量就足够了。15磅灭菌30分钟。
用本发明的方法，可得到产量较高的10-18个碳α·ω-二羧酸。特别是十六碳α，ω-二羧酸，用16立升发酵罐，正十六烷投入量为20%（V/V），在适宜条件下发酵70小时，产酸最高达77.5克/升，而延长发酵时间到117小时，产酸量高达123克/升，转化率为79%，明显优于日本用阴沟假丝酵母突变株MR-12及热带假丝酵母突变株M2030所产生的十六碳二羧酸产量，后处理方法也较简单。
用气相色谱法对正烷烃发酵生产十六烷二羧酸进行定性和定量分析，分析条件为：柱温230℃，N235ml/分，H20.6kg/cm2，Ar0.2kg/cm2，气化室280℃。
图1、2、3以及表1可以证明十六烷发酵产生的二羧酸（用DC表示）是十六碳二羧酸（DC16），纯度为97.7%，图4表明所用的正十六烷原料的纯度为99.7%。
实施例
（1）取一接种环的UH-3-9菌体，涂布在15×180的大试管麦芽汁固体斜面上，共6支，28℃培养2天;（2）把上述培养2天的一支大斜面菌种，接入装30ml麦芽汁培养基的250ml三角瓶中，共6瓶，28℃，在200转/分的旋转摇床上培养2天;（3）把（2）中培养的麦芽汁种液2瓶，接入一个装500ml麦芽汁培养基的3000ml三角瓶中，共三瓶，在28℃120转/分的旋转摇床上培养43小时，（4）把（3）中培养的种液两瓶（约1000ml）接入一个装有10升发酵培养基的16升自动控制罐中，其中含有KH2PO480克。NaCl10克，酵母膏20克，玉米浆10克，丙烯酸10ml，尿素10克（溶于50ml水中，单独灭菌，接种前加入），消泡剂（甘油聚醚）10克，溶于7升自来水中，用NaOH调pH值至7.3，以及2000ml正十六烷，在121℃灭菌30分钟后，29-30℃时接种，（5）接种后，在29℃，搅拌速度
700-900转/分，通气量1∶1-1∶1.5，罐压10-15磅/厘米2的条件下培养发酵117小时。24小时内，繁殖菌体，到24小时用NaOH调一次pH值至7.0，40小时后再调一次pH值至7.5，从48小时开始，把pH值自动控制在7.7，直至发酵结束。测得十六碳二羧酸为123.4克/升，转化率达79%，（6）发酵结束后，加热升温至80-90℃，加NaOH溶液，调pH值至10以上，趁热离心去除菌体（已基本上没有残正十六烷），清液放置冷却过夜，大量大颗粒十六碳二羧酸钠盐结晶析出，倒出结晶母液（十六碳二羧酸还有1.8%），钠盐结晶用少量自来水洗，抽干，结晶母液蒸发浓缩为少量体积后，放置冷却结晶，收集十六碳二羧酸钠盐，合并待精制。每220克十六碳二羧酸钠盐（含水量约为55%），溶解于3升热水中（约90℃），加浓HCl调pH值至2-3，生成白色沉淀，放置冷却结晶过夜，抽滤干，在60℃烘干，得白色十六碳二羧酸91克。发酵液中十六碳二羧酸的分离精制总收率为80%左右。
图1.为标准二羧酸及发酵产物的色谱图
数据如下：
名称 时间 含量 MK 峰面积
1.2 0.3991 3537
1.72 0.2003 1775
2.12 8.9584 79397
2.63 8.399 ∨ 74438
3.3 16.2976 ∨ 144442
4.19 13.2711 ∨ 117619
5.37 1.2669 11229
6.94 51.2071 453836
总量 99.9999 886275
图2.为正十六烷发酵生产十六烷二羧酸的纯度分析数据如下：
名称 时间 含量 MK 峰面积
1.71 0.0262 133
2.1 0.098 499
2.35 0.0634 323
2.62 0.1113 567
2.97 0.1165 593
3.3 0.6172 ∨ 3143
4.18 0.6772 3448
4.86 0.0564 287
5.35 0.5139 2617
6.91 97.7194 497647
总量 99.9999 509261
图3.二羧酸碳数规律图
说明：图3是根据图1的色谱结果，按图1的出峰时间，进行碳数规律作图。
图4.发酵原料正十六烷纯度分析
数据如下：
名称 时间 含量 MK 峰面积
1.06 0.0005 38
1.48 0.0205 1547
1.84 0.0065 489
2.35 99.9724 7521908
总量 100 7523983
Claims (5)
1、一种利用微生物发酵生产长链α·ω-二羧酸的方法，其特征在于：
(1)把用一株热带假丝酵母UH-3-9(Candida tropicalis UH-3-9中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNO.0129)培养成的种母液接入pH值为5.5-9.0含有5-40%(V/V)16个碳原子的正烷烃和95-60%(V/V)发酵培养基的混合液中，发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4-12克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，表面活性剂吐温60 0.1-2.0克/升及其它营养源；
(2)上述混合物在24-34℃下维持48-144小时，然后将产生的α·ω-二羧酸进行分离提纯。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于混合液中正烷烃的含量为10-25%（V/V），发酵培养基含量90-75%（V/V）。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵培养基的组成中：碱金属磷酸盐6-8克/升，尿素0.8-1.2克/升，丙烯酸0.5-1.2毫升/升，表面活性剂吐温600.3-0.7克/升。
4、根据权利要求1，3所述的方法，其特征是碱金属磷酸盐最好是KH2PO4和Na2HPO4。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征是发酵混合液的温度控制在26-32℃，pH值为6.5-8。
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