CN1259424C - 一种提高长链二元酸发酵产率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高长链二元酸发酵产率的方法。本发明方法以C10～C18正构烷烃为原料，用微生物发酵法生产相应二元酸，主要特点为在发酵生产过程中加入抑制剂来减弱菌株的β-氧化能力，抑制剂包括C5～C18卤代脂肪酸、甲基脂肪酸及其盐或酯中的一种或几种，抑制剂浓度为0.01～5mmol/L。本发明方法加入的抑制剂可以有效减弱菌株的β-氧化能力，降低了烷烃消耗，使发酵产率有较大提高，产酸速度快，特别适于制取长链二元酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高长链二元酸发酵产率的方法，特别适于发酵法制取C10～C18长链二元酸的过程。
背景技术
长链二元酸是一种重要的精细化工原料，可用于合成香料、热熔胶、工程塑料和液晶等，应用非常广泛。
目前，长链二元酸主要利用微生物发酵法生产，利用微生物双末端氧化的特殊功能发酵正构烷烃制取长链二元酸。由微生物氧化烷烃生成长链二元酸的机理研究可知，其主反应是ω-氧化，副反应是β-氧化，生成的产物长链二元酸可被进一步氧化降解。虽然目前国内外生产菌株的ω-氧化能力较强，产酸最高可达200g/L，但在生产长链二元酸过程中面临的一个首要问题是发酵产率低，一般烷烃对长链二元酸的分子转化率只有50～60％，因此造成了原材料的大量消耗，生产成本过高。由于高生产成本已成为高档热熔胶、高级航空润滑油和特性工程塑料等下游产品开发的限制因素。如何减弱菌种的β-氧化能力，阻断或缓解长链二元酸进一步降解是提高发酵产率、减少烷烃消耗、降低生产成本的关键。为此，研究人员从菌种选育、发酵条件及代谢调控等方面开展了大量的研究工作，以提高发酵水平。
WO 91/06660公开了一种利用基因工程技术，构建工程菌发酵生产二元酸的方法。它对发酵菌种C.tropicalis基因组进行了专门修饰，导致β-氧化相关的基因POX4和POX5缺失，使其β-氧化途径阻断，可高效生产长链二元酸。中国专利CN1233658A公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选方法。该方法能快速而高效的获得α、ω-氧化增强的假丝酵母突变株，为提高产酸量和转化率打下基础。中国专利CN1257126A公开了一种利用一株难以利用正构烷烃作生长碳源的热带假丝酵母突变株FP-UV-56氧化C10～C18正构烷烃生产α，ω-长链二元酸的方法，同时采用双底物发酵使产酸量和转化率均有提高。
中国专利CN1130685A、CN1162644A、CN1369564A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A分别公开了通过硝基胍、亚硝酸和紫外线多次反复诱变，选育出ω-氧化能力更强的热带假丝酵母突变菌株，并以烷烃作生长碳源，氧化正构烷烃生产长链二元酸的方法。这些菌株对应十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸有一定效果。
上述方法主要从菌种改良方面来提高发酵产率，而菌种改良的工作量大，不确定因素多，发酵产率仍需进一步提高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种简单易行的提高二元酸发酵产率的方法。
本发明提高二元酸发酵产率方法为在常规的发酵法生产C10～C18长链二元酸的过程中，加入抑制剂来减弱菌株的β-氧化能力，降低了烷烃消耗，使发酵产率有较大提高。抑制剂主要有C5～C18卤代脂肪酸、C5～C18甲基脂肪酸及上述酸的盐或酯等中的一种或几种。卤代脂肪酸可以选自溴代辛烷酸、10-溴代癸酸、11-溴代十一酸、溴代己酸甲酯、2-溴代己酸、6，8-二氯代辛酸乙酯、溴代月桂酸酯、碘代棕榈酸、溴代棕榈酸酯等中的一种或几种。甲基脂肪酸可以选自15-甲基棕榈酸、4-甲基壬酸、3-甲基辛酸甲酯、2-甲基戊酸、甲基月桂酸等中的一种或几种。卤代脂肪酸及甲基脂肪酸盐可以选自所述酸的钠盐、钾盐等中的一种或几种。卤代脂肪酸及甲基脂肪酸酯可以选自所述酸与C1～C3一元醇反应得到的酯类的一种或几种。抑制剂浓度为0.01～5mmol/L，以0.05～2.0mmol/L为好。抑制剂可以在菌体培养初期加入，也可以在转入产酸期时加入。
本发明涉及的发酵法生产长链二元酸的其它条件，如菌体的选育和培养、发酵过程的原料及条件等，可以与现有技术相同。下面介绍一种常规较理想的情况。
本发明所用菌种为可使C10～C18正构烷烃发酵得到相应碳数的二元酸的微生物菌种。如热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变株PF-UV-56，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.0356，同时也适用于具有β-氧化酶系的可发酵生产长链二元酸的其它类型菌株。
本发明制取长链二元酸的具体方法是：
1、取一接种环FP-UV-56酵母菌，涂布在无菌的麦芽汁固体斜面培养基上，于29～32℃培养40～48小时。
2、取一支步骤1培养好的斜面菌种，接入经121℃，20min灭菌后装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，在180转/分旋转摇床上于29～32℃培养30～48小时，作摇瓶种子液。
3、取一定体积培养好的无杂菌的种子液接种至含有发酵培养基的三角摇瓶中，在180转/分旋转摇床上于29～32℃培养20～40小时，这期间主要消耗糖质来迅速繁殖菌体。待糖质消耗后，上调pH值并加入正构烷烃，转入发酵产酸期。在产酸期，根据发酵时间延长及二元酸积累量的增加逐渐上调pH值，其变化范围为7.0～8.5。正构烷烃(nC)采取每隔12～36小时按5％(v/v)分批补加，以发酵混合液初始体积为准，烷烃总加入量为5～20％(v/v)，总培养时间为3～4天。分别采用了生长细胞和休止细胞两种发酵方式。
上述方法所涉及培养基为：
(1)斜面培养基：10Brix麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面。
(2)种子和发酵培养基(g/L)：糖质10～40，金属磷酸盐2～10，酵母膏1～3，玉米浆1～3，尿素1～4，NaCl 0.5～1.5，MgSO4·7H2O 0.5～3，铵盐2～8，维生素B1 20～200ppm，正构烷烃(nC)10～50ml/L，自来水配制，自然pH。
糖质可以是葡萄糖、蔗糖等；金属磷酸盐可以是钾盐或钠盐；铵盐可以是(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4或CH3COONH4；正构烷烃可以是C10～C18烷烃，特别是C12～C16正构烷烃。
本发明在正构烷烃发酵生产相应碳数二元酸过程中，加入抑制剂来减弱菌株的β-氧化能力，降低了烷烃消耗，使发酵产率有较大提高。与现有技术相比，本发明具有产酸速度快、β-氧化弱、烷烃消耗少、发酵产率高的特点，特别适于制取长链二元酸。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明的方法和效果。
实施例1
(1)取一接种环FP-UV-56菌种，涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于30℃培养48小时。
(2)将(1)培养好的菌种接入装有50mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，于30℃在180转/分的旋转摇床上培养40小时。培养基组成为(g/L)：葡萄糖30，KH2PO4 6，酵母膏1，玉米浆1，尿素2，NaCl 1，MgSO4.7H2O 0.5，VB1 0.1，正十三烷(nC13)20mL/L，自来水配制，自然pH。
(3)在装有50mL发酵培养基的500mL三角摇瓶中，接入5mL上述种子液，同时加入0.5mmol/L的抑制剂2-溴代辛烷酸(2-Bromooctanoic acid，简称BA)，并且做3个平行样，在180转/分的旋转摇床上于30℃发酵4天。发酵培养基为(g/L)：葡萄糖30，KH2PO4 4，酵母膏1，玉米浆1，尿素1(分消)，NaCl1，MgSO4.7H2O 0.5和(NH4)2SO4 5(分消)，VB1 0.05，nC13 50mL/L，自来水配制，自然pH，在121℃下灭菌20分钟。发酵期间每12小时用5N NaOH调pH值至7.5～8.2。发酵基质为nC13，总加入量为15％(v/v)。发酵结束后，取1mL发酵液以肉豆蔻酸作内标，经酸化、乙醚萃取、去乙醚、用甲醇溶解，三氟化硼作催化剂于80℃左右酯化，再用正己烷萃取后用气相色谱分析酸含量。另取1mL发酵液，按残烃含量与内标比约1∶1加入nC15，并用正己烷萃取后用气相色谱分析残烃含量，通过计算得出发酵产率，结果见表1。
实施例2
按实施例1的方法，但以抑制剂15-甲基棕榈酸甲酯(15-Methylpalmitic acidmethyl ester简称ME)替代BA，在摇瓶接种时加入，浓度为1mmol/L，发酵基质为nC14，加入量为10％(v/v)，发酵3天。发酵结束后，用实施例1方法测定二元酸及残余烷烃，经计算得出发酵产率，结果见表1。
实施例3
按实施例1的方法，但以抑制剂11-溴代十一酸(11-Bromoundecane acid简称BD)替代BA，并在菌体培养40小时时加入，浓度为0.05mmol/L，发酵基质为nC15，加入量为15％(v/v)，发酵4天。发酵结束后，用实施例1方法测定二元酸及残余烷烃，经计算得出发酵产率，结果见表1。
实施例4
按实施例1的培养方法，在菌体培养40小时时将培养液以4000转/分速度离心10分钟去清液，并用1/15M磷酸缓冲液(pH6.8)洗涤菌体，然后再加入50mL该缓冲液及5mmol/L抑制剂溴代棕榈酸乙酯(Bromoopalmitate，简称BP)，继续培养1小时后再离心。然后加入1/15M磷酸缓冲液(pH8.0)及10％(v/v)发酵基质正nC16。在产酸期pH值变化范围为7.0～8.5，发酵产酸3天。发酵结束后，用实施例1方法测定二元酸及残余烷烃，经计算得出发酵产率，结果见表1。
实施例5
按实施例1的培养方法，在接种时加入0.5mmol/L抑制剂甲基棕榈酸钠盐(Methylpalmitate，简称MP)，培养40小时后将培养液以4000转/分速度离心10分钟去清液，并用1/15M磷酸缓冲液(pH7.4～8.5)洗涤菌体，然后再加入50mL该缓冲液、1mmol/L抑制剂甲基戊酸(Methyl valeric acid，简称MA)及10％(v/v)发酵基质nC12。在产酸期pH值变化范围为7.0～8.5，发酵产酸3天。发酵结束后，用实施例1方法测定二元酸及残余烷烃，经计算得出发酵产率，结果见表1。
比较例
按实施例1的培养方法，但不加抑制剂。在菌体培养40小时时转入产酸期，发酵基质为nC13发酵4天。发酵结束后，用实施例1方法测定二元酸及残余烷烃，经计算得出发酵产率，结果见表1。
表1各实施例结果
| 实施例 | 发酵基质 | 抑制剂名称 | 加入方式 | 发酵产率(％) |
| 1 | nC13 | BA | 接种时加入，生长细胞发酵 | 161 |
| 2 | nC14 | ME | 接种时加入，生长细胞发酵 | 140 |
| 3 | nC15 | BD | 产酸期加入，生长细胞发酵 | 106 |
| 4 | nC16 | BP | 培养40小时加入，休止细胞发酵 | 117 |
| 5 | nC12 | MP and MA | 接种时加入15-MS产酸期再加入2-MA休止细胞发酵 | 111 |
| 比较例 | 正nC13 | 不加抑制剂 | 生长细胞发酵 | 100 |
(注：以比较例的发酵产率为100％，各实施例与之相比)
Claims (9)
1、一种提高长链二元酸发酵产率的方法，包括以C10～C18正构烷烃为原料，用微生物发酵法生产相应二元酸，其特征在于在发酵生产过程中加入抑制剂来减弱菌株的β-氧化能力，抑制剂包括C5～C18卤代脂肪酸、C5～C18甲基脂肪酸及上述酸的盐或酯中的一种或几种，抑制剂浓度为0.01～5mmol/L；其中所述的微生物菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变株PF-UV-56，保藏编号为CGMCC NO.0356。
2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制剂选自溴代辛烷酸、10-溴代癸酸、11-溴代十一酸、溴代己酸甲酯、2-溴代己酸、6，8-二氯代辛酸乙酯、溴代月桂酸酯、碘代棕榈酸、溴代棕榈酸酯、15-甲基棕榈酸、4-甲基壬酸、3-甲基辛酸甲酯、甲基戊酸、上述酸类钠盐、上述酸类钾盐、上述酸与C1～C3一元醇反应的酯。
3、按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的抑制剂的加入浓度为0.05～2.0mmol/L。
4、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制剂在菌体培养初期加入或在转入产酸期时加入。
5、按照权利要求1所述的方法，其特征在于微生物发酵法制取长链二元酸的过程为：
(1)取一接种环FP-UV-56酵母菌，涂布在无菌的麦芽汁固体斜面培养基上，于29～32℃培养40～48小时；
(2)取一支步骤(1)培养好的斜面菌种，接入经121℃，20min灭菌后装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，在180转/分旋转摇床上于29～32℃培养30～48小时，作摇瓶种子液；
(3)取一定体积培养好的无杂菌的种子液接种至含有发酵培养基的三角摇瓶中，在180转/分旋转摇床上于29～32℃培养20～40小时，然后上调pH值并加入正构烷烃，转入产酸期；正烷烃采取每隔12～36小时按5％(v/v)分批补加，以发酵混合液初始体积为准，总加入量为5％～20％(v/v)，总培养时间为3～4天。
6、按照权利要求5所述的方法，其特征在于所述的斜面培养基为：10Brix麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面。
7、按照权利要求5所述的方法，其特征在于所述的种子和发酵培养基为：糖质10～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏1～3g/L，玉米浆1～3g/L，尿素1～4g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～3g/L，铵盐2～8g/L，VB1 20～200ppm，正构烷烃10～50ml/L。
8、按照权利要求7所述的方法，其特征在于所述的糖质是葡萄糖、蔗糖或半乳糖；金属磷酸盐是钾盐或钠盐；铵盐是(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4或CH3COONH4；正构烷烃是C10～C18直链烷烃。
9、按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的正构烷烃是C12～C16正构烷烃。
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