CN112011579B

CN112011579B - 一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法

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Publication number: CN112011579B
Application number: CN201910453128.6A
Authority: CN
Inventors: 周豪宏; 徐敏; 刘修才; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN112011579A

Abstract

本发明提供了一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法，本发明通过抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因或其同源基因的表达量和/或活性，并利用改造后的工程菌进行长链二元酸的发酵生产。改造后的工程菌与改造前的长链二元酸生产菌株相比，极大地提高了目标碳链长度的长链二元酸的提取纯化效率，降低生产成本，节约了能耗，为制备高纯度的长链二元酸产品及提高下游产品的质量提供了新方法。

Description

一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法

技术领域

本发明涉及基因工程改造及微生物发酵技术领域，具体涉及一种在二元酸生产中降低非目标碳链长度的二元酸杂质的方法。

背景技术

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。长链二元酸作为重要的单体原料，广泛用于合成聚酰胺、热熔胶、粉末涂料、防腐剂、香料、润滑剂、塑化剂等。长期以来，长链二元酸经由石油通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法面临多种挑战，化学合成法得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物，因此需要复杂的后续提取步骤，对于生产工艺和生产成本而言，都是巨大的障碍。采用微生物发酵技术生产长链二元酸，因其产生的污染少、环境友好、能够合成化学合成方法难以合成的产物如12碳以上的长链二元酸且纯度高等特点，较传统的化学合成法具有明显的优势。

尽管微生物发酵法生产长链二元酸较传统化学法产生的二元酸纯度高，但发酵过程中由于中间代谢产物的运输和氧化速率的协调性可能会导致代谢副产物累积，例如会导致非目标碳链长度的二元酸杂质产生，给后期产品的提取纯化带来严峻的挑战，并影响下游产品的质量。当从发酵液中提取发酵获得的目标长链二元酸时，极难通过一般分离纯化工艺去除上面提及的杂质，因此降低产品中非目标碳链长度的杂质二元酸的含量成为生物合成法面临的重要课题，亟需开发能够有效降低非目标碳链长度二元酸杂酸含量的菌株和发酵生产方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于采用基因工程的手段，对脂肪酸合成途径进行遗传改造，以减少不必要非目标长度长链二元酸杂质的产生。本发明的另一目的在于提供发酵生产长链二元酸的菌株及其构建方法与应用。

由于长链二元酸合成的代谢途径的特性，氧化过程在长链二元酸的合成中具有高度的复杂性，在菌株细胞内存在复杂的调控网络和机制。长链二元酸生产过程中，脂肪酸与长链二元酸在过氧化物酶体中可经过β-氧化产生乙酰辅酶A，乙酰辅酶A通过柠檬酸-丙酮酸循环可以跨膜运输至细胞质，经过活化成乙酰ACP和羧化为丙二酸单酰辅酶A后，进入脂肪酸从头合成途径。在酵母细胞中，脂肪酸从头合成由脂肪酸合成酶FAS(Fatty AcidSynthetase)催化，FAS由FAS1和FAS2分别编码的具有多个功能域的β-和α-亚基组成。细胞质中乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A的含量比率会影响合成的脂肪酸链的长度。不同长度的脂肪酸重新经过ω-氧化最终成为相应链长的二元酸。

发明人发现，通过基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因，改造生产菌株脂肪酸合成途径，能够显著减少不必要非目标长度二元酸杂质的产生。

首先，本发明提供了一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法，通过抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因或其同源基因的表达量和/或活性，并利用改造后的长链二元酸生产菌株(工程菌)进行长链二元酸的发酵生产。

不同微生物中FAS2基因在Genbank中的登录号分别为Saccharomyces cerevisiae(PTN40466)、Candida tropicalis MYA3404(XP_002548204)、Candida viswanathii(RCK64589)以及Candida albicans(KGU30720)。FAS2基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基替换、缺失或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

优选地，本发明提供的一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法，是通过基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因或其同源基因，或将菌株中FAS2基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件，使长链二元酸生产菌株中FAS2的表达量显著降低，并利用改造后的长链二元酸生产菌株(工程菌)进行长链二元酸的发酵生产。

所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选地，选自C9～C18的长链二元酸，更优选地，选自癸二酸、十二碳二元酸、十四碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。

在一些实施方案中，在生产十碳二元酸时，可能会产生的二元酸杂质包括十二碳二元酸和十四碳二元酸；在生产十二碳长链二元酸时，可能会产生的二元酸杂质包括十四碳二元酸和十六碳二元酸。

进一步地，本发明提供了一种生产长链二元酸的工程菌，所述工程菌是通过抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因或其同源基因的表达量和/或活性得到的。

优选地，本发明提供的一种生产长链二元酸的工程菌是利用基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因或其同源基因，或将菌株中FAS2基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件使长链二元酸生产菌株中FAS2的表达量显著降低，而得到的工程菌。

所述长链二元酸生产菌株选自棒状杆菌属(Corynebacterium)、白地霉菌属(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyce)、耶氏酵母属(Yarrowia)中的菌种；优选假丝酵母属菌种；更优选热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

优选地，本发明提供的一种生产长链二元酸的工程菌是通过同源重组方法敲除保藏号为CCTCC NO：M 2011192或CCTCC NO：M 203052的热带假丝酵母(Candida tropicalis)基因组内一个拷贝的FAS2基因而得到。

另一方面，本发明提供了所述的工程菌的构建方法，该方法通过抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因或其同源基因的表达量和/或活性而得到。

进一步地，本发明提供的上述工程菌的构建方法是将长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因或其同源基因敲除，或将菌株中FAS2基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件使长链二元酸生产菌株中FAS2的表达量显著降低，得到所述的工程菌。

本发明中，所述转录或翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点(RBS)、增强子、弱化子、衰减子、5’-UTR、3’-UTR等调控基因表达水平的元件。

本发明中，所述低活性的调控元件为与原始的调控元件相比，调控活性降低的元件。

本发明的工程菌适用于生产C9～C22长链二元酸，优选C9～C18长链二元酸。

本发明中，所述工程菌为能够将包括长链烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种的底物转化为长链二元酸的菌株。

利用所述产长链二元酸的工程菌生产长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有的非目标碳链长度二元酸杂质的总含量显著下降，所述质量比率为发酵液中非目标碳链长度二元酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

当使用本发明的工程菌发酵生产十碳长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有的十二碳二元酸的含量降至1.0％以下，十四碳二元酸的含量降至0.2％以下。

当使用本发明的工程菌发酵法生产十二碳长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中发酵生产的长链二元酸含有的十四碳二元酸的含量降至1.0％以下，十六碳二元酸的含量降至0.2％以下。

本发明还提供了所述工程菌在长链二元酸发酵生产中，降低非目标碳链长度二元酸含量、或提高目标碳链长度二元酸纯度中的应用。

本发明提供一种长链二元酸的生产方法，以C9～C22的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种为发酵底物，发酵所述的工程菌，以生产长链二元酸。

本发明中，所述发酵底物优选为C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。

上述生产方法中，所述的长链二元酸，包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，进而优选包括癸二酸、十二碳二元酸、十四碳二元酸、十六碳二元酸、十八碳二元酸中的一种或多种。

上述生产方法中，发酵结束后的发酵液中含有的单一的非目标碳链长度二元酸杂质含量降至1.0％以下，优选降至0.2％以下。

上述生产方法中，发酵温度28-32℃；发酵pH为5.0-7.8。

本发明的上述生产方法中，所述发酵采用的发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐。

所述碳源选自葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)，如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

所述氮源选自蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或所述氮源的总添加量为0.1％～4％(w/v)，如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％、2.9％、3.5％。

所述无机盐选自硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或所述无机盐的总添加量为0.1％～1.5％(w/v)，如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

作为本发明的优选实施方式，种子培养基可以包括以下成分:蔗糖1.0％～3.0％、尿素0.1％～0.5％、酵母膏0.1％～1.0％、玉米浆0.2％～1.0％及磷酸二氢钾0.4％～1.2％。优选当种子液菌体光密度(OD₆₂₀)达到0.5(稀释30倍)以上时，将种子液接入发酵培养基中进行发酵转化，接种量可以为10％～30％(v/v)。

在本发明的一些优选实施方式中，所述接种量可以为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。

在本发明的一些优选实施方式中，发酵培养基可以包括以下成分：葡萄糖2.0％～5.0％、酵母膏0.1％～1.0％、玉米浆0.2％～1.0％、硝酸钾0.1％～1％、磷酸二氢钾0.1％～1.0％及硫酸铵0.1％～0.5％(w/v)。

在本发明的一些优选实施方式中，可以在种子培养基和发酵培养基中先加入所述发酵底物，也可以在发酵过程中再加入所述发酵底物。

本发明还提供了一种根据上述方法制备获得的长链二元酸发酵液，其中非目标碳链长度的二元酸杂质与使用未改造的工程菌相比显著降低。

如无其他说明，本发明OD₆₂₀值均为稀释30倍时检测。

一般情况下，发酵结束后获得的长链二元酸发酵液中可能包含水分、长链二元酸盐、菌体和其它杂质。发酵过程中产生的发酵处理液可以是对发酵液进行加碱调节、脱色、分离等步骤处理后获得的混合溶液，如膜清液。所述发酵处理液可以包括菌体，也可以不包括菌体。

在本发明的一些优选实施方式中，将长链二元酸从发酵液或发酵处理液中分离提纯，具体方法可以参考中国发明专利公开号CN1292072C和CN104418725B中记载的发酵液预处理、精制等方法，以获得长链二元酸最终产品。

本发明通过抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因或其同源基因的表达，使改造后的菌株在发酵生产长链二元酸时大大降低了非目标碳链长度的二元酸杂质，极大地降低了后期的提取纯化工艺的难度和成本，进而有利于提高长链二元酸下游产品的质量和性能。

附图说明

图1为实施例1中采用同源重组的方法敲除一个拷贝的FAS2基因的示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

按照发酵领域常识，发酵培养基的原料添加量的百分比为质量体积比，即w/v；％表示g/100mL。

同源基因是指序列相似性达70％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。本发明中所指的FAS2的同源基因既可以是FAS2基因的直向同源基因，也可以是其横向同源基因或异源同源基因。

序列同一性是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸变体与本文所述的多核苷酸具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的多核苷酸或多肽同源性。

PCR重叠延伸是指通过设计具有互补末端的引物，通过PCR扩增将不同DNA片段拼接到一起的方法。

同源重组是指依赖于序列相似性的DNA分子之间的重组，最常见于细胞内用于修复有丝分裂期间产生的突变。同源重组技术已广泛应用于基因组编辑，包括基因敲除、基因修复以及向特定位点引入新的基因等。以酿酒酵母为代表的一类微生物，其细胞内发生同源重组的几率非常高，不依赖于序列特异性，在基因组编辑方面具有明显的优势。而位点特异性重组，依赖于特异性位点和位点特异性重组酶参与，重组仅发生于特异的位点之间，如Cre/loxP、FLP/FRT等。本发明使用的同源重组技术不属于位点特异性重组，重组依赖于细胞内的DNA修复系统。

抗性标记是指选择性标记的一种，其往往携带有赋予转化子在抗生素存在的条件下得以生存的能力。所述抗性标记基因包括NPT、HYG、BLA及CAT等，分别可以抗卡那霉素、潮霉素、氨苄/羧苄青霉素以及氯霉素等。优选的，所述抗性标记基因是潮霉素抗性基因HYG。

以下实施例中使用的菌株：

(1)出发菌株热带假丝酵母菌株CAT N145(中国专利CN102839133A，菌种保藏号为CCTCC NO:M2011192)；

(2)出发菌株热带假丝酵母菌株ES9-66(中国专利CN1285766C，菌种保藏号为CCTCC NO:M203052)。

以下实施例中长链二元酸的检测采用气相色谱法(GC)，具体方法如下：

(1)发酵液中产物及杂质含量检测：发酵液经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测(内标法)，色谱条件如下：

色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据二元酸产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行二元酸产量计算，根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。

(2)固体产品纯度及杂质含量检测：固体样品经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测(归一法)，

色谱条件：色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

分别根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。

以下实施例中采用的培养基配方如下：

(1)YPD培养基(w/v)：蛋白胨2％，葡萄糖2％和酵母提取物(总氮含量8.5wt％)1％。

(2)种子培养基(w/v)：蔗糖2.0％、尿素0.3％、酵母膏(总氮含量10wt％)0.5％、玉米浆(总氮含量3.0wt％)0.4％、磷酸二氢钾0.8％。

(3)发酵培养基(w/v)：葡萄糖3.0％、酵母膏(总氮含量5wt％)0.8％、玉米浆(总氮含量4.5wt％)0.6％、硝酸钾0.5％、磷酸二氢钾0.5％及硫酸铵0.3％。发酵培养基中加入发酵底物正十二烷或正十烷200～400mL/L。发酵过程使用1N HCl和1N NaOH控制发酵液pH值为7.5～7.6。

实施例1长链二元酸生产菌株的构建

1、FAS2基因的克隆

(1)总RNA提取与转录组测序

挑取热带假丝酵母菌株CAT N145的单菌落接种于含有1mlYPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的10ml试管中，常规方法增菌后收集菌液。RNA提取采用TRNzol universalReagen(Tiangen)试剂盒，并辅以液氮研磨破碎细胞。转录组测序采用Miseq(Illumina)平台，采用双端测序的方法，得到22M长度为2 x 251bp的Reads。测得的Read去除接头并用CutAadpt过滤低质量的碱基和Reads后，用Trinity软件(http://trinityrnaseq.sf.net)组装得到Unigene，并用NCBI的Non-Redundant蛋白质数据库进行功能注释。

(2)生物信息学分析

采用本地Blast(Blast+2.7.1)的方法对所得到的Unigene建库并用已知来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis MYA3404)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)以及白色念珠菌(Candida albicans)的甘油三磷酸酰基转移酶基因做query，通过tblastn搜索比对候选基因。最终通过分析筛选到一个候选FAS2基因，其部分CDS序列如SEQ ID NO.1所示。不同微生物中FAS2基因在Genbank中的登录号分别为Saccharomyces cerevisiae(PTN40466)、Candida tropicalis MYA3404(XP_002548204)、Candida viswanathii(RCK64589)以及Candida albicans(KGU30720)。

2、同源重组模板的制备

本实施例中所有DNA片段均使用Takara公司

HS高保真DNA聚合酶(Takara,R040A)扩增得到。1％琼脂糖凝胶电泳后用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)回收纯化DNA片段。

(1)FAS2基因上下游同源臂的扩增

热带假丝酵母CAT N145基因组DNA提取采用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(生工，货号518257)，并辅以液氮研磨的方法提高破壁效率。每50μL反应体系加入1μg基因组作为模板进行PCR扩增。

上游同源臂扩增所用引物为：

FAS_UP-F：

5’-ACTCAAAGGACGCCAAGGAG-3’(SEQ ID NO.2)

FAS_UP-R:

5’-TTCTGCAAAACAGCGGAAGC-3’(SEQ ID NO.3)

下游同源臂扩增所用引物为：

FAS_DOWN-F：

5’-GGCCTGGATCATGGGTTTCA-3’(SEQ ID NO.4)

FAS_DOWN-R:

5’-CTCCTTTGGAGTTCTGCCGT-3’(SEQ ID NO.5)

PCR扩增，获得的产物称为FAS_UP和FAS_DOWN经测序证实无误，其序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。

(2)抗性筛选标记(HYG，即潮霉素抗性基因)的扩增，扩增模板为本公司所有的载体pCIB2(SEQ ID NO.8)，引物序列：

FAS_HYG-F：

5’-GCTTCCGCTGTTTTGCAGAAGCATGCGAACCCGAAAATGG-3’(SEQ ID NO.9)

FAS_HYG-R：

5’-TGAAACCCATGATCCAGGCCGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’(SEQ ID NO.10)

PCR扩增，获得的产物称为HYG，经测序证实无误，如SEQ ID NO.11所示。

(3)PCR重叠延伸得到完整的重组模板

将上述SEQ NO.6、7和11共3条回收纯化的PCR片段进行重叠延伸，得到同源重组模板，并回收纯化。具体方法如下：

加入等摩尔量的FAS_UP、FAS_DOWN和HYG片段作为模板，引物为FAS_UP-F和FAS_Down-R，用

HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，PCR反应产物凝胶电泳后进行回收纯化大小约为3.6Kb的重组片段，其序列如SEQ ID NO.12所示。敲除一个拷贝FAS2基因的示意图见图1。

3、重组转化子的转化与筛选

酵母电转化制备感受态细胞，酵母感受态电击转化，收集菌液后涂布含有100mg/L潮霉素B的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。挑取获取的单菌落接种于含有1ml YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的10ml试管中，培养温度31℃，摇床转速220rpm培养24小时。进行菌落PCR鉴定，鉴定FAS2基因的引物序列如下：

FAS-1F:5’-AGAAGACCAACGAAGGCTGG-3’(SEQ ID NO.13)

FAS-1R:5’-ATTGAGCTGGTCTGGTGTCG-3’(SEQ ID NO.14)

鉴定同源重组的引物序列如下：

HYG-2F:5’-ATGCTCCGCATTGGTCTTGA-3’(SEQ ID NO.15)

FAS-2R:5’-ACACTTGTCACCGTGTTCGT-3’(SEQ ID NO.16)

上述两组PCR引物扩增均为阳性的菌株即为一个拷贝的FAS2基因被敲除的菌株，记为菌株662，即构建得到本发明的长链二元酸生产菌株。

实施例2重组菌株662发酵生产十二碳长碳链二元酸

挑取菌株662的单菌落接种于含有1ml YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的10ml试管中，培养温度31℃，摇床转速220rpm培养24小时。取上述菌液接入含有25ml的种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为7％，摇床转速220rpm、培养温度31℃培养至OD₆₂₀达到0.8时。将种子液接入装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，发酵培养基中底物为250mL/L正十二烷。在31℃、250rpm摇床培养至发酵结束，培养过程中控制pH为7.5～7.6。并以菌株CAT N145作为对照组：培养和发酵方法与实施例1构建菌株662相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，进行GC检测，计算十二碳二元酸含量以及十四碳二元酸和十六碳二元酸的杂质质量比率(杂质质量比为发酵液中杂质占目标长链二元酸的质量百分比)，结果如下表1所示。

表1

菌株	CAT N145	662
			十二碳二元酸产量(mg/g)	129.8	133.4
十四碳二元酸(％)	1.83	0.58
			十六碳二元酸(％)	0.27	0.09

由表1可知，与对照组相比，敲除一个拷贝的FAS2基因的菌株662获得的发酵液中十四碳二元酸和十六碳二元酸占十二碳二元酸的质量比率均显著降低。

实施例3菌株662发酵生产十碳长链二元酸

发酵方法与实施例2相同，区别在于，发酵培养基中底物为250mL/L正十烷。并以菌株CAT N145作为对照组：除培养基不含潮霉素B外，培养和发酵方法与菌株662相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，进行GC检测，计算十碳二元酸含量以及十二碳二元酸和十四碳二元酸的杂质质量比率(杂质质量比为发酵液中杂质占目标长链二元酸的质量百分比)，结果如下表2所示。

表2

菌株	CAT N145	662
			十碳二元酸产量(mg/g)	109.6	112.5
十二碳二元酸(％)	1.21	0.60
			十四碳二元酸(％)	0.35	0.11

由上表可知，与对照组相比，敲除一个拷贝的FAS2基因的菌株获得的发酵液中十二碳二元酸和十四碳二元酸占十碳二元酸的质量比率均显著降低。

实施例4重组菌株663发酵生产十二碳长碳链二元酸

将实施例1所述SEQ ID NO:12的DNA片段同源重组入热带假丝酵母ES9-66，获得一个拷贝的FAS2基因被敲除的重组菌株及筛选方法的方法同实施例1，筛选得到的阳性株菌命名为663。

发酵方法同实施例2，所用菌株为ES9-66(对照组)和663，发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品，计算十二碳二元酸产量与杂质含量，如表3所示。结果表明，与亲代菌株ES9-66相比，两种杂质含量均有显著下降。

表3

菌株	ES9-66	663
			十二碳二元酸产量(mg/g)	112.5	114.1
十四碳二元酸(％)	1.53	0.50
			十六碳二元酸(％)	0.18	0.06

从上述针对不同的发酵底物发酵生产长链二元酸的实施例2-4中可以看出，发酵后的发酵液中非目标碳链长度二元酸杂质的含量，与亲代菌株相比，均有明显降低。低非目标碳链长度二元酸杂质含量的降低，在很大程度上约了提取纯化的生产成本，另一方面，二元酸产品纯度的提高，有助于提升下游产品的品质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 CIBT美国公司

<120> 一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法

<130> KHP191111435.6

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5649

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagccag agattgaaca agaattatca cacaccttgt taactgaatt gttagcttat 60

caattcgctt ctccagtccg atggatcgaa acccaagatg tcttcttgaa gcaacacaac 120

accgaaagaa tcatcgaaat cggtccttct ccaaccttgg ccggtatggc caacagaacc 180

atcaaggcca aataccaatc ctacgacgcc gctttgtcct tgcagagaga agttttgtgc 240

tactcaaagg acgccaagga gatctactac aagccagatc cagcagatct tgctccaaag 300

gaagaaccaa agaaggaaga agctgccgcc gctccagccg ctacaccagc tgctgctgct 360

gctgctgcta ctcctgctgc tgccccagtc gccgctgctc cagccccatc tgctggccct 420

gctgaatcca tcccagatga accagtcaag gcttccttgt tgatccacgt cttggttgct 480

cagaaattaa agaaaccatt ggatgctgtt ccaatgtcca aggctatcaa agatttagtt 540

aacggtaagt ccactgtcca gaacgaaatt cttggtgact tgggtaaaga attcggttcc 600

actcctgaaa aaccagaaga taccccattg gaagaattgg ccgaacagtt ccaagactcc 660

ttcagtggtc aattgggtaa gacttctact tcattgattg gtagattgat gtcttctaag 720

atgcctggtg gtttctcaat caccgctgcc agaaaatact tggaatccag attcggtttg 780

ggtgctggta gacaagactc tgtcttgttg gttgctttga ccaacgaacc tgcaagtaga 840

ttggcttctg aagctgaagc taagacattc ttggatacca tggctcaaaa atatgcctca 900

tctgccggta tttccttgtc atcagcttct gctggtgccg gtgctggagg tgccgctggt 960

ggcgccgttg ttgacagcgc tgctttggac gccttgactg ccgaaaacaa gaagttggct 1020

agacaacaat tagaggtctt ggccagatac ttgcaagtcg acttgaactc aggagctaag 1080

tcttttatca aagaaaaaga agcttccgct gttttgcaga aagaattgga cttgtgggaa 1140

gccgaacatg gtgaattcta cgccagaggt atcaaaccaa ctttctcagc tttgaaagca 1200

agaacctatg attcctactg gaactgggcc agacaagatg ttttgtccat gtactttgat 1260

attttgtttg gtaagttgac ctccgttgac agagaaacca tcgaccaatg tatccaaatt 1320

atgaacagat ccaacccaac tttgatcaag ttcatgcaat accacattga ccactgtcca 1380

gaatacaagg gtgagactta caagttggcc aagagattgg gtcaacagtt gattgacaac 1440

tgtaagcaaa ccttgaatga agacccagtg tacaaggacg tttctagaat cactggtcca 1500

aagaccaccg tctgcgccaa gggtaacatt gaatacgaag aagccgaaaa ggattctgtt 1560

agaaagtttg aacagtacgt ctacgaaatg gcccaaggtg gtgaaatgac caggattgcc 1620

caaccaacta ttcaagaaga cttggccaga gtttacaaag ccatctccaa gcaagcttcc 1680

agagacagca agttggaatt gcagaaagtc tacgagcaat tgttgaaggt tgttgctggt 1740

tcagacgaaa ttgaaactca gcaattaacc aaggacatct tgcaagctcc aactggcgcc 1800

aacaccccaa ctgatgaaga tgaaatttcc accgccgact ctgacgatga aattgcttca 1860

ttgccagata agacttcaat tgcccaacca gtttcttcaa ctgttccacc ccagaccatc 1920

ccattcttgc acattcaaaa gaagaccaac gaaggctggg aatacgaccg caagttgtct 1980

gccctttact tggacggttt ggaatccgct gctgtcaacg gtctcacctt caaggacaag 2040

tacgttttgg ttaccggtgc tggtgctgga tccattggtg ccgaaatctt gcaaggtttg 2100

atcagtggtg gtgccaaggt tgttgttacc acttctagat tctccaagaa ggttactgag 2160

tactaccaaa acatgtacgc cagatacggt gctgctggtt ctactttgat tgttgttcca 2220

ttcaaccaag gttctaaaca agatgttgac gctttggttc aatacatcta cgacgatcca 2280

aagaagggtg gtttaggctg ggacttggat gccattatcc cattcgctgc tatcccagaa 2340

aatggtaacg gtatcgacaa cattgattct aaatccgaat ttgcccacag aattatgttg 2400

accaaccttt tgagattgtt gggtgctgtc aaatccaaga agactaccga caccagacca 2460

gctcaatgta tcttgccaat gtctcctaac cacggtactt tcggtttcga tgggttgtac 2520

tctgaatcca agatttcctt ggaaaccttg ttcaacagat ggtactccga agattggggt 2580

tccaagttga ccgtctgtgg tgccgttatt ggttggacca gaggtactgg tttgatgagc 2640

gccaacaaca tcattgccga aggtattgaa aagattggtg tcagaacctt ctcccaaaag 2700

gaaatggctt tcaacatctt gggtttgttg actcctcaga ttgtcaagtt gtgccaagaa 2760

gaaccagtta tggccgactt gaacggtggt ttgcaattca ttgaaaactt gaaggatttc 2820

acttccaagt tgagatctga cttgatggaa tccgctgaag ttagaagagc tgtctccatt 2880

gaatccgcca tcgaacaaaa ggttgtcaat ggtgacaatg ttgatgccaa ctacaccaag 2940

gttaccgttc aaccaagagc caacatgaaa ttcgacttcc caaccttgaa atcttacgat 3000

gacatcaaga aggttgctcc agaattggaa ggcatgttgg acttggaatc cgtcgttgtt 3060

gtcactggtt tcgctgaagt tggtccatgg ggtaacgcca gaaccagatg ggaaatggaa 3120

tccaagggtg aattctcctt ggaaggtgcc attgaaatgg cctggatcat gggtttcatc 3180

aagtaccaca acggtaactt gaagggtaag ccttactctg gttgggttga tgccaagacc 3240

caaactccaa tcgatgacaa ggacatcaag gccaagtacg aagaagagat cttggaccac 3300

tctggtatta gattgattga gccagaattg ttcaatggct acgatccaaa gaagaagcag 3360

atgatccaag aagttgtcat ccaacatgac ttggaaccat ttgaagcctc caaggaaacc 3420

gctgaacaat acaaacacga acacggtgac aagtgtgaga tctttgaaat tgaagaatcc 3480

ggtgaataca ctgttagaat cttgaaaggt gctaccttgt ttgttccaaa ggctttgaga 3540

tttgacagat tggttgctgg tcaaattcca actggttggg atgctcgtac ctacggtatt 3600

ccagaagata ccattaacca agttgatcct atcactttgt acgtcttgat tgctaccgtt 3660

gaagctttgt tgtctgctgg tatcaccgac ccatatgaat tctacaagta cgtccacgtt 3720

tccgaagttg gtaactgttc tggttccggt atgggtggtg tctctgcctt gagaggaatg 3780

ttcaaggaca gatacgccga cagaccagtt caaaacgata tcttgcaaga atctttcatc 3840

aacaccatgt ccgcttgggt caacatgttg ttgttgtctt cttctggtcc aataaagacc 3900

ccagttggtg cttgtgctac cgctgttgaa tccgtggaca ttggtattga aactattttg 3960

tctggtaagg ctaaggttgt tatggttggt ggttacgatg acttccagga agaaggttct 4020

tatgaattcg ccaacatgaa tgccacttcc aactctcttg acgagtttgc ccacggcaga 4080

actccaaagg agatgtccag accaactacc actactagac acggtttcat ggaggcccaa 4140

ggttccggta tccaggttat tatgactgct gacttggcca tcaagatggg tgttccaatt 4200

cacgctgtgt tggccatgtc cgccactgct accgacaaga ttggtagatc tgttccggct 4260

ccaggtaagg gtattttgac cactgccagg gaacaccacg gtaacttgaa gtacccatct 4320

ccagctttga acatcaagta cagaaagaga caattgaagg ctagattaga ccaaatcaag 4380

gcttgggaag aagctgaaat tgcttacttg caagacgaag ctgagttggc caaggaagaa 4440

atgggcgatg aattctccat gcacgaattc ttgaaggaaa gaactgaaga agtgtaccgc 4500

gaatccaaga gacaagtttc tgacgctaag aagcaatggg gtaaccaatt ctacaagtct 4560

gacccaagaa ttgccccatt gagaggtgcc ttggctgctt tcaacttgac cattgacgat 4620

cttggtgttg cttccttcca cggtacttct accgtcgcca acgataagaa cgaatccgcc 4680

actattaaca gcatgatgca acacttgggc agatctgaag gtaacccagt gtttggtgtt 4740

ttccagaagt acttgactgg tcatccaaag ggtgctgctg gtgcttggat gttgaacggt 4800

gccatccaga tcttggagtc tggtattgtt ccaggtaaca gaaatgccga taacgttgac 4860

aaggtcttgg aagaatacga gtacgtcttg tacccatcca gatccatcca aactgacggt 4920

atcaaggccg tttccgtgac ctctttcggt ttcggtcaaa aaggtgctca agctgttgtc 4980

gtccacccag actacttgtt tgctgttttg gacagatcta cttatgaaga ctacgccacc 5040

agagtttctg ccagaaacaa gaagacttac cgttacatgc acaatgctat tactagaaac 5100

actatgtttg ttgctaagga taaggctcca tatgccgatg aattggaaca accagtttac 5160

ttggacccat tagcccgtgt tgaaaacgct aaggaaaagc ttgccttcag caacaagagt 5220

atccaatcca accaagctta tgctggtgaa aatgccagaa ccactgccaa ggctttggct 5280

gccttgaaca agtcatccaa gggtgttggt gtcgacgttg aattgttgtc agagctcaac 5340

ttggagaatg aaacttttgt tgcaagaaac ttcactcctg gtgaaatcca atactgctcc 5400

aagagttcca acccacaagc ttcatacacc ggtacttggt ccgccaaaga agctgttttc 5460

aaggcattag gtgttgaatc taaaggtgct ggtgctagct tggttgatat tgagatcact 5520

cgtgacgtca acggtgctcc acaagttgtc ttgcacgggg atgccgcaaa atcagccgcc 5580

aaagctggtg tcaagaacgt caagatttcc atctcccatg acgacttcca agccactgct 5640

gttgccttg 5649

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actcaaagga cgccaaggag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctgcaaaa cagcggaagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcctggatc atgggtttca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcctttgga gttctgccgt 20

<210> 6

<211> 880

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actcaaagga cgccaaggag atctactaca agccagatcc agcagatctt gctccaaagg 60

aagaaccaaa gaaggaagaa gctgccgccg ctccagccgc tacaccagct gctgctgctg 120

ctgctgctac tcctgctgct gccccagtcg ccgctgctcc agccccatct gctggccctg 180

ctgaatccat cccagatgaa ccagtcaagg cttccttgtt gatccacgtc ttggttgctc 240

agaaattaaa gaaaccattg gatgctgttc caatgtccaa ggctatcaaa gatttagtta 300

acggtaagtc cactgtccag aacgaaattc ttggtgactt gggtaaagaa ttcggttcca 360

ctcctgaaaa accagaagat accccattgg aagaattggc cgaacagttc caagactcct 420

tcagtggtca attgggtaag acttctactt cattgattgg tagattgatg tcttctaaga 480

tgcctggtgg tttctcaatc accgctgcca gaaaatactt ggaatccaga ttcggtttgg 540

gtgctggtag acaagactct gtcttgttgg ttgctttgac caacgaacct gcaagtagat 600

tggcttctga agctgaagct aagacattct tggataccat ggctcaaaaa tatgcctcat 660

ctgccggtat ttccttgtca tcagcttctg ctggtgccgg tgctggaggt gccgctggtg 720

gcgccgttgt tgacagcgct gctttggacg ccttgactgc cgaaaacaag aagttggcta 780

gacaacaatt agaggtcttg gccagatact tgcaagtcga cttgaactca ggagctaagt 840

cttttatcaa agaaaaagaa gcttccgctg ttttgcagaa 880

<210> 7

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcctggatc atgggtttca tcaagtacca caacggtaac ttgaagggta agccttactc 60

tggttgggtt gatgccaaga cccaaactcc aatcgatgac aaggacatca aggccaagta 120

cgaagaagag atcttggacc actctggtat tagattgatt gagccagaat tgttcaatgg 180

ctacgatcca aagaagaagc agatgatcca agaagttgtc atccaacatg acttggaacc 240

atttgaagcc tccaaggaaa ccgctgaaca atacaaacac gaacacggtg acaagtgtga 300

gatctttgaa attgaagaat ccggtgaata cactgttaga atcttgaaag gtgctacctt 360

gtttgttcca aaggctttga gatttgacag attggttgct ggtcaaattc caactggttg 420

ggatgctcgt acctacggta ttccagaaga taccattaac caagttgatc ctatcacttt 480

gtacgtcttg attgctaccg ttgaagcttt gttgtctgct ggtatcaccg acccatatga 540

attctacaag tacgtccacg tttccgaagt tggtaactgt tctggttccg gtatgggtgg 600

tgtctctgcc ttgagaggaa tgttcaagga cagatacgcc gacagaccag ttcaaaacga 660

tatcttgcaa gaatctttca tcaacaccat gtccgcttgg gtcaacatgt tgttgttgtc 720

ttcttctggt ccaataaaga ccccagttgg tgcttgtgct accgctgttg aatccgtgga 780

cattggtatt gaaactattt tgtctggtaa ggctaaggtt gttatggttg gtggttacga 840

tgacttccag gaagaaggtt cttatgaatt cgccaacatg aatgccactt ccaactctct 900

tgacgagttt gcccacggca gaactccaaa ggag 934

<210> 8

<211> 5873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcttccgctg ttttgcagaa gcatgcgaac ccgaaaatgg 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgaaacccat gatccaggcc gctagcagct ggatttcact 40

<210> 11

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcttccgctg ttttgcagaa gcatgcgaac ccgaaaatgg agcaatcttc cccggggcct 60

ccaaatacca actcacccga gagagataaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata 120

tccaccaagg taagtaactc agagttaatg atacaggtgt acacagctcc ttccctagcc 180

attgagtggg tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc 240

aattccatgg ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct 300

ctgaaaatct tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc 360

caccctccct tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta 420

ctttccctcc ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga 480

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg 540

tctccgacct catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 600

gagggcgtgg atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 660

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 720

aattcagcga gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 780

acctccctga aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga 840

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 900

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 960

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca 1020

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 1080

acaatgtcct cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 1140

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 1200

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 1260

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1320

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 1380

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1440

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 1500

agtgtgctac ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata 1560

aataggatgc aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa 1620

tgaagtctat gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag 1680

tctgtaaaaa aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg 1740

aaatccagct gctagcggcc tggatcatgg gtttca 1776

<210> 12

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagcgaccaa agcgattcag gttggtcatt tacgactgct tgctctggct cttgtcagtg 60

atatttgatt gttttttcag agagatcaga ccgagagggg cgtttaagat ccccagagag 120

ggtccggtga tctttgttgc cgccccccat cataatcagt ttgttgatcc catcgtgttg 180

atgaaccagg tgaaaagaga agcaaaccga agaatatcat tcttgattgc ggccaagtca 240

tatcaattga aagctgttgg aacgatggca agcatgcgaa cccgaaaatg gagcaatctt 300

ccccggggcc tccaaatacc aactcacccg agagagataa agagacacca cccaccacga 360

gacggagtat atccaccaag gtaagtaact cagagttaat gatacaggtg tacacagctc 420

cttccctagc cattgagtgg gtatcacatg acactggtag gttacaacca cgtttagtag 480

ttattttgtg caattccatg gggatcagga agtttggttt ggtgggtgcg tctactgatt 540

cccctttgtc tctgaaaatc ttttccctag tggaacactt tggctgaatg atataaattc 600

accttgattc ccaccctccc ttctttctct ctctctctgt tacacccaat tgaattttct 660

tttttttttt actttccctc cttctttatc atcaaagata agtaagttta tcaattgcct 720

attcagaatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tcatcgaaaa 780

gttcgacagc gtctccgacc tcatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag 840

cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct ccgggtaaat agctgcgccg atggtttcta 900

caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct 960

tgacattggg gaattcagcg agagcctcac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt 1020

cacgttgcaa gacctccctg aaaccgaact ccccgctgtt ctccagccgg tcgcggaggc 1080

catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc 1140

gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca 1200

tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct 1260

cgatgagctc atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga 1320

tttcggctcc aacaatgtcc tcacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag 1380

cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg 1440

gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg 1500

atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt 1560

ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg 1620

atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac 1680

cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag 1740

ggcaaaggaa tagtgtgcta cccacgctta ctccaccaga gctattaaca tcagaaatat 1800

ttattctaat aaataggatg caaaaaaaaa acccccctta ataaaaaaaa aagaaacgat 1860

tttttatcta atgaagtcta tgtatctaac aaatgtatgt atcaatgttt attccgttaa 1920

acaaaaatca gtctgtaaaa aaggttctaa ataaatattc tgtctagtgt acacattctc 1980

ccaaaatagt gaaatccagc tgctagcatg agtgacgggg tctccttatt aaactcagat 2040

aattctttga caaatctccc aatgttttcg gattacgtgt tgcacaagaa cgcaaagaac 2100

ccggacttgg agcttgatcc ccaatctttg gcggcatcga gagtcaattc gatggtcaac 2160

atacctcatg cttctcatgg cgttaatacg ccatcaccgt caacttcaag acgcccacca 2220

ttgaccgaaa ccgcctcgtc ggagcatatg gaattgaact ttgggtctgg agcc 2274

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agaagaccaa cgaaggctgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attgagctgg tctggtgtcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgctccgca ttggtcttga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acacttgtca ccgtgttcgt 20

Claims

1.一种二元酸生产中降低非目标碳链长度二元酸杂质的方法，其特征在于，抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因的表达量和/或活性，并利用改造后的工程菌进行长链二元酸的发酵生产；

所述长链二元酸为十二碳二元酸或十碳二元酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括通过基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因，或将菌株中FAS2基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件。

3.一种生产长链二元酸的工程菌，其特征在于，抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因的表达量和/或活性，得到改造后的工程菌；

所述长链二元酸为十二碳二元酸或十碳二元酸。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，利用基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因，或将菌株中FAS2基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件，使长链二元酸生产菌株中FAS2的表达量显著降低，得到改造后的工程菌。

5.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述长链二元酸生产菌株选自棒状杆菌属(Corynebacterium)、白地霉菌属(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyce)、耶氏酵母属(Yarrowia)中的菌种。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述长链二元酸生产菌株选自假丝酵母属菌种。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述长链二元酸生产菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

8.权利要求3-7任一所述的工程菌的构建方法，其特征在于，抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因的表达量和/或活性，得到改造后的工程菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用基因工程手段敲除长链二元酸生产菌株基因组内一个拷贝的FAS2基因，或将菌株中FAS2基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件，使长链二元酸生产菌株中FAS2的表达量显著降低。

10.一种长链二元酸的生产方法，其特征在于，以正十烷为发酵底物，发酵权利要求3～7任一项所述的工程菌以生产十碳二元酸，或者，以正十二烷为底物，发酵权利要求3～7任一项所述的工程菌以生产十二碳二元酸。

11.根据权利要求10所述的生产方法，其特征在于，发酵结束后的发酵液中含有的单一的非目标碳链长度二元酸杂质含量降至1.0％以下。

12.抑制或降低长链二元酸生产菌株中FAS2基因的表达的物质在降低非目标碳链长度的二元酸杂质中的应用；

所述长链二元酸为十二碳二元酸或十碳二元酸。

13.根据权利要求10所述的方法制备获得的长链二元酸发酵液，其中非目标碳链长度的二元酸杂质与使用未改造的工程菌相比显著降低。