CN115992164A - CRISPRi基因抑制系统、包含其的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRISPRi基因抑制系统、包含其的基因工程菌及其应用。所述CRISPRi基因抑制系统包含：dCas9表达盒和sgRNA表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述sgRNA表达盒包括编码所述sgRNA的核苷酸序列及其上游的第二启动子；所述dCas9基因编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明的CRISPRi基因抑制系统通过启动子的选择，能够在不破坏目的基因序列的情况下灵活抑制其在维斯假丝酵母中的表达，并可以灵活控制抑制效果，丰富基因表达的调控手段；还可以规避传统基因改造方法带来的弊端，避免基因敲除带来的对目的基因与细胞生理功能网络的彻底破坏。

Description

CRISPRi基因抑制系统、包含其的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种CRISPRi基因抑制系统、包含其的基因工程菌及其应用。

背景技术

维斯假丝酵母(Candida viswanathii)是一种产自油田、具有降解原油能力的真菌。其在工业生物领域具有极高的利用价值。通过改造维斯假丝酵母的代谢途径，可以利用其以烷烃为底物合成长链二元酸。例如Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)报道了敲除POX4和POX5的各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率。因此认为维斯假丝酵母是具有重要工业价值的微生物。

我们需要对维斯假丝酵母的基因组与基因表达过程进行改造，才能达到控制产物代谢途径的目的。在很多情况下，我们需要敲除或抑制对最终产物的表达有影响的基因。例如：在长链二元酸的代谢途径中，β-氧化会将烷烃合成的中间产物分解成二氧化碳，因此需要对参与β-氧化过程的基因进行阻断。在实验室常用的模式生物中，阻断基因的表达的方法有很多种，但由于模式生物中的通用工具在其它微生物中的适用性差异很大，对于不同的底盘微生物需要开发基因调控的工具。目前，在假丝酵母中，阻断基因表达的工具仅限于对基因的敲除。线性DNA片段同源重组的方法已在多篇文献中提到。Lombardi等人(mSphere.2019Mar 13；4(2):e00125-19)也报道了利用CRISPR-Cas9(ClusteredRegularly-Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9)基因编辑方法。但基因敲除工具会彻底破坏目的基因的序列，在微生物的基因组与代谢中产生不可逆的改变。这个问题会导致我们无法研究一些关键的必需基因，因为必需基因的敲除会导致菌株无法生长，导致编辑失败。这也为开发可控的基因抑制系统提供了研究价值。

除基因敲除以外，在模式微生物中报道过很多种可控的基因抑制系统，比如RNAi、TAL-effector系统等。但相较于上述系统，CRISPR interference(CRISPRi)技术具有明显的优势。CRISPRi基因抑制技术是由CRISPR-Cas基因编辑技术衍生而成，其主体构成的Cas9蛋白与sgRNA基本相同。Cas9蛋白是具有DNA结合能力与DNA内切酶活性的蛋白。sgRNA(small guide RNA)是一条具有固定二级结构区域与可变20碱基识别序列的小RNA，它的二级结构域能够结合Cas9蛋白形成CRISPR复合体，20碱基识别序列能够识别并结合基因组中与其互补的序列并将Cas9蛋白精准定位在基因组的特定区域。与CRISPR-Cas编辑系统不同的是，Qi等人(Cell.2013Feb28；152(5):1173-83.)提到Jinek等在S.pyogenes的Cas9蛋白上的酶切活性位点找到了两个点突变D10A、H840A，制造出了突变体dCas9(dead Cas9)蛋白。dCas9不再具有DNA内切酶活性但仍保留了结合DNA的能力，这样仍可以通过sgRNA的引导绑定在基因组中的特异性位置。当CRISPRi复合体绑定在内源基因的开放阅读框中时，CRISPRi复合体可以从物理上阻断RNA聚合酶的转录进程，从而达到抑制基因转录、最终抑制基因表达的作用。

相较于基因敲除，CRISPRi能够在不破坏目的基因序列的情况下灵活抑制其表达。并根据结合位点的调整做到部分抑制或全部抑制目的基因的表达，这样方便我们对必需基因进行研究。相较于RNAi，CRISPRi具有更低的脱靶效应，能够更精准地引导控制目的基因。相较于DNA结合蛋白(如TAL-effector)，CRISPRi由于RNA-DNA互补序列抑制作用更加高效。综上所述，CRISPRi技术是一个在多个方面都具有优势的基因抑制的方法。在维斯假丝酵母中开发CRISPRi系统对于该菌株中的基因调控具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少能够在不破坏目的基因序列的情况下灵活抑制其表达的维斯假丝酵母的缺陷，提供一种CRISPRi基因抑制系统、包含其的基因工程菌及其应用。本发明的CRISPRi基因抑制系统通过启动子的选择，能够在不破坏目的基因序列的情况下灵活抑制其表达，并可以灵活控制抑制效果。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供一种CRISPRi基因抑制系统在维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)中的应用；尤其是在抑制维斯假丝酵母的目的基因表达中的应用；

所述CRISPRi基因抑制系统包含：dCas9表达盒和sgRNA表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述sgRNA表达盒包括编码所述sgRNA的核苷酸序列及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示；所述dCas9基因编码如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

在本发明一些实施方案中，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明一些实施方案中，编码所述sgRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的PAM序列例如NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:9所示。

本领域技术人员应当理解的是，本发明中，所述目的基因是所述CRISPRi基因抑制系统所要抑制表达的基因。

在本发明一些具体实施方案中，所述识别序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8所示。

在本发明一些具体实施方案中，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

在本发明一些实施方案中，所述dCas9表达盒整合在所述维斯假丝酵母的染色体中。

本发明的第二方面提供一种CRISPRi基因抑制系统，所述CRISPRi基因抑制系统包含：dCas9表达盒和sgRNA表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA表达盒包括编码所述sgRNA的核苷酸序列及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示；所述dCas9基因编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在本发明一些实施方案中，编码所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明一些实施方案中，编码所述sgRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:9所示。

在本发明一些具体实施方案中，所述识别序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8所示。

本发明的第三方面提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达如第二方面所述的CRISPRi基因抑制系统，所述基因工程菌的出发菌为维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)。

在本发明一些实施方案中，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

本发明的第四方面提供一种抑制维斯假丝酵母中的基因表达的方法，所述方法包括：

(1)使所述维斯假丝酵母包含如第二方面所述的CRISPRi基因抑制系统中的dCas9表达盒；

(2)根据要抑制的目的基因，设计如第二方面所述的CRISPRi基因抑制系统中的sgRNA表达盒并将其导入到所述维斯假丝酵母中，即得。

本发明的第五方面提供一种启动子组合，所述启动子组合包括核苷酸序列如SEQID NO:3所示的第一启动子，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的第二启动子。

在本发明一些具体实施方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第一启动子即启动子1.0，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的第二启动子分别为启动子2.0和启动子2.1。

本发明的第六方面提供一种重组载体组合，所述重组载体组合包括编码dCas9的核酸的dCas9重组载体和编码sgRNA的核酸的sgRNA重组载体；

所述dCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述sgRNA为如第二方面所述的sgRNA。

在本发明一些实施方案中，所述dCas9重组载体或sgRNA重组载体的骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101及其衍生质粒。

在本发明一些具体实施方案中，所述sgRNA重组载体的骨架质粒为pCIB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明中，CRISPRi基因抑制系统包括两个部分，dCas9蛋白与sgRNA，需要同时在底盘菌(即维斯假丝酵母菌)中进行表达。当CRISPRi基因抑制系统在维斯假丝酵母中正确表达后，dCas9蛋白会被在基因组20bp靶点的5’端上游的一个能够让其识别的PAM(Protospace adjacent motif)序列引导至细胞核中，sgRNA通过dCas9的结合域与dCas9结合，形成CRISPR复合体。CRISPR复合体会通过sgRNA的20bp的识别序列找到其在基因组中与之互补的序列，并将CRISPR复合体锚定在目的基因的表达框内。

本发明中，所述PAM序列为本领域常规，即NGG。

锚定后，CRISPR复合体会通过紧密的结合在目的基因的DNA双链上，当目的基因转录时，率先锚定的CRISPR复合体会阻断RNA聚合酶与DNA的结合，降低转录水平，从而达到抑制目的基因表达的作用。

本发明中，dCas9蛋白为S.pyogenes的Cas9蛋白D10A、H840A两个点突变的突变体，放在了维斯假丝酵母第一启动子下表达。该表达框两端接入维斯假丝酵母γ整合位点同源臂，并构建至氨苄抗生素标记的克隆载体中。该整合质粒经过酶切线性化，使用CRISPR-Cas9编辑的方法插入维斯假丝酵母γ整合位点中，获得dCas9表达菌株。

本发明中，所述sgRNA含有20bp识别序列的全结构域在质粒载体中的序列，20bp序列由于其可变性，由20个“N”碱基表示。其后的序列为sgRNA特有的结构序列。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的CRISPRi基因抑制系统通过启动子的选择，能够在不破坏目的基因序列的情况下灵活抑制其在维斯假丝酵母中的表达，并可以灵活控制抑制效果，丰富基因表达的调控手段；可以规避传统基因改造方法带来的弊端，避免基因敲除带来的对目的基因与细胞生理功能网络的彻底破坏。同时，本发明的CRISPRi基因抑制系统一种灵活、高效、可控的基因表达调节的工具，能够快速引进调控元件对多个不同目的基因进行抑制，解决基因敲除周期长的问题，解决通过基因敲除无法实现的抑制必需基因的问题。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中使用的维斯假丝酵母菌株的保藏编号为CCTCC：M2020048，培养方法参见CN111748480A。

实施例中使用的基因合成方法、PCR扩增方法均为本领域常规。

实施例中使用的Gibson重组(Thermo-Invitrogen GeneArt^TM Gibson AssemblyHiFi reagent master mix A46629)方法、转化的方法(参见Molecular Cloning:ALaboratory Manual)均为本领域常规。

实施例中使用的质粒回收试剂盒为

AxyPrep Plasmid Miniprep KitAP-MN-P-250。

实施例中使用的ScaI限制性内切酶为Thermo FastDigest ScaI FD0434。

实施例中使用的大肠杆菌为Top10。

实施例1构建CRISPRi基因抑制系统表达菌株

第一步：构建dCas9整合表达菌株

1、通过PCR分别扩增如SEQ ID NO:2所示的dCas9基因片段和如SEQ ID NO:3所示的启动子1.0片段。

2、使用Gibson重组的方法，以1:0.75:0.75:2.5的体积比例将质粒载体pUC19、dCas9基因片段、启动子1.0片段和Gibson重组酶预混液进行混合、组装，并在50℃孵育15～30min，获得dCas9重组质粒。

3、将获得的dCas9重组质粒用化学转化的方法转化至大肠杆菌中。将转化完成的菌涂布在含有40μg/mL氨苄抗生素的LB平板上，37℃过夜培养。

4、挑取平板上的单克隆至5mL LB+40μg/mL氨苄液体培养基中，过夜振荡培养后使用质粒回收试剂盒提取质粒，收获纯化后的dCas9整合质粒。

5、使用ScaI限制性内切酶酶切dCas9整合质粒，获得线性化的dCas9整合质粒，可用于转化整合。

6、制备感受态细胞：划线挑取维斯假丝酵母菌株单克隆，在YPD培养基中30℃振荡培养24个小时，按1:200的比例稀释后过夜培养16个小时。

7、使用分光光度计测定菌液OD值，当OD值达到约2时制备电转感受态细胞。将80μL感受态细胞转移至2mm间隙的电转杯中，加入pCas9CRISPR编辑质粒线性化后的dCas9整合质粒；在2.4kV电压下进行电转，将电转孵育完毕后的菌均匀涂在含有100μg/mL诺尔丝菌素抗性的YPD平板中，30℃培养3～6天。

8、挑取平板中的单克隆至含有100μg/mL诺尔丝菌素抗性的YPD平板中，若无菌生长，则表明pCas9 CRISPR质粒已完全丢失。经过验证，获得dCas9整合表达菌株。

第二步：构建sgRNA质粒

1、在维斯假丝酵母的基因组序列中确定并找到要激活的目的基因，并在目的基因的表达框内从初始密码子ATG开始250bp以内寻找NGG PAM序列。在找到的PAM序列上游取20bp作为sgRNA的识别序列。

2、通过PCR分别扩增包含如SEQ ID NO:6、7和8所示的识别序列和通用结构的sgRNA片段、如SEQ ID NO:4所示的启动子2.0片段和如SEQ ID NO:5所示的启动子2.1片段。

3、使用Gibson重组的方法，以1:1.5:2.5的体积比例将sgRNA片段与启动子2.0片段或启动子2.1片段、质粒载体pCIB2和Gibson重组酶预混液分别进行混合、组装，并在50℃孵育15～30min，获得对应于启动子2.0片段和启动子2.1片段两种sgRNA重组质粒。

4、将步骤3获得的sgRNA重组质粒用化学转化的方法转化至大肠杆菌中，将转化完成的菌涂布在含有40μg/mL氨苄抗生素的LB平板上，过夜培养。

5、挑取平板上的单克隆至5mL LB+40μg/mL氨苄液体培养基，过夜振荡培养后使用质粒回收试剂盒提取质粒，收获纯化后的sgRNA质粒。

第三步：转化sgRNA质粒

1、将第一步中获得的dCas9整合表达菌株在YPD平板上划线挑菌，挑取单克隆于含YPD的种子摇瓶中30℃振荡培养24个小时。

2、将菌从种子摇瓶中按1:200的比例稀释后转接至含YPD的摇瓶中，过夜培养16个小时。

3、其他步骤参见第一步的7，收获菌液，制作感受态细胞。使用电转化的方法将sgRNA重组质粒转化至感受态细胞中，在YPD平板上30℃培养获得单克隆。

4、挑取平板中的单克隆，进行下一步的筛选验证。

实施例2 CRISPRi基因抑制系统的效果验证

按照实施例1，在表达RFP荧光蛋白的维斯假丝酵母菌株中插入dCas9的表达框，构建了dCas9整合表达菌株。在RFP的表达框内根据前述位点选取的原则找到sgRNA位点，所述sgRNA位点的20bp的识别序列为：

识别序列1：agataacatggctattatta(SEQ ID NO:6)；

识别序列2：gaagatttgaacaatgttag(SEQ ID NO:7)；

识别序列3：tggagttgattttatatcaa(SEQ ID NO:8)。

根据上述识别序列，如表1所示分别构建了sgRNA重组质粒，将sgRNA重组质粒分别转化至所述dCas9整合表达菌株中，每种sgRNA重组质粒得到三株包含CRISPRi基因抑制系统的RFP抑制菌株(菌株A～I)。通过酶标仪测定荧光值的方法评价RFP基因受CRISPRi调控后的表达量。采用的对照菌株含有RFP、dCas9和一个非识别序列的sgRNA。结果如表2所示。

表1 CRISPRi基因抑制系统元件配置

表2菌株表达量

通过结果可以看出，无论是由启动子2.0或启动子2.1表达sgRNA，3个RFP识别序列均通过CRISPRi对基因表达起到了抑制作用，启动子2.0的效果更佳。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司

CIBT美国公司

<120> CRISPRi基因抑制系统、包含其的基因工程菌及其应用

<130> P21015930C

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1417

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dCas9

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1               5                   10                  15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

            20                  25                  30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

        35                  40                  45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

    50                  55                  60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65                  70                  75                  80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

                85                  90                  95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

            100                 105                 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

        115                 120                 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

    130                 135                 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145                 150                 155                 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

                165                 170                 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

            180                 185                 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

        195                 200                 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

    210                 215                 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225                 230                 235                 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

                245                 250                 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

            260                 265                 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

        275                 280                 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

    290                 295                 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305                 310                 315                 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

                325                 330                 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

            340                 345                 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

        355                 360                 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

    370                 375                 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385                 390                 395                 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

                405                 410                 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

            420                 425                 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

        435                 440                 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

    450                 455                 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465                 470                 475                 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

                485                 490                 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

            500                 505                 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

        515                 520                 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

    530                 535                 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545                 550                 555                 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

                565                 570                 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

            580                 585                 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

        595                 600                 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

    610                 615                 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625                 630                 635                 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

                645                 650                 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

            660                 665                 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

        675                 680                 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

    690                 695                 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705                 710                 715                 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

                725                 730                 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

            740                 745                 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

        755                 760                 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

    770                 775                 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785                 790                 795                 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

                805                 810                 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

            820                 825                 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

        835                 840                 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

    850                 855                 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865                 870                 875                 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

                885                 890                 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

            900                 905                 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

        915                 920                 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

    930                 935                 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945                 950                 955                 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

                965                 970                 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

            980                 985                 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

        995                 1000                1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

    1010                1015                1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

    1025                1030                1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

    1040                1045                1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

    1055                1060                1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

    1070                1075                1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

    1085                1090                1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

    1100                1105                1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

    1115                1120                1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

    1130                1135                1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

    1145                1150                1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

    1160                1165                1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

    1175                1180                1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

    1190                1195                1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

    1205                1210                1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

    1220                1225                1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

    1235                1240                1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

    1250                1255                1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

    1265                1270                1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

    1280                1285                1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

    1295                1300                1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

    1310                1315                1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

    1325                1330                1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

    1340                1345                1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

    1355                1360                1365

Glu Gly Ala Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys

    1370                1375                1380

Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Tyr Lys

    1385                1390                1395

Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp

    1400                1405                1410

Asp Asp Asp Lys

    1415

<210> 2

<211> 4119

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dCas9

<400> 2

atggacaaga agtactccat cggtttggcc atcggtacta actcagttgg ttgggccgtt 60

atcaccgacg aatacaaggt cccatccaag aagttcaagg tcttgggtaa caccgaccgt 120

cactccatca agaagaactt gatcggtgcc ttgttgttcg actcaggtga aaccgccgaa 180

gctaccagat tgaagagaac cgccagaaga cgttacaccc gtcgtaagaa ccgtatctgt 240

tacttgcaag aaatcttctc caacgaaatg gctaaggttg acgactcctt cttccacaga 300

ttggaagaat ccttcttggt cgaagaagac aagaagcacg aacgtcaccc aatcttcggt 360

aacatcgttg atgaagtcgc ttaccacgaa aagtacccaa ccatctacca cttgcgtaag 420

aagttggtcg attccaccga taaggccgat ttgcgtttga tctacttggc cttggcccac 480

atgatcaagt tcagaggtca cttcttgatc gaaggtgact tgaacccaga caactccgac 540

gttgataagt tgttcatcca attggtccaa acctacaacc aattgttcga agaaaaccca 600

atcaacgctt caggtgttga tgctaaggct attttgtccg ctcgtttgtc caagtcccgt 660

agattggaaa acttgatcgc ccaattgcca ggtgaaaaga agaacggttt gttcggtaac 720

ttgatcgcct tgtccttggg tttgacccca aacttcaagt ccaacttcga cttggccgaa 780

gacgccaaat tgcaattgtc caaggacacc tacgacgacg acttggacaa cttgttggcc 840

caaatcggtg accaatacgc cgacttgttc ttggccgcta aaaacttgtc cgacgctatc 900

ttgttgtccg acatcttgag agtcaacacc gaaatcacta aggctccatt gtccgcttcc 960

atgatcaagc gttacgacga acaccaccaa gacttgacct tgttgaaggc cttggtccgt 1020

caacaattgc cagaaaagta caaggaaatc ttcttcgacc aatccaagaa cggttacgcc 1080

ggttacattg acggtggtgc ttcccaagaa gaattctaca agttcatcaa gccaatcttg 1140

gaaaagatgg acggtactga agaattgttg gtcaagttga acagagaaga cttgttgcgt 1200

aagcaacgta ccttcgacaa cggttccatc ccacaccaaa tccacttggg tgaattgcac 1260

gccatcttgc gtcgtcaaga agacttctac ccattcttga aggacaaccg tgaaaagatc 1320

gaaaagatct tgaccttccg tatcccatac tacgtcggtc cattggctag aggtaactcc 1380

agattcgctt ggatgacccg taagtccgaa gaaaccatca ccccatggaa cttcgaagaa 1440

gttgttgata agggtgcttc cgctcaatcc ttcatcgaac gtatgaccaa cttcgacaag 1500

aacttgccaa acgaaaaggt cttgccaaag cactccttgt tgtacgaata cttcaccgtc 1560

tacaacgaat tgaccaaggt caagtacgtc accgaaggta tgcgtaagcc agctttcttg 1620

tccggtgaac aaaagaaggc catcgttgat ttgttgttca agaccaaccg taaggtcacc 1680

gtcaagcaat tgaaggaaga ctacttcaag aagatcgaat gtttcgactc cgtcgaaatc 1740

tcaggtgtcg aagacagatt caacgcttcc ttgggtactt accacgactt gttgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttctt ggacaacgaa gaaaacgaag acatcttgga agacatcgtc 1860

ttgaccttga ccttgttcga agacagagaa atgatcgaag aacgtttgaa gacctacgcc 1920

cacttgttcg acgacaaggt catgaagcaa ttgaagcgtc gtagatacac cggttggggt 1980

agattgtccc gtaagttgat caacggtatc agagacaagc aatccggtaa gaccatcttg 2040

gacttcttga agtcagacgg tttcgccaac cgtaacttca tgcaattgat ccacgacgac 2100

tccttgacct tcaaggaaga catccaaaag gcccaagttt ccggtcaagg tgattccttg 2160

cacgaacaca tcgctaattt ggccggttct ccagccatca agaagggtat cttgcaaacc 2220

gtcaaggtcg ttgatgaatt ggttaaggtc atgggtcgtc acaagccaga aaacatcgtc 2280

atcgaaatgg ccagagaaaa ccaaaccacc caaaagggtc aaaagaactc cagagaacgt 2340

atgaagcgta tcgaagaagg tatcaaggaa ttgggttccc aaatcttgaa ggaacaccca 2400

gtcgaaaaca cccaattgca aaacgaaaag ttgtacttgt actacttgca aaacggtaga 2460

gacatgtacg ttgatcaaga attggacatc aaccgtttgt ccgactacga cgttgacgcc 2520

atcgtcccac aatccttctt gaaggacgac tccatcgaca acaaggtctt gaccagatcc 2580

gacaagaaca gaggtaagtc cgacaacgtc ccatccgaag aagtcgtcaa gaagatgaag 2640

aactactggc gtcaattgtt gaacgccaag ttgatcaccc aacgtaagtt cgacaacttg 2700

accaaggccg aaagaggtgg tttgtcagaa ttggacaagg ccggtttcat caagcgtcaa 2760

ttggtcgaaa cccgtcaaat caccaagcac gtcgctcaaa tcttggactc ccgtatgaac 2820

accaagtacg acgaaaacga caagttgatc agagaagtca aggtcatcac cttgaagtcc 2880

aagttggtct ccgacttccg taaggacttc caattctaca aggtccgtga aatcaacaac 2940

taccaccacg ctcacgacgc ttatttgaac gccgttgttg gtactgcttt gatcaagaag 3000

tacccaaagt tggaatccga attcgtctac ggtgactaca aggtctacga cgtcagaaag 3060

atgatcgcca agtccgaaca agaaatcggt aaggctaccg ccaagtactt cttctactcc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accttggcca acggtgaaat ccgtaagcgt 3180

ccattgatcg aaaccaacgg tgaaaccggt gaaatcgttt gggacaaggg tagagacttc 3240

gctaccgtta gaaaggtctt gtccatgcca caagtcaaca tcgtcaagaa gaccgaagtc 3300

caaaccggtg gtttctccaa ggaatccatc ttgccaaagc gtaactccga caagttgatc 3360

gcccgtaaga aggattggga cccaaagaag tacggtggtt tcgattcccc aaccgttgct 3420

tactccgtct tggttgtcgc caaagtcgaa aagggtaagt ccaagaagtt gaagtccgtc 3480

aaggaattgt tgggtatcac catcatggaa cgttcctcct tcgaaaagaa cccaatcgac 3540

ttcttggaag ccaagggtta caaggaagtc aagaaggact tgatcatcaa gttgccaaag 3600

tactccttgt tcgaattgga aaacggtcgt aagagaatgt tggcttccgc cggtgaattg 3660

caaaagggta acgaattggc cttgccatcc aagtacgtca acttcttgta cttggcctcc 3720

cactacgaaa agttgaaggg ttccccagaa gacaacgaac aaaagcaatt gttcgtcgaa 3780

caacacaagc actacttgga cgaaatcatc gaacaaatct ccgaattctc caagagagtc 3840

atcttggccg acgctaactt ggataaggtc ttgtccgcct acaacaagca cagagacaag 3900

ccaatcagag aacaagccga aaacatcatc cacttgttca ccttgaccaa cttgggtgct 3960

ccagccgctt ttaagtactt cgataccacc atcgaccgta agcgttacac ttccaccaag 4020

gaagtcttgg acgctacctt gatccaccaa tccatcaccg gtttgtacga aacccgtatc 4080

gacttgtccc aattgggtgg tgacgaaggt gccgattaa 4119

<210> 3

<211> 1455

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子1.0

<400> 3

aagaaacgta ttgcaactgg agatagcgat cgttcaattt attccgattt tgtgggggaa 60

gtcgcccgct agtgggcgtg cgcgagtggc aaaagaaact gggccatgct tcttatcatc 120

ccttagaaga gcaatcataa gaaacgttca gtgagaaaaa cgttggcttc ggttaatgat 180

caccttaaag gcaaaatacc tccatgtatg aacatgtagg ttattccttt ttcttttttt 240

gcaacaccct cggcgggttg ttcatattcc cggaaaacac ctccactcgg ggctaagtgg 300

atcttctata aacccgggga aataaggagc cccggtgagc gcgcacacac accaccttca 360

ttttgtccga gggaaacagc acgtgaatcc ggaacacgag aggaatattt cttctatttt 420

tttttcttct ctactgtgag cgcgtgatta tataatcaca agcgatcaac ttatggtagg 480

gtcgtgcacg gcgcaccggg ttccaaaatg atctgcgagg gacaaaattc ttttttttct 540

tccagcatgc cgctggtggc aaataccgtc gtggcatgat gctccctatg catttgattc 600

acaccaccac caccattaat caccaattaa gaggggacaa aagtgaacaa ttggtggccg 660

tcaggttaca ctcatctgct tcggagtttt acgtcccttt ctcttttcaa tttgtgaaat 720

gtcaccctgg cggcgttcga gagagatcag tccgaagcgc gtggtaggag aaacggagca 780

ccgcagcaac aaaaaaaaaa aaaaaaaatt ccaaacccaa gggggtaggg agaagaacag 840

ccagggaagt tgtttaccga cctgaccgta aatttgctgc tgaaagaaac gtgtcaaaca 900

agaccaattg gctcaattga ccctgtggaa atgctttgtt gaccaccaat gcttccacca 960

aacgttactt tttttttgca atcggatggt atgggtctgg ggttcacctg ttttgtaaag 1020

ctacagaagg tggcatattt ctctgatcag gtgttttttt tttcggctgc tgctgctcgt 1080

ggtggtgtag tggtagtggt gtgtgtgtgt gtgtgtgcgt gcgtgtggaa ggacgctttt 1140

tgctctctga ctcctcccaa tcagaagttg ctatagtggt gaaacaacaa tggatgataa 1200

tgccccgggc ggtgcgtgtc cgacacaaac cactacattt tttagctggg agcctactgc 1260

cactacgacc cacccaccca tggtcaacaa aaaaattctg acaaattata aaataaccct 1320

tgaattcccc cttggaaaaa tttttggtat ttctctctct cttttccttt ccctcttctt 1380

tttctctcca tcaatcaatt gacgttcagt aactcaatta attacatcac atccctcaat 1440

taaagaattt aaaca 1455

<210> 4

<211> 239

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子2.0

<400> 4

ccctcgtttt gcccttctct ttttttttct tttctgctct gctggtctgt ttcctttgct 60

cttcgctgtt atcaaccggg caaacgtagt catttttttt tcgctcgtct ctcccttaga 120

gtttaccttc tcgttgatta aaagaaaaat tttcttccac tttttttttc tgattctgct 180

tttttccttt ccctttcttt tctttccttt gctctacaca tctaaagaaa taatcaatc 239

<210> 5

<211> 239

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子2.1

<400> 5

cactcgtatt gcccttctct tttattctct tctctgctgt gctggtctgt atcctttgct 60

ctacgctgat atcaaccggg caaacgtagt catttttttt tcgctcgtct ctcccttaga 120

gtttaccttc tcgttgatta aaagaaaaat tttcttggac tttttttttc tcattctgct 180

tttttccttt ccctttcttt tatatctttt gctctacaca tctaaagaaa taatcattc 239

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 识别序列1

<400> 6

agataacatg gctattatta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 识别序列2

<400> 7

gaagatttga acaatgttag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 识别序列3

<400> 8

tggagttgat tttatatcaa 20

<210> 9

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sgRNA结构序列

<400> 9

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 10

<211> 5873

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCIB2

<400> 10

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

Claims (10)

1.一种CRISPRi基因抑制系统在维斯假丝酵母(Candida viswanathii)中的应用；

所述CRISPRi基因抑制系统包含：dCas9表达盒和sgRNA表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述sgRNA表达盒包括编码所述sgRNA的核苷酸序列及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示；所述dCas9基因编码如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

和/或，编码所述sgRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的PAM序列例如NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:9所示；

例如，所述识别序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述dCas9表达盒整合在所述维斯假丝酵母的染色体中。

5.一种CRISPRi基因抑制系统，其特征在于，所述CRISPRi基因抑制系统包含：dCas9表达盒和sgRNA表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA表达盒包括编码所述sgRNA的核苷酸序列及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5所示；所述dCas9基因编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

较佳地，编码所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.如权利要求5所述的CRISPRi基因抑制系统，其特征在于，编码所述sgRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的PAM序列例如NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:9所示；

例如，所述识别序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达如权利要求5或6所述的CRISPRi基因抑制系统，所述基因工程菌的出发菌为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)；

较佳地，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

8.一种抑制维斯假丝酵母中的基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)使所述维斯假丝酵母包含如权利要求5或6所述的CRISPRi基因抑制系统中的dCas9表达盒；

(2)根据要抑制的目的基因，设计如权利要求5或6所述的CRISPRi基因抑制系统中的sgRNA表达盒并将其导入到所述维斯假丝酵母中，即得；

较佳地，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

9.一种启动子组合，其特征在于，所述启动子组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第一启动子，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的第二启动子。

10.一种重组载体组合，其特征在于，所述重组载体组合包括编码dCas9的核酸的dCas9重组载体和编码sgRNA的核酸的sgRNA重组载体；

所述dCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述sgRNA为如权利要求5或6所述的CRISPRi基因抑制系统中的sgRNA。