CN114908030B - 一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用 - Google Patents

一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在枯草芽孢杆菌表面展示β‑环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用。本发明首次以枯草芽孢杆菌的表面疏水蛋白bslA为锚定蛋白，将环糊精葡萄糖基转移酶展示到枯草芽孢杆菌细胞表面，通过基因工程手段将环糊精葡萄糖基转移酶基因片段与表面疏水蛋白bslA编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒pBE2R作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以在细胞表面展示环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。本发明所涉及的枯草芽孢杆菌工程菌表达体系具有表达稳定、产酶量高的特点，并且作为生物安全菌株，在食品和医药领域具有优势。

Description

一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重 组菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用。
背景技术
环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)属于糖基水解酶α-淀粉酶家族(G13)，作为一种多功能酶，能以淀粉及其衍生物为底物，催化歧化反应、环化反应和耦合反应三种转糖基反应和水解反应，其环化反应可催化淀粉转化为环糊精(CD)。工业生产中，CGTase是催化淀粉及其衍生物合成环糊精的关键酶。目前已从多种微生物中分离得到CGTase，包括芽孢杆菌、放线菌、古细菌等。CGTase的产量低、不可重复使用且稳定性差是限制其工业化生产的主要因素。
微生物表面展示技术是通过基因工程手段，将外源蛋白质以融合蛋白形式展示在微生物细胞的表面。与可溶性蛋白质和传统的固定化蛋白质相比，在细菌表面展示的蛋白质具有更好的可重复使用性和稳定性，并且在发酵过程中更容易与底物或配体结合。枯草芽孢杆菌细胞表面展示系统具有以下优势：(1)外源目的蛋白在表面展示的过程中无需穿膜过程，表面展示效率高；(2)可展示分子量较大的外源蛋白；(3)可展示多聚体外源蛋白；(4)对于许多生物技术应用，枯草芽孢杆菌菌体表面展示的蛋白质可保持较长时间的活性。因此，本发明提供了一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。
本发明要解决的技术问题是提供上述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌基因工程菌，在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶。
在一些实施例中，所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌是向整合型载体pBE2R中插入融合基因，构建得到重组载体；再将所得重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，即得。
在一些实施例中，所述融合基因是由锚定蛋白基因与β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段融合而成；在一些实施例中，所述融合基因是由锚定蛋白基因和β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段通过连接肽基因连接在一起；在一些实施例中，所述锚定蛋白基因为细胞表面疏水蛋白bslA基因，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述连接肽基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一些实施例中，所述重组载体为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的pBE2R-bslA-CGT。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，通过向整合型载体pBE2R中插入由锚定蛋白基因和β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段通过连接肽基因连接在一起而得到的融合基因，构建得到重组载体；再将所得重组载体转化到枯草芽孢杆菌中制得；
在一些实施例中，所述融合基因是由锚定蛋白基因与β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段融合而成；在一些实施例中，所述融合基因是由锚定蛋白基因和β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段通过连接肽基因连接在一起；在一些实施例中，所述锚定蛋白基因为细胞表面疏水蛋白bslA基因，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述连接肽基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在一些实施例中，所述重组载体为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的pBE2R-bslA-CGT。
在一些实施例中，所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法具体包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，以bslA-F和bslA-R为引物，PCR扩增表面疏水蛋白bslA的基因序列；
(2)以优化后的环状芽孢杆菌Bacilluscirculans 251环糊精葡萄糖基转移酶基因为模板，以CGTase-F和CGTase-R为引物，PCR扩增环糊精葡萄糖基转移酶基因片段的序列；
(3)以步骤(1)得到的表面疏水蛋白bslA的基因与步骤(2)得到的环糊精葡萄糖基转移酶基因片段为模板，以步骤(1)中bslA-F与步骤(2)中CGTase-R为上下游引物，通过重叠延伸(overlap)PCR技术扩增得到融合基因片段；
(4)以整合型载体pBE2R为模板，以pBE2R-F和pBE2R-R为引物，反向PCR扩增得到pBE2R质粒载体的线性化片段序列；
(5)将步骤(3)得到的融合基因片段与步骤(4)得到的pBE2R质粒载体的线性化片段进行无缝克隆连接接，并转入大肠杆菌DH5α中，筛选，得到重组质粒pBE2R-bslA-CGT；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒pBE2R-bslA-CGT转化到枯草芽孢杆菌感受态中，筛选，获得重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。
步骤(1)中，所述表面疏水蛋白bslA的基因的扩增引物如下：
bslA-F：gagaggaatgtacacatgaaacgcaaattattatcttctttggcaattagt(SEQ IDNo.6)；
bslA-R：gccttgcggttgcaacaaagaatctggctctgtttcttctgaacaacttgctcaattccgt tctcttgat(SEQ ID No.7)；其中，bslA-R带有连接肽基因(下划线部分)。
步骤(1)中，PCR扩增表面疏水蛋白bslA基因序列的反应体系如下：KOD FX DNAPolymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 1μL，10μmol/L上游引物(bslA-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(bslA-R)1.5μL，ddH2O 5μL；PCR反应程序如下：94℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；4℃保存。
步骤(2)中，所述环糊精葡萄糖基转移酶基因片段的扩增引物如下：
CGTase-F：aaagaatctggctctgtttcttctgaacaacttgctcaattccgttctcttgatatgaagaaatttctga(SEQ ID No.8)；其中，CGTase-F带有连接肽基因(下划线部分)；
CGTase-R：accttagtggtgatggtgatgatgtggctgccaattcacgttaatggtc(SEQ IDNo.9)。
步骤(2)中，PCR扩增环糊精葡萄糖基转移酶基因片段序列的反应体系如下：KODFX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 1μL，10μmol/L上游引物(CGTase-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(CGTase-R)1.5μL，ddH2O 5μL；PCR反应程序如下：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸2min40s，35个循环；4℃保存。
步骤(3)中，所述重叠延伸PCR技术扩增得到融合基因片段基因序列反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 2μL，10μmol/L上游引物(bslA-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(CGTase-R)1.5μL，ddH2O 4μL；PCR反应程序如下：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min35s，35个循环；4℃保存。
步骤(4)中，所述pBE2R质粒载体的线性化片段扩增引物如下：
pBE2R-F：aattggcagccacatcatcaccatcaccactaaggttatgtattaattgtagccgcgttctaac(SEQ ID No.10)；
pBE2R-R：atttgcgtttcatgtgtacattcctctcttacctataatggtacc(SEQ ID No.11)。
步骤(4)中，反向PCR扩增得到pBE2R质粒载体的线性化片段序列反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 1μL，10μmol/L上游引物(pBE2R-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(pBE2R-R)1.5μL，ddH2O 5μL；PCR反应程序如下：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸6min35s，40个循环；4℃保存。
步骤(5)中，筛选方法为通过浓度为100mg/mL的氨苄青霉素LB平板进行筛选。
步骤(6)中，筛选方法为通过浓度为10mg/mL的卡那霉素LB平板进行筛选。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵产β-环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。
在一些实施例中，所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌按照2％～8％的体积比接种到发酵培养基中；在一些实施例中，所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌按照4％～6％的体积比接种到发酵培养基中；在一些实施例中，所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌按照5％的体积比接种到发酵培养基中。
在一些实施例中，以重组枯草芽孢杆菌基因工程菌为发酵菌株，通过液态发酵产β-环糊精葡萄糖基转移酶；在一些实施例中，所述液态发酵种子液的培养时间为10～20h；在一些实施例中，所述液态发酵种子液的培养时间为13h；在一些实施例中，所述液体发酵培养基为TB液体培养基，各组分含量如下：丙三醇3～7mL/L，蛋白胨10～14g/L，酵母粉22～26g/L，KH2PO4 1.31～3.31g/L，K2HPO4 14.43～18.43g/L；在一些实施例中，所述液体发酵培养基为TB液体培养基，各组分含量如下：丙三醇5mL/L，蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4 16.43g/L。
在一些实施例中，所述发酵的温度为30～44℃；在一些实施例中，所述发酵的温度为35～39℃；在一些实施例中，所述发酵的温度为37℃。
在一些实施例中，所述发酵的时间为30～66h；在一些实施例中，所述发酵的时间为44～52h；在一些实施例中，所述发酵的时间为48h。
在一些实施例中，其特征在于，所述发酵的转速为150～250rpm；在一些实施例中，其特征在于，所述发酵的转速为170～210rpm；在一些实施例中，其特征在于，所述发酵的转速为180rpm。
本发明将CGTase展示在枯草芽孢杆菌细胞表面，然后投入以淀粉及其衍生物为底物的发酵体系中生产β-环糊精葡萄糖基转移酶，使酶可重复使用，并提高了酶的稳定性，同时降低了生产成本，这种简单高效的工艺有利于连续生产，从而为工业化大规模生产提供可能。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1.本发明首次以枯草芽孢杆菌的表面疏水蛋白bslA为锚定蛋白，将环糊精葡萄糖基转移酶展示到枯草芽孢杆菌细胞表面，通过基因工程手段将环糊精葡萄糖基转移酶基因片段与表面疏水蛋白bslA编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒pBE2R作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以在细胞表面展示环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
2、本发明所述的枯草芽孢杆菌工程菌表达体系由于其安全、无内毒素的特点，作为生物安全菌株，在食品和医药领域具有优势。
3、本发明构建的细胞表面稳定展示环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌工程菌，在不影响菌株本身生长的同时，还提高环糊精葡萄糖基转移酶的稳定性，使其可重复使用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为枯草芽孢杆菌表面疏水蛋白bslA基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为环糊精葡萄糖基转移酶基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为融合基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为pBE2R质粒载体的线性化片段的琼脂糖凝胶电泳图。
图5为pBE2R-bslA-CGT载体构建示意图。
图6为菌落PCR验证pBE2R质粒载体的融合蛋白部分片段的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为LB培养基摇瓶培养种子生长曲线图。
图8为不同接种时间下枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵酶活图。
图9为表面展示与游离表达环糊精葡萄糖基转移酶的酶活对比图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述质粒(pBE2R)购买于厂家为淼灵质粒平台(货号：P0331)。
下述实施例中所述枯草芽孢杆菌168和环状芽孢杆菌Bacilluscirculans 251均为现有的菌。
实施例1：构建重组质粒
(一)提取枯草芽孢杆菌基因组
使用TaKaRa公司提取细菌基因组试剂盒(MiniBEST Bacteria Genomic DNAExtraction Kit)，具体方法如下：
1.菌种活化：将原始枯草芽孢杆菌168在LB平板上划线培养，挑取单菌落接种到装有5mL LB培养基的50mL离心管培养，37℃，220rpm，12h。
2.取2mL菌液加入1.5mL离心管中，12,000rpm离心2分钟，弃上清。
3.加入500μL的Buffer BS重悬细胞、加入50μL的Lysozyme(20mg/mL)，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60分钟(温育期间可每隔20分钟颠倒混匀一次)。
4.加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K(20mg/mL)和10μL的RNase A(10mg/mL)，充分吸打混匀，于56℃水浴温育10分钟，使溶液呈透明澄清状。
5.加入200μL的Buffer GB和200μL的100％乙醇，充分混匀。
6.将溶液转移至另一1.5mL离心管中(已放置吸附柱)，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。
7.加入500μL的Buffer WA，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
8.加入700μL的Buffer WB，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。并重复一次。
9.将离心管12,000rpm离心2分钟。
10.将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，在吸附柱膜的中央加入50μL的灭菌水，室温静置5分钟。
11.12,000rpm离心2分钟洗脱DNA，得到枯草芽孢杆菌基因组。
(二)克隆得到表面疏水蛋白bslA基因片段
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行PCR扩增得到表面疏水蛋白bslA基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述表面疏水蛋白bslA的基因的扩增引物如下：
bslA-F：gagaggaatgtacacatgaaacgcaaattattatcttctttggcaattagt
bslA-R：gccttgcggttgcaacaaagaatctggctctgtttcttctgaacaacttgctcaattccgt tctcttgat
所述PCR反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 1μL，10μmol/L上游引物(bslA-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(bslA-R)1.5μL，ddH2O5μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：94℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环；4℃保存。
PCR结束后通过质量百分比浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图1所示，图1中，泳道1为DL500的DNA Marker，泳道2-5为表面疏水蛋白bslA基因片段；根据片段大小切下目的条带，使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit)回收切胶产物。
(三)克隆得到环糊精葡萄糖基转移酶基因片段
以优化后的环状芽孢杆菌Bacilluscirculans 251环糊精葡萄糖基转移酶基因为模板，设计引物进行PCR扩增得到环糊精葡萄糖基转移酶基因片段，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
所述环糊精葡萄糖基转移酶基因片段的扩增引物如下：
CGTase-F：aaagaatctggctctgtttcttctgaacaacttgctcaattccgttctcttgatatgaagaaatttctga
CGTase-R：accttagtggtgatggtgatgatgtggctgccaattcacgttaatggtc
所述PCR反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 1μL，10μmol/L上游引物(CGTase-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(CGTase-R)1.5μL，ddH2O 5μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸2min40s，35个循环；4℃保存。
PCR结束后通过质量百分比浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图2所示，图2中，泳道1为DL2000的DNA Marker，泳道2-5为环糊精葡萄糖基转移酶基因片段；根据片段大小切下目的条带，使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit)回收切胶产物。
(四)以步骤(二)得到的表面疏水蛋白bslA的基因与步骤(三)得到的环糊精葡萄糖基转移酶基因片段为模板，设计引物进行重叠延伸(overlap)PCR扩增得到融合基因片段，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述融合蛋白基因片段的扩增引物如下：
bslA-F：gagaggaatgtacacatgaaacgcaaattattatcttctttggcaattagt
CGTase-R：accttagtggtgatggtgatgatgtggctgccaattcacgttaatggtc
所述PCR反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 2μL，10μmol/L上游引物(bslA-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(CGTase-R)1.5μL，ddH2O 4μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min35s，35个循环；4℃保存。
PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图3所示，图3中，泳道1为DL2000的DNA Marker，泳道2-5为融合蛋白基因片段；根据片段大小切下目的条带，使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit)回收切胶产物。
(五)以整合型载体pBE2R为模板，设计引物进行反向PCR扩增得到pBE2R质粒载体的线性化片段序列；
所述pBE2R质粒载体的线性化片段序列的扩增引物如下：
pBE2R-F：aattggcagccacatcatcaccatcaccactaaggttatgtattaattgtagccgcgttctaac
pBE2R-R：atttgcgtttcatgtgtacattcctctcttacctataatggtacc
所述PCR反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，Templet 1μL，10μmol/L上游引物(pBE2R-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(pBE2R-R)1.5μL，ddH2O 5μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸6min35s，40个循环；4℃保存。
PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图4所示，图4中，泳道1为DL5000的DNA Marker，泳道2-5为pBE2R质粒载体的线性化片段；根据片段大小切下目的条带，使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒(MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit)回收切胶产物。
(六)融合基因片段与pBE2R质粒载体的线性化片段的无缝克隆连接
使用Vazyme公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒(ClonExpress II OneStep Cloning Kit)，具体方法如下：
1.于冰上配置无缝克隆连接体系，使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。
所述无缝克隆连接体系如下：pBE2R质粒载体的线性化片段3μL，融合基因片段1μL，5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，ddH2O 10μL。
2.37℃水浴30min，后立即置于冰上冷却5min。
3.取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞(提前10min于冰上解冻)，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。
4.42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却3min。
5.加入900μL LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h，220rpm。
6.5000rpm离心5min，弃900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在浓度为100mg/mL的氨苄青霉素LB平板上轻轻涂匀。
7.37℃培养箱中倒置培养12-16h，筛选转化子，得到重组质粒pBE2R-bslA-CGT，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，pBE2R-bslA-CGT载体构建如图5所示。
实施例2：枯草芽孢杆菌化转感受态细胞的制备
1.将原始枯草芽孢杆菌在LB平板上划线培养，挑取单菌落接种到装有5mL GMI溶液的50mL离心管培养，37℃，125rpm，16h。
所述GMI溶液的组分如下：无机盐母液9.6mL、20％葡萄糖2.5mL、5％酪蛋白水解液0.4mL、10％酵母提取物1mL、蒸馏水定容至100mL。
2.取2mL培养后的GMI溶液接种到装有18mL新鲜GMI溶液的250mL三角烧瓶中培养，37℃200rpm，3.5h，得到种子液。
3.取10mL种子液接种到装有90mL GMII溶液的500mL三角烧瓶中培养，37℃，200rpm，90min。
所述GMII溶液的组分如下：无机盐母液9.7mL、20％葡萄糖2.5mL、5％酪蛋白0.08mL，10％酵母提取物0.04mL、1M氯化镁0.25mL、1M氯化钙0.05mL、定容至100mL。
4.收集菌体至50mL离心管，4℃，8000rpm离心10min，保留10mL菌液重悬菌体，得到枯草芽孢杆菌化转感受态细胞。
所述无机盐母液的组分如下：无水磷酸氢二钾140g/L、无水磷酸二氢钾60g/L、硫酸铵20g/L、二水柠檬酸三钠10g/L、七水硫酸镁2g/L。
实施例3：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌中
1.将感受态细胞置于45℃水浴5min解冻。
2.将10μL重组质粒加入到500μL感受态细胞中，37℃，200rpm，90min。
3.取100μL感受态细胞，用无菌涂布棒在浓度为10mg/mL的卡那霉素LB平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养12-16h，筛选抗卡那霉素的菌株。
实施例4：阳性重组菌的鉴定
以上述阳性重组菌落DNA为模板，设计引物进行菌落PCR扩增验证质粒是否转化成功；
所述阳性重组菌落验证引物如下：
pBE2R-YZ-F：ttgccgtgatttcgtgtattattggtttactta(SEQ ID No.12)
pBE2R-YZ-R：cggcagtttacgagagagatgatagggt(SEQ ID No.13)
所述PCR反应体系如下：KOD FX DNA Polymerase 1μL，Buffer 25μL，dNTP 10μL，10μmol/L上游引物(pBE2R-YZ-F)1.5μL，10μmol/L下游引物(pBE2R-YZ-R)1.5μL，ddH2O 5μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸3min50s，35个循环；4℃保存。
PCR结束后通过质量百分比浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图6所示，图6中，泳道1为DL5000的DNA Marker，泳道2-4为菌落PCR得到pBE2R质粒载体的融合蛋白部分片段，从而验证质粒pBE2R-bslA-CGT已转入枯草芽孢杆菌中，得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
实施例5：阳性重组菌的发酵产β-环糊精葡萄糖基转移酶
1.将实施例4构建好的枯草芽孢杆菌基因工程菌接种于LB液体培养基(含浓度为10μg/mL的卡那霉素)，37℃，200rpm过夜培养13h，得到种子液。
2.将种子液按5％接种量转接到装有50mL TB培养基的250mL三角烧瓶中，37℃，180rpm培养48h。
所述LB液体培养基，组分如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
所述TB液体培养基，组份如下：丙三醇5mL/L，蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4 16.43g/L。
实施例6：环糊精葡萄糖基转移酶酶活检测
1.取1mL实施例5发酵完成的菌液于2mL离心管中，5000rpm离心10min，去上清。
2.将离心管中的菌泥用1mL的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(25mmol/L，pH5.5)重悬，得到粗酶液。
3.用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液配制1％的可溶性淀粉作为底物，取2mL底物溶液于4mL离心管，50℃孵育10min。
4.向底物溶液中加入0.1mL步骤2得到的粗酶液，以缓冲液为空白对照，精确反应10min。
5.向4mL离心管加入0.2mL 0.6mol/L HCl终止反应，然后加入0.5mL 0.6mol/LNa2CO3调pH至10.0。
6.向4mL离心管加入0.2mL 1.2mmol/L酚酞溶液，25℃条件下显色15min，在550nm处测定吸光值。
一个酶活单位(U)定义为在上述测定条件下1min内生成1μmβ-环糊精所需要的酶量。
结果表明，本发明所构建的环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌能够实现在枯草芽孢杆菌细胞表面展示环糊精葡萄糖基转移酶。环糊精葡萄糖基转移酶活可达7.135U/mL，具有广泛的应用前景。
对比例1
1.将实施例4构建好的枯草芽孢杆菌基因工程菌接种于装有50mL LB液体培养基(含浓度为10μg/mL的卡那霉素)的250mL三角烧瓶中，37℃，200rpm培养，不同时间点取样，测菌体浓度，结果如图7所示，0-7h为菌体延滞期，8-16h为对数生长期，17-23h进入稳定期。
2.选择处于对数生长期的种龄为9-16h的种子液，按5％接种量转接到装有50mLTB培养基的250mL三角烧瓶中，37℃，180rpm培养24h，按照实施例6的操作测环糊精葡萄糖基转移酶酶活，结果如图8所示，可以看出，对数中期的种子更有利于发酵产酶，以种龄13h的为最佳，此时对应的菌体浓度OD600约为0.544。
对比例2
1.将环糊精葡萄糖基转移酶基因与pBE2R质粒载体的线性化片段直接进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，筛选，得到重组质粒pBE2R-CGT；
2.将重组质粒pBE2R-CGT转化到枯草芽孢杆菌感受态中，筛选，获得游离表达环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
3.将此游离表达环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌与实施例4构建好的表面展示环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌按照实施例5的操作进行发酵，并按照实施例6的操作，分别取沉淀与上清液测环糊精葡萄糖基转移酶酶活，结果如图9所示，可以看出，在枯草芽孢杆菌细胞表面展示的环糊精葡萄糖基转移酶酶活更高，达到7.135U/mL，比游离表达环糊精葡萄糖基转移酶高约3倍。
本发明提供了一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶的重组菌及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaacgca aattattatc ttctttggca attagtgcat taagtctcgg gttactcgtt 60
tctgcaccta cagcttcttt cgcggctgaa tctacatcaa ctaaagctca tactgaatcc 120
actatgagaa cacagtctac agcttcattg ttcgcaacaa tcactggcgc cagcaaaacg 180
gaatggtctt tctcagatat cgaattgact taccgtccaa acacgcttct cagccttggc 240
gttatggagt ttacattgcc aagcggattt actgcaaaca cgaaagacac attgaacgga 300
aatgccttgc gtacaacaca gatcctcaat aacgggaaaa cagtaagagt tcctttggca 360
cttgatttgt taggagctgg cgaattcaaa ttaaaactga ataacaaaac acttcctgcc 420
gctggtacat atactttccg tgcggagaat aaatcattaa gcatcggaaa taaattttac 480
gcagaagcca gcattgacgt ggctaagcgc agcactcctc cgactcagcc ttgcggttgc 540
aac 543
<210> 2
<211> 2139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagaaat ttctgaaatc gacagctgcg cttgccctgg gattatcgct gacgttcggg 60
cttttcagcc ctgcccaggc cgcgccggat acctcggtat ccaacaagca aaatttcagc 120
accgacgtca tctatcaaat tttcaccgac aggttttcgg acggcaatcc cgccaacaat 180
ccgaccggcg cggcgtttga cggaacctgc acgaacctcc ggctgtattg cggcggcgac 240
tggcagggca tcatcaacaa aatcaacgac ggttacctga ccgggatggg cgttaccgcc 300
atctggatct cccagccggt cgaaaacatc tacagcatca tcaattattc cggcgtaaac 360
aacacggcct atcacggcta ctgggcccgg gacttcaaga agacgaatcc ggcctacggc 420
acgattgcgg acttccagaa cctgatcgcc gccgcgcatg caaaaaacat caaagtcatt 480
atcgactttg ccccgaacca tacgtcgccc gcctcgtccg accagccttc ctttgcggaa 540
aacggccggc tgtacgataa cggcacgctg ctcgggggat acacgaacga tacgcagaac 600
ctgttccacc ataacggcgg cacggacttt tccacgaccg aaaacggcat ctacaaaaac 660
ctgtacgatc tcgccgacct gaaccataac aacagcaccg tggacgtcta cttgaaggac 720
gcgatcaaaa tgtggctgga cctcggcatc gacggcatcc gcatggatgc ggtgaagcat 780
atgccgttcg gctggcagaa gagctttatg gctgccgtca acaactataa gccggtcttt 840
accttcggcg aatggttcct gggcgtaaat gaagtgagcc cggaaaacca taagtttgcc 900
aacgaatccg gcatgagcct gcttgatttc cgttttgccc aaaaggtgcg gcaggtgttc 960
cgggacaaca ccgacaatat gtacggcctg aaggcgatgc tggagggctc cgcagccgat 1020
tacgcccagg tggatgacca ggtgacgttc atcgacaacc atgacatgga gcgtttccac 1080
gcaagcaatg caaaccgccg gaagctggag caagcgcttg cgttcacgct gacctcgcgc 1140
ggcgtccccg ccatttatta cggcaccgag cagtacatgt cgggcgggac cgatccggac 1200
aaccgggcgc ggatcccttc cttctccacg tcgacgaccg cctatcaggt cattcaaaag 1260
ctggcgccgc tgcgcaagtg caacccggcc atcgcctacg gatcgacgca ggagcgctgg 1320
atcaacaacg acgtgctcat ttatgagcgc aaattcggca gcaacgttgc cgtcgttgcc 1380
gtcaaccgca atttaaacgc gccggcttcc atttcgggac ttgtcacttc cctgccgcaa 1440
ggcagctaca acgacgtcct tggcggcctt ctgaacggca acacgttatc ggtaggctcc 1500
ggcggggccg cctccaattt cacgcttgcg gccggcggca cggcggtgtg gcagtacacc 1560
gcggctacgg cgacgccgac catcgggcat gtcgggccga tgatggccaa gccgggcgtg 1620
acgatcacga tcgacggccg cggcttcggc tctagcaaag gcaccgtcta cttcggtacg 1680
acggcggtga gcggggcgga catcacgtct tgggaagaca cgcagatcaa agtgaaaatt 1740
ccggccgtcg caggcggcaa ctacaacatt aaagtcgcaa acgctgccgg aacggcaagc 1800
aatgtgtatg acaacttcga ggtattgtcc ggagaccagg tcagcgtccg cttcgtggtc 1860
aacaacgcga cgacggccct tgggcaaaat gtgtacctga cgggcagtgt cagcgagctg 1920
gggaactggg acccggcaaa agcaatcggg ccgatgtaca atcaggtcgt ttaccaatat 1980
ccgaactggt attatgacgt cagcgttccg gccggcaaaa cgatcgagtt caagtttttg 2040
aaaaaacaag gctccaccgt cacgtgggaa ggcggcagca accacacctt caccgcgccg 2100
tccagcggca ccgcgaccat taacgtgaat tggcagcca 2139
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaagaatctg gctctgtttc ttctgaacaa cttgctcaat tccgttctct tgat 54
<210> 4
<211> 2655
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaacgca aattattatc ttctttggca attagtgcat taagtctcgg gttactcgtt 60
tctgcaccta cagcttcttt cgcggctgaa tctacatcaa ctaaagctca tactgaatcc 120
actatgagaa cacagtctac agcttcattg ttcgcaacaa tcactggcgc cagcaaaacg 180
gaatggtctt tctcagatat cgaattgact taccgtccaa acacgcttct cagccttggc 240
gttatggagt ttacattgcc aagcggattt actgcaaaca cgaaagacac attgaacgga 300
aatgccttgc gtacaacaca gatcctcaat aacgggaaaa cagtaagagt tcctttggca 360
cttgatttgt taggagctgg cgaattcaaa ttaaaactga ataacaaaac acttcctgcc 420
gctggtacat atactttccg tgcggagaat aaatcattaa gcatcggaaa taaattttac 480
gcagaagcca gcattgacgt ggctaagcgc agcactcctc cgactcagcc ttgcggttgc 540
aacaaagaat ctggctctgt ttcttctgaa caacttgctc aattccgttc tcttgatgcg 600
ccggatacct cggtatccaa caagcaaaat ttcagcaccg acgtcatcta tcaaattttc 660
accgacaggt tttcggacgg caatcccgcc aacaatccga ccggcgcggc gtttgacgga 720
acctgcacga acctccggct gtattgcggc ggcgactggc agggcatcat caacaaaatc 780
aacgacggtt acctgaccgg gatgggcgtt accgccatct ggatctccca gccggtcgaa 840
aacatctaca gcatcatcaa ttattccggc gtaaacaaca cggcctatca cggctactgg 900
gcccgggact tcaagaagac gaatccggcc tacggcacga ttgcggactt ccagaacctg 960
atcgccgccg cgcatgcaaa aaacatcaaa gtcattatcg actttgcccc gaaccatacg 1020
tcgcccgcct cgtccgacca gccttccttt gcggaaaacg gccggctgta cgataacggc 1080
acgctgctcg ggggatacac gaacgatacg cagaacctgt tccaccataa cggcggcacg 1140
gacttttcca cgaccgaaaa cggcatctac aaaaacctgt acgatctcgc cgacctgaac 1200
cataacaaca gcaccgtgga cgtctacttg aaggacgcga tcaaaatgtg gctggacctc 1260
ggcatcgacg gcatccgcat ggatgcggtg aagcatatgc cgttcggctg gcagaagagc 1320
tttatggctg ccgtcaacaa ctataagccg gtctttacct tcggcgaatg gttcctgggc 1380
gtaaatgaag tgagcccgga aaaccataag tttgccaacg aatccggcat gagcctgctt 1440
gatttccgtt ttgcccaaaa ggtgcggcag gtgttccggg acaacaccga caatatgtac 1500
ggcctgaagg cgatgctgga gggctccgca gccgattacg cccaggtgga tgaccaggtg 1560
acgttcatcg acaaccatga catggagcgt ttccacgcaa gcaatgcaaa ccgccggaag 1620
ctggagcaag cgcttgcgtt cacgctgacc tcgcgcggcg tccccgccat ttattacggc 1680
accgagcagt acatgtcggg cgggaccgat ccggacaacc gggcgcggat cccttccttc 1740
tccacgtcga cgaccgccta tcaggtcatt caaaagctgg cgccgctgcg caagtgcaac 1800
ccggccatcg cctacggatc gacgcaggag cgctggatca acaacgacgt gctcatttat 1860
gagcgcaaat tcggcagcaa cgttgccgtc gttgccgtca accgcaattt aaacgcgccg 1920
gcttccattt cgggacttgt cacttccctg ccgcaaggca gctacaacga cgtccttggc 1980
ggccttctga acggcaacac gttatcggta ggctccggcg gggccgcctc caatttcacg 2040
cttgcggccg gcggcacggc ggtgtggcag tacaccgcgg ctacggcgac gccgaccatc 2100
gggcatgtcg ggccgatgat ggccaagccg ggcgtgacga tcacgatcga cggccgcggc 2160
ttcggctcta gcaaaggcac cgtctacttc ggtacgacgg cggtgagcgg ggcggacatc 2220
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aacattaaag tcgcaaacgc tgccggaacg gcaagcaatg tgtatgacaa cttcgaggta 2340
ttgtccggag accaggtcag cgtccgcttc gtggtcaaca acgcgacgac ggcccttggg 2400
caaaatgtgt acctgacggg cagtgtcagc gagctgggga actgggaccc ggcaaaagca 2460
atcgggccga tgtacaatca ggtcgtttac caatatccga actggtatta tgacgtcagc 2520
gttccggccg gcaaaacgat cgagttcaag tttttgaaaa aacaaggctc caccgtcacg 2580
tgggaaggcg gcagcaacca caccttcacc gcgccgtcca gcggcaccgc gaccattaac 2640
gtgaattggc agcca 2655
<210> 5
<211> 9339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatgtatcaa gataagaaag aacaagttca aaaccatcaa aaaaagacac cttttcaggt 60
gcttttttta ttttataaac tcattccctg atctcgactt cgttcttttt ttacctctcg 120
gttatgagtt agttcaaatt cgttcttttt aggttctaaa tcgtgttttt cttggaattg 180
tgctgtttta tcctttacct tgtctacaaa ccccttaaaa acgtttttaa aggcttttaa 240
gccgtctgta cgttccttaa ggaattcgag ctcagcttta ttgagtggat gattatattc 300
cttttgatag gtggtatgtt ttcgcttgaa cttttaaata cagccattga acatacggtt 360
gatttaataa ctgacaaaca tcaccctctt gctaaagcgg ccaaggacgc tgccgccggg 420
gctgtttgcg tttttgccgt gatttcgtgt attattggtt tacttatttt tttgccaaag 480
ctgtaatggc tgaaaattct tacatttatt ttacattttt agaaatgggc gtgaaaaaaa 540
gcgcgcgatt atgtaaaata taaagtgata gcggtaccat tataggtaag agaggaatgt 600
acacatgaaa cgcaaattat tatcttcttt ggcaattagt gcattaagtc tcgggttact 660
cgtttctgca cctacagctt ctttcgcggc tgaatctaca tcaactaaag ctcatactga 720
atccactatg agaacacagt ctacagcttc attgttcgca acaatcactg gcgccagcaa 780
aacggaatgg tctttctcag atatcgaatt gacttaccgt ccaaacacgc ttctcagcct 840
tggcgttatg gagtttacat tgccaagcgg atttactgca aacacgaaag acacattgaa 900
cggaaatgcc ttgcgtacaa cacagatcct caataacggg aaaacagtaa gagttccttt 960
ggcacttgat ttgttaggag ctggcgaatt caaattaaaa ctgaataaca aaacacttcc 1020
tgccgctggt acatatactt tccgtgcgga gaataaatca ttaagcatcg gaaataaatt 1080
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gcttttcagc cctgcccagg ccgcgccgga tacctcggta tccaacaagc aaaatttcag 1320
caccgacgtc atctatcaaa ttttcaccga caggttttcg gacggcaatc ccgccaacaa 1380
tccgaccggc gcggcgtttg acggaacctg cacgaacctc cggctgtatt gcggcggcga 1440
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caacacggcc tatcacggct actgggcccg ggacttcaag aagacgaatc cggcctacgg 1620
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tatcgacttt gccccgaacc atacgtcgcc cgcctcgtcc gaccagcctt cctttgcgga 1740
aaacggccgg ctgtacgata acggcacgct gctcggggga tacacgaacg atacgcagaa 1800
cctgttccac cataacggcg gcacggactt ttccacgacc gaaaacggca tctacaaaaa 1860
cctgtacgat ctcgccgacc tgaaccataa caacagcacc gtggacgtct acttgaagga 1920
cgcgatcaaa atgtggctgg acctcggcat cgacggcatc cgcatggatg cggtgaagca 1980
tatgccgttc ggctggcaga agagctttat ggctgccgtc aacaactata agccggtctt 2040
taccttcggc gaatggttcc tgggcgtaaa tgaagtgagc ccggaaaacc ataagtttgc 2100
caacgaatcc ggcatgagcc tgcttgattt ccgttttgcc caaaaggtgc ggcaggtgtt 2160
ccgggacaac accgacaata tgtacggcct gaaggcgatg ctggagggct ccgcagccga 2220
ttacgcccag gtggatgacc aggtgacgtt catcgacaac catgacatgg agcgtttcca 2280
cgcaagcaat gcaaaccgcc ggaagctgga gcaagcgctt gcgttcacgc tgacctcgcg 2340
cggcgtcccc gccatttatt acggcaccga gcagtacatg tcgggcggga ccgatccgga 2400
caaccgggcg cggatccctt ccttctccac gtcgacgacc gcctatcagg tcattcaaaa 2460
gctggcgccg ctgcgcaagt gcaacccggc catcgcctac ggatcgacgc aggagcgctg 2520
gatcaacaac gacgtgctca tttatgagcg caaattcggc agcaacgttg ccgtcgttgc 2580
cgtcaaccgc aatttaaacg cgccggcttc catttcggga cttgtcactt ccctgccgca 2640
aggcagctac aacgacgtcc ttggcggcct tctgaacggc aacacgttat cggtaggctc 2700
cggcggggcc gcctccaatt tcacgcttgc ggccggcggc acggcggtgt ggcagtacac 2760
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gacgatcacg atcgacggcc gcggcttcgg ctctagcaaa ggcaccgtct acttcggtac 2880
gacggcggtg agcggggcgg acatcacgtc ttgggaagac acgcagatca aagtgaaaat 2940
tccggccgtc gcaggcggca actacaacat taaagtcgca aacgctgccg gaacggcaag 3000
caatgtgtat gacaacttcg aggtattgtc cggagaccag gtcagcgtcc gcttcgtggt 3060
caacaacgcg acgacggccc ttgggcaaaa tgtgtacctg acgggcagtg tcagcgagct 3120
ggggaactgg gacccggcaa aagcaatcgg gccgatgtac aatcaggtcg tttaccaata 3180
tccgaactgg tattatgacg tcagcgttcc ggccggcaaa acgatcgagt tcaagttttt 3240
gaaaaaacaa ggctccaccg tcacgtggga aggcggcagc aaccacacct tcaccgcgcc 3300
gtccagcggc accgcgacca ttaacgtgaa ttggcagcca catcatcacc atcaccacta 3360
aggttatgta ttaattgtag ccgcgttcta acgacaatat gtacaagcct aattgtgtag 3420
catctggctt actgaagcag accctatcat ctctctcgta aactgccgtc agagtcggtt 3480
tggttggacg aaccttctga gtttctggta acgccgttcc gcaccccgga aatggtcagc 3540
gaaccaatca gcagggtcat cgctagccag atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc 3600
atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa 3660
gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc 3720
cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcacc attccttgcg gcggcggtgc 3780
tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc 3840
gtcgatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 3900
acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 3960
cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 4020
gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat 4080
aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 4140
ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 4200
aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 4260
tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 4320
agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 4380
cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 4440
taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 4500
tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 4560
tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 4620
cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 4680
gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 4740
cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa 4800
actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 4860
ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 4920
tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 4980
tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 5040
acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 5100
ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 5160
ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 5220
ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 5280
gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 5340
ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 5400
aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 5460
gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 5520
gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 5580
aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 5640
cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 5700
tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 5760
ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 5820
atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 5880
cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 5940
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 6000
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 6060
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg atttcacttt ttgcattcta caaactgcat 6120
aactcatatg taaatcgctc ctttttaggt ggcacaaatg tgaggcattt tcgctctttc 6180
cggcaaccac ttccaagtaa agtataacac actatacttt atattcataa agtgtgtgct 6240
ctgcgaggct gtcggcagtg ccgaccaaaa ccataaaacc tttaagacct ttcttttttt 6300
tacgagaaaa aagaaacaaa aaaacctgcc ctctgccacc tcagcaaagg ggggttttgc 6360
tctcgtgctc gtttaaaaat cagcaaggga caggtagtat tttttgagaa gatcactcaa 6420
aaaatctcca cctttaaacc cttgccaatt tttattttgt ccgttttgtc tagcttaccg 6480
aaagccagac tcagcaagaa taaaattttt attgtctttc ggttttctag tgtaacggac 6540
aaaaccactc aaaataaaaa agatacaaga gaggtctctc gtatctttta ttcagcaatc 6600
gcgcccgatt gctgaacaga ttaataatag attttagctt tttatttgtt gaaaaaagct 6660
aatcaaattg ttgtcgggat caattactgc aaagtctcgt tcatcccacc actgatcttt 6720
taatgatgta ttggggtgca aaatgcccaa aggcttaata tgttgatata attcatcaat 6780
tccctctact tcaatgcggc aactagcagt accagcaata aacgactccg cacctgtaca 6840
aaccggtgaa tcattactac gagagcgcca gcttcatcac ttgcctccca tagatgaatc 6900
cgaacctcat tacacattag aactgcgaat ccatcttcat ggtgaaccaa agtgaaacct 6960
agtttatcgc aataaaaacc tatactcttt ttaatatccc cgactggcaa tgccgggata 7020
gactgtaaca ttctcacgca taaaatcccc tttcattttc taatgtaaat ctattacctt 7080
attattaatt caattcgctc ataattaatc ctttttctta ttacgcaaaa tggcccgatt 7140
taagcacacc ctttattccg ttaatgcgcc atgacagcca tgataattac taatactagg 7200
agaagttaat aaatacgtaa ccaacatgat taacaattat tagaggtcat cgttcaaaat 7260
ggtatgcgtt ttgacacatc cactatatat ccgtgtcgtt ctgtccactc ctgaatccca 7320
ttccagaaat tctctagcga ttccagaagt ttctcagagt cggaaagttg accagacatt 7380
acgaactggc acagatggtc ataacctgaa ggaagatctg attgcttaac tgcttcagtt 7440
aagaccgaag cgctcgtcgt ataacagatg cgatgatgca gaccaatcaa catggcacct 7500
gccattgcta cctgtacagt caaggatggt agaaatgttg tcggtccttg cacacgaata 7560
ttacgccatt tgcctgcata ttcaaacagc tcttctacga taagggcaca aatcgcatcg 7620
tggaacgttt gggcttctac cgatttagca gtttgataca ctttctctaa gtatccacct 7680
gaatcataaa tcggcaaaat agagaaaaat tgaccatgtg taagcggcca atctgattcc 7740
acctgagatg cataatctag tagaatctct tcgctatcaa aattcacttc caccttccac 7800
tcaccggttg tccattcatg gctgaactct gcttcctctg ttgacatgac acacatcatc 7860
tcaatatccg aatagggccc atcagtctga cgaccaagag agccataaac accaatagcc 7920
ttaacatcat ccccatattt atccaatatt cgttccttaa tttcatgaac aatcttcatt 7980
ctttcttctc tagtcattat tattggtcca ttcactattc tcattccctt ttcagataat 8040
tttagatttg cttttctaaa taagaatatt tggagagcac cgttcttatt cagctattaa 8100
taactcgtct tcctaagcat ccttcaatcc ttttaataac aattatagca tctaatcttc 8160
aacaaactgg cccgtttgtt gaactactct ttaataaaat aatttttccg ttcccaattc 8220
cacattgcaa taatagaaaa tccatcttca tcggcttttt cgtcatcatc tgtatgaatc 8280
aaatcgcctt cttctgtgtc atcaaggttt aattttttat gtatttcttt taacaaacca 8340
ccataggaga ttaacctttt acggtgtaaa ccttcctcca aatcagacaa acgtttcaaa 8400
ttcttttctt catcatcggt cataaaatcc gtatccttta caggatattt tgcagtttcg 8460
tcaattgccg attgtatatc cgatttatat ttatttttcg gtcgaatcat ttgaactttt 8520
acatttggat catagtctaa tttcattgcc tttttccaaa attgaatcca ttgtttttga 8580
ttcacgtagt tttctgtatt cttaaaataa gttggttcca cacataccaa tacatgcatg 8640
tgctgattat aagaattatc tttattattt attgtcactt ccgttgcacg cataaaacca 8700
acaagatttt tattaatttt tttatattgc atcattcggc gaaatccttg agccatatct 8760
gacaaactct tatttaattc ttcgccatca taaacatttt taactgttaa tgtgagaaac 8820
aaccaacgaa ctgttggctt ttgtttaata acttcagcaa caaccttttg tgactgaatg 8880
ccatgtttca ttgctctcct ccagttgcac attggacaaa gcctggattt acaaaaccac 8940
actcgataca actttctttc gcctgtttca cgattttgtt tatactctaa tatttcagca 9000
caatctttta ctctttcagc ctttttaaat tcaagaatat gcagaagttc aaagtaatca 9060
acattagcga ttttcttttc tctccatggt ctcacttttc cactttttgt cttgtccact 9120
aaaacccttg atttttcatc tgaataaatg ctactattag gacacataat attaaaagaa 9180
acccccatct atttagttat ttgtttagtc acttataact ttaacagatg gggtttttct 9240
gtgcaaccaa ttttaagggt tttcaatact ttaaaacaca tacataccaa cacttcaacg 9300
cacctttcag caactaaaat aaaaatgacg ttatttcta 9339
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagaggaatg tacacatgaa acgcaaatta ttatcttctt tggcaattag t 51
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccttgcggt tgcaacaaag aatctggctc tgtttcttct gaacaacttg ctcaattccg 60
ttctcttgat 70
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaagaatctg gctctgtttc ttctgaacaa cttgctcaat tccgttctct tgatatgaag 60
aaatttctga 70
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accttagtgg tgatggtgat gatgtggctg ccaattcacg ttaatggtc 49
<210> 10
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattggcagc cacatcatca ccatcaccac taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 60
taac 64
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atttgcgttt catgtgtaca ttcctctctt acctataatg gtacc 45
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgccgtgat ttcgtgtatt attggtttac tta 33
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggcagttta cgagagagat gatagggt 28

Claims (8)

1.一种重组枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，在枯草芽孢杆菌表面展示β-环糊精葡萄糖基转移酶；
向整合型载体pBE2R中插入融合基因，构建得到重组载体；再将所得重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，即得重组枯草芽孢杆菌基因工程菌；
所述融合基因是由锚定蛋白基因和β-环糊精葡萄糖基转移酶基因片段通过连接肽基因连接在一起；
其中，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌在发酵产β-环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌基因工程菌按照2%~8%的体积比接种到发酵培养基中。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，以重组枯草芽孢杆菌基因工程菌为发酵菌株，通过液态发酵产β-环糊精葡萄糖基转移酶。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，液体发酵培养基为TB液体培养基，各组分含量如下：丙三醇 3~7mL/L，蛋白胨10~14g/L，酵母粉22~26g/L，KH2PO4 1.31~3.31g/L，K2HPO414.43~18.43g/L。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述发酵的温度为30~44℃。
7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述发酵的时间为30~66h。
8.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述发酵的转速为150~250rpm。
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