CN110684676B - 一种低含量羟基酸杂质的长链二元酸及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低含量羟基酸杂质的长链二元酸及其生产方法，具体涉及利用同源重组方法制备长链二元酸菌株、利用该菌株发酵生产低含量羟基酸杂质的长链二元酸。本发明涉及一种产长链二元酸重组微生物，其具有增加的乙醇脱氢酶活性及任选具有降低的乙酰辅酶A氧化酶活性。本发明还涉及使用所述产长链二元酸重组微生物生产长链二元酸的方法和用途。

Description

一种低含量羟基酸杂质的长链二元酸及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种低含量羟基酸杂质的长链二元酸及其生产方法，以及利用同源重组方法制备长链二元酸菌株、利用该菌株生产低羟基酸杂质含量的长链二元酸的方法。

背景技术

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。长链二元酸作为重要的单体原料，广泛用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、防腐剂、香料、润滑剂、塑化剂等。

长期以来，长链二元酸经由石油通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法面临多种挑战，化学合成法得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物，因此需要复杂的后续提取纯化步骤，对于生产工艺和生产成本而言，都是巨大的障碍。采用微生物发酵技术生产长链二元酸，因其产生的污染低、环境友好、能够合成化学合成方法难以合成的产物如12碳以上的长链二元酸且纯度高等特点，较传统的化学合成法具有明显的优势。

此前，二元酸菌种的改良大多通过传统的随机诱变或采用基因工程的方法得以实现，由于诱变本身随机性的特点，对筛选通量有很高的要求，而且每一次对于性状改变都要求新一轮的诱变筛选，在技术上已经成为重要的限制因素。采用基因工程的手段可以对菌株进行有针对性的遗传改造，从而获得产率更高的优良菌株。长链二元酸微生物发酵法生产方法主要为烷烃经ω-氧化生成。继而又可以经过β-氧化途径而被降解，尽管较传统化学法产生的二元酸纯度高，但发酵过程中仍然会产生一些杂酸，杂酸的存在会使后续的提取纯化工艺面临诸多挑战，特别是在除菌、过滤等处理阶段，很难有效分离长链二元酸与其他杂质，大大降低了生产效率和产品收率。长链二元酸产品或粗品因存在杂质而造成的产品质量问题给下游客户带来了很大困扰，因此降低杂酸的含量成为生物合成法面临的重要课题，在一定程度上影响了生物法长链二元酸产业的发展。

以往的研究表明，可以通过增强ω-氧化途径并抑制β-氧化途径的手段来提高长链二元酸的产率。如Coginis公司的Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)报导敲除POX4和POX5各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率。进一步过量表达ω-氧化途径中的限速步骤的两个关键酶P450及氧化还原酶CPR-a基因，可以使产量得到有效提升。赖小勤等(中国发明专利CN103992959B)报道向二元酸生产菌株中引入一个拷贝的CYP52A14基因也可以有效提高二元酸的转化率和生产效率。另外清华大学曹竹安等人(Biotechnol.J.,1,68-74,2006)发现敲除乙酰辅酶A由过氧化物酶体向线粒体运输过程中的关键基因CAT中的一个拷贝，从而部分阻断乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，也可以有效降低二元酸的降解，从而使二元酸产量得到显著提高。

然而，采用基因工程的手段改造二元酸生产菌株以降低羟基酸含量的研究尚未见有报道。本领域依然存在对杂质含量低的长链二元酸产品以及发酵生产这类产品的菌株、其制备方法的需求。

发明内容

本发明涉及一种产长链二元酸重组微生物，其具有增加的乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1)活性，和任选地，具有降低的乙酰辅酶A氧化酶(EC1.3.3.6)活性。

在一些实施方案中，本发明所述产长链二元酸重组微生物具有过表达的ADH基因或其同源基因。

在一些实施方案中，本发明所述产长链二元酸重组微生物中POX4基因或其同源基因被弱化，例如被失活或抑制。

在一些实施方案中，本发明所述产长链二元酸重组微生物中，POX4基因或其同源基因被ADH基因或其同源基因替换，例如所述产长链二元酸重组微生物基因组内的一个拷贝的POX4基因或其同源基因被一个拷贝的ADH基因或其同源基因替换。

本发明进一步涉及一种利用所述产长链二元酸重组微生物生产长链二元酸的方法，包括在适于所述产长链二元酸重组微生物生长的条件下培养所述产长链二元酸重组微生物的步骤，任选地，还包括从培养产物中分离和/或纯化长链二元酸的步骤。

本发明进一步涉及一种生产长链二元酸的方法，包括培养本发明所述产长链二元酸重组微生物，任选地，还包括分离、提取和/或纯化长链二元酸。

在一些实施方案中，利用本发明所述产长链二元酸重组微生物生产的长链二元酸中羟基酸杂质含量显著降低，例如相对于乙醇脱氢酶活性未增加的(例如ADH基因未过表达)和/或乙酰辅酶A氧化酶活性未降低(例如POX4基因未被弱化)的微生物，例如野生型或起始微生物。

在一些实施方案中，利用所述产长链二元酸重组微生物生产的长链二元酸中羟基酸杂质含量相对于POX4基因未被替换例如未被ADH基因替换的微生物显著降低。

在一些实施方案中，所述产长链二元酸重组微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属或耶氏酵母属中的任意一种；更优选地，其中所述微生物是酵母菌；更优选地，其中所述微生物选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

在一些实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸，优选C9～C18长链二元酸，更优选十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种；更优选地，所述长链二元酸选自十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，或者正十碳至十六碳二元酸中的至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种或多种。

在一些实施方案中，所述羟基酸杂质包括含有一个羧基(-COOH)的羟基脂肪酸。

在一些实施方案中，所述羟基脂肪酸含有1个端羧基和1个端羟基。

在一些实施方案中，所述羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)_n-COOH，其中n≥7。

在一些实施方案中，所述羟基脂肪酸包括九碳羟基脂肪酸、十碳羟基脂肪酸、十一碳羟基脂肪酸、十二碳羟基脂肪酸、十三碳羟基脂肪酸、十四碳羟基脂肪酸、十五碳羟基脂肪酸、十六碳羟基脂肪酸、十七碳羟基脂肪酸、十八碳羟基脂肪酸、或十九碳羟基脂肪酸中的任意一种或多种。

在一些实施方案中，利用本发明所述具有增加的乙醇脱氢酶活性及任选具有降低的乙酰辅酶A氧化酶活性的产长链二元酸重组微生物通过发酵生产长链二元酸时，相对于乙醇脱氢酶活性未增加的和/或乙酰辅酶A氧化酶活性未降低的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少10％，优选至少20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

在一些实施方案中，利用本发明所述产长链二元酸重组微生物(例如其中POX4基因或其同源基因被ADH基因或其同源基因替换)通过发酵生产长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量相对于POX4基因或其同源基因未被替换例如未被ADH基因或其同源基因替换的微生物降低至少10％，优选至少20％，优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

在一些实施方案中，利用本发明所述产长链二元酸重组微生物生产长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质的含量降低至3％以下，其中百分比为发酵液中羟基酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

在一些实施方案中，利用本发明所述产长链二元酸重组微生物发酵生产的长链二元酸含有羟基脂肪酸杂质，所述羟基脂肪酸杂质的含量降低至10000ppm以下，优选8000ppm、4000ppm、2000ppm、300ppm、250ppm、200ppm、150ppm以下或更低。

在一些实施方案中，当发酵生产的长链二元酸是十二碳长链二元酸时，羟基脂肪酸杂质主要为十二碳羟基脂肪酸，所述十二碳羟基脂肪酸杂质的含量低于4000ppm。

在一些实施方案中，当发酵生产的长链二元酸是十碳长链二元酸时，羟基脂肪酸杂质主要为十碳羟基脂肪酸，所述十碳羟基脂肪酸杂质的含量低于2000ppm。

在一些实施方案中，当发酵生产的长链二元酸是十六碳长链二元酸时，羟基脂肪酸杂质主要为十六碳羟基脂肪酸，所述十六碳羟基脂肪酸杂质的含量低于9000ppm。

本发明进一步涉及一种改造产长链二元酸微生物的方法，包括增强乙醇脱氢酶活性，和任选地，降低乙酰辅酶A氧化酶活性。

在一个实施方案中，本发明所述改造产长链二元酸微生物的方法包括用ADH基因或其同源基因替换所述产长链二元酸微生物基因组内的POX4基因或其同源基因的步骤，优选采用同源重组的方式进行。

在一些实施方案中，利用本发明所述改造的产长链二元酸微生物相对于改造前的微生物(例如POX4基因未被替换例如未被ADH基因替换的微生物)，生产的长链二元酸中羟基酸杂质含量显著降低。

本发明进一步涉及一种低含量羟基酸杂质的长链二元酸，所述长链二元酸中含有的羟基酸杂质的含量大于0，且在10000ppm以下，优选4000ppm以下，更优选300ppm以下，并且所述羟基酸杂质包括含有一个羧基的羟基脂肪酸。

在一些实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸，优选选自C9～C18的长链二元酸，更优选选自十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种；更优选地，所述长链二元酸选自十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种或者正十碳至十六碳二元酸中的至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。

在一些实施方案中，所述羟基脂肪酸含有1个端羧基和1个端羟基，所述羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)_n-COOH，其中n≥7。优选地，所述羟基酸杂质包括九碳羟基脂肪酸、十碳羟基脂肪酸、十一碳羟基脂肪酸、十二碳羟基脂肪酸、十三碳羟基脂肪酸、十四碳羟基脂肪酸、十五碳羟基脂肪酸、十六碳羟基脂肪酸、十七碳羟基脂肪酸、十八碳羟基脂肪酸、或十九碳羟基脂肪酸中的任意一种。

在一些实施方案中，当所述长链二元酸为十二碳二元酸时，羟基酸杂质主要为十二碳羟基脂肪酸，所述十二碳羟基脂肪酸杂质的含量低于4000ppm，优选低于3000ppm，2000ppm，1000ppm，500ppm，300ppm，200ppm，150ppm或更低。

在一些实施方案中，当所述长链二元酸为十碳二元酸时，羟基酸杂质主要为十碳羟基脂肪酸，所述十碳羟基脂肪酸杂质的含量低于2000ppm，优选低于1500ppm，1000ppm，500ppm，300ppm，200ppm，150ppm或更低。

在一些实施方案中，当所述长链二元酸为十六碳二元酸时，羟基酸杂质主要为十六碳羟基脂肪酸，所述十六碳羟基脂肪酸杂质的含量低于9000ppm，优选低于8000ppm，6000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm，800ppm，600ppm，500ppm，400ppm，300ppm，200ppm或更低。

在一些实施方案中，所述产长链二元酸的微生物基因组内的一个拷贝的POX4基因或其同源基因被一个拷贝的ADH基因或其同源基因替换。

本发明进一步涉及一种微生物发酵法生产长链二元酸过程中的发酵液，发酵液中含有羟基酸杂质，所述羟基酸杂质的含量在3％以下，2％以下，1.5％以下，1.3％以下，如1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％以下或更低，所述百分比为发酵液中羟基脂肪酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

优选地，所述长链二元酸为C9～C22的长链二元酸，并且所述羟基酸杂质为含有1个端羧基和1个端羟基的羟基脂肪酸。

本发明进一步涉及本发明所述的长链二元酸的生产方法，包括用ADH基因或其同源基因替换产长链二元酸的微生物基因组内的POX4基因或其同源基因，获得改造后的产长链二元酸的微生物；培养改造后的产长链二元酸的微生物发酵生产长链二元酸；任选地，其所述生产方法还包括从培养产物分离、提取和/或纯化长链二元酸的步骤。

优选地，所述改造后的产长链二元酸的微生物基因组内的一个拷贝的POX4基因或其同源基因被一个拷贝的ADH基因或其同源基因替换。

优选地，所述替换采用同源重组的方式进行。

在一些实施方案中，本发明所述微生物是酵母菌；更优选地，其中所述微生物选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

本发明进一步涉及利用所述长链二元酸的生产方法获得的产物。

在一些实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸；所述羟基酸杂质包括含有一个羧基(-COOH)的羟基脂肪酸。

换言之，本发明提供了一种新的低含量羟基酸杂质的长链二元酸，并为解决生物法生产长链二元酸过程中产生的羟基酸等杂酸的技术难题，提供了一种新的二元酸生产菌株的制备方法、菌株以及发酵生产长链二元酸的方法。

优选地，本发明采用同源重组的方法向二元酸生产菌株基因组内增加了一个拷贝的ADH基因，其核苷酸序列例如SEQ ID NO：3所示。

优选地，本发明的二元酸生产菌株的制备方法包括步骤：(1)制备同源重组模板，包括靶位点上下游重组模板、ADH基因和抗性筛选标记基因HYG(潮霉素抗性基因)，之后通过PCR重叠延伸的方法得到完整的重组模板；(2)将完整的重组模板转化至感受态细胞，在含有潮霉素的抗性培养基上筛选得到含有抗性标记的菌株；(3)通过进一步同源重组，去除靶位点所含有的抗性筛选标记基因，即靶位点只含有ADH基因的生产菌株。

进一步对突变菌株去除抗性筛选标记后，与亲代菌株相比，发酵结束后的发酵液中羟基酸杂质的质量比率显著降低，且对发酵液进行提取纯化后获得长链二元酸成品中羟基酸杂质的含量可以降低至200ppm以下，进一步提高了发酵产物长链二元酸的纯度，使二元酸产品作为工程塑料、合成香料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品的重要原料，更有利于下游产品的生产制造，提高下游产品的质量。低羟基酸杂质含量的长链二元酸产品在制备尼龙长丝时会具有更优的透光性，更适合应用在对尼龙透光性要求较高的产品领域。更重要的是，低羟基酸杂质含量的长链二元酸在很大程度上降低了二元酸后期的提取纯化、废水处理工艺的难度，简化工艺并节约了能耗。

附图说明

图1为通过同源重组的方式将基因POX4替换为ADH并去除潮霉素筛选标记的示意图。

具体实施方式

定义：

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。参见例如，Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。

长链烷烃：本发明的发酵底物包括长链烷烃，长链烷烃属于饱和链烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，其包括化学式CH₃(CH₂)_nCH₃的烷烃，其中n≥7。优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸、以下或简称为二元酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。优选地，所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。优选地，所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，优选地，正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种或多种。

产长链二元酸的微生物：已报道的可产生和积累二元酸的菌株包括细菌、酵母以及霉菌等，如：棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)等。其中假丝酵母属的许多种类是发酵生产二元酸的优良菌种。所述发酵的菌种优选包括：热带假丝酵母或清酒假丝酵母。在具体实施方案中，所述微生物选自CCTCC M2011192和CCTCC M203052。

POX4基因(GenBank登录号：M12160)编码乙酰辅酶A氧化酶(EC1.3.3.6)，参与β-氧化途径中脂肪酸及其衍生物的氧化过程。已知热带假丝酵母中存在三个POX基因，POX2、POX4和POX5，其可能以八聚体的形式共同参与β-氧化途径。

ADH基因编码乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，其广泛存在于多数生物中。在NAD⁺辅酶的帮助下催化醇类氧化为醛类或酮类。在植物、酵母、以及一些细菌中也催化相反的步骤，以保证细胞内充足的NAD⁺供应。热带假丝酵母中ADH参与ω-氧化途径中醇氧化为醛的过程。

本发明所述的羟基酸杂质包括含有一个羧基(-COOH)的羟基脂肪酸。优选地，所述羟基脂肪酸含有1个端羧基和1个端羟基，所述羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)_n-COOH，其中n≥7。优选地，所述羟基酸杂质包括碳链上碳原子数在9以上、且同时含有1个端羧基和1个羟基的长链羟基脂肪酸，如九碳羟基脂肪酸、十碳羟基脂肪酸、十一碳羟基脂肪酸、十二碳羟基脂肪酸、十三碳羟基脂肪酸、十四碳羟基脂肪酸、十五碳羟基脂肪酸、十六碳羟基脂肪酸、十七碳羟基脂肪酸、十八碳羟基脂肪酸、或十九碳羟基脂肪酸中的任意一种。所述九碳羟基脂肪酸指的是含有9个碳原子、且含有1个端羧基和1个端羟基的长链羟基脂肪酸。

本发明所述的羟基酸杂质与待生产的长链二元酸对应，即长链二元酸与羟基酸杂质上的碳原子数量相同，只是多了一个羟基。在本发明中，羟基酸与羟基脂肪酸可互换使用。

用本发明所述具有增加的乙醇脱氢酶活性及任选具有降低的乙酰辅酶A氧化酶活性(例如POX4基因或其同源基因被ADH基因或其同源基因替换)的微生物发酵生产长链二元酸时，相对于乙醇脱氢酶活性未增加和/或乙酰辅酶A氧化酶活性未降低(例如POX4基因或其同源基因未被ADH基因或其同源基因替换)的微生物，发酵结束后的发酵液含有的羟基酸杂质的含量显著下降，如至少下降5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

如本文所用，“增加的酶活性”是指与参照相比，酶的活性增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更高。

如本文所用，“降低的酶活性”是指与参照相比，酶的活性降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多，甚至100％。

本领域已知多种用于增加酶活性的方法，例如包括但不限于过表达酶编码基因，例如使用强启动子、增加基因拷贝数等。

本领域已知多种用于降低酶活性的方法，例如包括但不限于弱化或失活酶编码基因，例如缺失或敲除部分或全部酶编码基因、使用弱启动子、使用拮抗剂或抑制剂(例如包括但不限于抗体、干扰RNA等)等。

在本文中，所述参照可以是野生型微生物或者是进行所需遗传操作前的相同微生物(例如用于进行遗传操作以增加酶活性的起始微生物)。在本文中，亲代微生物和起始微生物可互换使用，指对其进行所需遗传操作(例如增加或降低酶活性)的微生物。

如本文所用，“过表达”是指相对于遗传操作前的水平，基因的表达水平是升高的，例如升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更高。过表达基因的方法是本领域熟知的，例如包括但不限于使用强启动子、增加基因拷贝数等。增加基因拷贝数可以例如但不限于通过引入一或多个拷贝的外源基因或内源基因实现，例如通过表达载体或整合进基因组中。

如本文所用，“外源基因”是指来自另一细胞或生物体的基因，例如来自相同物种或不同物种的基因。

如本文所用，“内源基因”是指细胞或生物体自身的基因。

在一些实施方案中，在本发明所述产长链二元酸重组微生物中，一或多个拷贝的ADH基因或其同源基因可以整合进基因组(例如通过同源重组)，任选在基因组任意位点，例如基因组内一个拷贝的任意基因被一或多个拷贝的ADH基因或其同源基因替换。

本发明发酵生产长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有羟基酸杂质，该羟基酸杂质的含量相对于POX4基因或其同源基因未被替换的微生物显著下降，如至少下降5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

在一些实施方案中，使用微生物发酵法生产长链二元酸，发酵液中含有羟基脂肪酸杂质，所述羟基脂肪酸杂质的含量降低至3％以下，2％以下，1.5％以下，1.3％以下，如1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％以下或更低，所述百分比为发酵液中羟基脂肪酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

在一些实施方案中，所述发酵生产的长链二元酸含有羟基脂肪酸杂质，所述羟基脂肪酸杂质的含量降低至10000ppm以下，如8000ppm、4000ppm、2000ppm、300ppm、250ppm、200ppm、150ppm以下或更低。

本发明杂质含量的单位ppm为杂质占长链二元酸的质量比率，且100ppm＝100*10^-6＝0.01％。

在本发明一个实施方式中，当使用本发明的微生物发酵法生产十二碳长链二元酸时，羟基酸杂质主要为十二碳羟基脂肪酸，所述十二碳羟基脂肪酸杂质的含量低于4000ppm，优选低于3000ppm，2000ppm，1000ppm，500ppm，300ppm，200ppm，150ppm或更低。所述十二碳羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)₁₀-COOH。

在本发明一个实施方式中，当使用本发明的微生物发酵法生产十碳长链二元酸时，羟基酸杂质主要为十碳羟基脂肪酸，所述十碳羟基脂肪酸杂质的含量低于2000ppm，优选低于1500ppm，1000ppm，500ppm，300ppm，200ppm，150ppm或更低。所述十碳羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)₈-COOH。

在本发明一个实施方式中，当使用本发明的微生物发酵法生产十六碳长链二元酸时，羟基酸杂质主要为十六碳羟基脂肪酸，所述十六碳羟基脂肪酸杂质的含量低于9000ppm，优选低于8000ppm，6000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm，800ppm，600ppm，500ppm，400ppm，300ppm，200ppm或更低。所述十六碳羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)₁₄-COOH。

所述二元酸及杂质含量的测试方法可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如气相色谱检测法的内标法或归一法等。

同源基因是指序列相似性达80％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。本发明中所指的POX4基因或ADH基因的同源基因既可以是POX4基因或ADH基因的直向同源基因，也可以是其横向同源基因或异源同源基因。

序列同一性是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸变体与本文所述的多核苷酸具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的多核苷酸同源性。

如本文所用，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指核苷酸序列无变化的程度，可通过比对多核苷酸与参考多核苷酸之间的相同核苷酸碱基的数目而检测。序列同一性可以通过标准排列对比算法程序使用由每个供应商制定的默认缺口罚分确定。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(沉默取代)以及相同的残基。基本同源的核酸分子典型在中等严格条件下或者在高度严格条件下杂交全长核酸或者至少或至少约70％、80％或90％全长的感兴趣的核酸分子。本发明还涵盖了含有简并密码子代替杂交核酸分子中密码子的核酸分子。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列可以使用已知的计算机算法确定，如BLASTN、FASTA、DNAStar及Gap(University of Wisconsin GeneticsComputer Group(UWG),Madison WI,USA)。例如，核酸分子的同源性或同一性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48:443(1970)，由Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981)修订)。简而言之，GAP程序根据相似的排列对比的符号(即核苷酸)的数目除以两个序列中较短序列的符号总数而定义相似性。

PCR重叠延伸又称SOE(gene splicing by overlap extension)PCR，是指通过设计具有互补末端的引物，通过PCR扩增将不同DNA片段拼接到一起的方法。

同源重组是指依赖于序列相似性的DNA分子之间的重组，最常见于细胞内用于修复有丝分裂期间产生的突变。同源重组技术已广泛应用于基因组编辑，包括基因敲除、基因修复以及向特定位点引入新的基因等。以酿酒酵母为代表的一类微生物，其细胞内发生同源重组的几率非常高，不依赖于序列特异性，在基因组编辑方面具有明显的优势。而位点特异性重组，依赖于特异性位点和位点特异性重组酶参与，重组仅发生于特异的位点之间，如Cre/loxP、FLP/FRT等。本专利使用的同源重组技术不属于位点特异性重组，重组依赖于细胞内的DNA修复系统。

抗性标记是指选择性标记的一种，其往往携带有赋予转化子在抗生素存在的条件下得以生存的能力。所述抗性标记基因包括NPT、HYG、BLA及CAT等，分别可以抗卡那霉素、潮霉素、氨苄/羧苄青霉素以及氯霉素等。优选地，所述抗性标记基因是潮霉素抗性基因HYG。

发酵生产过程中，所述发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐。

在一些实施方案中，所述碳源包括选自葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)，例如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

在一些实施方案中，所述氮源包括选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或所述氮源的总添加量为0.1％～3％(w/v)，例如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％。

在一些实施方案中，所述无机盐包括选自磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或所述无机盐的总添加量为0.1％～1.5％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

在一些实施方案中，所述营养因子包括选自维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；和/或所述营养因子的总添加量为0～1％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％。按照发酵领域常识，本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL。

本发明所述的OD值为菌体光密度，且为稀释30倍时测定的值。

在本发明的一个实施方案中，发酵菌株的接种量为10％～30％，例如11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。所述菌株培养至菌体光密度(OD₆₂₀)为0.5以上(稀释30倍)时，加入底物进行发酵转化。

长链二元酸的提取纯化：对发酵制得的发酵液进行提取纯化处理，以获得长链二元酸成品。所述提取纯化的步骤包括：对发酵液进行除菌，酸化，以及对获得的清液进行酸化，固液分离，和/或溶剂结晶。

本发明所述的提取纯化，可以重复进行一次以上，进行多次提取纯化步骤有助于进一步降低二元酸产品中的杂质含量，例如，在本发明一个实施方式中，参考中国发明专利CN 101985416 A实施例1中精制工艺对本发明获得的十二碳长链二元酸产品继续进行处理，获得的的十二碳长链二元酸中十二碳羟基脂肪酸杂质含量从处理前的3000ppm以上降低至200ppm以下，如180ppm以下、160ppm以下、140ppm、120ppm或更低。

所述发酵液包括生物发酵长链二元酸的过程中产生的含有长链二元酸盐的发酵液，所述含有长链二元酸盐的发酵液中可能含有长链二元酸钠盐、长链二元酸钾盐或长链二元酸铵盐等。

所述除菌优选膜过滤：使用过滤膜将残留的菌体和大蛋白等杂质分离出去，与含有长链二元酸盐的发酵液有效地分离开。进而优选陶瓷膜过滤工艺。使用陶瓷膜进行膜过滤时，优选膜前压力为0.2-0.4MPa；优选过滤膜孔径为0.05-0.2微米。

所述酸化是膜过滤后对获得的含有长链二元酸盐的膜清液进行酸化处理，通过加入酸将长链二元酸盐转化为长链二元酸沉淀。酸化时优选使用无机酸，如硫酸、盐酸、硝酸、或其混合酸。所述酸化处理时无机酸的加入量，需将溶液中的长链二元酸充分沉淀，主要以溶液的终点pH为准，优选酸化的终点pH低于5，更优选终点pH低于4.0。加入无机酸进行酸化处理时，可以获得长链二元酸沉淀和相应的无机盐溶液。

所述固液分离是将获得的长链二元酸沉淀与酸化母液分离开，所述固液分离包括过滤或/和离心分离，可以使用常用的固液分离设备。

优选地，所述提取纯化的步骤还包括对含有长链二元酸盐的发酵液进行脱色，向含有长链二元酸盐的发酵液或膜清液中加入活性炭进行脱色处理，脱色处理后再过滤除去活性炭，脱色步骤可以进一步脱除长链二元酸溶液中的杂质。优选地，活性炭的加量为0.1-5wt％，进而优选1-3wt％(相对于溶液中含有的长链二元酸的量)。

所述溶剂结晶，即将长链二元酸沉淀溶解于有机溶剂中，并通过冷却\蒸发\溶析使长链二元酸结晶，再分离晶体，获得纯化后长链二元酸。所述有机溶剂包括醇、酸、酮和酯的一种或多种；其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇中的一种或多种；所述酸包括乙酸；所述酮包括丙酮；所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。

在另一个优选的实施方式中，长链二元酸沉淀溶解在有机溶剂后进行脱色，再分离得到清液，使用活性炭脱色时，脱色的温度为85～100℃，脱色的时间为15～165min；在另一个优选的实施方式中，分离清液后，降温结晶，降温结晶可包括以下步骤：首先降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶。在另一个优选的实施方式中，结晶之后，分离出所得晶体，由此得到长链二元酸，分离晶体的方式可以为离心分离。

在一些实施方案中，本发明涉及利用上述获得的二元酸产品生产尼龙长丝、工程塑料、合成香料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品。

如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。

如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在一些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在一些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1培养基、培养发酵方法及二元酸检测方法

1、YPD培养基，配方(w/v)为：2％蛋白胨，2％葡萄糖和1％酵母提取物(OXOID,LP0021)。固体培养基中还需加入2％琼脂粉。

培养时，可取单菌落于含有1mL YPD液体培养基的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。

2、种子培养基，配方(w/v)为：蔗糖10～20g/L(具体使用10g/L)，酵母膏3～8g/L(具体使用3g/L)，工业发酵用玉米浆(简称玉米浆，总氮含量2.5wt％)2～4g/L(具体使用2g/L)，KH₂PO₄ 4～12g/L(具体使用4g/L)，尿素0.5～4g/L(具体使用0.5g/L)(115℃，20min单独灭菌)，发酵底物为正十二烷、正十烷、正十六烷20mL/L。

培养时，将步骤1培养后的菌液接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶，接种量为3-5％，在250RPM、30℃摇床培养至OD₆₂₀达到0.8时(稀释30倍后)。

3、发酵培养基(w/v)：蔗糖10-40g/L(具体使用10g/L)，玉米浆(总氮含量2.5wt％)1～5g/L(具体使用1g/L)，酵母膏4～12g/L(具体使用4g/L)，NaCl 0～3g/L(具体未使用)，KNO₃ 4～12g/L(具体使用4g/L)，KH₂PO₄ 4～12g/L(具体使用4g/L)，尿素0.5～3g/L(具体使用0.5g/L)(115℃，20min单独灭菌)，发酵底物为正十二烷、正十烷、正十六烷300～400mL/L(具体使用300mL/L)，丙烯酸4g/L，用1N HCl和1N NaOH调节pH值至7.5～7.6。

发酵时，将步骤2培养的种子液接种到装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为10-30％，在30℃、250RPM摇床培养90-144h。培养过程中通过隔段时间补加酸/碱的方式调节pH值至设定范围。

4、气相色谱法(GC)测定二元酸产量和羟基脂肪酸杂质含量的步骤

(1)发酵液产物及杂质含量检测：发酵液经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测，色谱条件如下：

色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据二元酸产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行二元酸产量计算，根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。

(2)固体产品纯度及杂质含量检测：将固体产品经常规气相色谱法前处理，气相色谱检测，

色谱条件：色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。

实施例2同源重组模板的制备

本实施例中所有DNA片段均使用Takara公司HS高保真DNA聚合酶(Takara，R040A)扩增得到。1％琼脂糖凝胶电泳后用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)回收纯化DNA片段。

1、ADH基因的扩增

假丝酵母细胞(菌种保藏号：CCTCC M2011192)基因组DNA提取采用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(生工，货号518257)，并辅以液氮研磨的方法提高破壁效率。每50μL反应体系加入5μg基因组作为模板进行PCR扩增。所用的引物及PCR反应条件如下：

ADH-F：

5’-CGACGGAGTTAGTGTCCGTTGTCTTGGTTGGTTTGCCAGC-3’

(SEQ ID NO：1)

ADH-R:

5’-CCATTTTCGGGTTCGCATGCAAAAACGACTGGCCGGAGAT-3’

(SEQ ID NO：2)

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃2m 30s，5个循环

步骤3:98℃10s，72℃2m 30s，25个循环

步骤4:72℃5m。

获得的产物称为ADH基因，经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO：3所示。

2、抗性筛选标记(HYG，即潮霉素抗性基因)的扩增，扩增模板为本公司所有的载体pCIB2(SEQ ID NO：4)，引物序列和PCR反应条件如下如下：

Tadh_HYG-F：

5’-ATCTCCGGCCAGTCGTTTTTGCATGCGAACCCGAAAATGG-3’

(SEQ ID NO：5)

POX4_HYG-R：

5’-CTAAGGGTTTTTCCGGGGCTGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’

(SEQ ID NO：6)

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃1m 50s，5个循环

步骤3:98℃10s，72℃2m，25个循环

步骤4:72℃5m。

获得的产物称为HYG，经测序证实无误，如SEQ ID NO：7所示。

3、上下游同源重组片段的扩增，模板为上述基因组DNA，引物序列如下：

POX4_Up-F：5’-CCCCCACCTTTTGTCTCTGG-3’(SEQ ID NO：8)

POX4_Up-R：5’-AACGGACACTAACTCCGTCG-3’(SEQ ID NO：9)

POX4_Down-F：5’-AGCCCCGGAAAAACCCTTAG-3’(SEQ ID NO：10)

POX4_Down-R：5’-GAGACGTGGGGGTAAGGTTG-3’(SEQ ID NO：11)。

PCR反应条件一致如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃15s，30个循环

步骤3:72℃5m。

获得的产物分别称为POX4_Up和POX4_Down，PCR产物经乙醇沉淀后回收，其序列如SEQ ID NO：12和13所示。

4、PCR重叠延伸得到完整的重组模板

将上述SEQ NO.3、7、12和13共4条回收纯化的PCR片段进行重叠延伸，得到同源重组模板，并回收纯化。具体方法如下：

加入等摩尔量的ADH、HYG、POX4_Up和POX4_Down片段作为模板，引物为POX4_Up-F和POX4_Down-R，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃5m，20个循环

步骤3:72℃8m。

凝胶电泳后进行回收纯化大小约为4.5Kb的重组片段，其序列如SEQ ID NO：14所示。

图1为通过同源重组的方式将基因POX4替换为ADH并去除潮霉素筛选标记的示意图。

实施例3重组转化子的转化

1、酵母电转化感受态细胞的制备

将30℃，250RPM摇床过夜培养的酵母细胞CCTCC M2011192接种到实施例1的100mLYPD培养基中，至OD₆₂₀为0.1。相同条件下培养至OD₆₂₀至1.3时，3000g、4℃离心收集细胞。用冰冷的无菌水洗涤细胞两次并收集后将细胞重悬于10mL冰上预冷的1M的山梨醇溶液，4℃、1500g离心收集细胞后重悬于1mL上述山梨醇溶液，分装100μL细胞悬液用于遗传转化。

2、酵母感受态电击转化

上述感受态细胞中加入1μg回收纯化的DNA片段SEQ ID NO：14，冰上放置5min后迅速转移至0.2cm电击杯，电击转化(BioRad，Micropulser^TM Electroporator，转化程序SC2，1.5kV，25uFD，200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃，200RPM培养2小时后，收集菌液后涂布含有100mg/L潮霉素B的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

实施例4重组转化子的筛选

挑取实施例3中获取的单菌落接种于含有1mL实施例1的YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2mL离心管中，250RPM、30℃培养过夜。次日进行菌落PCR鉴定，所用引物序列和PCR反应条件如下：

Pox4_Up-F:5’-GTGGTGGTAAGCCGACAGAA-3’(SEQ ID NO：15)

ADH-2R:5’-AACAGCCTCAGCAGTGTCTC-3’(SEQ ID NO：16)

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃30s，30个循环

步骤3:72℃5m。

PCR筛选到的阳性菌株命名为731HYG。

实施例5带有抗性标记的重组菌株羟基酸占二元酸比率的测定

1、筛选方法：挑取菌株731HYG的单菌落接种于含有1mL实施例1YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基(含100mg/L潮霉素B)的500mL摇瓶中，接种量为3％，250RPM、30℃培养至OD₆₂₀达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接入装有15mL实施例1所述发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，且发酵培养基中底物为正十二烷。继续250RPM、30℃培养至发酵结束。

并以菌株CCTCC M2011192作为对照组：除培养基不含潮霉素B外，培养和发酵方法外与上述相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中4所述的方法进行GC检测，计算十二碳二元酸含量及十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率，结果如下表1所示。

2、筛选结果：经筛选得到一株与原始菌株CCTCC M2011192相比，羟基脂肪酸杂质含量有效降低的候选菌株，编号为731HYG。

表1

菌株	CCTCC M2011192	731HYG
			十二碳二元酸产量(mg/g)	147.3	148.2
十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	1.32	0.75

本发明所述羟基脂肪酸质量比率为其所占十二碳二元酸的质量百分比，由表1可知十二碳羟基脂肪酸杂质的质量比率下降了43.2％。

实施例6抗性筛选标记的去除

1、去除抗性筛选标记所用的同源重组模板的制备

以热带假丝酵母CCTCC M2011192的基因组DNA为模板，使用HS高保真DNA聚合酶进行PCR扩增去除抗性筛选标记所需的DNA片段。所用引物序列如下：/>

Tadh-F：5’-TAAACAAAACCTGGCGCCTC-3’(SEQ ID NO：17)

Tadh-R：5’-AAAAACGACTGGCCGGAG-3’(SEQ ID NO：18)

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃30s，30个循环

步骤3:72℃5m。

1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化，序列如SEQ ID NO：19所示。

加入等摩尔量的回收纯化的DNA片段SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：13作为模板，引物为Tadh-F和POX4_Down-R，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃45s，20个循环

步骤3:72℃5m。

凝胶电泳后进行回收纯化大小约为600bp的重组片段，其序列如SEQ ID NO：20所示。

2、去除抗性筛选标记

制备菌株731HYG的新鲜电转化感受态细胞，加入0.3μg回收的步骤1的重组片段，冰上放置5min后迅速转移至冰上预冷的0.2cm电击杯，电击转化(如上，1.5kV，25uFD，200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃、200RPM培养2小时后，收集菌液后涂布含有不含抗生素的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

3、去除抗性标记的菌株的筛选

挑取单菌落一一对应分别接种于含有和不含潮霉素(100mg/L)的YPD平板，挑取在含有抗生素培养基上不生长、但不含抗生素培养基上能够生长的单菌落接种于含有1mLYPD培养基的2mL离心管中，于4℃、250RPM过夜培养，次日通过菌落PCR鉴定抗性筛选标记是否去除，所用引物及PCR反应条件如下。

a)引物：Tadh-F和POX4_Down-R；

PCR反应条件为94℃45s；94℃25s，55℃25s，72℃2m15s(30个循环)；72℃5m；15℃保存。

b)引物：

HYG-F:5’-CTCGGAGGGCGAAGAATCTC-3’(SEQ ID NO：21)

HYG-R:5’-CAATGACCGCTGTTATGCGG-3’(SEQ ID NO：22)

PCR反应条件为94℃45s；94℃25s，52℃25s，72℃45s(30个循环)；72℃5m；15℃保存。

使用Tadh-F和POX4_Down-R只能扩增出长度为221bp的片段且HYG-F和HYG-R无扩增片段的菌株即为去除了抗性标记的目的菌株，目的菌株中POX4基因被ADH取代，并且不含抗性筛选标记基因HYG。最终该菌株命名为731。

实施例7重组菌株731二元酸生产中羟基酸占比的测定

发酵：分别接种菌株CCTCC M2011192和731至含有1mL实施例1所述YPD培养基的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，摇床250RPM、30℃，36～48h培养至OD₆₂₀达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接种到装有15mL实施例1发酵培养基的摇瓶中，接种量为20％，发酵培养基中底物为正十二烷。继续摇床培养250RPM、30℃培养至发酵结束。并以菌株CCTCC M2011192作为对照组，培养和发酵方法外与上述相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中4所述的方法进行GC检测，计算十二碳二元酸含量及羟基脂肪酸杂质质量比率，结果如下表2所示：

表2

菌株	CCTCC M2011192	731
			十二碳二元酸产量(mg/g)	146.4	148.5
十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	1.41	0.72

由表2可知去除抗性筛选标记后，十二碳羟基脂肪酸杂质的质量比率下降了48.9％。

提取纯化：

(1)将上述发酵液，用质量浓度30％的氢氧化钠溶液调节pH为8.4，加水调节到长链二元酸浓度为8.5wt％，加热至45℃，用0.05微米孔径的陶瓷膜[购自三达膜科技(厦门)有限公司]对发酵液进行过滤。使用的陶瓷膜膜面积为0.84平方米，膜前压力设定0.3MPa，收集膜清液。

(2)将接收到的膜清液，在60℃下，加入5wt％的粉末活性炭(相对于溶液中含有的长链二元酸的量)脱色，过滤得到澄清液体。

(3)再向所述澄清液体中加入硫酸，调节pH至3.5，降温到30℃，过滤得到湿固体，用3倍于湿固体重量的纯净水洗涤滤饼，过滤后烘干，获得十二碳二元酸一级产品。

(4)向十二碳二元酸一级产品加入3.5倍量(相对于十二碳二元酸一级产品重量)浓度为97％的醋酸，加热到85℃溶解，加入1％大孔粉末活性炭(相对于十二碳二元酸一级产品重量)脱色，在85℃下保持1小时，热过滤得到清液。该溶液以10℃/小时的速度降温，到30℃得到十二碳二元酸晶体溶液。过滤，水洗涤湿固体的溶剂，烘干后得到十二碳二元酸二级产品。

使用实施例1中4所述方法测定并计算十二碳二元酸纯度及羟基脂肪酸杂质含量，如下表3所示：

表3

实施例8菌株731发酵生产十碳长链二元酸

发酵：接种菌株731至含有1mL实施例1YPD培养基的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，摇床250RPM、30℃，36～48h培养至OD620达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接种到装有15mL实施例1发酵培养基的摇瓶中，接种量为20％，发酵培养基中底物为正十烷。继续摇床培养250RPM、30℃培养至发酵结束。并以菌株CCTCC M2011192作为对照组，培养和发酵方法外与上述相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中4所述的方法进行GC检测，计算十碳二元酸产量及十碳羟基脂肪酸杂质的质量比率，结果如下表4所示：

表4

由表4可知十碳羟基脂肪酸杂质的质量比率下降了39.1％。

提取纯化步骤：与实施例7提取纯化步骤相同。使用实施例1中4所述方法测定并计算获得的十碳二元酸一级产品和二级产品的纯度及十碳羟基脂肪酸杂质含量，如下表5所示：

表5

实施例9菌株731发酵生产十六碳长链二元酸

发酵：接种菌株731至含有1mL实施例1YPD培养基的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，摇床250RPM、30℃，36～48h培养至OD620达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接种到装有15mL实施例1发酵培养基的摇瓶中，接种量为20％，发酵培养基中底物为正十六烷。继续摇床培养250RPM、30℃培养至发酵结束。并以菌株CCTCC M2011192作为对照组，培养和发酵方法外与上述相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中4所述的方法进行GC检测，计算十六碳二元酸产量及十六碳羟基脂肪酸杂质的质量比率，结果如下表6所示：

表6

菌株	CCTCC M2011192	731
			十六碳二元酸产量(mg/g)	123.8	126.7
十六碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	3.08	1.96

由表6可知十六碳羟基脂肪酸杂质的质量比率下降了36.4％。

提取纯化步骤：与实施例7提取纯化步骤相同。使用实施例1中4所述方法测定并计算获得的十六碳二元酸一级产品和二级产品的纯度及十六碳羟基脂肪酸杂质含量，如下表7所示：

表7

实施例10将实施例2所述DNA片段SEQ ID NO：14同源重组入热带假丝酵母(CCTCCM203052)，获得POX4基因被ADH基因替换的重组菌株的方法同实施例3。筛选单克隆的方法同实施例4。将筛选得到的阳性株菌命名为732HYG。

发酵方法同实施例5，所用菌株为CCTCC M203052和732HYG。发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中4所述的方法进行GC检测，计算十二碳二元酸产量及十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率，如表8所示。结果表明，与亲代菌株CCTCC M203052相比，732HYG中羟基脂肪酸杂质含量显著下降。

表8

菌株	CCTCC M203052	732HYG
			十二碳二元酸产量(mg/g)	134.6	133.5
十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	1.24	0.58

实施例11将ADH基因重组在基因组上任意选择的位点。

同源重组模板制备方法参照实施例2。用HS高保真DNA聚合酶扩增如下片段，所需引物如下：

Up-F：5’-TTAGACCGCCAGAGAAGGGA-3’(SEQ ID NO：23)

Up-R：5’-TGTCATTGCGTAACGTGGGA-3’(SEQ ID NO：24)

Down-F：5’-GTGGTGGGTTCCCAGCTTAT-3’(SEQ ID NO：25)

Down-R：5’-GGAGGTACCAACAATCCCCG-3’(SEQ ID NO：26)

模板为实施例1所述基因组DNA，PCR反应条件一致如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃1m 10s，30个循环

步骤4:72℃5m。

所得PCR产物分别为Up和Down。

ADH-2F：

5’-TCCCACGTTACGCAATGACAGTCTTGGTTGGTTTGCCAGC-3’(SEQ ID NO：27)

HYG-2R：

5’-ATAAGCTGGGAACCCACCACGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3’(SEQ ID NO：28)

模板为10⁶倍稀释后的SEQ ID NO：14，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃4m，5个循环

步骤3:98℃10s，72℃4m，25个循环

步骤4:72℃5m。

所得产物为ADH-HYG。

上述片段Up、Down、ADH-HYG分别经回收纯化后，加入等摩尔量的模板进行PCR重叠延伸，所用引物为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26，PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s，55℃10s，72℃6m 30s，20个循环

步骤4:72℃5m。

所得大小约为6Kb的PCR产物回收纯化后经测序确认无误，如SEQ ID NO：29所示。

将1μg上述PCR回收纯化的DNA片段SEQ ID NO：29转入菌株CCTCC M 20111192过程同实施例3。重组子筛选参照实施例4，所用引物及PCR反应条件为：

HR-F：5’-TCATGATAGCCATCGGCCAC-3’(SEQ ID NO：30)

HR-R：5’-CCACCAACCAGCCCCATTAT-3’(SEQ ID NO：31)

步骤1:94℃5m

步骤2:94℃30s，55℃30s，72℃1m 30s，30个循环

步骤3:72℃5m。

将PCR所筛选到的阳性菌株(与未转化株相比，能够扩增出大小约为1.4Kb的目的片段)命名为733HYG。

发酵方法同实施例5，所用菌株为CCTCC M2011192和733HYG。发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中4所述的方法进行GC检测，计算十二碳二元酸产量及十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率，如表9所示。结果表明，与亲代菌株CCTCC M2011192相比，733HYG中十二碳羟基脂肪酸杂质含量下降了38.9％，说明十二碳羟基酸杂质的含量相对于没有过表达ADH基因的亲代菌株显著下降。

表9

菌株	CCTCC M2011192	733HYG
			十二碳二元酸产量(mg/g)	144.9	145.6
十二碳羟基脂肪酸杂质质量比率(％)	1.26	0.77

从上述针对不同的发酵底物发酵生产长链二元酸的实施例7-11中可以看出，发酵后的发酵液中羟基脂肪酸杂质的含量均显著降低，与亲代菌株相比，羟基脂肪酸杂质的含量能降低至少30％，而同时过表达ADH基因并弱化POX4基因(例如使用ADH基因替换POX4基因)，羟基脂肪酸含量进一步降低。而且，对获得的十二碳二元酸、十碳二元酸、十六碳二元酸进行进一步的提取纯化，可以进一步降低羟基脂肪酸杂质含量，很大程度上降低了后期的提取纯化工艺的难度。而且二元酸产品作为尼龙长丝、合成香料、工程塑料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品的重要原料，随着羟基脂肪酸杂质含量的降低，将更有利于下游产品的生产制造，提高下游产品的质量。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

CIBT美国公司

<120> 一种低含量羟基酸杂质的长链二元酸及其生产方法

<130> I2019TC3080CB

<150> 201810734180.4

<151> 2018-07-06

<150> 201810734353.2

<151> 2018-07-06

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer ADH-F

<400> 1

cgacggagtt agtgtccgtt gtcttggttg gtttgccagc 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer ADH-R

<400> 2

ccattttcgg gttcgcatgc aaaaacgact ggccggagat 40

<210> 3

<211> 2331

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ADH

<400> 3

cgacggagtt agtgtccgtt gtcttggttg gtttgccagc tggtgccaag ctcgaagcac 60

ctatcttcaa tgccgttgcc aaatccatct aaatcaagga ttcttacgtg ggtaaccgaa 120

gagacactgc tgaggctgtt gatttcttcg cgaaaggttt ggtcaagtgt ccaattaagg 180

ttgttgagtt gagtgaattg ccagagattt tcaaattgtt ggaagagggt aagatcttgg 240

gtagatacgt cgttgacact gccaaataat caggcggctc cttccccaat ttacgtagat 300

gtttccgttt atagaattat attttacaca tgccccaaag caaacatttc cataattctt 360

gaacacttgt agaacacatg tgggagtcca ccccacgagc ggacatatgt gccctatttg 420

aacaataact ccggaatgtt gtgtgattac ataattacaa ccccgcgcgt gggaataatt 480

taccgaggcg acacaatccc ccttttccag accaccaatg gtgacatttt ggtagtattt 540

ccacaagagg aaattacaga aataatgggg ctggttggtg gtgggagtgg tacatacaac 600

attgagaacg tattcggagc caattggctg aatgagacac gataattggc cgcatgctcc 660

agggagcctg cgacacatca aatttgacag gtctgaatca atttcatcat tggttcaaat 720

aatatccgat accgtcaatc ttcttatcaa aagtggggat ctttccccaa attcagctag 780

caacgtatag cactcccccc tttccactcc ttcctagaag catatttaaa cggggatgtt 840

tctccctcga tttcttttcc aaaactgcaa aaaactttaa tcaccaaaac taactccgaa 900

acaagtatgt ccgttccaac tactcagaaa gctgttatct ttgaaaccaa tggtggcaag 960

ttagaataca aagacgtgcc ggtccctgtc cctaaaccca acgaattgct tgtcaacgtc 1020

aagtactcgg gtgtgtgtca ttctgacttg catgtctgga aaggcgactg gcccattcct 1080

gccaagttgc ccttggtggg aggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgtcgg catgggtgac 1140

aacgtcaagg gctggaaggt gggggacttg gctggtatca agtggttgaa tggttcgtgt 1200

atgaactgtg agttttgcca acagggcgca gaacctaact gttcaagagc cgacatgtct 1260

gggtataccc acgatggaac tttccaacaa tacgccactg ctgatgctgt ccaagctgcc 1320

aagatcccag aaggcgccga catggctagt atcgccccga tcttgtgcgc tggtgtgacc 1380

gtgtacaagg ctttgaagaa cgccgacttg ttggctggcc aatgggtggc tatctctggt 1440

gctggtggtg gtttgggctc cttgggtgtg cagtacgcta aagccatggg ttacagagtg 1500

ttggctatcg acggtggtga cgagagagga gagtttgtca agtccttggg cgccgaagtg 1560

tacattgact tccttaagga acaggacatc gttagtgcta tcagaaaggc aactggtggt 1620

ggtccacacg gtgttattaa cgtgtcagtg tccgaaaagg caatcaacca gtcggtggag 1680

tacgtcagaa ctttggggaa agtggtttta gttagcttgc cggcaggtgg taaactcact 1740

gctcctcttt tcgagtctgt tgctagatca atccagatta gaactacgtg tgttggcaac 1800

agaaaggata ctactgaagc tattgatttc tttgttagag ggttgatcga ttgcccaatt 1860

aaagtcgctg gtttaagtga agtgccagag atttttgact tgatggagca gggaaagatc 1920

ttgggtagat atgtcgttga tacgtcaaag tagttatcta tattgtttcc cagaatggag 1980

atttctctaa ttgctctata ctctccgact ctatcagcac tttaccatct gtcgcatcta 2040

ggtaataaag ttcggtcaca ccaagcgatt taacgtactt ccacgtcttg tcataattca 2100

aaccaacctg ggtcaaagcg tgagcatcat ctgataaaca aaacctggcg cctccatgct 2160

ttatgattgc ctccgcaata tccctcttag gatacgacgt gtcccaccct ttccttatag 2220

ctgacgagtt caactcaaac aacccgccgt acagttttac caacttgata ttccggacaa 2280

tcaatgccca gatctccggc cagtcgtttt tgcatgcgaa cccgaaaatg g 2331

<210> 4

<211> 5873

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vector pCIB2

<400> 4

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Tadh_HYG-F

<400> 5

atctccggcc agtcgttttt gcatgcgaac ccgaaaatgg 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX4_HYG-R

<400> 6

ctaagggttt ttccggggct gctagcagct ggatttcact 40

<210> 7

<211> 1776

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HYG

<400> 7

atctccggcc agtcgttttt gcatgcgaac ccgaaaatgg agcaatcttc cccggggcct 60

ccaaatacca actcacccga gagagataaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata 120

tccaccaagg taagtaactc agagttaatg atacaggtgt acacagctcc ttccctagcc 180

attgagtggg tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc 240

aattccatgg ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct 300

ctgaaaatct tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc 360

caccctccct tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta 420

ctttccctcc ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga 480

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg 540

tctccgacct catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 600

gagggcgtgg atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 660

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 720

aattcagcga gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 780

acctccctga aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga 840

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 900

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 960

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca 1020

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 1080

acaatgtcct cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 1140

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 1200

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 1260

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1320

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 1380

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1440

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 1500

agtgtgctac ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata 1560

aataggatgc aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa 1620

tgaagtctat gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag 1680

tctgtaaaaa aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg 1740

aaatccagct gctagcagcc ccggaaaaac ccttag 1776

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX4_Up-F

<400> 8

cccccacctt ttgtctctgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX4_Up-R

<400> 9

aacggacact aactccgtcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX4_Down-F

<400> 10

agccccggaa aaacccttag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX4_Down-R

<400> 11

gagacgtggg ggtaaggttg 20

<210> 12

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> POX4_Up

<400> 12

cccccacctt ttgtctctgg tggtggtaag ccgacagaaa ggaaaaataa ggcgacggag 60

ttagtgtccg tt 72

<210> 13

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> POX4_Down

<400> 13

agccccggaa aaacccttag ttgatagttg cgaatttagg tcgacctctc atgatttcaa 60

ccttaccccc acgtctc 77

<210> 14

<211> 4176

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> complete recombination template

<400> 14

cccccacctt ttgtctctgg tggtggtaag ccgacagaaa ggaaaaataa ggcgacggag 60

ttagtgtccg ttgtcttggt tggtttgcca gctggtgcca agctcgaagc acctatcttc 120

aatgccgttg ccaaatccat ctaaatcaag gattcttacg tgggtaaccg aagagacact 180

gctgaggctg ttgatttctt cgcgaaaggt ttggtcaagt gtccaattaa ggttgttgag 240

ttgagtgaat tgccagagat tttcaaattg ttggaagagg gtaagatctt gggtagatac 300

gtcgttgaca ctgccaaata atcaggcggc tccttcccca atttacgtag atgtttccgt 360

ttatagaatt atattttaca catgccccaa agcaaacatt tccataattc ttgaacactt 420

gtagaacaca tgtgggagtc caccccacga gcggacatat gtgccctatt tgaacaataa 480

ctccggaatg ttgtgtgatt acataattac aaccccgcgc gtgggaataa tttaccgagg 540

cgacacaatc ccccttttcc agaccaccaa tggtgacatt ttggtagtat ttccacaaga 600

ggaaattaca gaaataatgg ggctggttgg tggtgggagt ggtacataca acattgagaa 660

cgtattcgga gccaattggc tgaatgagac acgataattg gccgcatgct ccagggagcc 720

tgcgacacat caaatttgac aggtctgaat caatttcatc attggttcaa ataatatccg 780

ataccgtcaa tcttcttatc aaaagtgggg atctttcccc aaattcagct agcaacgtat 840

agcactcccc cctttccact ccttcctaga agcatattta aacggggatg tttctccctc 900

gatttctttt ccaaaactgc aaaaaacttt aatcaccaaa actaactccg aaacaagtat 960

gtccgttcca actactcaga aagctgttat ctttgaaacc aatggtggca agttagaata 1020

caaagacgtg ccggtccctg tccctaaacc caacgaattg cttgtcaacg tcaagtactc 1080

gggtgtgtgt cattctgact tgcatgtctg gaaaggcgac tggcccattc ctgccaagtt 1140

gcccttggtg ggaggtcacg aaggtgctgg tgtcgttgtc ggcatgggtg acaacgtcaa 1200

gggctggaag gtgggggact tggctggtat caagtggttg aatggttcgt gtatgaactg 1260

tgagttttgc caacagggcg cagaacctaa ctgttcaaga gccgacatgt ctgggtatac 1320

ccacgatgga actttccaac aatacgccac tgctgatgct gtccaagctg ccaagatccc 1380

agaaggcgcc gacatggcta gtatcgcccc gatcttgtgc gctggtgtga ccgtgtacaa 1440

ggctttgaag aacgccgact tgttggctgg ccaatgggtg gctatctctg gtgctggtgg 1500

tggtttgggc tccttgggtg tgcagtacgc taaagccatg ggttacagag tgttggctat 1560

cgacggtggt gacgagagag gagagtttgt caagtccttg ggcgccgaag tgtacattga 1620

cttccttaag gaacaggaca tcgttagtgc tatcagaaag gcaactggtg gtggtccaca 1680

cggtgttatt aacgtgtcag tgtccgaaaa ggcaatcaac cagtcggtgg agtacgtcag 1740

aactttgggg aaagtggttt tagttagctt gccggcaggt ggtaaactca ctgctcctct 1800

tttcgagtct gttgctagat caatccagat tagaactacg tgtgttggca acagaaagga 1860

tactactgaa gctattgatt tctttgttag agggttgatc gattgcccaa ttaaagtcgc 1920

tggtttaagt gaagtgccag agatttttga cttgatggag cagggaaaga tcttgggtag 1980

atatgtcgtt gatacgtcaa agtagttatc tatattgttt cccagaatgg agatttctct 2040

aattgctcta tactctccga ctctatcagc actttaccat ctgtcgcatc taggtaataa 2100

agttcggtca caccaagcga tttaacgtac ttccacgtct tgtcataatt caaaccaacc 2160

tgggtcaaag cgtgagcatc atctgataaa caaaacctgg cgcctccatg ctttatgatt 2220

gcctccgcaa tatccctctt aggatacgac gtgtcccacc ctttccttat agctgacgag 2280

ttcaactcaa acaacccgcc gtacagtttt accaacttga tattccggac aatcaatgcc 2340

cagatctccg gccagtcgtt tttgcatgcg aacccgaaaa tggagcaatc ttccccgggg 2400

cctccaaata ccaactcacc cgagagagat aaagagacac cacccaccac gagacggagt 2460

atatccacca aggtaagtaa ctcagagtta atgatacagg tgtacacagc tccttcccta 2520

gccattgagt gggtatcaca tgacactggt aggttacaac cacgtttagt agttattttg 2580

tgcaattcca tggggatcag gaagtttggt ttggtgggtg cgtctactga ttcccctttg 2640

tctctgaaaa tcttttccct agtggaacac tttggctgaa tgatataaat tcaccttgat 2700

tcccaccctc ccttctttct ctctctctct gttacaccca attgaatttt cttttttttt 2760

ttactttccc tccttcttta tcatcaaaga taagtaagtt tatcaattgc ctattcagaa 2820

tgaaaaagcc tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctcatcgaa aagttcgaca 2880

gcgtctccga cctcatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg 2940

taggagggcg tggatatgtc ctccgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc 3000

gttatgttta tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg 3060

gggaattcag cgagagcctc acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc 3120

aagacctccc tgaaaccgaa ctccccgctg ttctccagcc ggtcgcggag gccatggatg 3180

cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa 3240

tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc 3300

actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc 3360

tcatgctttg ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct 3420

ccaacaatgt cctcacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga 3480

tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt 3540

gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc 3600

ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg 3660

gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag 3720

ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct 3780

gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg 3840

aatagtgtgc tacccacgct tactccacca gagctattaa catcagaaat atttattcta 3900

ataaatagga tgcaaaaaaa aaacccccct taataaaaaa aaaagaaacg attttttatc 3960

taatgaagtc tatgtatcta acaaatgtat gtatcaatgt ttattccgtt aaacaaaaat 4020

cagtctgtaa aaaaggttct aaataaatat tctgtctagt gtacacattc tcccaaaata 4080

gtgaaatcca gctgctagca gccccggaaa aacccttagt tgatagttgc gaatttaggt 4140

cgacctctca tgatttcaac cttaccccca cgtctc 4176

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Pox4_Up-F

<400> 15

gtggtggtaa gccgacagaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer ADH-2R

<400> 16

aacagcctca gcagtgtctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Tadh-F

<400> 17

gagggttgat cgattgccca 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Tadh-R

<400> 18

aaaaacgact ggccggag 18

<210> 19

<211> 474

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA fragment for removing resistance marker

<400> 19

gagggttgat cgattgccca attaaagtcg ctggtttaag tgaagtgcca gagatttttg 60

acttgatgga gcagggaaag atcttgggta gatatgtcgt tgatacgtca aagtagttat 120

ctatattgtt tcccagaatg gagatttctc taattgctct atactctccg actctatcag 180

cactttacca tctgtcgcat ctaggtaata aagttcggtc acaccaagcg atttaacgta 240

cttccacgtc ttgtcataat tcaaaccaac ctgggtcaaa gcgtgagcat catctgataa 300

acaaaacctg gcgcctccat gctttatgat tgcctccgca atatccctct taggatacga 360

cgtgtcccac cctttcctta tagctgacga gttcaactca aacaacccgc cgtacagttt 420

taccaacttg atattccgga caatcaatgc ccagatctcc ggccagtcgt tttt 474

<210> 20

<211> 551

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> homologous recombination template with resistance marker removed

<400> 20

gagggttgat cgattgccca attaaagtcg ctggtttaag tgaagtgcca gagatttttg 60

acttgatgga gcagggaaag atcttgggta gatatgtcgt tgatacgtca aagtagttat 120

ctatattgtt tcccagaatg gagatttctc taattgctct atactctccg actctatcag 180

cactttacca tctgtcgcat ctaggtaata aagttcggtc acaccaagcg atttaacgta 240

cttccacgtc ttgtcataat tcaaaccaac ctgggtcaaa gcgtgagcat catctgataa 300

acaaaacctg gcgcctccat gctttatgat tgcctccgca atatccctct taggatacga 360

cgtgtcccac cctttcctta tagctgacga gttcaactca aacaacccgc cgtacagttt 420

taccaacttg atattccgga caatcaatgc ccagatctcc ggccagtcgt ttttagcccc 480

ggaaaaaccc ttagttgata gttgcgaatt taggtcgacc tctcatgatt tcaaccttac 540

ccccacgtct c 551

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-F

<400> 21

ctcggagggc gaagaatctc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-R

<400> 22

caatgaccgc tgttatgcgg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Up-F

<400> 23

ttagaccgcc agagaaggga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Up-R

<400> 24

tgtcattgcg taacgtggga 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Down-F

<400> 25

gtggtgggtt cccagcttat 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Down-R

<400> 26

ggaggtacca acaatccccg 20

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer ADH-2F

<400> 27

tcccacgtta cgcaatgaca gtcttggttg gtttgccagc 40

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-2R

<400> 28

ataagctggg aacccaccac gctagcagct ggatttcact 40

<210> 29

<211> 6099

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR product

<400> 29

ttagaccgcc agagaaggga gtgggaaggc agaaaaatag tccggtattt tatgtatggc 60

ataaaggagt gtgtatagag acagaagaat aaaaatttca ggtttggttt atgtgtcgtt 120

tcggttgtag actaatggac gttgatgatc tctcatcatg atagccatcg gccacctcaa 180

atgatcgtga gacgcaaagg ctgaaatagg gttgagggtt gcttgattag acgagcattc 240

tgagctgttg tattctgtcg ttgatccctg gggctatctc tgctgatcgt caaacaagac 300

agccaaaaaa aacatccacc cactggtcag tggggctgta tgcaggcgta cgggtaaata 360

atttgtacgt tttaggaaac cattgtgcac aaaaagctaa agaaatctta acgagtggtt 420

aacctgtgta acagaggagg gagggaaaaa atttggccac aaacacacag acagaattat 480

tttacaagct agacaaccaa gtcaacccta gcccaactta atttcataga aaaatcaacc 540

aatcctattg tttgccaaaa taatttatag cccatgtaat agaatctctt gtctgtccaa 600

tttaaatact ttttgtactt atctcaaagt taacatcacc tgcttagcca taatccaggg 660

ttaacattct catccccacc accaccctca taactgtggg tcgcctgaga tttttcacat 720

aaatttttca cagatttccc ttgaaccaat tttttttttc ccctttgatt ttctggattt 780

ttttttttta caaccactgc tttagacgat ctctagctgg ttttctttct atttcattgc 840

ctgggtagtc gccgtaacca tttcccacct tcccattcta aacagtcaca gggtcctcct 900

caaacaacag cggtatgact tggattagaa cagaattctt gatcaaaggg aagatcatca 960

aacccttttt gcccaacgat aagcatccca cgttacgcaa tgacagtctt ggttggtttg 1020

ccagctggtg ccaagctcga agcacctatc ttcaatgccg ttgccaaatc catctaaatc 1080

aaggattctt acgtgggtaa ccgaagagac actgctgagg ctgttgattt cttcgcgaaa 1140

ggtttggtca agtgtccaat taaggttgtt gagttgagtg aattgccaga gattttcaaa 1200

ttgttggaag agggtaagat cttgggtaga tacgtcgttg acactgccaa ataatcaggc 1260

ggctccttcc ccaatttacg tagatgtttc cgtttataga attatatttt acacatgccc 1320

caaagcaaac atttccataa ttcttgaaca cttgtagaac acatgtggga gtccacccca 1380

cgagcggaca tatgtgccct atttgaacaa taactccgga atgttgtgtg attacataat 1440

tacaaccccg cgcgtgggaa taatttaccg aggcgacaca atcccccttt tccagaccac 1500

caatggtgac attttggtag tatttccaca agaggaaatt acagaaataa tggggctggt 1560

tggtggtggg agtggtacat acaacattga gaacgtattc ggagccaatt ggctgaatga 1620

gacacgataa ttggccgcat gctccaggga gcctgcgaca catcaaattt gacaggtctg 1680

aatcaatttc atcattggtt caaataatat ccgataccgt caatcttctt atcaaaagtg 1740

gggatctttc cccaaattca gctagcaacg tatagcactc ccccctttcc actccttcct 1800

agaagcatat ttaaacgggg atgtttctcc ctcgatttct tttccaaaac tgcaaaaaac 1860

tttaatcacc aaaactaact ccgaaacaag tatgtccgtt ccaactactc agaaagctgt 1920

tatctttgaa accaatggtg gcaagttaga atacaaagac gtgccggtcc ctgtccctaa 1980

acccaacgaa ttgcttgtca acgtcaagta ctcgggtgtg tgtcattctg acttgcatgt 2040

ctggaaaggc gactggccca ttcctgccaa gttgcccttg gtgggaggtc acgaaggtgc 2100

tggtgtcgtt gtcggcatgg gtgacaacgt caagggctgg aaggtggggg acttggctgg 2160

tatcaagtgg ttgaatggtt cgtgtatgaa ctgtgagttt tgccaacagg gcgcagaacc 2220

taactgttca agagccgaca tgtctgggta tacccacgat ggaactttcc aacaatacgc 2280

cactgctgat gctgtccaag ctgccaagat cccagaaggc gccgacatgg ctagtatcgc 2340

cccgatcttg tgcgctggtg tgaccgtgta caaggctttg aagaacgccg acttgttggc 2400

tggccaatgg gtggctatct ctggtgctgg tggtggtttg ggctccttgg gtgtgcagta 2460

cgctaaagcc atgggttaca gagtgttggc tatcgacggt ggtgacgaga gaggagagtt 2520

tgtcaagtcc ttgggcgccg aagtgtacat tgacttcctt aaggaacagg acatcgttag 2580

tgctatcaga aaggcaactg gtggtggtcc acacggtgtt attaacgtgt cagtgtccga 2640

aaaggcaatc aaccagtcgg tggagtacgt cagaactttg gggaaagtgg ttttagttag 2700

cttgccggca ggtggtaaac tcactgctcc tcttttcgag tctgttgcta gatcaatcca 2760

gattagaact acgtgtgttg gcaacagaaa ggatactact gaagctattg atttctttgt 2820

tagagggttg atcgattgcc caattaaagt cgctggttta agtgaagtgc cagagatttt 2880

tgacttgatg gagcagggaa agatcttggg tagatatgtc gttgatacgt caaagtagtt 2940

atctatattg tttcccagaa tggagatttc tctaattgct ctatactctc cgactctatc 3000

agcactttac catctgtcgc atctaggtaa taaagttcgg tcacaccaag cgatttaacg 3060

tacttccacg tcttgtcata attcaaacca acctgggtca aagcgtgagc atcatctgat 3120

aaacaaaacc tggcgcctcc atgctttatg attgcctccg caatatccct cttaggatac 3180

gacgtgtccc accctttcct tatagctgac gagttcaact caaacaaccc gccgtacagt 3240

tttaccaact tgatattccg gacaatcaat gcccagatct ccggccagtc gtttttgcat 3300

gcgaacccga aaatggagca atcttccccg gggcctccaa ataccaactc acccgagaga 3360

gataaagaga caccacccac cacgagacgg agtatatcca ccaaggtaag taactcagag 3420

ttaatgatac aggtgtacac agctccttcc ctagccattg agtgggtatc acatgacact 3480

ggtaggttac aaccacgttt agtagttatt ttgtgcaatt ccatggggat caggaagttt 3540

ggtttggtgg gtgcgtctac tgattcccct ttgtctctga aaatcttttc cctagtggaa 3600

cactttggct gaatgatata aattcacctt gattcccacc ctcccttctt tctctctctc 3660

tctgttacac ccaattgaat tttctttttt tttttacttt ccctccttct ttatcatcaa 3720

agataagtaa gtttatcaat tgcctattca gaatgaaaaa gcctgaactc accgcgacgt 3780

ctgtcgagaa gtttctcatc gaaaagttcg acagcgtctc cgacctcatg cagctctcgg 3840

agggcgaaga atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctccggg 3900

taaatagctg cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg 3960

ccgcgctccc gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctcacctatt 4020

gcatctcccg ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct ccctgaaacc gaactccccg 4080

ctgttctcca gccggtcgcg gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga 4140

cgagcgggtt cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt 4200

tcatatgcgc gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg 4260

tcagtgcgtc cgtcgcgcag gctctcgatg agctcatgct ttgggccgag gactgccccg 4320

aagtccggca cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctcacg gacaatggcc 4380

gcataacagc ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg 4440

ccaacatctt cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg 4500

agcggaggca tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg 4560

gtcttgacca actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc 4620

agggtcgatg cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg 4680

cccgcagaag cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa 4740

accgacgccc cagcactcgt ccgagggcaa aggaatagtg tgctacccac gcttactcca 4800

ccagagctat taacatcaga aatatttatt ctaataaata ggatgcaaaa aaaaaacccc 4860

ccttaataaa aaaaaaagaa acgatttttt atctaatgaa gtctatgtat ctaacaaatg 4920

tatgtatcaa tgtttattcc gttaaacaaa aatcagtctg taaaaaaggt tctaaataaa 4980

tattctgtct agtgtacaca ttctcccaaa atagtgaaat ccagctgcta gcgtggtggg 5040

ttcccagctt atttgaccaa catcagtcaa atctttgaag gtcaggcatt cgaacacttg 5100

acgtcgttcc atcagagaat cttgaaaata tacccaggtg ctaaaatcat cactgatgac 5160

gacgaagcta agcaattgag tgaaagcaga acgaatggta gattcttgca catcaagact 5220

gttgaaccag tgtatgaatt ctccgacaaa ttgctttaca cttctgttgg tgtcagaaag 5280

tatgctagag acaaggatct tcgttcgttt gtgtccacca aagtcattcc tggatcaact 5340

tctgttttgg atatgtggac tcagcaaact acgtaccatt cttggttgtc attcccaaca 5400

cttatgaaca gatcattcat taaggaagtc aagtctgtca agttgtctcc gttggagaat 5460

ggtatcagaa tcattgccga caagaacaat gctttgattg agttggaagc tgctgtcgtc 5520

aaaaagtcta ctgaaaagag tgactacact gagcagttga atgacttgtc aaggcagttg 5580

gctggaactg tcgattcccc tgtcaatggt ggcgttggtc agtaccgtgc attctttacg 5640

gatgccaagt acggaatcaa ggaagaagac atcaagaagg ttgctttatt gcgcgatgcc 5700

ttcaacgacc ttgccatgat tttgtaccgt tgtttgaatt tgcatggaag attcattggt 5760

ccaactatga aggtgtcgca caatgcattg gttgaattgt tcaacaagaa ctttaaggag 5820

gaaattgttg ccttgagatt gggcgaagaa gctcctaaac ctgtgccatc gagccgtgtt 5880

tcaatcttcc aggacagacg ttatgctgga agtcagttga acgagcgtgg ttcgatctcg 5940

aacatgtcta gctcgaacta ttctgggtcg agattagcaa gatcaccaac caatgcctcc 6000

accaattcat caaactcatc gatgaaccga tcaggaagat cttcgggata cccatcaagc 6060

aacatccagc ctggttattc ggggattgtt ggtacctcc 6099

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HR-F

<400> 30

tcatgatagc catcggccac 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HR-R

<400> 31

ccaccaacca gccccattat 20

Claims (62)

1.一种产长链二元酸重组微生物，其具有增加的乙醇脱氢酶活性以及具有降低的乙酰辅酶A氧化酶活性，其中所述产长链二元酸重组微生物选自假丝酵母属，其中乙酰辅酶A氧化酶由POX4基因编码。

2.权利要求1的产长链二元酸重组微生物，其具有过表达的ADH基因和/或弱化的POX4基因。

3.权利要求1的产长链二元酸重组微生物，其中，在所述重组微生物中，POX4基因被一或多个拷贝的ADH基因替换。

4.权利要求1的产长链二元酸重组微生物，其中，所述微生物选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

5.权利要求1的产长链二元酸重组微生物，其中所述产长链二元酸重组微生物基因组内的一个拷贝的POX4基因被一个拷贝的ADH基因替换。

6.权利要求5的产长链二元酸重组微生物，其中所述ADH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

7.一种生产长链二元酸的方法，包括在适于权利要求1-6任一项所述的产长链二元酸重组微生物生长的条件下培养所述产长链二元酸重组微生物。

8.权利要求7的方法，还包括从培养产物中分离和/或纯化长链二元酸。

9.权利要求7的方法，其中，所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸。

10.权利要求7的方法，其中，所述长链二元酸选自C9～C18长链二元酸。

11.权利要求7的方法，其中，所述长链二元酸选自十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。

12.权利要求7的方法，其中，所述长链二元酸选自正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种。

13.权利要求7的方法，其中，培养所述产长链二元酸重组微生物获得具有低含量羟基酸杂质的长链二元酸，其中所述羟基酸杂质的含量大于0，且在10000ppm以下，其中所述羟基酸杂质包括含有一个羧基的羟基脂肪酸。

14.权利要求13的方法，其中，所述羟基酸杂质的含量在4000ppm以下。

15.权利要求13的方法，其中，所述羟基酸杂质的含量在300ppm以下。

16.权利要求13的方法，其中，所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸。

17.权利要求13的方法，其中，所述长链二元酸选自C9～C18长链二元酸。

18.权利要求13的方法，其中，所述长链二元酸选自十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。

19.权利要求13的方法，其中，所述长链二元酸选自正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种。

20.权利要求13的方法，其中，所述羟基脂肪酸含有1个端羧基和1个端羟基，所述羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)_n-COOH，其中n≥7。

21.权利要求13的方法，其中所述羟基脂肪酸选自九碳羟基脂肪酸、十碳羟基脂肪酸、十一碳羟基脂肪酸、十二碳羟基脂肪酸、十三碳羟基脂肪酸、十四碳羟基脂肪酸、十五碳羟基脂肪酸、十六碳羟基脂肪酸、十七碳羟基脂肪酸、十八碳羟基脂肪酸、或十九碳羟基脂肪酸中的任意一种或多种。

22.权利要求13的方法，其中：

当所述长链二元酸为十二碳二元酸时，羟基酸杂质为十二碳羟基脂肪酸，其中十二碳羟基脂肪酸的含量低于4000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm，500ppm，300ppm，200ppm，150ppm或更低；

当所述长链二元酸为十碳二元酸时，羟基酸杂质为十碳羟基脂肪酸，其中十碳羟基脂肪酸的含量低于2000ppm，1500ppm，1000ppm，500ppm，300ppm，200ppm，150ppm或更低；或者

当所述长链二元酸为十六碳二元酸时，羟基酸杂质为十六碳羟基脂肪酸，其中十六碳羟基脂肪酸杂质的含量低于9000ppm，8000ppm，6000ppm，3000ppm，2000ppm，1000ppm，800ppm，600ppm，500ppm，400ppm，300ppm，200ppm或更低。

23.权利要求13的方法，其中，培养所述产长链二元酸重组微生物获得发酵液，其中发酵液中含有的羟基酸杂质的含量在3％以下，其中所述百分比为发酵液中羟基脂肪酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

24.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在2％以下。

25.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在1.5％以下。

26.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在1.3％以下。

27.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在1.2％以下或更低。

28.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在1.1％以下或更低。

29.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在1.0％以下或更低。

30.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.9％以下或更低。

31.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.8％以下或更低。

32.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.7％以下或更低。

33.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.6％以下或更低。

34.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.5％以下或更低。

35.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.4％以下或更低。

36.权利要求23的方法，其中羟基酸杂质的含量在0.3％以下或更低。

37.权利要求23的方法，其中，所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸，并且所述羟基酸杂质为含有1个端羧基和1个端羟基的羟基脂肪酸。

38.权利要求23的方法，其中所述长链二元酸选自C9～C18长链二元酸。

39.权利要求23的方法，其中所述长链二元酸选自十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。

40.权利要求23的方法，其中所述长链二元酸选自正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种。

41.权利要求23的方法，其中所述羟基脂肪酸化学式为CH₂OH-(CH₂)_n-COOH，其中n≥7。

42.权利要求23的方法，其中所述羟基脂肪酸选自九碳羟基脂肪酸、十碳羟基脂肪酸、十一碳羟基脂肪酸、十二碳羟基脂肪酸、十三碳羟基脂肪酸、十四碳羟基脂肪酸、十五碳羟基脂肪酸、十六碳羟基脂肪酸、十七碳羟基脂肪酸、十八碳羟基脂肪酸、或十九碳羟基脂肪酸中的任意一种或多种。

43.权利要求7的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少10％，其中百分比为发酵液中羟基酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

44.权利要求7的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质的含量降低至3％以下，其中百分比为发酵液中羟基酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

45.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少20％。

46.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少30％或更高。

47.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少40％或更高。

48.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少50％或更高。

49.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少60％或更高。

50.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少70％或更高。

51.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少80％或更高。

52.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少90％或更高。

53.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少95％或更高。

54.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少96％或更高。

55.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少97％或更高。

56.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少98％或更高。

57.权利要求43或44的方法，其中相对于POX4基因未被ADH基因替换的微生物，发酵结束后的发酵液中含有的羟基酸杂质含量降低至少99％或更高。

58.一种改造产长链二元酸微生物的方法，包括增强乙醇脱氢酶活性以及降低乙酰辅酶A氧化酶活性，其中所述产长链二元酸微生物选自假丝酵母属，其中乙酰辅酶A氧化酶由POX4基因编码。

59.权利要求58的方法，包括用ADH基因替换所述产长链二元酸微生物基因组内的POX4基因。

60.权利要求58的方法，其中替换采用同源重组的方式进行。

61.权利要求58的方法，其中，利用所述改造的产长链二元酸微生物生产的长链二元酸中杂酸含量相对于POX4基因未被替换的微生物降低。

62.权利要求58的方法，其中POX4基因未被ADH基因替换。