CN115992114A - CRISPRa基因激活系统、包含其的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRISPRa基因激活系统、包含其的基因工程菌及其应用。所述CRISPRa基因激活系统包含：dCas9表达盒、scRNA表达盒和激活因子表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子；所述scRNA表达盒包括编码所述scRNA的核苷酸序列及其上游的第二启动子；所述激活因子表达盒包括激活因子基因及其上游的第三启动子。本发明的CRISPRa基因激活系统能够在不添加诱导剂、不构建大体量表达载体的情况下灵活调控不同的基因组内源基因，为维斯假丝酵母中开发可靠的基因表达量上调的工具，解决外源基因过表达载体承受空间的限制。

Description

CRISPRa基因激活系统、包含其的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种CRISPRa基因激活系统、包含其的基因工程菌及其应用。

背景技术

维斯假丝酵母(Candida viswanathii)是一种产自油田、具有降解原油能力的真菌。其在工业生物领域具有极高的利用价值。通过改造维斯假丝酵母的代谢途径，可以利用其以烷烃为底物合成长链二元酸。例如Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)报道了敲除POX4和POX5的各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率。因此认为维斯假丝酵母是具有重要工业价值的微生物。

我们需要对维斯假丝酵母的基因组与基因表达过程进行改造，才能达到控制产物代谢途径的目的。例如：在长链二元酸的代谢途径中，合成长链二元酸的主要途径为ω-氧化，我们便希望能够提高ω-氧化相关基因的表达。通常情况下，我们会将需要过量表达的基因克隆至一个含有诱导型启动子的质粒载体中，再将质粒转化至工程菌中，在培养过程中加入诱导剂进行过量表达。但该方法存在一些明显的缺陷：当需要过量表达的内源基因很多时，需将所有基因依次克隆在载体质粒中，载体的体量会增大，克隆和转化难度会增加。同时，诱导基因的表达需要诱导剂，可能会增加发酵成本。因此，在维斯假丝酵母中开发可控的基因激活系统是具有研究价值的。

CRISPR activation，即CRISPRa技术，逐渐进入大家的视野。它能够在不引入外源基因表达框的情况下直接与基因组中目的基因进行相互作用，提高目的基因的转录水平。CRISPRa的原理是利用dCas9结合但不酶切双链DNA的能力，在CRISPR系统中引入一个转录激活因子，并将该CRISPR系统定位在目的基因启动子附近从而提高其表达水平。CRISPRa以多种不同形式在模式生物中被报道，其中包括：Gilbert等人报道的dCas9-VP64、Chavez等人报道的CRISPR-VPR、Chavez等人报道的Suntag以及Zalatan等人报道的CRISPR-scRNA等。

CRISPRa能够实现多个scRNA(scaffold RNA)同时表达，这意味着使用CRISPRa系统在理论上可以规避过量表达中引入大量外源序列的弊端，直接控制内源基因并提升其表达水平。同时，CRISPRa系统在运行过程中不需要添加其它的小分子诱导剂，因此，在维斯假丝酵母中开发CRISPRa系统对底盘细胞的基因工程改造具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少能够在不引入更多外源基因序列的情况下提升目的基因表达的维斯假丝酵母的缺陷，提供一种CRISPRa基因激活系统在维斯假丝酵母中的应用。本发明的CRISPRa基因激活系统能够在不引入更多外源基因序列的情况下提升目的基因表达，并可以灵活控制激活效果。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供一种CRISPRa基因激活系统在维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)中的应用；尤其是在提高维斯假丝酵母的目的基因表达中的应用；

所述CRISPRa基因激活系统包含：dCas9表达盒、scRNA表达盒和激活因子表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述scRNA表达盒包括编码所述scRNA的核苷酸序列及其上游的第三启动子，所述第三启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；

所述激活因子表达盒包括激活因子基因及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。

在本发明一些实施方案中，所述激活因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明一些实施方案中，编码所述scRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的PAM序列例如NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:6所示。

在本发明一些具体实施方案中，所述识别序列如SEQ ID NO:9～12任一项所示。

本领域技术人员应当理解的是，本发明中，所述目的基因是所述CRISPRa基因激活系统所要提高其表达水平的基因。

在本发明一些实施方案中，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

在本发明一些实施方案中，所述dCas9表达盒整合在所述维斯假丝酵母的染色体中。

在本发明一些具体实施方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一启动子即启动子1.0；所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的第二启动子分别为启动子2.0和启动子2.1；所述核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的第二启动子分别为启动子3.0和启动子3.1。

本发明的第二方面提供一种CRISPRa基因激活系统，所述CRISPRa基因激活系统如第一方面所述。

在本发明一些实施方案中，所述激活因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明一些实施方案中，编码所述scRNA的核苷酸序列如第一方面所述。

在本发明一些具体实施方案中，所述识别序列如SEQ ID NO:9～12任一项所示。

本发明的第三方面提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达如第二方面所述的CRISPRa基因激活系统，所述基因工程菌的出发菌为维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)。

在本发明一些实施方案中，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

本发明的第四方面提供一种提高维斯假丝酵母中的基因表达的方法，所述方法包括：

(1)使所述维斯假丝酵母包含如第二方面所述的CRISPRa基因激活系统中的dCas9表达盒；

(2)根据要提高表达的目的基因，设计如第二方面所述的CRISPRa基因激活系统的scRNA表达盒和激活因子表达盒，并将其导入到所述维斯假丝酵母中，即得。

在本发明一些实施方案中，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

本发明的第五方面提供一种重组载体组合，所述重组载体组合包括编码dCas9的核酸的dCas9重组载体，以及编码scRNA和激活因子的核酸的复合重组载体；或者所述重组载体组合包括编码dCas9的核酸的dCas9重组载体、编码scRNA的核酸的scRNA重组载体和编码激活因子的核酸的激活因子重组载体；

所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述scRNA为如第二方面所述的CRISPRa基因激活系统的scRNA。

在本发明一些实施方案中，所述dCas9重组载体或复合重组载体的骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101及其衍生质粒。

在本发明一些具体实施方案中，所述复合重组载体的骨架质粒为pCIB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

本发明中，所述CRISPRa基因激活系统含有三个部分：dCas9蛋白、scRNA和激活因子。所述dCas9蛋白能够结合基因组DNA，所述scRNA是具有固定二级结构区域与可变20碱基识别序列的小RNA，所述激活因子可以促进目的基因的表达。所述scRNA包含能够分别与dCas9和激活因子的结合的功能域二级结构，结合后形成CRISPR复合体，而scRNA作为整个CRISPR复合体的骨架。同时，scRNA含有的20碱基识别序列能够识别并结合基因组中与其互补的序列并将dCas9蛋白精准定位在基因组的特定区域。激活因子区域含有能与scRNA结合域结合的RNA结合区域与可能与RNA转录系统相互作用的激活因子区域。当CRISPRa系统在细胞中表达时，dCas9、scRNA与激活因子通过其特定区域结合形成CRISPR复合体。CRISPR复合体会通过scRNA的20bp识别序列寻找到基因组中与其互补的区域。

本发明通过编辑scRNA的20bp识别序列，将CRISPR复合体引导至目的基因所在的上游启动子区域，绑定在CRISPR复合体上的激活因子会与附近的RNA转录酶及其辅助蛋白进行相互作用，使RNA转录酶更高效地结合启动子序列，达到提高转录水平从而提高基因表达的目的。

本发明中，所述CRISPRa基因激活系统的三个部分需要同时在底盘菌(即维斯假丝酵母菌)中进行表达。

在本发明一些实施方案中，在本发明的维斯假丝酵母中，dCas9蛋白整合在维斯假丝酵母的基因组中，激活因子重组蛋白与scRNA共同插入到同一质粒载体中表达。

当CRISPRa系统在维斯假丝酵母中正确表达后，dCas9蛋白会被在基因组20bp靶点的5’端上游的一个能够让其识别的PAM(Protospace adjacent motif)序列引导至细胞核中，激活因子随之进入细胞核中；scRNA通过dCas9结合域与dCas9结合，同时通过激活因子结合域与激活因子结合，形成CRISPR复合体。CRISPR复合体会通过scRNA的20bp识别序列找到其在基因组中与之互补的序列将CRISPR复合体锚定在目的基因启动子区域的上游。

本发明中，所述PAM序列为本领域常规，即NGG。

锚定后，绑定在启动子上游的CRISPR复合体会通过激活因子域RNA聚合酶系统的蛋白进行相互作用，使RNA聚合酶能够更高效地绑定在目的基因的启动子区域。这样会使RNA聚合酶的转录活动增加，从而提高目的基因的表达量。

本发明中，dCas9蛋白为S.pyogenes的Cas9蛋白D10A、H840A两个点突变的突变体，放在了维斯假丝酵母第一启动子下表达。该表达框两端接入维斯假丝酵母γ整合位点同源臂，并构建至氨苄抗生素标记的克隆载体中。该整合质粒经过酶切线性化，使用CRISPR-Cas9编辑的方法插入维斯假丝酵母γ整合位点中，获得dCas9表达菌株。

scRNA与激活因子蛋白均在同一个质粒中表达。scRNA的通用结构与序列在Zalatan等人的文献(Engineering Complex Synthetic Transcriptional Programs withCRISPR RNA Scaffolds,Cell 160,339-350，2015-01-15)中有过报道。scRNA和激活因子的表达框共同构建在含有氨苄抗生素标记的克隆载体中。

所述激活因子可为本领域常规，例如MCP-VP64，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

MCP-VP64是一种重组组合蛋白。MCP负责与scRNA结合，它能够绑定scRNA中MS2的结构识别域，使其能与CRISPR复合体绑定。VP64能够与RNA聚合酶转录系统进行相互作用，从而提高目的基因的表达效率。

本发明中，所述scRNA含有20bp识别序列的全结构域在质粒载体中的序列，20bp序列由于其可变性，由20个“N”碱基表示。其后的序列为scRNA中识别dCas9的结构序列与识别激活因子的发卡夹序列。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的CRISPRa基因激活系统通过启动子的选择，能够在不添加诱导剂、不构建大体量表达载体的情况下灵活调控不同的基因组内源基因，为维斯假丝酵母中开发可靠的基因表达量上调的工具。本发明克服了传统方法的上述弊端，对基因表达的激活作用可控，解决外源基因过表达中表达量不可控或需要使用小分子诱导试剂等问题，使维斯假丝酵母中基因表达调控手段更丰富、更灵活，能够快速引进调控元件对多个不同目的基因进行激活，解决外源基因过表达载体承受空间的限制。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中使用的维斯假丝酵母菌株的保藏编号为CCTCC：M2020048，培养方法参见CN111748480A。

实施例中使用的基因合成方法、PCR扩增方法均为本领域常规。

实施例中使用的Gibson重组(Thermo-Invitrogen GeneArt^TMGibson AssemblyHiFi reagent master mix A46629)方法、转化的方法(参见Molecular Cloning:ALaboratory Manual)均为本领域常规。

实施例中使用的质粒回收试剂盒为

AxyPrep Plasmid Miniprep KitAP-MN-P-250。

实施例中使用的ScaI限制性内切酶为Thermo FastDigest ScaI FD0434。

实施例中使用的大肠杆菌为Top10。

实施例1构建CRISPRa基因激活系统表达菌株

第一步：构建dCas9整合表达菌株

1、通过PCR分别扩增如SEQ ID NO:1所示的dCas9基因片段和如SEQ ID NO:2所示的启动子1.0片段。

2、使用Gibson重组的方法，以1:0.75:0.75:2.5的体积比例将质粒载体pUC19、dCas9基因片段、启动子1.0片段和Gibson重组酶预混液进行混合、组装，并在50℃孵育15～30min，获得dCas9重组质粒。

3、将获得的dCas9重组质粒用化学转化的方法转化至大肠杆菌中。将转化完成的菌涂布在含有40μg/mL氨苄抗生素的LB平板上，37℃过夜培养。

4、挑取平板上的单克隆至5mL LB+40μg/mL氨苄液体培养基中，过夜振荡培养后使用质粒回收试剂盒提取质粒，收获纯化后的dCas9整合质粒。

5、使用ScaI限制性内切酶酶切dCas9整合质粒，获得线性化的dCas9整合质粒，可用于转化整合。

6、制备感受态细胞：划线挑取维斯假丝酵母菌株单克隆，在YPD培养基中30℃振荡培养24个小时，按1:200的比例稀释后过夜培养16个小时。

7、使用分光光度计测定菌液OD值，当OD值达到约2时制备电转感受态细胞。将80μL感受态细胞转移至2mm间隙的电转杯中，加入pCas9CRISPR编辑质粒与线性化后的dCas9整合质粒；在2.4kV电压下进行电转，将电转孵育完毕后的菌均匀涂在含有100μg/mL诺尔丝菌素的YPD平板中，30℃培养3～6天。

8、挑取平板中的单克隆至含有100μg/mL诺尔丝菌素的YPD平板中，若无菌生长，则表明pCas9 CRISPR质粒已完全丢失。经过验证，获得dCas9整合表达菌株。

第二步：构建scRNA+激活因子质粒

1、在维斯假丝酵母的基因组序列中确定并找到要激活的目的基因，并在目的基因启动子序列上游50～300bp范围内寻找NGG的PAM识别序列。在找到的PAM序列上游取20bp作为scRNA的识别序列。

2、通过PCR分别扩增包含识别序列和通用结构的scRNA片段，以及如SEQ ID NO:7所示的启动子3.0片段或如SEQ ID NO:8所示的启动子3.1片段；

通过PCR分别扩增包含如SEQ ID NO:3所示的MCP-VP64片段，以及如SEQ ID NO:4所示的启动子2.0片段或如SEQ ID NO:5所示的启动子2.1片段。

3、使用Gibson重组的方法，以0.75:1:0.75:2.5的体积比例将scRNA片段与启动子3.0片段或启动子3.1片段、质粒载体pCIB2、MCP-VP64片段与启动子2.0片段或启动子2.1片段、以及Gibson重组酶预混液分别进行混合、组装，并在50℃孵育15～30min，获得对应于不同启动子片段的scRNA+激活因子质粒。

4、将步骤3获得的scRNA+激活因子质粒用化学转化的方法转化至大肠杆菌中，将转化完成的菌涂布在含有40μg/mL氨苄抗生素的LB平板上，过夜培养。

5、挑取平板上的单克隆至5mL LB+40μg/mL氨苄液体培养基，过夜振荡培养后使用质粒回收试剂盒提取质粒，收获纯化后的scRNA+激活因子质粒。

第三步：转化scRNA+激活因子质粒

1、将第一步中获得的dCas9整合表达菌株在YPD平板上划线挑菌，挑取单克隆于含YPD的种子摇瓶中30℃振荡培养24个小时。

2、将菌从种子摇瓶中按1:200的比例稀释后转接至含YPD的摇瓶中，过夜培养16个小时。

3、其他步骤参见第一步的7，收获菌液，制作感受态细胞。使用电转化的方法将scRNA+激活因子质粒转化至感受态细胞中，在YPD平板上30℃培养获得单克隆。

4、挑取平板中的单克隆，进行下一步的筛选验证。

实施例2CRISPRa基因激活系统的效果验证

按照实施例1，在维斯假丝酵母菌株中插入dCas9的表达框，构建了dCas9整合表达菌株。选取了两个基因PXA1和AAT2作为目的基因，每个基因都通过标准的方法设计了两个scRNA。scRNA的20bp的识别序列分别为：

PXA1-1：actacaaagaagaagatgca(SEQ ID NO:9)；

PXA1-2：aaagtcgatctggcatgaaa(SEQ ID NO:10)；

AAT2-1：tcttattactgcgaaactgt(SEQ ID NO:11)；

AAT2-2：aagaaaacgggtaaactgta(SEQ ID NO:12)。

根据上述识别序列，如表1所示分别构建了不同启动子的scRNA+激活因子重组质粒，并分别转化至所述dCas9整合表达菌株中，得到以下菌株：

表1 CRISPRa基因激活系统元件配置

菌株编号	激活因子启动子	scRNA启动子	识别序列
				菌株1	启动子2.0	启动子3.0	PXA1-1
菌株2	启动子2.0	启动子3.0	PXA1-2
				菌株3	启动子2.0	启动子3.0	AAT2-1
菌株4	启动子2.0	启动子3.0	AAT2-2
				菌株5	启动子2.1	启动子3.1	PXA1-1
菌株6	启动子2.1	启动子3.1	PXA1-2
				菌株7	启动子2.1	启动子3.1	AAT2-1
菌株8	启动子2.1	启动子3.1	AAT2-2

各菌株一式三份，将24株菌株与对照菌株培养24小时后，通过RT-qPCR对PXA1与AAT2基因的表达水平进行了测定。采用的对照菌株含有GFP、dCas9，并且含有一个非靶点序列的scRNA+激活因子质粒。得到的结果如表2和表3所示。

表2 PXA1基因表达水平检测结果

表3 AAT2基因表达水平检测结果

	识别序列	表达水平	标准误差
				对照菌株	无关序列	222.86	24.73
菌株3	AAT2-1	411.01	8.87
				菌株4	AAT2-2	410.24	10.00
菌株7	AAT2-1	390.72	16.25
				菌株8	AAT2-2	369.65	10.25

通过结果可以看出，无论哪一种启动子组合，CRISPRa作用于PXA1和AAT2这两个基因上都呈现了表达水平显著提高的效果。而且启动子2.0和启动子3.0组合获得的表达水平要高于启动子2.1和启动子3.1组合的效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司

CIBT美国公司

<120> CRISPRa基因激活系统、包含其的基因工程菌及其应用

<130> P21015931C

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4119

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dCas9

<400> 1

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atcaccgacg aatacaaggt cccatccaag aagttcaagg tcttgggtaa caccgaccgt 120

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aaggaattgt tgggtatcac catcatggaa cgttcctcct tcgaaaagaa cccaatcgac 3540

ttcttggaag ccaagggtta caaggaagtc aagaaggact tgatcatcaa gttgccaaag 3600

tactccttgt tcgaattgga aaacggtcgt aagagaatgt tggcttccgc cggtgaattg 3660

caaaagggta acgaattggc cttgccatcc aagtacgtca acttcttgta cttggcctcc 3720

cactacgaaa agttgaaggg ttccccagaa gacaacgaac aaaagcaatt gttcgtcgaa 3780

caacacaagc actacttgga cgaaatcatc gaacaaatct ccgaattctc caagagagtc 3840

atcttggccg acgctaactt ggataaggtc ttgtccgcct acaacaagca cagagacaag 3900

ccaatcagag aacaagccga aaacatcatc cacttgttca ccttgaccaa cttgggtgct 3960

ccagccgctt ttaagtactt cgataccacc atcgaccgta agcgttacac ttccaccaag 4020

gaagtcttgg acgctacctt gatccaccaa tccatcaccg gtttgtacga aacccgtatc 4080

gacttgtccc aattgggtgg tgacgaaggt gccgattaa 4119

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子1.0

<400> 2

aagaaacgta ttgcaactgg agatagcgat cgttcaattt attccgattt tgtgggggaa 60

gtcgcccgct agtgggcgtg cgcgagtggc aaaagaaact gggccatgct tcttatcatc 120

ccttagaaga gcaatcataa gaaacgttca gtgagaaaaa cgttggcttc ggttaatgat 180

caccttaaag gcaaaatacc tccatgtatg aacatgtagg ttattccttt ttcttttttt 240

gcaacaccct cggcgggttg ttcatattcc cggaaaacac ctccactcgg ggctaagtgg 300

atcttctata aacccgggga aataaggagc cccggtgagc gcgcacacac accaccttca 360

ttttgtccga gggaaacagc acgtgaatcc ggaacacgag aggaatattt cttctatttt 420

tttttcttct ctactgtgag cgcgtgatta tataatcaca agcgatcaac ttatggtagg 480

gtcgtgcacg gcgcaccggg ttccaaaatg atctgcgagg gacaaaattc ttttttttct 540

tccagcatgc cgctggtggc aaataccgtc gtggcatgat gctccctatg catttgattc 600

acaccaccac caccattaat caccaattaa gaggggacaa aagtgaacaa ttggtggccg 660

tcaggttaca ctcatctgct tcggagtttt acgtcccttt ctcttttcaa tttgtgaaat 720

gtcaccctgg cggcgttcga gagagatcag tccgaagcgc gtggtaggag aaacggagca 780

ccgcagcaac aaaaaaaaaa aaaaaaaatt ccaaacccaa gggggtaggg agaagaacag 840

ccagggaagt tgtttaccga cctgaccgta aatttgctgc tgaaagaaac gtgtcaaaca 900

agaccaattg gctcaattga ccctgtggaa atgctttgtt gaccaccaat gcttccacca 960

aacgttactt tttttttgca atcggatggt atgggtctgg ggttcacctg ttttgtaaag 1020

ctacagaagg tggcatattt ctctgatcag gtgttttttt tttcggctgc tgctgctcgt 1080

ggtggtgtag tggtagtggt gtgtgtgtgt gtgtgtgcgt gcgtgtggaa ggacgctttt 1140

tgctctctga ctcctcccaa tcagaagttg ctatagtggt gaaacaacaa tggatgataa 1200

tgccccgggc ggtgcgtgtc cgacacaaac cactacattt tttagctggg agcctactgc 1260

cactacgacc cacccaccca tggtcaacaa aaaaattctg acaaattata aaataaccct 1320

tgaattcccc cttggaaaaa tttttggtat ttctctctct cttttccttt ccctcttctt 1380

tttctctcca tcaatcaatt gacgttcagt aactcaatta attacatcac atccctcaat 1440

taaagaattt aaaca 1455

<210> 3

<211> 525

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MCP-VP64

<400> 3

atggcttcta actttactca gttcgttctc gtcgacaatg gcggaactgg cgacgtgact 60

gtcgccccaa gcaacttcgc taacgggatc gctgaatgga tcagctctaa ctcgcgttca 120

caggcttaca aagtaacctg tagcgttcgt cagagctctg cgcagaatcg caaatacacc 180

atcaaagtcg aggtgcctaa aggcgcctgg cgttcgtact taaatatgga actaaccatt 240

ccaattttcg ccacgaattc cgactgcgag cttattgtta aggcaatgca aggtctccta 300

aaagatggaa acccgattcc ctcagcaatc gcagcaaact ccggcatcta cggctccgga 360

cgagccgatg ctctcgacga ttttgacctc gatatgctgg gatccgacgc tctcgatgac 420

ttcgaccttg acatgctggg gagtgacgct ctggacgact tcgatctcga catgctgggc 480

tccgacgccc tggatgactt cgatctggac atgctcatca actga 525

<210> 4

<211> 967

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子2.0

<400> 4

gactaaaagg tatgtgttgg tgtgaagaag aaagtggaag ggaagctggt gatggtgggt 60

tcgtctatcc cttttttata gttgcttgtt agtagggtac tctctaggga ctcgatgggg 120

gaaggttctt gatatttgct tagttcgaga aggttccaga tgagcgagac atttttggta 180

gcgacattgg gcttgatcga tgatgatctg cacgacattt tgtgttcttg cgacacgctg 240

cactaccaag tgtaatctgg ctgaacggat cacaagataa acctctgaaa aattatctca 300

gggcatgcaa caacaattat acatagaaga gggagtcacg atatacacct gtgaaggaat 360

catgtggtcg gctctccttg aactttgaat tcatgcaatt attaagaaga agcacaggtg 420

agcaacccac catacgttca tttgcaccac ctgatgatta aaagccaaag aaagaaaaaa 480

aaaaagaaac aggcggtggg aattgttaca acccacgcga acccgaaaat ggagcaatct 540

tccccggggc ctccaaatac caactcaccc gagagagaga aagagacacc acccaccacg 600

agacggagta tatccaccaa ggtaagtaac tcagggttaa tgatacaggt gtacacagct 660

ccttccctag ccattgagtg ggtatcacat gacactggca ggttacaacc acgtttagta 720

gttattttgt gcattccatg gggatcagga agtttggttt ggtgggtgcg tctactgatt 780

cccctttgtc tctgaaaatc ttttccctag tggaacactt tggctgaatg atataaattc 840

accttgattc ccaccctccc ttctttctct ctctctctgt tacacccaat tgaattttct 900

tttttttttt tactttccct ccttctttat catcaagata agtaagttta tcaattgcct 960

attcaga 967

<210> 5

<211> 967

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子2.1

<400> 5

gactaaaagc tatctgttgg tgtgaagaag aaagtggaag ggttgctggt gatggtgggt 60

tcgtctatcc cttttttata gttgcttgtt agtagggtac tctctaggga ctcgatgggc 120

cttggttctt gatatttgct tagttcgaga aggttccaga tgagcgagac atttttggta 180

gcgacaaagg gcttgatcga tgagtctctg cacgtgcttt tgtgttcttg cgacacgctg 240

ccctaccaac tgtaatcagg ttgaacggat cacaagataa acctctgaaa aattatctca 300

gggcatgcaa caacaattat acatataaca gggagtcaag atatacacct gtgaatgaat 360

catgtggtcg cctctccttg aactatgaat tcatgcaatt attatgaaga agcacaggtg 420

agcaacccac catacgttca tttgcaccac ctgatgatta aaagccaaag aaagaaaaaa 480

aaaaagaaac aggcggtttt aattcttaca acccacgcga acccgaaaat ggagcaatct 540

tcccggggcc ctccaaatac ttactcaccc gagagagaga aagagacacc acccaccacg 600

agacggagta tatccacgaa ggtaagtaac tcagggttaa tgatacaggt gtacacagct 660

ccttccctag ccattgagtg ggtatcacat gacactggca ggttacaacc acgtttagta 720

gttattttgt gcattccatg gggatgacga agtttggttt ggtgggtgcg tctactgatt 780

cccctttgtc tctgaaaatc ttttccctag tggaacactt tggctgaatg atataaatac 840

accttgattc ccaccctccc ttctttctct ctctctctgt tacacccaat tgaattttct 900

tttttttttt tactttccct ccttctttat catcaagata agtaagttta tcaattgcct 960

attcaga 967

<210> 6

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> scRNA结构序列

<400> 6

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgcggga gcacatgagg atcacccatg tgcgactccc acagtcactg 120

gggagtcttc cc 132

<210> 7

<211> 239

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子3.0

<400> 7

ccctcgtttt gcccttctct ttttttttct tttctgctct gctggtctgt ttcctttgct 60

cttcgctgtt atcaaccggg caaacgtagt catttttttt tcgctcgtct ctcccttaga 120

gtttaccttc tcgttgatta aaagaaaaat tttcttccac tttttttttc tgattctgct 180

tttttccttt ccctttcttt tctttccttt gctctacaca tctaaagaaa taatcaatc 239

<210> 8

<211> 239

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子3.1

<400> 8

cactcgtatt gcccttctct tttattctct tctctgctgt gctggtctgt atcctttgct 60

ctacgctgat atcaaccggg caaacgtagt catttttttt tcgctcgtct ctcccttaga 120

gtttaccttc tcgttgatta aaagaaaaat tttcttggac tttttttttc tcattctgct 180

tttttccttt ccctttcttt tatatctttt gctctacaca tctaaagaaa taatcattc 239

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PXA1-1

<400> 9

actacaaaga agaagatgca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PXA1-2

<400> 10

aaagtcgatc tggcatgaaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAT2-1

<400> 11

tcttattact gcgaaactgt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAT2-2

<400> 12

aagaaaacgg gtaaactgta 20

<210> 13

<211> 5873

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCIB2

<400> 13

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

Claims (10)

1.一种CRISPRa基因激活系统在维斯假丝酵母(Candida viswanathii)中的应用；

所述CRISPRa基因激活系统包含：dCas9表达盒、scRNA表达盒和激活因子表达盒；其中：所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述scRNA表达盒包括编码所述scRNA的核苷酸序列及其上游的第三启动子，所述第三启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；

所述激活因子表达盒包括激活因子基因及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激活因子基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；

和/或，编码所述scRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的PAM序列例如NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:6所示；例如，所述识别序列如SEQ ID NO:9～12任一项所示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述dCas9表达盒整合在所述维斯假丝酵母的染色体中。

5.一种CRISPRa基因激活系统，其特征在于，所述CRISPRa基因激活系统包含：dCas9表达盒、scRNA表达盒和激活因子表达盒；其中：

所述dCas9表达盒包括dCas9基因及其上游的第一启动子，所述dCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述scRNA表达盒包括编码所述scRNA的核苷酸序列及其上游的第三启动子，所述第三启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；

所述激活因子表达盒包括激活因子基因及其上游的第二启动子，所述第二启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示；

较佳地，所述激活因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6.如权利要求5所述的CRISPRa基因激活系统，其特征在于，编码所述scRNA的核苷酸序列包含识别序列和结构序列；所述识别序列为与目的基因转录起始250个碱基内的PAM序列例如NGG序列上游的20个碱基互补的序列；所述结构序列如SEQ ID NO:6所示；

例如，所述识别序列如SEQ ID NO:9～12任一项所示。

7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达如权利要求5或6所述的CRISPRa基因激活系统，所述基因工程菌的出发菌为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)；

较佳地，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

8.一种提高维斯假丝酵母中的基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)使所述维斯假丝酵母包含如权利要求5或6所述的CRISPRa基因激活系统中的dCas9表达盒；

(2)根据要提高表达的目的基因，设计如权利要求5或6所述的CRISPRa基因激活系统中的scRNA表达盒和激活因子表达盒，并将其导入到所述维斯假丝酵母中，即得。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母为保藏号为CCTCC：M2020048的菌株。

10.一种重组载体组合，其特征在于，所述重组载体组合包括编码dCas9的核酸的dCas9重组载体，以及编码scRNA和激活因子的核酸的复合重组载体；或者，

所述重组载体组合包括编码dCas9的核酸的dCas9重组载体、编码scRNA的核酸的scRNA重组载体和编码激活因子的核酸的激活因子重组载体；

所述dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述scRNA为如权利要求5或6所述的CRISPRa基因激活系统中的scRNA。