CN108642075A - 适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法。所述表达载体含有pUC19质粒的序列，且所述pUC19质粒上的多克隆位点处插入有太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子；其中，所述启动子在所述终止子的上游。该表达载体无需诱导，可稳定表达，并在太瑞斯梭孢壳霉中高效表达，而且具有在大肠杆菌中稳定性复制和保持、以及便于DNA纯化分离操作的特质。

Description

适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法。

背景技术

太瑞斯梭孢壳霉属于散囊菌纲，散囊菌霉目，嗜热子囊菌科，拉丁名为Thielaviaterrestris。菌落为白色，具短绒毛，于45℃下生长迅速，具有水解生物质中多种主要多糖的能力，可产生大量的植物细胞壁降解酶类。它是潜在的耐高温酶库，所产酶的最适温度多在60～80℃之间，温度耐受性良好。因此，太瑞斯梭孢壳霉在用于耐热酶类表达研究方面具有巨大的应用前景。

现有的关于太瑞斯梭孢壳霉表达载体的研究未见报道，利用高效率的启动子表达目的蛋白是构建表达载体的一种常用策略，其中3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)基因的启动子在多种工业菌株中被用作表达载体构建。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法，旨在解决现有太瑞斯梭孢壳霉表达载体有限，缺少高效表达载体的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体，所述表达载体含有pUC19质粒的序列，且所述pUC19质粒上的多克隆位点处插入有太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子；其中，所述启动子在所述终止子的上游。

本发明另一方面提供一种上述表达载体的制备方法，包括如下步骤：

以太瑞斯梭孢壳霉基因组为模板，进行PCR扩增，得到所述太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子的序列；

提供pUC19质粒，将所述启动子和所述终止子插入到所述pUC19质粒上的多克隆位点处。

本发明提供的表达载体是在太瑞斯梭孢壳霉表达载体构建中属首次应用，由在pUC19的多克隆位点处插入太瑞斯梭孢壳霉基因中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子而获得，其有益效果在于：该表达载体无需诱导，可稳定表达，并在太瑞斯梭孢壳霉中高效表达，而且具有在大肠杆菌中稳定性复制和保持、以及便于DNA纯化分离操作的特质。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的表达载体pUC-PT构建示意图；

图2为本发明实施例2提供的表达载体pUC-Pgpd-xyn-Tgpd构建示意图；

图3为本发明实施例4中表达载体pUC-Pgpd-xyn-Tgpd转化验证电泳图；

图4为本发明实施例4中表达载体pUC-Pgpd-xyn-Tgpd表达后木聚糖酶的酶活图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体，所述表达载体含有pUC19质粒的序列，且所述pUC19质粒上的多克隆位点处插入有太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子；其中，所述启动子在所述终止子的上游。

本发明实施例提供的表达载体是在太瑞斯梭孢壳霉表达载体构建中属首次应用，由在pUC19的多克隆位点处插入太瑞斯梭孢壳霉基因中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd，GeneID:11517920)的启动子和终止子而获得，其有益效果在于：该表达载体无需诱导，可稳定表达，并在太瑞斯梭孢壳霉中高效表达，而且具有在大肠杆菌中稳定性复制和保持、以及便于DNA纯化分离操作的特质，构建简单且便于筛选、保存。

进一步地，所述表达载体的序列如SEQ ID NO.3所示，全长为5883bp，GC含量为52.7％。所述启动子的序列如SEQ ID NO.1所示(即SEQ ID NO.3中的第245-2254位)，所述终止子的序列如SEQ ID NO.2所示(即SEQ ID NO.3中的第2283-3482位)。

所述表达载体的序列如下SEQ ID NO.3：

GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCACCTGGAGCTCTCAGCAACCCAAGGAATAAGTCCGTGAGGGATCGAGATGTTGGTCATCAGTG GAGTGGGTCGAAGGCAGGAGGACGAGATATAGTGGTTGACGAGGACACGGTCCGTCGGACAAGTAGTTAACGCCAGT ACTCCGTAGTTAAAGCATATGATACTCGATGTTTGAGCCTCGCCTGTACCACCTGAAATCGTGAAAACTGAATACTT CGACGATATCATCACGTCTTGGGCCCCTGAGGGAGTCAATATTTGGGTCCACTGAAGTTTGGTCGTTGAGCTCCGGC GAGTCGTCTTGACAGGGATGCTCAACTGAAAGAATGACGTCGATGGCGACCTGTTAAATAATTTCACTATAACGTGA GGGGCATGACTGAGCACCCAACCCGAACCAAAAAGTGTACGCTAGGCATCTCGATCGGTTCCTTACCGGATTGTTAG TCATACCTCCAATTTTAGTGTAAACCGCTCGTCGAGAAGTCGTCATCCATCATGCCAATCATCAAGTATGATCAGGT TGTCACGGAATGCTGCGTTGAATCCGGATTCC ATGGAGGGGTGTCCGCCCAGCAGCTGAGTGAATCATCGAGGCTTGGCAGACATGGTGCGTTTAATTACGGATACGGA CACCTCCGACCTCGCCTGTCGCCAGACTCCGAGTCTTGGCCCGGTCCAATTCACTGTTACACAGTCACAGCCCTCCC 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本表达载体存在原核生物基因质粒的复制起始位点(原核生物基因质粒的复制起始位点为SEQ ID NO.3中的第5114-5702位)，在大肠杆菌中可稳定复制、保持，便于质粒DNA的分离、纯化；存在氨苄青霉素的抗性基因(氨苄青霉素抗性基因为SEQ ID NO.3中的第4083-4943位)，便于挑取存在本载体的大肠杆菌。本发明所提供的表达载体用以插入需研究的目的基因，待其转化入太瑞斯梭孢壳霉中，可表达生成融合蛋白。

进一步地，所述表达载体的中的所述启动子的序列的上游和所述终止子的序列的下游存在通用引物M13的结合位点。所述启动子的序列和所述终止子的序列之间存在Xba I酶切位点和Kpn I酶切位点。Xba I、Kpn I两个酶切位点，可双酶切，以插入目的基因。通用引物M13的结合位点，便于重组载体构建过程中的测序验证。优选地，目的基因为木聚糖酶基因(Xylanase,简写xyn)，即所述启动子的序列和所述终止子的序列之间连接有木聚糖酶基因序列。

所述载体主要用于太瑞斯梭孢壳霉中基因的功能研究，亦可用于其他丝状真菌的研究。通过Xba I、Kpn I酶切或者反向PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)的方法使载体线性化。目的基因通过相同酶切，使其带有对应的粘性末端。通过连接酶使目的基因重组到表达载体上，转化到大肠杆菌中，筛选后扩大培养并提取重组质粒，转化入太瑞斯梭孢壳霉或者其他丝状真菌中，表达目的蛋白，进而研究其功能。

另一方面，本发明实施例提供了一种上述表达载体的制备方法，包括如下步骤：

S01：以太瑞斯梭孢壳霉基因组为模板，进行PCR扩增，得到所述太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子的序列；

S02：提供pUC19质粒，将所述启动子和所述终止子插入到所述pUC19质粒上的多克隆位点处。

优选地，步骤S01中，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对进行所述PCR扩增，得到所述3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子。利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对进行所述PCR扩增，得到所述3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子。

优选地，步骤S02中，将所述启动子和所述终止子插入到所述pUC19质粒上的多克隆位点处的步骤包括：

将启动子连接到T载体上，得到启动子-T载体重组质粒，将终止子连接到T载体上，得到终止子-T载体重组质粒；

通过Sph I和Xba I双酶切所述启动子-T载体重组质粒和所述pUC19质粒，然后进行重组，得到含有所述启动子序列的初始表达载体；

通过Kpn I和EcoR I双酶切所述终止子-T载体重组质粒和所述初始表达载体，然后进行重组，得到含有所述启动子和终止子的表达载体(如实施例1的pUC-PT)。

本发明实施例提供的上述用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体的制备方法，可以轻松获得本发明实施例提供的适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体，由此获得相应的功能。

本发明实施例还提供了一种将上述表达载体转化至太瑞斯梭孢壳霉的方法，包括以下步骤：

以目的基因引物序列为引物进行PCR扩增，得到目的基因序列(例如木聚糖酶基因序列)；

将所述目的基因序列转化至Top10感受态细胞中，扩大培养，并提取质粒；

将提取的质粒与太瑞斯梭孢壳霉表达载体通过Xba I和Kpn I双酶切，得到有可互补粘性末端的目的基因序列和pUC-PT；

将有可互补粘性末端的目的基因序列和pUC-PT进行重组；

重组后的表达载体转化至太瑞斯梭孢壳霉后表达。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

一种pUC-PT表达载体及其制备方法

pUC-PT表达载体的结构图见图1，制备方法如下。

1、以太瑞斯梭孢壳霉基因组为模板，Pgpd-Sph I-F、Pgpd-Xba I-R为引物进行PCR扩增，得到太瑞斯梭孢壳霉基因中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的Pgpd启动子序列(Pgpd-Sph I-F、Pgpd-Xba I-R、太瑞斯梭孢壳霉基因组各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；98℃变性，58℃退火，72℃延伸，35循环)；

2、将PCR扩增产物使用omega胶回收试剂盒进行回收，得到浓度约为50ng/μl的Pgpd溶液；

3、将Pgpd启动子序列连接到T载体上(0.03pmol Pgpd启动子序列，0.03pmol T载体，10x buffer 2μl，T4-DNA连接酶5U，加ddH₂O至2μl，96℃连接过夜)；

4、将连接产物转化至大肠杆菌Top10中，扩大培养，并提取质粒；

5、提取的质粒与pUC19通过Sph I和Xba I双酶切，得到有可互补的粘性末端的Pgpd启动子序列和pUC19；

6、将第5步得到的Pgpd启动子、pUC19和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混匀，于16℃反应30min。重复第4步，得到重组的初始表达载体(含有Pgpd启动子)。

7、以太瑞斯梭孢壳霉基因组为模板，Tgpd-Kpn I-F、Tgpd-EcoR I-R为引物进行PCR扩增，得到太瑞斯梭孢壳霉基因中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的Tgpd终止子序列(Tgpd-Kpn I-F、Tgpd-EcoR I-R、太瑞斯梭孢壳霉基因组各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；98℃变性，58℃退火，72℃延伸，35循环)；将PCR扩增产物使用omega胶回收试剂盒进行回收，得到浓度约为50ng/μl的Tgpd溶液；

8、将Tgpd终止子序列连接到T载体上(0.03pmol Tgpd终止子序列，0.03pmolpMD19-T载体，10x buffer 2μl，T4-DNA连接酶5U，加ddH₂O至2μl，96℃连接过夜)；

9、将连接产物转化至大肠杆菌Top10中，扩大培养，并提取质粒；

10、提取的质粒与步骤6的初始表达载体(含有Pgpd启动子)通过Kpn I和EcoR I双酶切，得到有可互补的粘性末端的Tgpd终止子和初始表达载体；

11、将得到的Tgpd终止子、初始表达载体和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混匀，于16℃反应30min。重复第9步，得到重组的表达载体pUC-PT。

本实施例中使用的引物序列见下表1。

表1

实施例2

一种pUC-Pgpd-xyn-Tgpd表达载体及其制备方法

pUC-Pgpd-xyn-Tgpd表达载体的结构图见图2，制备方法如下。

材料：xyn-Xba I-F(10μM/L)，xyn-Kpn I-R(10μM/L)，DNA聚合酶(Premix Taq，购自takara)，太瑞斯梭孢壳霉基因组溶液(约200ng/μL)，核酸内切酶(Xba I、Kpn I，购自takara)，T载体(pMD19，购自takara)，DNA连接酶(DNA Ligation Kit，购自takara)，大肠杆菌感受态细胞Top10，omega胶回收试剂盒，omega质粒小提试剂盒。

1、以太瑞斯梭孢壳霉基因组为模板，xyn-Xba I-F、xyn-Kpn I-R为引物进行PCR扩增，得到太瑞斯梭孢壳霉xyn基因序列(xyn-Xba I-F、xyn-Kpn I-R R、太瑞斯梭孢壳霉基因组各1μl，Premix Taq 10μl、ddH₂O 7μl；98℃变性，55℃退火，72℃延伸，35循环)

2、将PCR扩增产物使用omega胶回收试剂盒进行回收，得到浓度约为50ng/μl的xyn溶液。

3、将目的基因xyn连接到T载体上(0.03pmol xyn序列，0.03pmol pMD19-T载体，10x buffer 2μl，T4-DNA连接酶5U，加ddH₂O至2μl，96℃连接过夜)。

4、将连接产物转化至大肠杆菌Top10中，扩大培养，并提取质粒。

5、提取的质粒与实施例1的pUC-PT载体先后通过Xba I和Kpn I双酶切，得到有可互补的粘性末端的xyn基因序列和pUC-PT。

6、将第5步得到的xyn基因、pUC-PT和DNA Ligation Kit溶液I以4:1:5的比例混匀，于16℃反应30min。重复第4步，得到重组的表达载体pUC-Pgpd-xyn-Tgpd(见附图2)。

上述扩增xyn基因的引物序列如下：

xyn-Xba I-F引物序列：

SEQ ID NO.8：5’-GCTCTAGAATGGTCCACTTCTCGATTCTTGCCC-3’；

xyn-Kpn I-R引物序列：

SEQ ID NO.9：5’-CGGGGTACCTTATTGCACCGTGATGCTGGCAGAG-3’。

实施例3

表达载体UC-Pgpd-xyn-Tgpd转化至太瑞斯梭孢壳霉中

使用材料：

PDA固体培养基：称取200g去皮马铃薯，切碎后于1000mL去离子水中煮沸30分钟，所得溶液用三层纱布过滤后，加入葡萄糖20g，琼脂15g，加去离子水定容至1000mL。若用作筛选太瑞斯梭孢壳霉转化筛选培养基，则加入终浓度为160μg/mL的潮霉素B。

液体基本培养基：Mandels营养盐浓缩液100ml/L，Mandels微量元素浓缩液1.0ml/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1.0g/L，1M pH 4.5的柠檬酸缓冲液50ml/L，吐温80 2.0g/L。

Mandels营养盐浓缩液：(NH₄)₂SO₄ 14g，尿素3g，KH₂PO₄ 20g，CaCl₂.2H₂O4g，MgSO₄.7H₂O 3g，加水至1000mL。

Mandels微量元素浓缩液：FeSO₄.7H₂O 5g，ZnSO₄.7H₂O 1.7g，CoCl₂.6H₂O3.7g，MnSO₄.H₂O 1.6g，加水至1000mL。

STC溶液：山梨醇109.3g，1M Tris·HCL溶液5mL，1M CaCl₂溶液25mL，去离子水定容至500mL，121℃高压灭菌25min。

1M MgSO₄溶液：硫酸镁60g，用去离子水定容至500mL，121℃高压灭菌25min。

60％PEG4000溶液：预先配置含有50mM CaCl₂和10mM Tris·HCL的缓冲溶液，取60g PEG4000于烧杯中，加缓冲液定容至100mL,加热溶解后再次定容至100mL。

具体步骤：

1、取约10⁸个孢子接种于40mL液体基本培养基中，于250mL锥形瓶中28℃，250r/min，培养12小时。

2、将培养液于50mL离心管中5000rpm离心10min，去上清液。

3、加入20mL的1M MgSO₄溶液，并吹打均匀，5000rpm离心10min，取上清液。

4、重复步骤3一次。

5、加入10mL溶壁酶(100mg溶壁酶溶解于10mL 1M MgSO₄溶液中过滤除菌)，并吹打均匀，于250mL的锥形瓶中28℃，70r/min培养2h。

6、取培养液于50mL离心管中，加入20mL的STC，轻柔吹打均匀，于4℃，5000rpm离心15min，去上清。

7、加入10mL的STC，轻柔吹打均匀，5000rpm再次离心5min。

8、弃上清液，加入1ml的STC，轻柔吹打均匀，取200μl加入已灭菌的1.5mL的离心管中。

9、加入实施例2的UC-Pgpd-xyn-Tgpd重组载体和pAN7-1各10μg后，于冰上静置30min。

10、58℃热激2min后，加入50μl 60％的PEG4000，混匀后静置20min。

11、将溶液转移至50mL离心管中，加入2mL 60％的PEG4000，混匀后静置5min。

12、加入20mL的STC，4℃，5000rpm离心15min，去上清液。

13、吹打均匀后加入10mL原生质体再生培养基(5mL的2倍浓度STC，1mL的10倍浓度葡萄糖，4mL的2.5倍浓度基本培养基)。于250mL的锥形瓶中，28℃，70r/min培养24小时。

14、培养液加入20mL的STC溶液于50mL的离心管中，5000rpm离心10min。

15、加入1mL的STC溶液，吹打均匀，取200μl涂布于PDA潮霉素B抗性平板上，37℃培养2～3d后挑取单菌落，于PDA潮霉素B抗性平板再次筛选。

16、培养2～3d后挑取单菌落于PDA平板28℃培养7天后，用无菌水洗脱孢子保存。

实施例4

表达载体UC-Pgpd-xyn-Tgpd转化至太瑞斯梭孢壳霉后表达验证

使用材料：Pgpd-xyn-F(10μM/L)，Pgpd-xyn-R(10μM/L)，xyn-Tgpd-F(10μM/L)，xyn-Tgpd-R(10μM/L)，DNA聚合酶(Premix Taq，购自takara)，菌丝裂解试剂(Lysis Bufferfor Microorganism to Direct PCR，购自takara)，Pgpd-xyn-Tgpd质粒。

液体产酶发酵培养基：5g黄豆饼粉，7g葡萄糖，1g蛋白胨，10ml Mandels营养盐浓缩液，0.1ml Mandels微量元素浓缩液，5mL pH 4.5的1mol/L的柠檬酸缓冲液，0.05g吐温80，加水至1000mL。

Mandels营养盐浓缩液：(NH₄)₂SO₄ 14g，尿素3g，KH₂PO₄ 20g，CaCl₂.2H₂O4g，MgSO₄.7H₂O 3g，加水至1000mL。

Mandels微量元素浓缩液：FeSO₄.7H₂O 5g，ZnSO₄.7H₂O 1.7g，CoCl₂.6H₂O3.7g，MnSO₄.H₂O 1.6g，加水至1000mL。

乙酸乙酸钠缓冲液：4.1g乙酸钠加入500mL水中，以乙酸滴定调PH至4.8，加水至1000mL。

木聚糖底物溶液：1g木聚糖加入80mL乙酸乙酸钠缓冲液中，加热搅拌至溶解，加水至100mL。

DNS(3,5-二硝基水杨酸试剂)：将7.5g 3,5-二硝基水杨酸和14.0g NaOH充分溶解在1000mL水中，加入216.0g酒石酸钾钠、5.6mL预先在50℃水浴中溶化的苯酚和6.0g偏重亚硫酸钠，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后使用。

具体步骤为：

1、取50μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR试剂于灭菌的PCR管中。

2、用枪头挑取太瑞斯梭孢壳霉单菌落，于试剂中搅动几下后取出。

3、于温控板中80℃加热15min，低速短暂离心，取5μL裂解后的上清液作为PCR反应的模板。

4、以菌丝裂解上清液为模板，Pgpd-xyn-F、Pgpd-xyn-R，xyn-Tgpd-F、xyn-Tgpd-R分别为引物进行PCR扩增，得到大小为1255bp的Pgpd-xyn条带与大小为1525bp的xyn-Tgpd条带。(Pgpd-xyn-F、Pgpd-xyn-R、太瑞斯梭孢壳霉基因组各1μl，Premix Taq 10μl、ddH2O 7μl；98℃变性，55℃退火，72℃延伸，35循环)。

5、以表达载体UC-Pgpd-xyn-Tgpd为模板，Pgpd-xyn-F、Pgpd-xyn-R，xyn-Tgpd-F、xyn-Tgpd-R分别为引物进行PCR扩增，得到大小为1255bp的Pgpd-xyn条带与大小为1525bp的xyn-Tgpd条带，作为阳性对照。140V电压下进行琼脂糖凝胶电泳20分钟。(Pgpd-xyn-F、Pgpd-xyn-R、太瑞斯梭孢壳霉基因组各1μl，Premix Taq 10μl、ddH2O 7μl；98℃变性，55℃退火，72℃延伸，35循环)

6、取约10⁷个转化菌株孢子与野生型孢子分别接种于100mL液体产酶发酵培养基，于250mL锥形瓶中45℃，200r/min培养。

7、分别于48h，72h，96h，120h，144h取1mL发酵液，13000rpm离心5min，取上清。

8、取30μl发酵液上清加入270μl乙酸乙酸钠缓冲液中稀释。

9、取300μl木聚糖底物溶液加入2mL离心管中，50℃预热。

10、将稀释后的发酵液上清加入木聚糖底物溶液中，50℃水浴30min，立即加入900μl DNS溶液，吹打混匀。

11、沸水浴5min，置于冰水中冷却至室温。

12、于540nm测定吸光值，根据木糖标准曲线计算水解释放的木糖量。

参见图3，右起泳道1为Pgpd-xyn验证条带，泳道2为xyn-Tgpd验证条带，泳道3为Pgpd-xyn阳性对照，泳道4为xyn-Tgpd阳性对照，泳道5为以无菌水为PCR模板的阴性对照，泳道6为Marker。转化子扩增的验证条带与阳性对照处于同一位置，且大小符合1255bp、1525bp，表达载体UC-Pgpd-xyn-Tgpd成功转化入太瑞斯梭孢壳霉。

参见图4，表达载体UC-Pgpd-xyn-Tgpd转化菌株(即图中Transformat)在第120h的木聚糖酶活达到最大值，酶活达到39.57U/mL，较野生菌株(即图中wild type)12.23U/mL提升3.24倍。由此得出结论，太瑞斯梭孢壳霉基因xyn编码的木聚糖酶可在太瑞斯梭孢壳霉中进行高效表达，pUC-PT载体可提升目的基因的表达量。

Pgpd-xyn-F引物(SEQ ID NO.10)：5’-GCTGAGATTCCCGTCCCTTC-3’；

Pgpd-xyn-R引物(SEQ ID NO.11)：5’-CCCTTGCTGTTCCAGTTTGC-3’。

xyn-Tgpd-F引物(SEQ ID NO.12)：5’-CCGCAAACTGGAACAGCAAG-3’；

xyn-Tgpd-R引物(SEQ ID NO.13)：5’-GGAGATAGAGAAACGGGGGA-3’。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体及其制备方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2010

<212> DNA

<213> 太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)

<400> 1

cacctggagc tctcagcaac ccaaggaata agtccgtgag ggatcgagat gttggtcatc 60

agtggagtgg gtcgaaggca ggaggacgag atatagtggt tgacgaggac acggtccgtc 120

ggacaagtag ttaacgccag tactccgtag ttaaagcata tgatactcga tgtttgagcc 180

tcgcctgtac cacctgaaat cgtgaaaact gaatacttcg acgatatcat cacgtcttgg 240

gcccctgagg gagtcaatat ttgggtccac tgaagtttgg tcgttgagct ccggcgagtc 300

gtcttgacag ggatgctcaa ctgaaagaat gacgtcgatg gcgacctgtt aaataatttc 360

actataacgt gaggggcatg actgagcacc caacccgaac caaaaagtgt acgctaggca 420

tctcgatcgg ttccttaccg gattgttagt catacctcca attttagtgt aaaccgctcg 480

tcgagaagtc gtcatccatc atgccaatca tcaagtatga tcaggttgtc acggaatgct 540

gcgttgaatc cggattccat ggaggggtgt ccgcccagca gctgagtgaa tcatcgaggc 600

ttggcagaca tggtgcgttt aattacggat acggacacct ccgacctcgc ctgtcgccag 660

actccgagtc ttggcccggt ccaattcact gttacacagt cacagccctc ccaaccggtt 720

aaccactcgg cgcgcccgtc caacacgtgc ttcggagtcc gtgtttggtt cgagatgact 780

tgatatcaga tgggtggcgc gaccgccgga acgttggcgc ggtccgactt ggcggatctc 840

acggaacgct gcgcttcgtg cggaccgacg tcgccccaag cacgccgaca tcatgcgaag 900

aaaaatgcag gcacgggaag ttgacgcgag acgtggtgtg gaagcttggg ctgtgggctg 960

agattcccgt cccttcgtat tctgctggat gttttactgt aagtttcgta gcacaatcgc 1020

gggctccgaa gcagagtcaa gtccgaagct agcagagtcg agttccgacg tcaaacggct 1080

cgtttcctgc gccgcagcga ggttcggagc ggtggcgatt gcatggtcag ggccggtcac 1140

ctcaagggcg cgggttgcgc gatttcaaat acgctggcca gagcaggcca aagacgagac 1200

aaattcggtt ttgtaaacgg accggcacgc cggactggag cttttgtcgc tcccaccctt 1260

actcggccga tcgtctcgct tgcgcggcac gaccggccca gagagtcgcc cggtgacgga 1320

ggagcaagga tcgtggcgaa tacgccgctg caagttccaa gccttgcgga tacctggtat 1380

gctattggct gtttttccac tatgcagtag gcctgtttcc atggtagagg ggcactgaaa 1440

gctccctggt tacggcgatg ctgtggcccc accaaacagg ccgcaatctg tgatgcaact 1500

gcaagagcac cccaccacag cgaggggctc aaccattttt attctcgctc atgccaccaa 1560

cctccccctc cctttccaac aatccacact gacaagaaac ccacttcgca aagttttttt 1620

tctcccattg aagaactgtc atttccagac agtccagctc agctttcagt caccgacaac 1680

cacttccaga aaggtttcct gaggtaagca aatcgcgagc gccccccacg aaaccccgca 1740

cctccatctt ccgccccgta ttggacctgc gccgcgcaaa agaaaaccca atcgctttgc 1800

ccatcgctgc cgctgcccgg ttacggacac cgcttttgac caggcgatat acactataaa 1860

acctttttcc cagacccatt cccaagcgga tcccattctc tctgtcctct ccattgtccg 1920

ctttgcagca tcacatcctc gctgcatacc ccgcgcccaa gctacccctc cattcgcgtg 1980

ccaagctcac tcgcccgagc cgcagaaaag 2010

<210> 2

<211> 1200

<212> DNA

<213> 太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)

<400> 2

tggctgcgct gcgcggctgt agttgacggt tgatcgctct cgcctgcttt ccccgtaaaa 60

gggtgcacat gttttcgggc aagaacgtat tcgattaggt agcgaggcag caaaaatgca 120

gaaaaagccc caggcaattc caagtccctt gcggttgtgt gtatgatgtg atgtagttgt 180

gggtggacaa gccaggccgc tagtcttagc caagtccatg ctcgctgcct ggacagagct 240

gagtgcactg caggcttcac agacatctgt cgtcagtttg aggggtaggt acgcagcaac 300

tacgcagcct cactgacgtc tgtattctcc cttcgggtga tgctgtcgat agaggcagaa 360

ggtggtccac acagactggc ccaccaacca catgaagctt gatgattatc acgtagtaga 420

catgacatct ttgaatgcat ccatccacct cgcagttccg aggtccgctc ctttccgttc 480

cggtttccgc ctcccgttca gttccgcatc gcatcaccgt tttctccgtc actgcggttg 540

gtgctaagat agcttaccta ctcatttctc agaccaaccg ttgaatgcat ggctggcctg 600

actcgctcga ccgagttagc tggcgtggct gactgactga cctgacagac ctaggtattg 660

acctgactgg cctgactggc ctgactgatt gaccgaccga cctactgacc tgacctacct 720

gattgaccta acctacctgg ctggcctgac taactggact aacctgaccg acctggccag 780

cctgactgac ctgctcgact aatttcagct ggacagatct cagctgaacc gccatgaacc 840

acacatacat acccgcacta tgcacatgtt aaccacgacc tttccagaaa gcaaagatgg 900

acgccaaaag ctctctcgca ttcccccgtt tctctatctc cggcgccaga accgccgaga 960

ctacccagta gtagtagtag tagtagtagt agtagtacct agggcgagat gggaaacaaa 1020

cataacagca gacatactac ctagctacct ggcttaggtg aacagaaaaa agcagccttc 1080

tggctaacaa actctcccat cgatcgatgc atggaaaata ccggcccagg ctccctacag 1140

acacccaggg agaaagacat tcccctcctt cgtcgtagtt atctcgcacc gccgagccga 1200

<210> 3

<211> 5883

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc 240

atgccacctg gagctctcag caacccaagg aataagtccg tgagggatcg agatgttggt 300

catcagtgga gtgggtcgaa ggcaggagga cgagatatag tggttgacga ggacacggtc 360

cgtcggacaa gtagttaacg ccagtactcc gtagttaaag catatgatac tcgatgtttg 420

agcctcgcct gtaccacctg aaatcgtgaa aactgaatac ttcgacgata tcatcacgtc 480

ttgggcccct gagggagtca atatttgggt ccactgaagt ttggtcgttg agctccggcg 540

agtcgtcttg acagggatgc tcaactgaaa gaatgacgtc gatggcgacc tgttaaataa 600

tttcactata acgtgagggg catgactgag cacccaaccc gaaccaaaaa gtgtacgcta 660

ggcatctcga tcggttcctt accggattgt tagtcatacc tccaatttta gtgtaaaccg 720

ctcgtcgaga agtcgtcatc catcatgcca atcatcaagt atgatcaggt tgtcacggaa 780

tgctgcgttg aatccggatt ccatggaggg gtgtccgccc agcagctgag tgaatcatcg 840

aggcttggca gacatggtgc gtttaattac ggatacggac acctccgacc tcgcctgtcg 900

ccagactccg agtcttggcc cggtccaatt cactgttaca cagtcacagc cctcccaacc 960

ggttaaccac tcggcgcgcc cgtccaacac gtgcttcgga gtccgtgttt ggttcgagat 1020

gacttgatat cagatgggtg gcgcgaccgc cggaacgttg gcgcggtccg acttggcgga 1080

tctcacggaa cgctgcgctt cgtgcggacc gacgtcgccc caagcacgcc gacatcatgc 1140

gaagaaaaat gcaggcacgg gaagttgacg cgagacgtgg tgtggaagct tgggctgtgg 1200

gctgagattc ccgtcccttc gtattctgct ggatgtttta ctgtaagttt cgtagcacaa 1260

tcgcgggctc cgaagcagag tcaagtccga agctagcaga gtcgagttcc gacgtcaaac 1320

ggctcgtttc ctgcgccgca gcgaggttcg gagcggtggc gattgcatgg tcagggccgg 1380

tcacctcaag ggcgcgggtt gcgcgatttc aaatacgctg gccagagcag gccaaagacg 1440

agacaaattc ggttttgtaa acggaccggc acgccggact ggagcttttg tcgctcccac 1500

ccttactcgg ccgatcgtct cgcttgcgcg gcacgaccgg cccagagagt cgcccggtga 1560

cggaggagca aggatcgtgg cgaatacgcc gctgcaagtt ccaagccttg cggatacctg 1620

gtatgctatt ggctgttttt ccactatgca gtaggcctgt ttccatggta gaggggcact 1680

gaaagctccc tggttacggc gatgctgtgg ccccaccaaa caggccgcaa tctgtgatgc 1740

aactgcaaga gcaccccacc acagcgaggg gctcaaccat ttttattctc gctcatgcca 1800

ccaacctccc cctccctttc caacaatcca cactgacaag aaacccactt cgcaaagttt 1860

tttttctccc attgaagaac tgtcatttcc agacagtcca gctcagcttt cagtcaccga 1920

caaccacttc cagaaaggtt tcctgaggta agcaaatcgc gagcgccccc cacgaaaccc 1980

cgcacctcca tcttccgccc cgtattggac ctgcgccgcg caaaagaaaa cccaatcgct 2040

ttgcccatcg ctgccgctgc ccggttacgg acaccgcttt tgaccaggcg atatacacta 2100

taaaaccttt ttcccagacc cattcccaag cggatcccat tctctctgtc ctctccattg 2160

tccgctttgc agcatcacat cctcgctgca taccccgcgc ccaagctacc cctccattcg 2220

cgtgccaagc tcactcgccc gagccgcaga aaagaactgt ctagaggatc cccgggtacc 2280

attggctgcg ctgcgcggct gtagttgacg gttgatcgct ctcgcctgct ttccccgtaa 2340

aagggtgcac atgttttcgg gcaagaacgt attcgattag gtagcgaggc agcaaaaatg 2400

cagaaaaagc cccaggcaat tccaagtccc ttgcggttgt gtgtatgatg tgatgtagtt 2460

gtgggtggac aagccaggcc gctagtctta gccaagtcca tgctcgctgc ctggacagag 2520

ctgagtgcac tgcaggcttc acagacatct gtcgtcagtt tgaggggtag gtacgcagca 2580

actacgcagc ctcactgacg tctgtattct cccttcgggt gatgctgtcg atagaggcag 2640

aaggtggtcc acacagactg gcccaccaac cacatgaagc ttgatgatta tcacgtagta 2700

gacatgacat ctttgaatgc atccatccac ctcgcagttc cgaggtccgc tcctttccgt 2760

tccggtttcc gcctcccgtt cagttccgca tcgcatcacc gttttctccg tcactgcggt 2820

tggtgctaag atagcttacc tactcatttc tcagaccaac cgttgaatgc atggctggcc 2880

tgactcgctc gaccgagtta gctggcgtgg ctgactgact gacctgacag acctaggtat 2940

tgacctgact ggcctgactg gcctgactga ttgaccgacc gacctactga cctgacctac 3000

ctgattgacc taacctacct ggctggcctg actaactgga ctaacctgac cgacctggcc 3060

agcctgactg acctgctcga ctaatttcag ctggacagat ctcagctgaa ccgccatgaa 3120

ccacacatac atacccgcac tatgcacatg ttaaccacga cctttccaga aagcaaagat 3180

ggacgccaaa agctctctcg cattcccccg tttctctatc tccggcgcca gaaccgccga 3240

gactacccag tagtagtagt agtagtagta gtagtagtac ctagggcgag atgggaaaca 3300

aacataacag cagacatact acctagctac ctggcttagg tgaacagaaa aaagcagcct 3360

tctggctaac aaactctccc atcgatcgat gcatggaaaa taccggccca ggctccctac 3420

agacacccag ggagaaagac attcccctcc ttcgtcgtag ttatctcgca ccgccgagcc 3480

gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 3540

taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 3600

cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt 3660

tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 3720

ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 3780

acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg 3840

catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat 3900

acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 3960

ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 4020

gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 4080

tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 4140

tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 4200

acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 4260

cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 4320

ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 4380

ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 4440

atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 4500

cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 4560

tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 4620

gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 4680

ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 4740

ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 4800

tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 4860

cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 4920

ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 4980

tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 5040

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 5100

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 5160

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 5220

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 5280

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 5340

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 5400

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 5460

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 5520

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 5580

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 5640

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 5700

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 5760

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 5820

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 5880

aga 5883

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acatgcatgc cacctggagc tctcagcaac ccaagg 36

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagatc ttttctgcgg ctcgggcgag tga 33

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggggtacca ttggctgcgc tgcgcggctg tagt 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggaattcg gctcggcggt gcgagataac tacg 34

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctctagaat ggtccacttc tcgattcttg ccc 33

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggggtacct tattgcaccg tgatgctggc agag 34

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgagattc ccgtcccttc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccttgctgt tccagtttgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgcaaactg gaacagcaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggagatagag aaacggggga 20

Claims (10)

1.一种适用于太瑞斯梭孢壳霉的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有pUC19质粒的序列，且所述pUC19质粒上的多克隆位点处插入有太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子；其中，所述启动子在所述终止子的上游。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，所述终止子的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子的序列的上游和所述终止子的序列的下游存在通用引物M13的结合位点。

5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子的序列和所述终止子的序列之间存在Xba I酶切位点和Kpn I酶切位点。

6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子的序列和所述终止子的序列之间连接有木聚糖酶基因序列。

7.一种如权利要求1-5任一项所述的表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以太瑞斯梭孢壳霉基因组为模板，进行PCR扩增，得到所述太瑞斯梭孢壳霉基因组中的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子和终止子的序列；

提供pUC19质粒，将所述启动子和所述终止子插入到所述pUC19质粒上的多克隆位点处。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对进行所述PCR扩增，得到所述3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对进行所述PCR扩增，得到所述3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的终止子。

10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述启动子和所述终止子插入到所述pUC19质粒上的多克隆位点处的步骤包括：

将启动子连接到T载体上，得到启动子-T载体重组质粒，将终止子连接到T载体上，得到终止子-T载体重组质粒；

通过Sph I和Xba I双酶切所述启动子-T载体重组质粒和所述pUC19质粒，然后进行重组，得到含有所述启动子序列的初始表达载体；

通过Kpn I和EcoR I双酶切所述终止子-T载体重组质粒和所述初始表达载体，然后进行重组，得到含有所述启动子和终止子的表达载体。