CN110684785B - 低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸，通过定向进化POX基因和同源重组方法制备长链二元酸菌株、利用该菌株发酵生产低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸。本发明还涉及含有该突变的启动子的菌株，该菌株发酵生产长链二元酸时，其发酵产物中低碳链杂酸杂质含量显著降低。

Description

低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸及其制备方法。具体而言，本发明涉及一种低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸，以及通过定向进化POX基因和同源重组方法制备长链二元酸菌株、该菌株发酵生产低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸的方法。

背景技术

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。长链二元酸作为重要的单体原料，广泛用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、防腐剂、香料、润滑剂、塑化剂等。

长期以来，长链二元酸经由石油通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法面临多种挑战，化学合成法得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物，因此需要复杂的后续提取纯化步骤，对于生产工艺和生产成本而言，都是巨大的障碍。采用微生物发酵技术生产长链二元酸，因其产生的污染低、环境友好、能够合成化学合成方法难以合成的产物如12碳以上的长链二元酸且纯度高等特点，较传统的化学合成法具有明显的优势。

但是微生物发酵技术生产的长链二元酸，有时会在产物中残留杂质，产品纯度的降低会严重影响产品的质量，对后期应用造成极大地影响。尤其是与长链二元酸特性比较类似的杂质，其不仅对后期的提取纯化带来了巨大的技术挑战，而且对于生产成本控制而言也会造成严重的负面影响。因此对于生产长链二元酸菌株进行遗传改造，以降低发酵过程中一些特定杂质的含量，对于生物合成法生产二元酸具有重要的意义和生产价值。

此前，二元酸菌种的改良大多通过传统的随机诱变或采用基因工程的方法得以实现，由于诱变本身随机性的特点，对筛选通量有很高的要求，而且每一次对于性状改变都要求新一轮的诱变筛选，在技术上已经成为重要的限制因素。采用基因工程的手段可以对菌株进行有针对性的遗传改造，从而获得产率更高的优良菌株。长链二元酸微生物发酵法生产方法主要为烷烃经ω-氧化生成。继而又可以经过β-氧化途径而被降解。以往的研究表明，可以通过增强ω-氧化途径并抑制β-氧化途径的手段来提高长链二元酸的产率。Coginis公司的Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)报导敲除POX4和POX5各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率。进一步过量表达ω-氧化途径中的限速步骤的两个关键酶P450及氧化还原酶POX基因，可以使产量得到有效提升。赖小勤等(中国发明专利CN103992959B)报道向二元酸生产菌株中引入一个拷贝的CYP52A14基因也可以有效提高二元酸的转化率和生产效率。另外清华大学曹竹安等人(Biotechnol.J.,1,68-74,2006)发现敲除乙酰辅酶A由过氧化物酶体向线粒体运输过程中的关键基因CAT中的一个拷贝，从而部分阻断乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，也可以有效降低二元酸的降解。

易错PCR是Leung等(Technique,1,11-15,1989)最早提出的构建基因文库进行定向研究的技术。通过改变PCR反应条件，如调整反应体系中四种脱氧核糖核酸的浓度、改变Mg²⁺的浓度以及使用低保真度的DNA聚合酶等方法，使碱基错配而引入突变。过高或过低的突变率都会影响构建突变库的效果，理想的碱基突变比例是每个DNA片段1-3个。因此利用易错PCR产生随机突变，并结合同源重组的方法进行基因的定向遗传学改造，可以帮助筛选对菌株产能进一步提高有帮助的有益突变。

以往对于二元酸菌株的改造大都集中于随机诱变或过量表达上游合成途径的基因或阻断下游β-氧化途径，对于代谢途径中基因的定向进化尚未有报道或应用。本领域依然存在能使长链二元酸产量显著提升并且部分杂质含量显著降低的菌株以及其制备方法的需求。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸，所述低碳链长链二元酸杂酸的含量大于0，且低于500ppm，优选低于400ppm，优选低于300ppm；优选低于250ppm；更优选低于200ppm，且其中所述低碳链长链二元酸杂酸的碳原子数量小于所述长链二元酸中的碳原子数量。

在一些实施方案中，所述长链二元酸为C9～C22的长链二元酸，优选C9～C18的长链二元酸，更优选包括十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种；更优选所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或者正十碳至十六碳二元酸中至少一种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。

在一些实施方案中，所述长链二元酸为十二碳二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸主要为十碳长链二元酸，所述十碳长链二元酸杂酸的含量低于350ppm，优选低于300ppm、290ppm、280ppm、270ppm、260ppm、250ppm、240ppm、230ppm、220ppm或210ppm或更低。

本发明的第二方面涉及一种微生物发酵法生产长链二元酸过程中的发酵液，发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，且所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的质量比率在1.5％以下，优选1.0％以下、0.9％以下；所述质量比率为发酵液中低碳链长链二元酸杂酸占长链二元酸的质量百分比。

在一些实施方案中，所述长链二元酸为十二碳二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸主要为十碳长链二元酸。

本发明的第三方面涉及一种如第一方面所述的长链二元酸的生产方法，包括定向进化长链二元酸合成途径的POX基因，获得含有突变的POX基因、其同源基因或其变体的长链二元酸生产微生物菌株，培养所述菌株发酵生产长链二元酸，任选地，其还包括从培养产物分离、提取和/或纯化长链二元酸的步骤。

所述突变的POX基因、其同源基因或其变体，其相对于GenBank登录号M12161(例如SEQ ID NO：24所示)，以起始密码子ATG上游第一位碱基(例如SEQ ID NO：24第456位碱基“C”)为-1计，在其启动子区域具有突变-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA，例如发生了一处碱基突变-182delA；并且其中所述变体与突变的POX基因、其同源基因具有至少70％的序列同一性。

在一些实施方案中，所述突变的POX基因的序列如SEQ ID NO：16所示或与其具有至少70％的序列同一性，例如具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的同一性的序列。

在一些实施方案中，所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用常规微生物(例如不含本发明所述突变的POX基因的非突变微生物)发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降5％，优选至少下降10％，更优选至少下降20％，更优选至少下降40％，更优选至少下降50％或更低。

在一些实施方案中，所述长链二元酸为十二碳二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸主要为十碳长链二元酸，例如癸二酸。

在一些实施方案中，所述微生物是酵母菌，优选所述微生物选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

在一些实施方案中，获得含有突变的POX基因、其同源基因或其变体的长链二元酸生产微生物菌株包括如下步骤：

1)通过易错PCR制备带有突变的目的基因(POX基因)片段；

2)制备同源重组所需的目的基因(POX基因)上下游片段作为同源重组的模板以及抗性标记基因，优选地，所述抗性标记基因是潮霉素B；

3)通过PCR重叠延伸制备完整的重组片段；

4)利用同源重组将所述重组片段引入菌株；

5)利用抗性标记筛选阳性菌株；

6)筛选低碳链长链二元酸杂酸得以降低的菌株；

7)任选地，筛选到的菌株进一步经过同源重组去除抗性筛选标记。

本发明的第四方面涉及一种突变的POX基因、其同源基因或其变体，其相对于GenBank登录号M12161(例如SEQ ID NO：24所示)，以起始密码子ATG上游第一位碱基(例如SEQ ID NO：24第456位碱基“C”)为-1计，在其启动子区域具有突变-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA，例如发生了一处碱基突变-182delA；并且其中所述变体与突变的POX基因、其同源基因具有至少70％的序列同一性。

在一些实施方案中，所述突变的POX基因的序列如SEQ ID NO：27或29所示或与其具有至少70％，例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的序列同一性。

在一些实施方案中，所述的突变的POX基因的序列如SEQ ID NO：16所示或与其具有至少70％的序列同一性，例如具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的同一性的序列。

本发明的第五方面涉及一种含有第四方面所述的突变的POX基因、其同源基因或其变体的微生物，其相对于含有未突变的POX基因、其同源基因或其变体的微生物，其长链二元酸产物中低碳链长链二元酸杂酸含量显著降低，且其中所述低碳链长链二元酸杂酸的碳原子数量小于所述长链二元酸中的碳原子数量。

优选地，所述微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、耶氏酵母属；更优选地，所述微生物是酵母菌；更优选地，所述微生物选自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。在一个具体实施方案中，所述微生物选自CCTCC M2011192和CCTCCM203052。

在一些实施方案中，所述长链二元酸为C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。在一些实施方案中，所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种或者正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。所述癸二酸即正十碳二元酸。

本发明的第六方面涉及一种利用第五方面所述的微生物产生长链二元酸的方法，其包括培养第五方面所述的微生物的步骤，任选地，其还包括从培养产物分离和/或纯化长链二元酸的步骤。

在一些实施方案中，所述微生物发酵产生长链二元酸的过程中，发酵结束后的发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，且所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的质量比率在1.5％以下，所述质量比率为发酵液中低碳链长链二元酸杂酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

在一些实施方案中，所述微生物发酵产生长链二元酸的过程结束后，发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，且所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用常规微生物(例如不含本发明所述突变的POX基因的非突变微生物)发酵法如采用本发明所述的非突变的微生物发酵法生产，低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降5％。

本发明的第七方面涉及一种利用第六方面所述的方法获得的长链二元酸，其中所述长链二元酸含有低碳链长链二元酸杂酸，所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量大于0，且低于500ppm，优选低于400ppm，优选低于300ppm；优选低于250ppm；更优选低于200ppm，且其中所述低碳链长链二元酸杂酸的碳原子数量小于所述长链二元酸中的碳原子数量。

在一些实施方案中，所述长链二元酸为C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种；更优选地，所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种或者正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。

在一些实施方案中，所述低碳链长链二元酸杂酸的含量低于500ppm。优选地，所述长链二元酸为十二碳二元酸，所述低碳链长链二元酸杂酸为十碳长链二元酸，其中所述十碳长链二元酸杂酸的含量低于350ppm，优选低于300ppm、290ppm、280ppm、270ppm、260ppm、250ppm、240ppm、230ppm、220ppm或210ppm或更低。

本发明的第八方面涉及一种改造长链二元酸生产菌株的方法，包括定向进化长链二元酸合成途径的关键基因的步骤，其中改造后的菌株发酵产物中低碳链长链二元酸杂酸含量相对于改造前的菌株得以实质性降低，例如在相同条件下。

优选地，所述长链二元酸合成途径的关键基因是POX基因。

优选地，所述微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、耶氏酵母属，更优选所述微生物是酵母菌，更优选所述微生物选自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。在一个具体实施方案中，所述微生物选自CCTCC M2011192和CCTCCM203052。

优选地，所述长链二元酸选自C9～C22的长链二元酸；优选选自C9～C18的长链二元酸；更优选选自十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。更优选地，所述长链二元酸选自十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种或者正十碳至十六碳二元酸中的至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。

优选地，所述低碳链长链二元酸杂酸为长度低于所述长链二元酸的二元酸杂酸；优选地，所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用常规微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降5％，优选至少下降10％，更优选至少下降20％，更优选至少下降40％，更优选至少下降50％或更低。

在一些实施方案中，所述改造长链二元酸生产菌株的方法包括步骤：

1)通过易错PCR制备带有突变的目的基因片段；

2)制备同源重组所需的目的基因上下游片段作为同源重组的模板以及抗性标记基因，优选地，所述抗性标记基因是潮霉素B；

3)通过PCR重叠延伸制备完整的重组片段；

4)利用同源重组将所述重组片段引入菌株；

5)利用抗性标记筛选阳性菌株；

6)筛选低碳链长链二元酸杂酸得以降低的菌株；

7)任选地，筛选到的菌株进一步经过同源重组去除抗性筛选标记。

本发明还涉及一种分离的突变启动子，其相对于SEQ ID NO：25所示序列，在266-275位的碱基AAAAAAAAAA突变为AAAAAAAAA，例如在第275位具有突变275delA，其优选包含或由SEQ ID NO：16、26所示序列组成，或与其具有至少70％的序列同一性，例如至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％或99.96％的序列同一性。

本发明还涉及包含所述突变的启动子的微生物，其中所述启动子用于控制POX基因(GenBank登录号M12161，其氨基酸编码序列例如SEQ ID NO：24的457-2445位核苷酸所示)的表达，优选所述微生物选自棒状杆菌、白地霉、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属、耶氏酵母属；更优选所述微生物是酵母菌；更优选所述微生物选自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。在一些实施方案中，所述微生物选自CCTCC M2011192和CCTCC M203052。

本发明还涉及使用所述包含所述突变的启动子的微生物生产长链二元酸的方法，包括培养所述微生物，任选地还包括从培养产物分离和/或纯化长链二元酸的步骤。

在一些实施方案中，所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸，优选C9～C18长链二元酸，更优选十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。优选地，所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种或者正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。

本发明以现有热带假丝酵母菌CATN145(保藏号为CCTCC M2011192)为出发菌株，采用易错PCR的方法对β-氧化中关键基因POX基因的启动子进行随机突变，并通过同源重组的方法对该基因进行定向进化，以此筛选低碳链长链二元酸杂酸显著降低的生产长链二元酸的菌株。通过筛选，本发明得到一株低碳链长链二元酸杂酸显著降低的菌株，命名为突变株526。通过测序分析发现，与亲代菌株CCTCC M2011192相比，突变株526的POX基因，以起始密码子ATG上游第一位碱基为-1计，在其启动子区域具有突变-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA，例如发生了一处碱基突变-182delA。

根据本发明，热带假丝酵母POX基因的序列如SEQ ID NO：16、26、27或29所示。

进一步对突变菌株去除抗性筛选标记，与原始菌株相比，发酵结束后的发酵液中低碳链杂酸的质量比率显著降低。且对发酵液进行提取纯化后获得长链二元酸成品中低碳链杂酸的含量降低至200ppm以下。所述低碳链杂酸为低碳链长链二元酸杂酸，其碳原子数小于发酵产物长链二元酸的碳原子数。

例如，当发酵产物为十二碳长链二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸主要为十碳二元酸，或为癸二酸。

本发明通过对POX基因进行定向进化，筛选到一株在该基因的启动子区域发生碱基突变的菌株，该菌株发酵生产长链二元酸时，使低碳链长链二元酸杂酸含量显著降低。纯度高、低碳链长链二元酸杂酸含量低的长链二元酸产品更能满足高档聚酰胺、聚酯等产品的质量要求，所得的聚合物产品性能也更加优异。更重要的是，这在很大程度上降低了二元酸后期的提取纯化工艺的难度，简化工艺并节约了能耗。

附图说明

图1为通过同源重组的方式整合进带有突变位点的POX基因并去除潮霉素筛选标记的示意图，“*”代表可能存在于POX任意区域(包括启动子、编码区和终止子)的突变。

图2为本发明的突变菌株(526，SEQ ID NO：16)与原始菌株(192，SEQ ID NO：28的1-545位核苷酸)POX基因核苷酸序列的比对结果，突变位点用黑框标出，其中192指代CCTCCM2011192。

具体实施方式

定义：

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。参见例如，Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。

长链烷烃：本发明所述发酵底物包括长链烷烃，长链烷烃属于饱和链烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，其包括化学式CH₃(CH₂)_n CH₃的烷烃，其中n≥7。优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸、以下或简称为二元酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。优选地，所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更优选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。优选地，所述长链二元酸为十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，更优选正十碳至十六碳二元酸中至少一种或多种，例如选自癸二酸、十一烷二元酸、十二烷二元酸、十三烷二元酸、十四烷二元酸、十五烷二元酸和十六烷二元酸中的至少一种。

产长链二元酸的微生物：已报道的可产生和积累二元酸的菌株包括细菌、酵母以及霉菌等，如：棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)等。假丝酵母属的许多种类是发酵生产二元酸的优良菌种。所述发酵的菌种优选包括：热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

发酵底物xC或Cx长链烷烃(x为碳原子数量，C为碳，x＝9-22)在发酵生产长链二元酸的过程中，长链烷烃被菌株氧化成xC或Cx长链二元酸(x为碳原子数量，C为碳，x＝9-22)，但是有些菌株因β氧化作用可能会将生成的xC或Cx长链二元酸降解为碳数低于原始长链烷烃的yC或Cy低碳链长链二元酸杂酸(y为碳原子数量，C为碳，y＜x)，因这些低碳链长链二元酸杂酸与期望获得的xC或Cx长链二元酸的特性非常相似，很难通过常规手段有效分离。这些低碳链长链二元酸杂酸会随着后处理工艺进入到最终的二元酸产品中，大大影响二元酸产品的纯度和质量。优选的，当长链二元酸的化学式为HOOC(CH₂)_nCOOH，且n≥7时；所述低碳链长链二元酸杂酸的化学式为HOOC(CH₂)_mCOOH，且m＜n，m和n均为整数。

在一些实施方案中，癸二酸是发酵生产十二碳二元酸过程中的主要低碳链长链二元酸杂酸，其占全部低碳链长链二元酸杂酸的大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％或更高。

本发明发酵生产长链二元酸时，发酵结束后的发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸，该低碳链长链二元酸杂酸的含量相对于采用常规微生物发酵法如采用本发明所述的非突变的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量显著下降，如至少下降5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，优选至少下降10％，更优选至少下降20％，更优选至少下降40％，更优选至少下降50％，更优选至少下降70％或更高。所述降低特别指低于目标长度的长链二元酸的某种具体低碳链长链二元酸杂酸的降低。例如，本发明发酵生产十二碳二元酸时，癸二酸的含量显著降低，例如降低至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。

如本文所用，本发明所述杂质的含量实质性降低或显著降低是指与参照相比，杂质的含量降低至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，优选至少下降10％，更优选至少下降20％，更优选至少下降40％，更优选至少下降50％，更优选至少下降70％或更多。

术语“分离的”当用于核酸时，是指所述核酸基本上不含其在天然状态下结合的其它细胞组分。其可以是例如均质状态，并且可以是干燥的或者在水溶液中。纯度和均质性典型地用分析化学技术确定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。

如本文所用，表述“相对于GenBank登录号M12161”或“相对于SEQ ID NO：25”是指与GenBank登录号M12161所示的序列(例如SEQ ID NO：24)或SEQ ID NO：25相比对，在相应位置具有所述的突变。所述相应位置是指当该给定多核苷酸序列(例如突变的POX基因或启动子序列)与参考序列(例如SEQ ID NO：25)相比较时参考序列的残基编号。当占据核酸内与给定碱基相同的基本结构位置时，核酸中的碱基“相应于”给定碱基。通常为了鉴别相应位置，排列核酸序列以便获得最高级别的匹配(见例如Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；Carillo et al.(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。核苷酸序列排列对比也可考虑核苷酸中的保守差异和/或取代频率。保守差异是保护涉及的残基的物理-化学性质的那些差异。排列对比可以是整体(在全长序列排列对比序列及包括所有残基)或局部(一部分序列的排列对比，仅包括最相似的一或多个区域)。

如本文所用，碱基突变“XXX delA”是指在第XXX位的碱基A缺失。

如本文所用，碱基突变“-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA”或“266_275AAAAAAAAAA>AAAAAAAAA”是指第-182至-191或266-275位的10个碱基A由于缺失一个碱基A而变为9个碱基A。所述缺失的碱基可以是这些位置中任意一个位置的碱基A。

在本文中，提及碱基时，G指鸟嘌呤，T指胸腺嘧啶，A指腺嘌呤，C指胞嘧啶，U指尿嘧啶。

如本文所用，“未突变的POX基因”是指不含有本发明所述突变-182delA(相对于SEQ ID NO：25为275delA)或-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA(相对于SEQ ID NO：25为266_275AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA)的POX基因，例如天然发生的、野生型等位基因，例如GenBank中登录号为M12161的POX基因。举例的未修饰的POX基因如SEQ ID NO：24所示。所述POX基因可以含有其他突变，例如在编码区中导致编码氨基酸不改变的沉默突变。

如本文所用，“非突变的微生物”是指不含有本发明所述突变的POX基因或同源基因的微生物，例如其含有GenBank中登录号为M12161的POX基因。在一个实施方案中，所述非突变的微生物含有本发明所述的未突变的POX基因。

在一些实施方案中，使用微生物发酵法生产长链二元酸，发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量降低至1.5％以下，如1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％以下或更低，优选降低至1.0％以下，更优选降低至0.6％以下，更优选降低至0.4％以下，所述百分比为发酵液中低碳链长链二元酸杂酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

本发明微生物发酵法生产的长链二元酸中含有低碳链长链二元酸杂酸，且所述低碳链长链二元酸杂酸的含量低于500ppm，优选低于400ppm，优选低于300ppm；优选低于250ppm；更优选低于200ppm；更优选低于150ppm，甚至更优选低于100ppm。

在本发明一个实施方式中，当使用微生物发酵法生产十二碳长链二元酸时，低碳链长链二元酸杂酸主要为十碳长链二元酸，所述十碳长链二元酸杂酸的含量低于350ppm，优选低于300ppm、290ppm、280ppm、270ppm、260ppm、250ppm、240ppm、230ppm、220ppm或210ppm，更优选低于200ppm、180ppm、160ppm、150ppm或更低。

本发明杂质含量的单位ppm为杂质占长链二元酸的质量比率，且100ppm＝100*10^-6＝0.01％。

所述二元酸及杂质含量的测试方法可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如气相色谱检测法的内标法或归一法等。

POX基因编码乙酰辅酶A氧化酶。优选的发酵菌株热带假丝酵母中存在三个POX基因，分别是POX2、POX4和POX5。这三个基因编码的蛋白被认为以八聚体的形式参与β-氧化途径，负责脂肪酸及其衍生物的降解过程。

同源基因是指序列相似性达80％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。本发明中所指的POX基因的同源基因既可以是POX基因的直向同源基因，也可以是其横向同源基因或异源同源基因。

序列同一性是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸变体与本文所述的多核苷酸具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的多核苷酸同源性。

如本文所用，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指核苷酸序列无变化的程度，可通过比对多核苷酸与参考多核苷酸之间的相同核苷酸碱基的数目而检测。序列同一性可以通过标准排列对比算法程序使用由每个供应商制定的默认缺口罚分确定。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(沉默取代)以及相同的残基。基本同源的核酸分子典型在中等严格条件下或者在高度严格条件下杂交全长核酸或者至少或至少约70％、80％或90％全长的感兴趣的核酸分子。本发明还涵盖了含有简并密码子代替杂交核酸分子中密码子的核酸分子。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同的”核苷酸序列可以使用已知的计算机算法确定，如BLASTN、FASTA、DNAStar及Gap(University of Wisconsin GeneticsComputer Group(UWG),Madison WI,USA)。例如，核酸分子的同源性或同一性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序对比序列信息而确定(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48:443(1970)，由Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981)修订)。简而言之，GAP程序根据相似的排列对比的符号(即核苷酸)的数目除以两个序列中较短序列的符号总数而定义相似性。

定向进化是指借助于技术手段模拟自然选择的过程。通过人为制造的突变和特定的筛选压力，使蛋白质或核酸向特定的方向突变，从而在短时间内在分子水平上的实现自然界中需要成千上万年才能完成的进化过程。本领域已知多种进行定向进化的方法，包括例如易错PCR等(可例如参见Technique,1,11-15,1989；Genome Research,2,28-33,1992)。

在一些实施方案中，在本发明的易错PCR中，Mg²⁺浓度范围为1～10mM，优选2～8mM，更优选5～6mM，和/或dNTP的浓度为0.1～5mM，优选0.2-3mM，更优选0.5～2mM，更优选0.8-1.5mM，例如1mM，和/或添加新鲜配置的MnCl₂至终浓度为0.1～5mM，优选0.2～2mM，更优选0.3～1mM，更优选0.4～0.7mM，例如0.5mM。在一些实施方案中，通过降低模板量并适当增加至40个或更多个循环PCR以增加突变几率，例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60或更多个循环。

PCR重叠延伸又称SOE(gene splicing by overlap extension)PCR是指通过设计具有互补末端的引物，通过PCR扩增将不同DNA片段拼接到一起的方法。

同源重组是指依赖于序列相似性的DNA分子之间的重组，最常见于细胞内用于修复有丝分裂期间产生的突变。同源重组技术已广泛应用于基因组编辑，包括基因敲除、基因修复以及向特定位点引入新的基因等。以酿酒酵母为代表的一类微生物，其细胞内发生同源重组的几率非常高，不依赖于序列特异性，在基因组编辑方面具有明显的优势。而位点特异性重组，依赖于特异性位点和位点特异性重组酶参与，重组仅发生于特异的位点之间，如Cre/loxP、FLP/FRT等。本专利使用的同源重组技术不属于位点特异性重组，重组依赖于细胞内的DNA修复系统。

抗性标记是指选择性标记的一种，其往往携带有赋予转化子在抗生素存在的条件下得以生存的能力。所述抗性标记基因包括NPT、HYG、BLA及CAT等，分别可以抗卡那霉素、潮霉素、氨苄/羧苄青霉素以及氯霉素等。优选的，所述抗性标记基因是潮霉素B。所述抗性标记基因是潮霉素B抗性基因HYG。

发酵生产过程中，所述发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐。

在一些实施方案中，所述碳源包括选自葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或所述碳源的添加量为1％～10％(w/v)，例如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

在一些实施方案中，所述氮源包括选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或所述氮源的总添加量为0.1％～3％(w/v)，例如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％。

在一些实施方案中，所述无机盐包括选自磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或所述无机盐的总添加量为0.1％～1.5％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

在一些实施方案中，所述营养因子包括选自维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；和/或所述营养因子的总添加量为0～1％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％。按照发酵领域常识，本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL。

本领域技术人员可以容易地确定上述物质的添加量。

在本发明的一个实施方案中，发酵菌株的接种量为10％～30％，例如11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％、29％。所述菌株培养至菌体光密度(OD₆₂₀)为0.5以上(稀释30倍)时，加入底物进行发酵转化。

长链二元酸的提取纯化：对发酵制得的发酵液进行提取纯化处理，以获得长链二元酸成品。所述提取纯化的步骤包括：对发酵液进行除菌，酸化，以及对获得的清液进行酸化，固液分离，和/或溶剂结晶。

本发明所述的提取纯化，可以重复进行一次以上，进行多次提取纯化步骤有助于进一步降低二元酸产品中的杂质含量，例如，参考中国发明专利CN 101985416A实施例1中精制方法的获得十二碳长链二元酸产品，十碳长链二元酸含量为520ppm，然后继续进行提取纯化或精制，十碳长链二元酸含量能够有效降低至200ppm以下，如180ppm以下、160ppm以下、140ppm、120ppm或更低。

所述发酵液包括生物发酵长链二元酸的过程中产生的含有长链二元酸盐的发酵液，所述含有长链二元酸盐的发酵液中可能含有长链二元酸钠盐、长链二元酸钾盐或长链二元酸铵盐等。

所述除菌优选膜过滤：使用过滤膜将残留的菌体和大蛋白等杂质分离出去，与含有长链二元酸盐的发酵液有效地分离开。进而优选陶瓷膜过滤工艺。使用陶瓷膜进行膜过滤时，优选膜前压力为0.2-0.4MPa；优选过滤膜孔径为0.05-0.2微米。

所述酸化是膜过滤后对获得的含有长链二元酸盐的膜清液进行酸化处理，通过加入酸将长链二元酸盐转化为长链二元酸沉淀。酸化时优选使用无机酸，如硫酸、盐酸、硝酸、或其混合酸。所述酸化处理时无机酸的加入量，需将溶液中的长链二元酸充分沉淀，主要以溶液的终点pH为准，优选酸化的终点pH低于5，更优选终点pH低于4.0。加入无机酸进行酸化处理时，可以获得长链二元酸沉淀和相应的无机盐溶液。

所述固液分离是将获得的长链二元酸沉淀与酸化母液分离开，所述固液分离包括过滤或/和离心分离，可以使用常用的固液分离设备。

优选地，所述提取纯化的步骤还包括对含有长链二元酸盐的发酵液进行脱色，向含有长链二元酸盐的发酵液或膜清液中加入活性炭进行脱色处理，脱色处理后再过滤除去活性炭，脱色步骤可以进一步脱除长链二元酸溶液中的杂质。优选地，活性炭的加量为0.1-5wt％，优选1-3wt％(相对于溶液中含有的长链二元酸的量)。

所述溶剂结晶，即将长链二元酸沉淀溶解于有机溶剂中，并通过冷却\蒸发\溶析使长链二元酸结晶，再分离晶体，获得纯化后长链二元酸。所述有机溶剂包括醇、酸、酮和酯的一种或多种；其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇中的一种或多种；所述酸包括乙酸；所述酮包括丙酮；所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。

在另一个优选的实施方式中，长链二元酸沉淀溶解在有机溶剂后进行脱色，再分离得到清液和更纯的长链二元酸，使用活性炭脱色时，脱色的温度为85～100℃，脱色的时间为15～165min；在另一个优选的实施方式中，分离清液后，降温结晶，降温结晶可包括以下步骤：首先降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶。在另一个优选的实施方式中，结晶之后，分离出所得晶体，由此得到长链二元酸，分离晶体的方式可以为离心分离。

在一些实施方案中，本发明涉及利用上述获得的二元酸产品生产尼龙长丝、工程塑料、合成香料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品。

如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。

如本文所用，术语“约”是指包括具体数值的数值范围，本领域技术人员可以合理认为其类似于具体数值。在一些实施方案中，术语“约”是指在使用本领域通常接受的测量的标准误差内。在一些实施方案中，约是指到具体数值的+/-10％。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1培养基、培养发酵方法及二元酸检测方法

1、YPD培养基，配方(w/v)为：2％蛋白胨，2％葡萄糖和1％酵母提取物(OXOID,LP0021)。固体培养基中还需加入1.5～2％琼脂粉。

培养时，可取单菌落于含有1mL YPD液体培养基的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。

2、种子培养基，配方(w/v)为：蔗糖10～20g/L(具体使用10g/L)，酵母膏3～8g/L(具体使用3g/L)，工业发酵用玉米浆(简称玉米浆，总氮含量2.5wt％)2～4g/L(具体使用2g/L)，KH₂PO₄ 4～12g/L(具体使用4g/L)，尿素0.5～4g/L(具体使用0.5g/L)(115℃，20min单独灭菌)，发酵底物为正十二烷20mL/L。

培养时，将步骤1培养后的菌液接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶，接种量为3-5％，在250rpm、30℃摇床培养至OD₆₂₀达到0.8时(稀释30倍后)。

3、发酵培养基(w/v)：蔗糖10-40g/L(具体使用10g/L)，玉米浆(总氮含量2.5wt％)1～5g/L(具体使用1g/L)，酵母膏4～12g/L(具体使用4g/L)，NaCl 0～3g/L(具体未使用)，KNO₃ 4～12g/L(具体使用4g/L)，KH₂PO₄ 4～12g/L(具体使用4g/L)，尿素0.5～3g/L(具体使用0.5g/L)(115℃，20min单独灭菌)，发酵底物为正十二烷300～400mL/L(具体使用300mL/L)，丙烯酸4g/L，用1N HCl和1N NaOH调节pH值至7.5～7.6。

发酵时，将步骤2培养的种子液接种到装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为10-30％，在30℃、250rpm摇床培养90-144h。培养过程中通过隔段时间补加酸/碱的方式调节pH值至设定范围。

4、气相色谱法(GC)测定二元酸产量和低碳链长链二元酸杂酸杂质含量的步骤

(1)发酵液产物及杂质含量检测：发酵液经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测(内标法)，色谱条件如下：

色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃，保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据二元酸产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行二元酸产量计算，根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算杂质含量。

(2)固体产品纯度及杂质含量检测：固体样品经常规气相色谱法前处理，使用气相色谱检测(归一法)，

色谱条件：色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。

气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。

方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。

根据二元酸产物峰面积和杂质峰面积计算产物纯度和杂质含量。

实施例2带有POX启动子突变的重组模板的制备

1、POX4启动子的克隆

(1)总RNA提取与转录组测序

将CCTCC M 2011192热带假丝酵母的单菌落接种于含有1mL实施例1所述YPD培养基的2mL离心管中，30℃，250rpm摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，250rpm、30℃培养至OD₆₂₀达到0.8。将种子液接入装有15mL实施例1所述发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％。继续250rpm、30℃培养36小时后发酵结束，3000g离心5min收集菌液。发酵培养基中发酵底物为400mL/L正十二烷。培养过程中通过间歇补1N HCl和1N NaOH的方式调节pH值至7.5～7.6。

RNA提取采用TRNzol universal Reagent(Tiangen)试剂盒，并辅以液氮研磨破碎细胞。转录组测序采用Miseq(Illumina)平台，采用双端测序方法，得到20M长度为2×251bp的Reads。测得的Read去除接头并用CutAadpt(v1.1.6)过滤低质量的碱基和Reads后，用Trinity软件(http://trinityrnaseq.sf.net)组装得到Unigene，并用NCBI的Non-Redundant蛋白质数据库进行功能注释。

(2)生物信息学分析

采用本地Blast(Blast+2.7.1)的方法对所得到的Unigene建库并用已知热带假丝酵母的乙酰辅酶A氧化酶I基因(M12161)做query，通过tblastn搜索得到一个候选POX基因，基因序列序列如SEQ ID NO：28所示。

2、POX启动子突变模板的制备。

使用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(Sangon，货号518257)提取假丝酵母细胞CCTCC M2011192基因组DNA。为提高细胞壁破碎效率，辅以液氮研磨的方法破碎细胞壁。以用该方法获得的基因组DNA作为模板进行易错PCR。获得的无突变产物称为POX，经测序证实与GenBank Accession Number：M12161)所示序列一致。

3、易错PCR

调整Mg²⁺的浓度(2-8mM，以0.5mM递增)，使用Taq DNA聚合酶(Takara，货号R001B)进行易错PCR扩增POX基因的启动子，引物如下：

Ppox-F：5'-GTGATTTGGCACTTGACAG-3'(SEQ ID NO：1)

Ppox-R：5'-TTTTGAAGTTCGGTAGGCAT-3'(SEQ ID NO：2)

PCR反应条件为：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃30s,72℃1m,35个循环

步骤3:72℃5m。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，采用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)进行回收纯化。

实施例3同源重组模板的制备

本实施例中所有DNA片段均使用Takara公司HS高保真DNA聚合酶(Takara,R040A)扩增得到。1％琼脂糖凝胶电泳后用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-250G)回收纯化DNA片段。

1、上下游同源重组片段的扩增，模板为热带假丝酵母基因组DNA(如上)，引物序列如下：

POX_Upstream-F：5'-ACAACAACGAAGAAGACTCA-3'(SEQ ID NO：3)

POX_Upstream-R：5'-CCCATTTCTTCCTCCAATCA-3'(SEQ ID NO：4)

POX_Downstream-F：5'-ATGCCTACCGAACTTCAAAA-3'(SEQ ID NO：5)

POX_Downstream-R：5'-TCTTTGTTGGTCTTTGGTCA-3'(SEQ ID NO：6)。

PCR反应条件一致如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃30s,72℃25s,30个循环

步骤3:72℃5m。

获得的产物分别称为POX_Upstream和POX_Downstream，经测序证实无误，其序列如SEQ ID NO：17和18所示。

2、抗性筛选标记(HYG，即潮霉素抗性基因)的扩增，扩增模板为本公司所有的载体pCIB2(SEQ ID NO：19)，引物序列如下：

POX_HYG-F：

5'-TGATTGGAGGAAGAAATGGGGCATGCGAACCCGAAAATGG-3'(SEQ ID NO：7)

POX_HYG-R：

5'-CTGTCAAGTGCCAAATCACGCTAGCAGCTGGATTTCACT-3'(SEQ ID NO：8)。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,55℃10s,72℃1m 50s,5个循环

步骤3:98℃10s,72℃2m,25个循环

步骤4:72℃5m。

获得的产物称为HYG，经测序证实无误，如SEQ ID NO：9所示。

3、PCR重叠延伸得到完整的重组模板

将回收的上述4条PCR片段带有随机突变的Ppox，SEQ ID NO：9、17和18进行重叠延伸，得到同源重组模板，并回收纯化。具体方法如下：

加入等摩尔量的POX_Upstream、POX、HYG和POX_Downstream片段作为模板，上下游引物分别为POX_Upstream-F和POX_Downstream-R，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃10s,72℃3m,30个循环

步骤3:72℃5m。

凝胶电泳后进行回收纯化大小约为2.6Kb的重组片段。

图1示出了本发明通过同源重组的方式整合进带有突变位点的POX基因并去除潮霉素筛选标记的示意图。

实施例4构建热带假丝酵母POX基因突变体库

1、酵母电转化感受态细胞的制备

将30℃，250rpm摇床过夜培养的假丝酵母细胞CCTCC M2011192接种到实施例1的100mL YPD培养基中，至OD₆₂₀为0.1。相同条件下培养至OD₆₂₀至1.3时，3000g、4℃离心收集细胞。用冰冷的无菌水洗涤细胞两次并收集后将细胞重悬于10mL冰上预冷的1M的山梨醇溶液，4℃、1500g离心收集细胞后重悬于1mL上述山梨醇溶液，分装100μL细胞悬液用于遗传转化。

2、酵母感受态电击转化

上述感受态细胞中加入1μg实施例3步骤(3)中回收的用于重组的DNA片段，冰上放置5min后迅速转移至0.2cm电击杯，电击转化(BioRad，MicropulserTM Electroporator，转化程序SC2，1.5kV，25uFD，200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃，200rpm培养2小时后，收集菌液后涂布含有100mg/L潮霉素B的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

实施例5突变菌株的筛选

1、筛选方法：挑取实施例4中获取的单菌落于含100mg/L潮霉素B的YPD培养基，30℃，250rpm培养过夜，以引物HYG-F和HYG-R(HYG-F:5'-CTCGGAGGGCGAAGAATCTC-3'(SEQ IDNO：10)；HYG-R:5'-CAATGACCGCTGTTATGCGG-3'(SEQ ID NO：11))进行菌落PCR鉴定阳性克隆。接种阳性克隆至含100mg/L潮霉素B的种子培养基中，250rpm、30℃培养至OD₆₂₀达到0.8时，将3.5mL种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中。继续250rpm、30℃培养120h至发酵结束。取0.5g发酵液样品制备检测样品进行GC检测，计算十二碳二元酸和低碳链长链二元酸杂酸十碳二元酸的产量。

2、筛选结果：经筛选得到一株与原始菌株CCTCC M2011192相比低碳链长链二元酸杂酸含量降低的候选菌株，编号为526HYG。产酸量与十碳二元酸杂酸的含量如表1所示。

表1

菌株	CCTCC M2011192	526HYG
			十二碳二元酸产量(mg/g)	147.9	149.8
十碳二元酸质量比率(％)	0.46	0.27

所述十碳二元酸杂酸质量比率为其所占十二碳二元酸的质量百分比。

实施例6突变菌株526HYG的POX基因序列分析

1、按实施例2的方法提取假丝酵母细胞CCTCC M2011192和526HYG酵母基因组DNA，并使用Tarkara公司HS高保真DNA聚合酶扩增POX基因的启动子区域，引物为Ppox-F和Ppox-R。

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃10s,72℃1m,30个循环

步骤3:72℃5m。

2、PCR完成后，将产物进行凝胶电泳并回收纯化。

3、纯化后的PCR片段加A处理：20μL PCR回收片段加入4μL 10X Takara Taq缓冲液、3.2μL dNTP(均为10mM)和0.2μL Takara Taq，补ddH₂O至40μL，72℃保温20分钟后，使用Axygen PCR纯化试剂盒回收。

4、TA克隆。取加A后的PCR回收片段4μL加入1μL pMD19-T载体骨架和5μL SolutionI，混匀后16℃保温30min。并将连接产物转化至DH5α化学感受态，挑取阳性克隆送至Majorbio(美吉生物)测序。

结果显示：亲代CCTCC M2011192的POX基因序列与GenBANK数据库中的序列(登录号：M12161)一致，而突变株526HYG在启动子区域碱基缺失突变。如图2所示，POX的启动子区域发生了碱基突变用黑框标出(192代表亲代菌株CCTCC M2011192)，其序列如SEQ ID NO：16所示。

实施例7抗性筛选标记的去除

1、同源重组模板的制备

以热带假丝酵母突变株526HYG的基因组DNA为模板扩增去除抗性筛选标记所需的重组模板片段POX-Upstream-2和Ppox，使用Tarkara公司HS进行PCR扩增，凝胶电泳后回收。获得的序列如SEQ ID NO：14和15所示。引物序列如下：

POX_Upstream-F：5'-ACAACAACGAAGAAGACTCA-3'(SEQ ID NO：3)

POX_Upstream-2R：5’-CTGTCAAGTGCCAAATCACCCCATTTCTTCCTCCAATCA-3’(SEQ IDNO：12)

Ppox-F：5'-GTGATTTGGCACTTGACAG-3'(SEQ ID NO：1)

Ppox-2R：5’-ATGATTGATGCAGAAGCAAG-3’(SEQ ID NO：13)

PCR反应条件一致如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃10s,72℃1m,30个循环

步骤3:72℃5m。

回收纯化上述PCR片段，并加入等摩尔量的POX_Upstream-2和Ppox作模板，所用引物为POX_Upstream-F和Ppox-R，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR重叠延伸，反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃10s,72℃1m 30s,30个循环

步骤3:72℃5m。

凝胶电泳后回收纯化大小约为1.3Kb的重叠延伸所得到的片段，即为去除潮霉素筛选标记所需的同源重组模板，其序列如SEQ ID NO：20所示。

2、去除抗性筛选标记

制备菌株526HYG的新鲜电转化感受态细胞，加入1μg回收的步骤1所述重组片段，冰上放置5min后迅速转移至冰上预冷的0.2cm电击杯，电击转化(如上，1.5kV,25uFD,200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃、200rpm培养2小时后，收集菌液后涂布含有不含抗生素的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

3、去除抗性标记的菌株的筛选

挑取单菌落一一对应分别接种于含有和不含潮霉素(100mg/L)的YPD平板，挑取在含有抗生素培养基上不生长但不含抗生素培养基上能够生长的单菌落接种于含有1mL YPD培养基的2mL离心管中，于4℃、250rpm过夜培养，次日通过菌落PCR鉴定抗性筛选标记是否去除，所用引物为

b)POX_Upstream-F和Ppox-2R

PCR反应条件如下：

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,50℃10s,72℃1m 30s,30个循环

步骤3:72℃5m。

b)HYG-F:5’-CTCGGAGGGCGAAGAATCTC-3’(SEQ ID NO：22)

HYG-R:5’-CAATGACCGCTGTTATGCGG-3’(SEQ ID NO：23)。

PCR反应条件为

步骤1:98℃30s

步骤2:98℃10s,55℃30s,72℃35s共30个循环

步骤3:72℃5s

4、筛选结果

通过菌落PCR，筛选得到1株抗性筛选标记去除的菌株，并通过测序确认，该菌株POX基因启动子区域存在的突变与526HYG菌株相同，并已去除潮霉素筛选标记基因。最终该菌株命名为526。

实施例8菌株526发酵生产长链二元酸

发酵：接种菌株526至含有1mL实施例1YPD培养基的2mL离心管中，30℃下，250RPM摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，摇床250rpm、30℃，36～48h培养至OD620达到0.8(稀释30倍后)时。将种子液接种到装有15mL实施例1发酵培养基的摇瓶中，接种量为20％，发酵培养基中底物为正十二烷。继续摇床培养250rpm、30℃培养至发酵结束。取0.5g上述发酵液样品，并使用实施例1中4所述方法测定并计算十二碳二元酸产量及十碳二元酸的质量比率，如下表2所示：

表2

菌株	CCTCC M2011192	526
			十二碳二元酸产量(mg/g)	148.2	150.3
十碳二元酸质量比率(％)	0.48	0.25

本发明所述十碳二元酸质量比率为其所占十二碳二元酸的质量百分比，由表2可知十碳二元酸杂质的质量比率下降了47.9％。

提取纯化：

(1)将上述发酵液，用质量浓度30％的氢氧化钠溶液调节pH为8.5，加水调节到长链二元酸浓度为6wt％，加热至45℃，用0.05微米孔径的陶瓷膜[购自三达膜科技(厦门)有限公司]对发酵液进行过滤。使用的陶瓷膜膜面积为0.84平方米，膜前压力设定0.3MPa，收集膜清液。

(2)将接收到的膜清液，在60℃下，加入5wt％的粉末活性炭(相对于溶液中含有的长链二元酸的量)脱色，过滤得到澄清液体。

(3)再向所述澄清液体中加入硫酸，调节pH至3，降温到30℃，过滤得到湿固体，用5倍于湿固体重量的纯净水洗涤滤饼，过滤后烘干，获得十二碳二元酸一级产品。

(4)向十二碳二元酸一级产品加入3.5倍量(相对于十二碳二元酸一级产品重量)浓度为97％的醋酸，加热到85℃溶解，加入1％大孔粉末活性炭(相对于十二碳二元酸一级产品重量)脱色，在85℃下保持1小时，热过滤得到清液。该溶液以10℃/小时的速度降温，到30℃得到十二碳二元酸晶体溶液。过滤，水洗涤湿固体的溶剂，烘干后得到十二碳二元酸二级产品。

使用实施例1中4所述方法测定并计算提取纯化步骤(3)和(4)获得的二元酸一级产品和二级产品中十二碳二元酸纯度及十碳二元酸杂酸含量，如下表3所示：

表3

从表3可以看出，十二碳二元酸产品中的十碳二元酸杂质经过提取纯化工艺后进一步提高了发酵产物长链二元酸产品的纯度，降低了低碳链长链二元酸杂酸的含量，并且降低了后期的提取纯化工艺的难度。

实施例9为进一步验证上述突变，提取酵母526HYG的基因组DNA，用HS高保真DNA聚合酶进行PCR扩增包含突变后的POX启动子和HYG抗性基因的DNA片段，PCR反应条件同实施例3.3。凝胶电泳后进行回收纯化，大小约为2.7Kb，经测序证实无误，其序列为SEQ ID NO：21。

酵母同源重组的方法同实施例4、5，菌落PCR鉴定方法同实施例7.3，所用引物为HYG-F(SEQ ID NO：22)和HYG-R(SEQ ID NO：23)。筛选到的阳性克隆命名为527HYG，POX启动子的测序方法同实施例6。经测序证实，其POX启动子发生的突变与菌株526相同。

发酵方法与二元酸测定方法同实施例5.1。结果如表4所示，与对照菌株CCTCCM2011192相比，筛选到的菌株527HYG与526HYG中十碳链二元酸杂酸的含量均有显著下降。

表4

实施例10

将实施例9所述DNA片段(SEQ ID NO：21)同源重组入热带假丝酵母(CCTCCM203052)，方法同实施例4和5。筛选得到的单克隆与亲代菌株(CCTCC M203052)基因组中POX基因的启动子序列测序方法同实施例6。经测序证实，亲代菌株(CCTCC M203052)的POX的基因序列与GENBANK(登录号M12161)公布的序列一致，而筛选得到的克隆中该基因携带有突变，突变位点与SEQ ID NO：16一致。将其中一株菌命名为528HYG。

发酵方法同实施例5，所用菌株为CCTCC M203052和528HYG。发酵结束后各取0.5g上述发酵液样品，计算十二碳二元酸产量与十碳二元酸杂酸含量，如表5所示。结果表明，与亲代菌株CCTCC M203052相比，528HYG中十碳二元酸杂质含量显著下降。

表5

菌株	CCTCC M203052	528HYG
			十二碳二元酸产量(mg/g)	132.1	133.6
十碳二元酸质量比率(％)	0.44	0.19

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

CIBT美国公司

<120> 低含量低碳链长链二元酸杂酸的长链二元酸及其制备方法

<130> NI2018TC411

<150> CN 201810734151.8

<151> 2018-07-06

<150> CN 201810734262.9

<151> 2018-07-06

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Ppox-F

<400> 1

gtgatttggc acttgacag 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Ppox-R

<400> 2

ttttgaagtt cggtaggcat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_Upstream-F

<400> 3

acaacaacga agaagactca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_Upstream-R

<400> 4

cccatttctt cctccaatca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_Downstream-F

<400> 5

atgcctaccg aacttcaaaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_Downstream-R

<400> 6

tctttgttgg tctttggtca 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_HYG-F

<400> 7

tgattggagg aagaaatggg gcatgcgaac ccgaaaatgg 40

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_HYG-R

<400> 8

ctgtcaagtg ccaaatcacg ctagcagctg gatttcact 39

<210> 9

<211> 1775

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HYG

<400> 9

tgattggagg aagaaatggg gcatgcgaac ccgaaaatgg agcaatcttc cccggggcct 60

ccaaatacca actcacccga gagagataaa gagacaccac ccaccacgag acggagtata 120

tccaccaagg taagtaactc agagttaatg atacaggtgt acacagctcc ttccctagcc 180

attgagtggg tatcacatga cactggtagg ttacaaccac gtttagtagt tattttgtgc 240

aattccatgg ggatcaggaa gtttggtttg gtgggtgcgt ctactgattc ccctttgtct 300

ctgaaaatct tttccctagt ggaacacttt ggctgaatga tataaattca ccttgattcc 360

caccctccct tctttctctc tctctctgtt acacccaatt gaattttctt ttttttttta 420

ctttccctcc ttctttatca tcaaagataa gtaagtttat caattgccta ttcagaatga 480

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct catcgaaaag ttcgacagcg 540

tctccgacct catgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 600

gagggcgtgg atatgtcctc cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 660

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 720

aattcagcga gagcctcacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 780

acctccctga aaccgaactc cccgctgttc tccagccggt cgcggaggcc atggatgcga 840

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 900

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 960

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctca 1020

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 1080

acaatgtcct cacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 1140

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 1200

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccgcggc 1260

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 1320

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 1380

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 1440

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaaggaat 1500

agtgtgctac ccacgcttac tccaccagag ctattaacat cagaaatatt tattctaata 1560

aataggatgc aaaaaaaaaa ccccccttaa taaaaaaaaa agaaacgatt ttttatctaa 1620

tgaagtctat gtatctaaca aatgtatgta tcaatgttta ttccgttaaa caaaaatcag 1680

tctgtaaaaa aggttctaaa taaatattct gtctagtgta cacattctcc caaaatagtg 1740

aaatccagct gctagcgtga tttggcactt gacag 1775

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-F

<400> 10

ctcggagggc gaagaatctc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-R

<400> 11

caatgaccgc tgttatgcgg 20

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer POX_Upstream-2R

<400> 12

ctgtcaagtg ccaaatcacc ccatttcttc ctccaatca 39

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer Ppox-2R

<400> 13

ggaaccgagg ccaaatta 18

<210> 14

<211> 267

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> POX-Upstream-2

<400> 14

acaacaacga agaagactca ggacacttta gtttattctg tttctttttt tgcaactccg 60

ctgggaataa tgaagcaccc gggcgatggc aatctcgcat ataagtttcg gagttttttc 120

tagaaggaat ttgcctctct acgtcacgta ccccgatgtt tgtcccacgg tttatcatcc 180

agcgggaaga aagagataat cacaggggta gagaccttgg ttatgggctg attggaggaa 240

gaaatggggt gatttggcac ttgacag 267

<210> 15

<211> 423

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ppox

<400> 15

gtgatttggc acttgacagc gcgagagtgg ttaacacctg gtttccctca tttgggttct 60

gacatttgat aagttgaaag aacaatgcag aattcacatg gctaatttgg cctcggttcc 120

acaacgcact cagcattaaa aaaaaaatac gcaatggcag ctcggtcgac gcagcagaag 180

cgccgacgta ccgtcgcgtt gccccgccca tgcctcgccg acccctccac cgccatcgtt 240

tgcccattgt ttgtggtagt gcgccgtgac acaaaaactt gtcctgtcac atgctgaagt 300

tacaccaaca taactactat gggattacgt aatcaaaaat ttcacagttt taacaaaaaa 360

aaatcataca atcaacattg ggacatcttg ccctccccca caaaacttgc ttctgcatca 420

atc 423

<210> 16

<211> 544

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutated POX

<400> 16

gtgatttggc acttgacagc gcgagagtgg ttaacacctg gtttccctca tttgggttct 60

gacatttgat aagttgaaag aacaatgcag aattcacatg gctaatttgg cctcggttcc 120

acaacgcact cagcattaaa aaaaaaatac gcaatggcag ctcggtcgac gcagcagaag 180

cgccgacgta ccgtcgcgtt gccccgccca tgcctcgccg acccctccac cgccatcgtt 240

tgcccattgt ttgtggtagt gcgccgtgac acaaaaactt gtcctgtcac atgctgaagt 300

tacaccaaca taactactat gggattacgt aatcaaaaat ttcacagttt taacaaaaaa 360

aaatcataca atcaacattg ggacatcttg ccctccccca caaaacttgc ttctgcatca 420

atcatatata aacatcatga aataagccta aactcacttc tttttttttc atccttccta 480

cttcttcttt catagtaact actttttttt tattaccaca cttattcatt cataccacgc 540

tatc 544

<210> 17

<211> 248

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> POX_Upstream

<400> 17

acaacaacga agaagactca ggacacttta gtttattctg tttctttttt tgcaactccg 60

ctgggaataa tgaagcaccc gggcgatggc aatctcgcat ataagtttcg gagttttttc 120

tagaaggaat ttgcctctct acgtcacgta ccccgatgtt tgtcccacgg tttatcatcc 180

agcgggaaga aagagataat cacaggggta gagaccttgg ttatgggctg attggaggaa 240

gaaatggg 248

<210> 18

<211> 183

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> POX_Downstream

<400> 18

atgcctaccg aacttcaaaa agaaagagaa ctcaccaagt tcaacccaaa ggagttgaac 60

tacttcttgg aaggttccca agaaagatcc gagatcatca gcaacatggt cgaacaaatg 120

caaaaagacc ctatcttgaa ggtcgacgct tcatactaca acttgaccaa agaccaacaa 180

aga 183

<210> 19

<211> 5873

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vector pCIB2

<400> 19

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcggtct 240

agtatgattg tcaataatga tgggtcatcg tttcctgatt cgacgttccc tgtggtgtcg 300

ttaaatagcc tgtctgaaat ctcctccatg attgtgttgg tgtgtgttgt ttgactttcc 360

caattgctta catttttttc ttcaaggatt cgctccaaaa tagacagaaa ttatcgcgac 420

aagtcagacg aacgtcgcac gaggcgaacc aaattcttta gaagcatacg aaaactcact 480

ttatttccat tagaagtatt aaattaacaa atatataata tacaggatac aaagtaaaag 540

cacgcttaag caaccaaagc ggaagcggta gcggattcgt atttccagtt aggtggcaag 600

acagcgacgg ttctgtagta tctggccaat ctgtggattc tagattcaat caaaatcaat 660

ctgaacttgg agtccttgtc ctttctgttt ctttccaagt gctttctgac agagacagcc 720

ttcttgatca agtagtacaa gtcttctggg atttctggag ccaaaccgtt ggatttcaag 780

attctcaaga tcttgttacc agtgacaacc ttggcttggg aaacaccgtg agcatctctc 840

aagataacac caatttgaga tggagtcaaa ccctttctgg cgtacttgat gacttgttca 900

acaacttcgt cagaagacaa cttgaaccaa gatggagcgt ttcttgagta tggaagagcg 960

gaggaggaaa tacctttacc ctaaaataac aagagctaat gttagtaatt tgaaaaaaaa 1020

gacgttgagc acgcacaccc catccacccc acaggtgaaa cacatcaaac gtagcaagaa 1080

caatagttgg ccctcccgtc aagggggcag gtaattgtcc aagtacttta gaaaagtatg 1140

tttttaccca taagatgaac acacacaaac cagcaaaagt atcaccttct gcttttcttg 1200

gttgaggttc aaattatgtt tggcaataat gcagcgacaa tttcaagtac ctaaagcgta 1260

tatagtaaca attctaggtc tgtatagtcg accgtaggtg aatcgtttac tttaggcaag 1320

accttgtccc tgataaagcc aggttgtact ttctattcat tgagtgtcgt ggtggtggta 1380

gtggtggttg attgggctgt tgtggtagta gtagtggttg tgatttggaa catacagatg 1440

aatgcatacg acccatgatg actgatttgt ttctttattg agttgatggt aagaaagaga 1500

agaagaggag gtaaaaaggt ggtagagtga aaaatttttt tctcttaaaa gtgagagaga 1560

gaaagagaaa aatttcactg cgaaacaaat ggttggggac acgacttttt tcaggaattt 1620

ttactcgaag cgtatatgca ggaaagttgt tgttagggaa tatggagcca caagagagct 1680

gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcgaacccg 1740

aaaatggagc aatcttcccc ggggcctcca aataccaact cacccgagag agagaaagag 1800

acaccaccca ccacgagacg gagtatatcc accaaggtaa gtaactcagg gttaatgata 1860

caggtgtaca cagctccttc cctagccatt gagtgggtat cacatgacac tggtaggtta 1920

caaccacgtt tagtagttat tttgtgcaat tccatgggga tcaggaagtt tggtttggtg 1980

ggtgcgtcta ctgattcccc tttgtctctg aaaatctttt ccctagtgga acactttggc 2040

tgaatgatat aaattcacct tgattcccac cctcccttct ttctctctct ctctgttaca 2100

cccaattgaa ttttcttttt ttttttactt tccctccttc tttatcatca aagataagta 2160

agtttatcaa ttgcctattc agaatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 2220

agtttctcat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctcat gcagctctcg gagggcgaag 2280

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctccgg gtaaatagct 2340

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 2400

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctcacctat tgcatctccc 2460

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tccctgaaac cgaactcccc gctgttctcc 2520

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 2580

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 2640

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 2700

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctcatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc 2760

acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctcac ggacaatggc cgcataacag 2820

cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct 2880

tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc 2940

atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc 3000

aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat 3060

gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa 3120

gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc 3180

ccagcactcg tccgagggca aaggaatagt gtgctaccca cgcttactcc accagagcta 3240

ttaacatcag aaatatttat tctaataaat aggatgcaaa aaaaaaaccc cccttaataa 3300

aaaaaaaaga aacgattttt tatctaatga agtctatgta tctaacaaat gtatgtatca 3360

atgtttattc cgttaaacaa aaatcagtct gtaaaaaagg ttctaaataa atattctgtc 3420

tagtgtacac attctcccaa aatagtgaaa tccagctgct agcgtgtaag cttggcactg 3480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 3540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 3660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 3720

gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 3780

ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 3840

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

<210> 20

<211> 673

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> homologous recombination template for removing resistance marker

<400> 20

acaacaacga agaagactca ggacacttta gtttattctg tttctttttt tgcaactccg 60

ctgggaataa tgaagcaccc gggcgatggc aatctcgcat ataagtttcg gagttttttc 120

tagaaggaat ttgcctctct acgtcacgta ccccgatgtt tgtcccacgg tttatcatcc 180

agcgggaaga aagagataat cacaggggta gagaccttgg ttatgggctg attggaggaa 240

gaaatggggt gatttggcac ttgacagcgc gagagtggtt aacacctggt ttccctcatt 300

tgggttctga catttgataa gttgaaagaa caatgcagaa ttcacatggc taatttggcc 360

tcggttccac aacgcactca gcattaaaaa aaaaatacgc aatggcagct cggtcgacgc 420

agcagaagcg ccgacgtacc gtcgcgttgc cccgcccatg cctcgccgac ccctccaccg 480

ccatcgtttg cccattgttt gtggtagtgc gccgtgacac aaaaacttgt cctgtcacat 540

gctgaagtta caccaacata actactatgg gattacgtaa tcaaaaattt cacagtttta 600

acaaaaaaaa atcatacaat caacattggg acatcttgcc ctcccccaca aaacttgctt 660

ctgcatcaat cat 673

<210> 21

<211> 2711

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA fragment containing mutated POX promoter and HYG resistance

gene

<400> 21

acaacaacga agaagactca ggacacttta gtttattctg tttctttttt tgcaactccg 60

ctgggaataa tgaagcaccc gggcgatggc aatctcgcat ataagtttcg gagttttttc 120

tagaaggaat ttgcctctct acgtcacgta ccccgatgtt tgtcccacgg tttatcatcc 180

agcgggaaga aagagataat cacaggggta gagaccttgg ttatgggctg attggaggaa 240

gaaatggggc atgcgaaccc gaaaatggag caatcttccc cggggcctcc aaataccaac 300

tcacccgaga gagataaaga gacaccaccc accacgagac ggagtatatc caccaaggta 360

agtaactcag agttaatgat acaggtgtac acagctcctt ccctagccat tgagtgggta 420

tcacatgaca ctggtaggtt acaaccacgt ttagtagtta ttttgtgcaa ttccatgggg 480

atcaggaagt ttggtttggt gggtgcgtct actgattccc ctttgtctct gaaaatcttt 540

tccctagtgg aacactttgg ctgaatgata taaattcacc ttgattccca ccctcccttc 600

tttctctctc tctctgttac acccaattga attttctttt tttttttact ttccctcctt 660

ctttatcatc aaagataagt aagtttatca attgcctatt cagaatgaaa aagcctgaac 720

tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctca tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctca 780

tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat 840

atgtcctccg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc 900

actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga 960

gcctcaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctccctgaaa 1020

ccgaactccc cgctgttctc cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg 1080

atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta 1140

catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga 1200

tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctcatg ctttgggccg 1260

aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctca 1320

cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc 1380

aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga 1440

cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata 1500

tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg 1560

cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc 1620

gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg 1680

ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag tgtgctaccc 1740

acgcttactc caccagagct attaacatca gaaatattta ttctaataaa taggatgcaa 1800

aaaaaaaacc ccccttaata aaaaaaaaag aaacgatttt ttatctaatg aagtctatgt 1860

atctaacaaa tgtatgtatc aatgtttatt ccgttaaaca aaaatcagtc tgtaaaaaag 1920

gttctaaata aatattctgt ctagtgtaca cattctccca aaatagtgaa atccagctgc 1980

tagcgtgatt tggcacttga cagcgcgaga gtggttaaca cctggtttcc ctcatttggg 2040

ttctgacatt tgataagttg aaagaacaat gcagaattca catggctaat ttggcctcgg 2100

ttccacaacg cactcagcat taaaaaaaaa atacgcaatg gcagctcggt cgacgcagca 2160

gaagcgccga cgtaccgtcg cgttgccccg cccatgcctc gccgacccct ccaccgccat 2220

cgtttgccca ttgtttgtgg tagtgcgccg tgacacaaaa acttgtcctg tcacatgctg 2280

aagttacacc aacataacta ctatgggatt acgtaatcaa aaatttcaca gttttaacaa 2340

aaaaaaatca tacaatcaac attgggacat cttgccctcc cccacaaaac ttgcttctgc 2400

atcaatcata tataaacatc atgaaataag cctaaactca cttctttttt tttcatcctt 2460

cctacttctt ctttcatagt aactactttt tttttattac cacacttatt cattcatacc 2520

acgctatcat gcctaccgaa cttcaaaaag aaagagaact caccaagttc aacccaaagg 2580

agttgaacta cttcttggaa ggttcccaag aaagatccga gatcatcagc aacatggtcg 2640

aacaaatgca aaaagaccct atcttgaagg tcgacgcttc atactacaac ttgaccaaag 2700

accaacaaag a 2711

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-F

<400> 22

ctcggagggc gaagaatctc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer HYG-R

<400> 23

caatgaccgc tgttatgcgg 20

<210> 24

<211> 2624

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 24

gaattcacat ggctaatttg gcctcggttc cacaacgcac tcagcattaa aaaaaaaata 60

cgcaatggca gctcggtcga cgcagcagaa gcgccgacgt accgtcgcgt tgccccgccc 120

atgcctcgcc gacccctcca ccgccatcgt ttgcccattg tttgtggtag tgcgccgtga 180

cacaaaaact tgtcctgtca catgctgaag ttacaccaac ataactacta tgggattacg 240

taatcaaaaa tttcacagtt ttaacaaaaa aaaaatcata caatcaacat tgggacatct 300

tgccctcccc cacaaaactt gcttctgcat caatcatata taaacatcat gaaataagcc 360

taaactcact tctttttttt tcatccttcc tacttcttct ttcatagtaa ctactttttt 420

tttattacca cacttattca ttcataccac gctatcatgc ctaccgaact tcaaaaagaa 480

agagaactca ccaagttcaa cccaaaggag ttgaactact tcttggaagg ttcccaagaa 540

agatccgaga tcatcagcaa catggtcgaa caaatgcaaa aagaccctat cttgaaggtc 600

gacgcttcat actacaactt gaccaaagac caacaaagag aagtcaccgc caagaagatt 660

gccagactct ccagatactt tgagcacgag tacccagacc aacaggccca gagattgtcg 720

atcctcggtg tctttgaccc acaagtcttc accagaatcg gtgtcaactt gggtttgttt 780

gtttcctgtg tccgtggtaa cggtaccaac tcccagttct tctactggac cataaataag 840

ggtatcgaca agttgagagg tatctatggt tgttttggta tgactgagtt ggcccacggt 900

tccaacgtcc aaggtattga aaccaccgcc acttttgacg aagacactga cgagtttgtc 960

atcaacaccc cacacattgg tgccaccaag tggtggatcg gtggtgctgc gcactccgcc 1020

acccactgct ccgtctacgc cagattgaag gtcaaaggaa aggactacgg tgtcaagacc 1080

tttgttgtcc cattgagaga ctccaaccac gacctcgagc caggtgtgac tgttggtgac 1140

attggtgcca agatgggtag agacggtatc gataacggtt ggatccagtt ctccaacgtc 1200

agaatcccaa gattctttat gttgcaaaag tactgtaagg tttcccgtct gggtgaagtc 1260

accatgccac catctgaaca attgtcttac tcggctttga ttggtggtag agtcaccatg 1320

atgatggact cctacagaat gaccagtaga ttcatcacca ttgccttgag atacgccatc 1380

cacagaagac aattcaagaa gaaggacacc gataccattg aaaccaagtt gattgactac 1440

ccattgcatc aaaagagatt gttcccattc ttggctgccg cttacttgtt ctcccaaggt 1500

gccttgtact tagaacaaac catgaacgca accaacgaca agttggacga agctgtcagt 1560

gctggtgaaa aggaagccat tgacgctgcc attgtcgaat ccaagaaatt gttcgtcgct 1620

tccggttgtt tgaagtccac ctgtacctgg ttgactgctg aagccattga cgaagctcgt 1680

caagcttgtg gtggtcacgg ttactcgtct tacaacggtt tcggtaaagc ctactccgac 1740

tgggttgtcc aatgtacctg ggaaggtgac aacaacatct tggccatgaa cgttgccaag 1800

ccaatggtta gagacttgtt gaaggagcca gaacaaaagg gattggttct ctccagcgtt 1860

gccgacttgg acgacccagc caagttggtt aaggctttcg accacgccct ttccggcttg 1920

gccagagaca ttggtgctgt tgctgaagac aagggtttcg acattaccgg tccaagtttg 1980

gttttggttt ccaagttgaa cgctcacaga ttcttgattg acggtttctt caagcgtatc 2040

accccagaat ggtctgaagt cttgagacct ttgggtttct tgtatgccga ctggatcttg 2100

accaactttg gtgccacctt cttgcagtac ggtatcatta ccccagatgt cagcagaaag 2160

atttcctccg agcacttccc agccttgtgt gccaaggtta gaccaaacgt tgttggtttg 2220

actgatggtt tcaacttgac tgacatgatg accaatgctg ctattggtag atatgatggt 2280

aacgtctacg aacactactt cgaaactgtc aaggctttga acccaccaga aaacaccaag 2340

gctccatact ccaaggcttt ggaagacatg ttgaaccgtc cagaccttga agtcagagaa 2400

agaggtgaaa agtccgaaga agctgctgaa atcttgtcca gttaatagag cactaggttt 2460

tgataatttg gttcttacag tttatgtatt ttgattcttc cttttttaga tacttttttt 2520

tatattttat tattccttat tgatgtaacg acagtcccac tataattaac ttaaactttg 2580

ctgtaaatca gatgacaagt gtttccctgt ttgcagggga gctc 2624

<210> 25

<211> 456

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 25

gaattcacat ggctaatttg gcctcggttc cacaacgcac tcagcattaa aaaaaaaata 60

cgcaatggca gctcggtcga cgcagcagaa gcgccgacgt accgtcgcgt tgccccgccc 120

atgcctcgcc gacccctcca ccgccatcgt ttgcccattg tttgtggtag tgcgccgtga 180

cacaaaaact tgtcctgtca catgctgaag ttacaccaac ataactacta tgggattacg 240

taatcaaaaa tttcacagtt ttaacaaaaa aaaaatcata caatcaacat tgggacatct 300

tgccctcccc cacaaaactt gcttctgcat caatcatata taaacatcat gaaataagcc 360

taaactcact tctttttttt tcatccttcc tacttcttct ttcatagtaa ctactttttt 420

tttattacca cacttattca ttcataccac gctatc 456

<210> 26

<211> 455

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutated POX promoter

<400> 26

gaattcacat ggctaatttg gcctcggttc cacaacgcac tcagcattaa aaaaaaaata 60

cgcaatggca gctcggtcga cgcagcagaa gcgccgacgt accgtcgcgt tgccccgccc 120

atgcctcgcc gacccctcca ccgccatcgt ttgcccattg tttgtggtag tgcgccgtga 180

cacaaaaact tgtcctgtca catgctgaag ttacaccaac ataactacta tgggattacg 240

taatcaaaaa tttcacagtt ttaacaaaaa aaaatcatac aatcaacatt gggacatctt 300

gccctccccc acaaaacttg cttctgcatc aatcatatat aaacatcatg aaataagcct 360

aaactcactt cttttttttt catccttcct acttcttctt tcatagtaac tacttttttt 420

ttattaccac acttattcat tcataccacg ctatc 455

<210> 27

<211> 2623

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutated POX gene

<400> 27

gaattcacat ggctaatttg gcctcggttc cacaacgcac tcagcattaa aaaaaaaata 60

cgcaatggca gctcggtcga cgcagcagaa gcgccgacgt accgtcgcgt tgccccgccc 120

atgcctcgcc gacccctcca ccgccatcgt ttgcccattg tttgtggtag tgcgccgtga 180

cacaaaaact tgtcctgtca catgctgaag ttacaccaac ataactacta tgggattacg 240

taatcaaaaa tttcacagtt ttaacaaaaa aaaatcatac aatcaacatt gggacatctt 300

gccctccccc acaaaacttg cttctgcatc aatcatatat aaacatcatg aaataagcct 360

aaactcactt cttttttttt catccttcct acttcttctt tcatagtaac tacttttttt 420

ttattaccac acttattcat tcataccacg ctatcatgcc taccgaactt caaaaagaaa 480

gagaactcac caagttcaac ccaaaggagt tgaactactt cttggaaggt tcccaagaaa 540

gatccgagat catcagcaac atggtcgaac aaatgcaaaa agaccctatc ttgaaggtcg 600

acgcttcata ctacaacttg accaaagacc aacaaagaga agtcaccgcc aagaagattg 660

ccagactctc cagatacttt gagcacgagt acccagacca acaggcccag agattgtcga 720

tcctcggtgt ctttgaccca caagtcttca ccagaatcgg tgtcaacttg ggtttgtttg 780

tttcctgtgt ccgtggtaac ggtaccaact cccagttctt ctactggacc ataaataagg 840

gtatcgacaa gttgagaggt atctatggtt gttttggtat gactgagttg gcccacggtt 900

ccaacgtcca aggtattgaa accaccgcca cttttgacga agacactgac gagtttgtca 960

tcaacacccc acacattggt gccaccaagt ggtggatcgg tggtgctgcg cactccgcca 1020

cccactgctc cgtctacgcc agattgaagg tcaaaggaaa ggactacggt gtcaagacct 1080

ttgttgtccc attgagagac tccaaccacg acctcgagcc aggtgtgact gttggtgaca 1140

ttggtgccaa gatgggtaga gacggtatcg ataacggttg gatccagttc tccaacgtca 1200

gaatcccaag attctttatg ttgcaaaagt actgtaaggt ttcccgtctg ggtgaagtca 1260

ccatgccacc atctgaacaa ttgtcttact cggctttgat tggtggtaga gtcaccatga 1320

tgatggactc ctacagaatg accagtagat tcatcaccat tgccttgaga tacgccatcc 1380

acagaagaca attcaagaag aaggacaccg ataccattga aaccaagttg attgactacc 1440

cattgcatca aaagagattg ttcccattct tggctgccgc ttacttgttc tcccaaggtg 1500

ccttgtactt agaacaaacc atgaacgcaa ccaacgacaa gttggacgaa gctgtcagtg 1560

ctggtgaaaa ggaagccatt gacgctgcca ttgtcgaatc caagaaattg ttcgtcgctt 1620

ccggttgttt gaagtccacc tgtacctggt tgactgctga agccattgac gaagctcgtc 1680

aagcttgtgg tggtcacggt tactcgtctt acaacggttt cggtaaagcc tactccgact 1740

gggttgtcca atgtacctgg gaaggtgaca acaacatctt ggccatgaac gttgccaagc 1800

caatggttag agacttgttg aaggagccag aacaaaaggg attggttctc tccagcgttg 1860

ccgacttgga cgacccagcc aagttggtta aggctttcga ccacgccctt tccggcttgg 1920

ccagagacat tggtgctgtt gctgaagaca agggtttcga cattaccggt ccaagtttgg 1980

ttttggtttc caagttgaac gctcacagat tcttgattga cggtttcttc aagcgtatca 2040

ccccagaatg gtctgaagtc ttgagacctt tgggtttctt gtatgccgac tggatcttga 2100

ccaactttgg tgccaccttc ttgcagtacg gtatcattac cccagatgtc agcagaaaga 2160

tttcctccga gcacttccca gccttgtgtg ccaaggttag accaaacgtt gttggtttga 2220

ctgatggttt caacttgact gacatgatga ccaatgctgc tattggtaga tatgatggta 2280

acgtctacga acactacttc gaaactgtca aggctttgaa cccaccagaa aacaccaagg 2340

ctccatactc caaggctttg gaagacatgt tgaaccgtcc agaccttgaa gtcagagaaa 2400

gaggtgaaaa gtccgaagaa gctgctgaaa tcttgtccag ttaatagagc actaggtttt 2460

gataatttgg ttcttacagt ttatgtattt tgattcttcc ttttttagat actttttttt 2520

atattttatt attccttatt gatgtaacga cagtcccact ataattaact taaactttgc 2580

tgtaaatcag atgacaagtg tttccctgtt tgcaggggag ctc 2623

<210> 28

<211> 2713

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 28

gtgatttggc acttgacagc gcgagagtgg ttaacacctg gtttccctca tttgggttct 60

gacatttgat aagttgaaag aacaatgcag aattcacatg gctaatttgg cctcggttcc 120

acaacgcact cagcattaaa aaaaaaatac gcaatggcag ctcggtcgac gcagcagaag 180

cgccgacgta ccgtcgcgtt gccccgccca tgcctcgccg acccctccac cgccatcgtt 240

tgcccattgt ttgtggtagt gcgccgtgac acaaaaactt gtcctgtcac atgctgaagt 300

tacaccaaca taactactat gggattacgt aatcaaaaat ttcacagttt taacaaaaaa 360

aaaatcatac aatcaacatt gggacatctt gccctccccc acaaaacttg cttctgcatc 420

aatcatatat aaacatcatg aaataagcct aaactcactt cttttttttt catccttcct 480

acttcttctt tcatagtaac tacttttttt ttattaccac acttattcat tcataccacg 540

ctatcatgcc taccgaactt caaaaagaaa gagaactcac caagttcaac ccaaaggagt 600

tgaactactt cttggaaggt tcccaagaaa gatccgagat catcagcaac atggtcgaac 660

aaatgcaaaa agaccctatc ttgaaggtcg acgcttcata ctacaacttg accaaagacc 720

aacaaagaga agtcaccgcc aagaagattg ccagactctc cagatacttt gagcacgagt 780

acccagacca acaggcccag agattgtcga tcctcggtgt ctttgaccca caagtcttca 840

ccagaatcgg tgtcaacttg ggtttgtttg tttcctgtgt ccgtggtaac ggtaccaact 900

cccagttctt ctactggacc ataaataagg gtatcgacaa gttgagaggt atctatggtt 960

gttttggtat gactgagttg gcccacggtt ccaacgtcca aggtattgaa accaccgcca 1020

cttttgacga agacactgac gagtttgtca tcaacacccc acacattggt gccaccaagt 1080

ggtggatcgg tggtgctgcg cactccgcca cccactgctc cgtctacgcc agattgaagg 1140

tcaaaggaaa ggactacggt gtcaagacct ttgttgtccc attgagagac tccaaccacg 1200

acctcgagcc aggtgtgact gttggtgaca ttggtgccaa gatgggtaga gacggtatcg 1260

ataacggttg gatccagttc tccaacgtca gaatcccaag attctttatg ttgcaaaagt 1320

actgtaaggt ttcccgtctg ggtgaagtca ccatgccacc atctgaacaa ttgtcttact 1380

cggctttgat tggtggtaga gtcaccatga tgatggactc ctacagaatg accagtagat 1440

tcatcaccat tgccttgaga tacgccatcc acagaagaca attcaagaag aaggacaccg 1500

ataccattga aaccaagttg attgactacc cattgcatca aaagagattg ttcccattct 1560

tggctgccgc ttacttgttc tcccaaggtg ccttgtactt agaacaaacc atgaacgcaa 1620

ccaacgacaa gttggacgaa gctgtcagtg ctggtgaaaa ggaagccatt gacgctgcca 1680

ttgtcgaatc caagaaattg ttcgtcgctt ccggttgttt gaagtccacc tgtacctggt 1740

tgactgctga agccattgac gaagctcgtc aagcttgtgg tggtcacggt tactcgtctt 1800

acaacggttt cggtaaagcc tactccgact gggttgtcca atgtacctgg gaaggtgaca 1860

acaacatctt ggccatgaac gttgccaagc caatggttag agacttgttg aaggagccag 1920

aacaaaaggg attggttctc tccagcgttg ccgacttgga cgacccagcc aagttggtta 1980

aggctttcga ccacgccctt tccggcttgg ccagagacat tggtgctgtt gctgaagaca 2040

agggtttcga cattaccggt ccaagtttgg ttttggtttc caagttgaac gctcacagat 2100

tcttgattga cggtttcttc aagcgtatca ccccagaatg gtctgaagtc ttgagacctt 2160

tgggtttctt gtatgccgac tggatcttga ccaactttgg tgccaccttc ttgcagtacg 2220

gtatcattac cccagatgtc agcagaaaga tttcctccga gcacttccca gccttgtgtg 2280

ccaaggttag accaaacgtt gttggtttga ctgatggttt caacttgact gacatgatga 2340

ccaatgctgc tattggtaga tatgatggta acgtctacga acactacttc gaaactgtca 2400

aggctttgaa cccaccagaa aacaccaagg ctccatactc caaggctttg gaagacatgt 2460

tgaaccgtcc agaccttgaa gtcagagaaa gaggtgaaaa gtccgaagaa gctgctgaaa 2520

tcttgtccag ttaatagagc actaggtttt gataatttgg ttcttacagt ttatgtattt 2580

tgattcttcc ttttttagat actttttttt atattttatt attccttatt gatgtaacga 2640

cagtcccact ataattaact taaactttgc tgtaaatcag atgacaagtg tttccctgtt 2700

tgcaggggag ctc 2713

<210> 29

<211> 2712

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mutant POX gene

<400> 29

gtgatttggc acttgacagc gcgagagtgg ttaacacctg gtttccctca tttgggttct 60

gacatttgat aagttgaaag aacaatgcag aattcacatg gctaatttgg cctcggttcc 120

acaacgcact cagcattaaa aaaaaaatac gcaatggcag ctcggtcgac gcagcagaag 180

cgccgacgta ccgtcgcgtt gccccgccca tgcctcgccg acccctccac cgccatcgtt 240

tgcccattgt ttgtggtagt gcgccgtgac acaaaaactt gtcctgtcac atgctgaagt 300

tacaccaaca taactactat gggattacgt aatcaaaaat ttcacagttt taacaaaaaa 360

aaatcataca atcaacattg ggacatcttg ccctccccca caaaacttgc ttctgcatca 420

atcatatata aacatcatga aataagccta aactcacttc tttttttttc atccttccta 480

cttcttcttt catagtaact actttttttt tattaccaca cttattcatt cataccacgc 540

tatcatgcct accgaacttc aaaaagaaag agaactcacc aagttcaacc caaaggagtt 600

gaactacttc ttggaaggtt cccaagaaag atccgagatc atcagcaaca tggtcgaaca 660

aatgcaaaaa gaccctatct tgaaggtcga cgcttcatac tacaacttga ccaaagacca 720

acaaagagaa gtcaccgcca agaagattgc cagactctcc agatactttg agcacgagta 780

cccagaccaa caggcccaga gattgtcgat cctcggtgtc tttgacccac aagtcttcac 840

cagaatcggt gtcaacttgg gtttgtttgt ttcctgtgtc cgtggtaacg gtaccaactc 900

ccagttcttc tactggacca taaataaggg tatcgacaag ttgagaggta tctatggttg 960

ttttggtatg actgagttgg cccacggttc caacgtccaa ggtattgaaa ccaccgccac 1020

ttttgacgaa gacactgacg agtttgtcat caacacccca cacattggtg ccaccaagtg 1080

gtggatcggt ggtgctgcgc actccgccac ccactgctcc gtctacgcca gattgaaggt 1140

caaaggaaag gactacggtg tcaagacctt tgttgtccca ttgagagact ccaaccacga 1200

cctcgagcca ggtgtgactg ttggtgacat tggtgccaag atgggtagag acggtatcga 1260

taacggttgg atccagttct ccaacgtcag aatcccaaga ttctttatgt tgcaaaagta 1320

ctgtaaggtt tcccgtctgg gtgaagtcac catgccacca tctgaacaat tgtcttactc 1380

ggctttgatt ggtggtagag tcaccatgat gatggactcc tacagaatga ccagtagatt 1440

catcaccatt gccttgagat acgccatcca cagaagacaa ttcaagaaga aggacaccga 1500

taccattgaa accaagttga ttgactaccc attgcatcaa aagagattgt tcccattctt 1560

ggctgccgct tacttgttct cccaaggtgc cttgtactta gaacaaacca tgaacgcaac 1620

caacgacaag ttggacgaag ctgtcagtgc tggtgaaaag gaagccattg acgctgccat 1680

tgtcgaatcc aagaaattgt tcgtcgcttc cggttgtttg aagtccacct gtacctggtt 1740

gactgctgaa gccattgacg aagctcgtca agcttgtggt ggtcacggtt actcgtctta 1800

caacggtttc ggtaaagcct actccgactg ggttgtccaa tgtacctggg aaggtgacaa 1860

caacatcttg gccatgaacg ttgccaagcc aatggttaga gacttgttga aggagccaga 1920

acaaaaggga ttggttctct ccagcgttgc cgacttggac gacccagcca agttggttaa 1980

ggctttcgac cacgcccttt ccggcttggc cagagacatt ggtgctgttg ctgaagacaa 2040

gggtttcgac attaccggtc caagtttggt tttggtttcc aagttgaacg ctcacagatt 2100

cttgattgac ggtttcttca agcgtatcac cccagaatgg tctgaagtct tgagaccttt 2160

gggtttcttg tatgccgact ggatcttgac caactttggt gccaccttct tgcagtacgg 2220

tatcattacc ccagatgtca gcagaaagat ttcctccgag cacttcccag ccttgtgtgc 2280

caaggttaga ccaaacgttg ttggtttgac tgatggtttc aacttgactg acatgatgac 2340

caatgctgct attggtagat atgatggtaa cgtctacgaa cactacttcg aaactgtcaa 2400

ggctttgaac ccaccagaaa acaccaaggc tccatactcc aaggctttgg aagacatgtt 2460

gaaccgtcca gaccttgaag tcagagaaag aggtgaaaag tccgaagaag ctgctgaaat 2520

cttgtccagt taatagagca ctaggttttg ataatttggt tcttacagtt tatgtatttt 2580

gattcttcct tttttagata ctttttttta tattttatta ttccttattg atgtaacgac 2640

agtcccacta taattaactt aaactttgct gtaaatcaga tgacaagtgt ttccctgttt 2700

gcaggggagc tc 2712

Claims (41)

1.一种分离的突变的启动子，其

(i)相对于GenBank登录号M12161，以起始密码子ATG上游第一位碱基为-1计，具有碱基突变-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA，或者

(ii)相对于SEQ ID NO：25所示序列，具有碱基突变266_275AAAAAAAAAA>AAAAAAAAA，

其中所述分离的突变的启动子由SEQ ID NO：16或26所示序列组成。

2.一种分离的突变的POX基因，其相对于GenBank登录号M12161，以起始密码子ATG上游第一位碱基为-1计，在其启动子区域具有突变-182_-191AAAAAAAAAA＞AAAAAAAAA；所述突变的POX基因的序列如SEQ ID NO：27或29所示。

3.一种含有权利要求1所述突变的启动子或权利要求2所述的突变的POX基因的微生物，其相对于含有未突变的启动子或POX基因的微生物，其长链二元酸产物中低碳链长链二元酸杂酸含量降低，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的碳原子数量小于所述长链二元酸中的碳原子数量；其中所述微生物选自热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

4.一种产生长链二元酸的方法，包括培养权利要求3所述的微生物的步骤。

5.权利要求4所述的方法，还包括从培养产物分离和/或纯化长链二元酸的步骤。

6.权利要求4的方法，其中所述微生物发酵产生长链二元酸的过程中，发酵结束后的发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，且所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的质量比率在1.5％以下，所述质量比率为发酵液中低碳链长链二元酸杂酸杂质占长链二元酸的质量百分比。

7.权利要求4所述的方法，其中所述微生物发酵产生长链二元酸的过程结束后的发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，且相比于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵生产，所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降5％。

8.权利要求4所述的方法，其中长链二元酸产物中含有低含量的低碳链长链二元酸杂酸，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的含量大于0，且低于500ppm，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的碳原子数量小于所述长链二元酸中的碳原子数量。

9.权利要求8所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的含量低于400ppm。

10.权利要求8所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的含量低于300ppm。

11.权利要求8所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的含量低于250ppm。

12.权利要求8所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸的含量低于200ppm。

13.权利要求8所述的方法，其中当所述长链二元酸为十二碳二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸为十碳长链二元酸，所述十碳长链二元酸杂酸的含量低于350ppm。

14.权利要求13所述的方法，其中所述十碳长链二元酸杂酸的含量低于260ppm。

15.权利要求13所述的方法，其中所述十碳长链二元酸杂酸的含量低于210ppm。

16.权利要求4所述的方法，其中发酵结束后的发酵液中含有低碳链长链二元酸杂酸杂质，所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的质量比率在1.5％以下，其中所述质量比率为发酵液中低碳链长链二元酸杂酸占长链二元酸的质量百分比。

17.权利要求16所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的质量比率在1.0％以下。

18.权利要求16所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的质量比率在0.9％以下。

19.权利要求16所述的方法，其中当所述长链二元酸为十二碳二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸为十碳长链二元酸。

20.一种改造长链二元酸生产菌株的方法，包括定向进化长链二元酸合成途径的关键基因，其中改造后的菌株的发酵产物中低碳链长链二元酸杂酸含量相对于改造前的菌株得以降低；

其中，所述长链二元酸合成途径的关键基因是POX基因，并且改造后的菌株含有权利要求1所述突变的启动子或权利要求2所述的突变的POX基因，其中所述微生物选自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

21.权利要求20所述的方法，其中所述长链二元酸选自C9～C22长链二元酸。

22.权利要求20所述的方法，其中所述长链二元酸选自C9～C18长链二元酸。

23.权利要求20所述的方法，其中所述长链二元酸选自十碳二元酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。

24.权利要求20所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸为长度低于所述长链二元酸的二元酸杂酸。

25.权利要求20所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降5％。

26.权利要求20所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降10％。

27.权利要求20所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降20％。

28.权利要求20所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降40％。

29.权利要求20所述的方法，其中所述低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降50％或更低。

30.权利要求20所述的方法，其包括步骤：

1)通过易错PCR制备带有突变的目的基因片段；

2)制备同源重组所需的目的基因上下游片段作为同源重组的模板以及抗性标记基因；

3)通过PCR重叠延伸制备完整的重组片段；

4)利用同源重组将所述重组片段引入菌株；

5)利用抗性标记筛选阳性菌株；

6)筛选低碳链长链二元酸杂酸得以降低的菌株。

31.权利要求30所述的方法，其中所述抗性标记基因是潮霉素B。

32.权利要求30所述的方法，还包括7)筛选到的菌株进一步经过同源重组去除抗性筛选标记。

33.一种生产权利要求8-15任一项所限定的长链二元酸或权利要求16-19任一项所限定的发酵液的方法，包括通过定向进化长链二元酸合成途径的POX基因，获得含有突变的POX基因的长链二元酸生产微生物菌株，培养所述菌株发酵生产长链二元酸，其中定向进化后的菌株含有权利要求1所述突变的启动子或权利要求2所述的突变的POX基因，其中所述微生物选自热带假丝酵母或清酒假丝酵母。

34.权利要求33所述的方法，还包括从培养产物分离、提取和/或纯化长链二元酸的步骤。

35.权利要求33所述的方法，其中培养产物中低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降5％。

36.权利要求33所述的方法，其中培养产物中低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降10％。

37.权利要求33所述的方法，其中培养产物中低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降20％。

38.权利要求33所述的方法，其中培养产物中低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降40％。

39.权利要求33所述的方法，其中培养产物中低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量相对于采用含有未突变的启动子或POX基因的微生物发酵法生产的低碳链长链二元酸杂酸杂质的含量至少下降50％或更低。

40.权利要求33所述的方法，其中当所述长链二元酸为十二碳二元酸时，所述低碳链长链二元酸杂酸为十碳长链二元酸。

41.权利要求33-40任一项所述的方法，其中所述长链二元酸生产微生物菌株通过权利要求20-32任一项所述的方法获得。