CN104099321A - 抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备与纯化的方法，包括种子扩增培养、发酵培养、离心收集菌体、菌体裂解、收集上清真空抽滤、分子筛层析、亲和层析、离子层析、异丙醇沉淀和PBS溶解等步骤。采用本发明方法最后获得抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的发酵含量为150-200mg/L发酵液，纯化后超螺旋比例质粒含量达90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的大量生产与纯化方法。
背景技术
质粒DNA作为生物药剂(尤其作为基因治疗和基因疫苗的载体)的意义和需求越来越大，近年来，重组质粒用于基因治疗得到了广泛深入地研究，目前肿瘤基因治疗大多采用巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子，缺乏组织特异性。有研究者使用肿瘤特异性启动子替代CMV进行基因治疗研究，结果发现，肿瘤特异启动子的活性极低(一般仅为CMV启动子活性的1％左右)，其疗效有限。针对肿瘤特异性启动子活性低这一科学问题，中山大学附属肿瘤医院谢小明教授团队于2007年开发了肿瘤特异性启动子放大系统(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier,VISA)。VISA系统大大提高了转基因效率，并增加转基因总表达指数(Total ExpressionIndex,TEI)。经实验证实，VISA系统可平均增强肿瘤特异性启动子活性600-700倍，同时增加了TEI，延长表达时间3-4倍，明显提高了基因治疗的疗效，减少了给药次数和有效剂量。VISA系统已于2010年获得美国专利和商标局(USPTO)授予的发明专利权(US7723104B2)。以T-VISA-BikDD为基因治疗载体，与多个抑癌基因或促凋亡基因结合，在高特异性灭杀乳腺癌、前列腺癌及肺癌等体内外实验中均取得良好的效果。Bik(Bcl-2interacting killer)是Bcl-2家族成员，具有凋亡诱导活性，能有效地结合Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xl等凋亡抑制蛋白，发挥促凋亡作用。BikDD是突变型的BiK，比BiK的促凋亡作用更强。因而其可以更好地应用于肿瘤的基因治疗。
基因治疗已成为一些重大疾病的有效治疗策略，目前携带治疗基因的重组质粒已作为基因药物进入临床研究。与蛋白类的生物制品一样，对用于基因治疗的生物制品的生产与质量控制都有相当严格的要求。目前，国内外已有多家制药公司正在建立大规模符合药学规格的质粒DNA生产工艺，如批量发酵，纯化等规模化制备环节，以满足日益扩大的临床需求，但这些生产工艺中还存在一些难以克服的瓶颈，例如载体构建、发酵细菌质粒拷贝数、细胞裂解、纯化过程中细菌染色体DNA去除、细菌内毒素去除、终产品质量控制等。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的大量生产与纯化方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法，包括以下步骤：
a)用摇床或发酵罐进行含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的大肠杆菌种子扩增培养，获得种子液；
b)将a)中获得的种子液接入发酵罐进行发酵培养；发酵过程中，通过流加培养基的方式进行补料；
c)发酵结束后，离心收集菌体，用裂解溶液对收集的大肠杆菌菌体进行裂解；
d)裂解后进行离心，收集上清液，用0.45μm的砂芯漏斗进行真空抽滤，抽滤后所得液体用异丙醇沉淀进行浓缩，然后对浓缩液进行分子筛层析，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
e)利用亲和层析(例如PS柱层析)分离上述洗脱液，收集含超螺旋的质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
f)将e)中收集的洗脱液进行离子层析，收集含质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
g)将f)中收集的洗脱液用异丙醇沉淀，冰浴2h；4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀1次，4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀，挥干乙醇，加入适量PBS溶解沉淀，使质粒含量1mg/ml，4℃保存。
其中，所述抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。质粒T-VISA-BikDD是一种能在肺癌细胞中高效高特异表达靶基因的质粒，在临床治疗肺癌疾病中具有极大的潜在应用前景。
前述的方法，a)中进行种子扩增培养所采用的种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油25mL/L。
摇床培养条件为：37℃250rpm，培养8-9h至菌体OD值为0.8-1.2。
发酵罐培养条件为：37℃，pH值控制在6.8-7.0，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养至菌体OD值为0.8-1.2。
前述的方法，b)中进行发酵培养所采用的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油80ml/L。
发酵培养条件为：37℃，pH值控制在7.0-7.2，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养20-24h至菌体OD值为95±5。
补料过程中所流加的培养基包括两种，补料培养基I的配方为：胰蛋白胨33g/L、酵母提取物66g/L、甘油500ml/L；补料培养基II的配方为：磷酸氢二钠40g/L、磷酸二氢钾20g/L，谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸均为微量。
具体流加方式为：发酵开始后第2.5h按发酵液体积的3％流加补料培养基I，第3.5h按发酵液体积的4％流加补料培养基I，第4.5h按发酵液体积的5％流加补料培养基I，第5.5h按发酵液体积的6％流加补料培养基I，第6.5h按发酵液体积的7％流加补料培养基I，第7.5h按发酵液体积的8％流加补料培养基I，第8.5h按发酵液体积的8-12％流加补料培养基I；补料培养基II在发酵开始后第10h一次性加入，加入量为发酵液体积的0.5％。
前述的方法，c)中裂解的具体方法为：向50g离心收集的湿菌体中加入1L的P1缓冲液，混匀后静止10min，然后加入1L的P2缓冲液，混匀后静止4min，最后加入1L的P3缓冲液混匀，4℃静止10min。其中，
P1缓冲液为:50mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0
P2缓冲液为:200mM NaOH，1％SDS，现配现用
P3缓冲液为:3.0M醋酸钾，冰醋酸调pH5.5
前述的方法，d)中抽滤后所得液体用异丙醇沉淀质粒进行浓缩，并用B1缓冲液溶解沉淀，然后进行Sepharose6FF分子筛层析，上样量为柱体积的1/10，使用前用B1缓冲液平衡1个柱体积，上样完成后继续用B1缓冲液洗脱，收集含质粒T-VISA-BikDD的洗脱液。
B1缓冲液为：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
前述的方法，e)中具体方法为：向d)稀释收集的洗脱液中，上样到Plasmid Select亲和层析柱，上样量以填料处理量1mg质粒/1ml填料来计算，上样前用2倍柱体积的B3缓冲液平衡，上样完成后继续用2倍柱体积的B3缓冲液洗柱，然后用缓冲液B4洗脱，收集含质粒T-VISA-BikDD的洗脱液。
其中，B3缓冲液为：2M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.5。
B4缓冲液为：1.7M(NH4)2SO4，0.3M NaCl10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.5。
前述的方法，f)中具体方法为：向e)收集的洗脱液中加入2倍洗脱液体积的注射用水，上样到Source30Q阴离子层析柱，上样量为柱体积，使用前用2倍柱体积的B6缓冲液平衡，上样完成后继续用2倍柱体积的B6缓冲液洗柱，然后用B6缓冲液洗脱，收集质粒T-VISA-BikDD的洗脱液。
其中，B6缓冲液为：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
以上三个层析柱使用后均用0.5M NaOH溶液洗柱，再用注射用水洗至中性，其中Source30Q阴离子凝胶柱还需用2M NaCl溶液洗柱再生，最后用注射用水洗至中性。
前述的方法还包括对g)中制备的质粒溶液进行过滤除菌的步骤。例如，使用孔径为22μm的无菌滤膜过滤。
采用本发明方法后，质粒T-VISA-BikDD发酵的含量为150-200mg/L，经过提取纯化，质粒超螺旋比例达90％以上。
本发明具有以下优点：
(一)本发明通过对培养基成分筛选优化和发酵工艺摸索，最终确定适合抗肺癌质粒T-VISA-BikDD发酵生产的种子培养基、发酵培养基和补料培养基，以及相匹配的发酵培养工艺，使质粒含量稳定在150-200mg/L，发酵周期20-24h，菌体OD值为95±5。
(二)本方法采用三步色谱层析，去除宿主DNA、RNA、细菌蛋白和细菌内毒素，其中质粒超螺旋比例达90％以上，OD260/280为1.8-2.0之间。
(三)本方法的重复性及稳定性好，整个工艺过程可控性强。
附图说明
图1为本发明实施例1中肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
实施例1 抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法
包括以下步骤：
1、用摇床或发酵罐进行含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的大肠杆菌种子扩增培养，获得种子液。
将配好的种子培养基(配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油25mL/L)进行湿热灭菌(121℃，20min)，待培养基冷却，将菌种按培养基体积的0.1％接入种子培养基中进行培养。摇床培养条件为：37℃250rpm8-9h，菌体OD为0.8-1.2时即可接入发酵罐中进行发酵。种子罐培养条件为：37℃，用15％氨水将pH值控制在6.8-7.0，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0。菌体OD为0.8-1.2时即可接入发酵罐中进行发酵。
2、将步骤1中获得的种子液接入发酵罐进行发酵培养；发酵过程中，通过流加培养基的方式进行补料。
将发酵培养基(配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油80mL/L)、补料培养基I(配方为：胰蛋白胨33g/L、酵母提取物66g/L、甘油500ml/L、)和补料培养基II(配方为：磷酸氢二钠40g/L、磷酸二氢钾20g/L，谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸均为微量)湿热灭菌(121℃，20min)，其体积比为10:3:1。将扩增培养好的种子液按发酵培养基体积的10％无菌接入一灭好菌的发酵罐中进行培养。发酵培养条件为：用15％的氨水将pH值控制在7.0-7.2，溶氧搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养20-24h，菌体OD生长到95±5，质粒含量为150-200mg/L时，可放罐收菌。在培养过程中补料培养基I的流加按表1执行。补料培养基II在10h一次性加入到发酵罐中。
表1 发酵过程补料培养基I流加方案
| 发酵起始时间 | 补料起始时间 | 设定补料比例(％) | 备注 |
| 0 | － | － | |
| 2.5 | 0 | 3 | 开始补料 |
| 3.5 | 1 | 4 | |
| 4.5 | 2 | 5 | |
| 5.5 | 3 | 6 | |
| 6.5 | 4 | 7 | |
| 7.5 | 5 | 8 | |
| 8.5-24 | 6 | 8-12 |
3、发酵结束后，离心收集菌体，用裂解溶液对收集的大肠杆菌菌体进行裂解。
用高速管式离心机进行收集发酵菌体，离心速度为20,000rpm，进料速度为240ml/min。向50g离心收集的湿菌体中加入1L的P1缓冲液，混匀后静止10min，然后加入1L的P2缓冲液，混匀后静止4min，最后加入1L的P3缓冲液混匀，4℃静止10min。
P1缓冲液为:50mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0。
P2缓冲液为:200mM NaOH，1％SDS，现配现用。
P3缓冲液为:3.0M醋酸钾，冰醋酸调pH5.5。
4、裂解后进行离心，9000g，4℃进行离心20min，收集上清，去除絮状菌体蛋白。收集的上清液用0.45μm的砂芯漏斗进行真空抽滤。
抽滤后所得液体用异丙醇沉淀，离心浓缩质粒初提液，然后进行Sepharose6FF分子筛层析，上样量为柱体积的1/10，使用前用B1缓冲液平衡1个柱体积，上样完成后继续用B1缓冲液洗脱，收集含质粒T-VISA-BikDD的峰1洗脱液。
B1缓冲液为：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
5、亲和层析：利用PS柱层析分离上述洗脱液以去除非超螺旋的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD，将收集的峰1洗脱液进行稀释，然后上样到PlasmidSelect亲和层析柱，上样量以填料处理量1mg质粒/1ml填料来计算，上样前用2倍柱体积的B3缓冲液平衡，上样完成后继续用2倍柱体积的B3缓冲液洗柱，然后用缓冲液B4洗脱，收集含超螺旋的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱峰液体。
B2缓冲液为：3M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
B3缓冲液为：2M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
B4缓冲液为：1.7M(NH4)2SO4，0.3M NaCl10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.5。
6、离子柱层析：向步骤5中收集的洗脱峰液体中加入2倍洗脱峰液体体积的注射用水，上样到Source30Q阴离子层析柱，上样量为柱体积，使用前用2倍柱体积的B6缓冲液平衡，上样完成后继续用2倍柱体积的B6缓冲液洗柱，然后用B6缓冲液洗脱，含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱峰液体。
B6缓冲液为：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
7、步骤6收集的洗脱峰液体用洗脱峰液体体积0.7倍的异丙醇沉淀，冰浴2h；4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀1次，4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀，挥干乙醇，加入适量PBS溶解沉淀，使质粒含量1mg/ml，4℃保存。
8、上述制备的质粒溶液用孔径0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌。
以上三个层析柱使用后均用0.5M NaOH溶液洗柱，再用注射用水洗至中性，其中Source30Q阴离子凝胶柱还需用2M NaCl溶液洗柱再生，最后用注射用水洗至中性。
抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备工艺流程如图1所示。
表2 连续三批发酵制备的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 广州市军科泰特医药科技有限公司
<120> 抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7412
<212> DNA
<213> 抗肺癌质粒（T-VISA-BikDD）
<400> 1
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc gcggctcgta tgttgtgtgg 180
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccactag 240
tccgaggcct cgagatctat cgatgcatgc catggtaccc gggagctcga attcgaagct 300
tctgcagacg cgtcgacgga tccttatcga ttttaccaca tttgtagagg ttttacttgc 360
tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 420
tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 480
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 540
atcttatcat gtctgctcga agcggccggc cgccccgact ctagtcgagc ccgtaccgag 600
ctcgaattcc aggcggggag gcggcccaaa gggagatccg actcgtctga gggcgaaggc 660
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ccatgcattc caaagaatcg aagtcctcca tagggtccag gtcctcttca tcgtcatcca 1620
tgccaagaac ctccatggtc gggggttcca ggagctgctc atacaggagg gtctccatca 1680
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cgttactagt ggatctcgag acaccactcg acacggcacc agctcaatca gtcacagtgt 1800
aaaaaagggc caagtgcaga gcgagtatat ataggactgg ggatcctcta gagtcggagt 1860
actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 1920
gtcctccgag cggagtactg tcctccggac ctgcaggcat gcaagcttgt attctatagt 1980
gtcacctaaa tgagctcggt acctatcgat agagaaatgt tctggcacct gcacttgcac 2040
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ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 3660
agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 3720
tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 3780
ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 3840
gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 3900
tatcgccgga attcctgcag cccgggggat ccgccccccc gaccgatgtc agcctggggg 3960
acgagctcca cttagacggc gaggacgtgg cgatggcgca tgccgacgcg ctagacgatt 4020
tcgatctgga catgttgggg gacggggatt ccccgggtcc gagatccgcc cccccgaccg 4080
atgtcagcct gggggacgag ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg 4140
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tgacataatt ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt 4320
taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg tgtattttaa attcacagtc 4380
ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt catgatcata atcagccata 4440
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aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 4560
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 4620
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatcgcggcc gctctagaac 4680
tagtggatcg atccccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt 4740
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 4800
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4860
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 4920
cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta 4980
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccttagcg 5040
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 5100
gctctaaatc ggggtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 5160
tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ctctatctcg 5220
ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg tctattggtt aaaaaatgag 5280
ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg 5340
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 5400
acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 5460
gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 5520
agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatggg gggggggggg 5580
aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 5640
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 5700
ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 5760
ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga 5820
agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 5880
cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc 5940
attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag 6000
cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 6060
tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 6120
tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 6180
ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt 6240
tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 6300
ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 6360
accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 6420
ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 6480
tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta 6540
cgctgacttg acgggacggc gcaagctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 6600
ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 6660
gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 6720
ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 6780
aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 6840
gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 6900
gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 6960
aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 7020
cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 7080
tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 7140
ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 7200
atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 7260
cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 7320
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 7380
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga ag 7412
Claims (8)
1.抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)用摇床或发酵罐进行含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的大肠杆菌种子扩增培养，获得种子液；
b)将a)中获得的种子液接入发酵罐进行发酵培养；发酵过程中，通过流加培养基的方式进行补料；
c)发酵结束后，离心收集菌体，用裂解溶液对收集的大肠杆菌菌体进行裂解；
d)裂解后进行离心，收集上清液，用0.45μm的砂芯漏斗进行真空抽滤，抽滤后所得液体用异丙醇沉淀质粒进行浓缩，然后对浓缩液进行分子筛层析，去除浓缩液中的RNA杂质，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
e)利用亲和层析分离上述洗脱液，去除非超螺旋的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD，收集高超螺旋比例(90％以上)的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
f)将e)中收集的洗脱液进行离子层析，去除内毒素，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
g)将f)中收集的洗脱液用异丙醇沉淀，冰浴2h；4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀1次，4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀，挥干乙醇，加入适量PBS溶解沉淀，使质粒含量1mg/ml分装，4℃保存；
其中，所述抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)中进行种子扩增培养所采用的种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油25mL/L；
摇床培养条件为：37℃，250rpm，培养8-9h至菌体OD值为0.8-1.2；
发酵罐培养条件为：37℃，pH值控制在6.8-7.0，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养至菌体OD值为0.8-1.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b)中进行发酵培养所采用的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油80mL/L；
发酵培养条件为：37℃，pH值控制在7.0-7.2，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养20-24h至菌体OD值为95±5；
补料过程中所流加的培养基包括两种，补料培养基I的配方为：胰蛋白胨33g/L、酵母提取物66g/L、甘油500mL/L；补料培养基II的配方为：磷酸氢二钠40g/L、磷酸二氢钾20g/L，谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸均为微量；
具体流加方式为：发酵开始后第2.5h按发酵液体积的3％流加补料培养基I，第3.5h按发酵液体积的4％流加补料培养基I，第4.5h按发酵液体积的5％流加补料培养基I，第5.5h按发酵液体积的6％流加补料培养基I，第6.5h按发酵液体积的7％流加补料培养基I，第7.5h按发酵液体积的8％流加补料培养基I，第8.5h按发酵液体积的8-12％流加补料培养基I；补料培养基II在发酵开始后第10h一次性加入，加入量为发酵液体积的0.5％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，c)中裂解的具体方法为：向50g离心收集的湿菌体中加入1L的P1缓冲液，混匀后静止10min，然后加入1L的P2缓冲液，混匀后静止4min，最后加入1L的P3缓冲液混匀，4℃静止10min；
其中，P1缓冲液为:50mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0；
P2缓冲液为:200mM NaOH，1％SDS；
P3缓冲液为:3.0M醋酸钾，冰醋酸调pH5.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d)中抽滤后所得液体用中空纤维柱或300KD的膜包进行浓缩，浓缩至滤液体积的1/25，并用B1缓冲液透析所得浓缩液，透析后的溶液再用B1缓冲液定容至滤液体积的1/20，然后进行Sepharose 6FF分子筛层析，上样量为柱体积的1/10，使用前用B1缓冲液平衡1个柱体积，上样完成后继续用B1缓冲液洗脱，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
B1缓冲液为：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，e)中具体方法为：向d)收集的洗脱液中加入2倍洗脱液体积的B2缓冲液，上样到PlasmidSelect Xtra亲和层析柱，上样量以填料处理量1mg质粒/1ml填料来计算，上样前用2倍柱体积的B3缓冲液平衡，上样完成后继续用2倍柱体积的B3缓冲液洗柱，然后用缓冲液B4洗脱，收集含超螺旋92％以上的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
其中，B2缓冲液为：3M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.5；
B3缓冲液为：2M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5；
B4缓冲液为：1.7M(NH4)2SO4，0.3M NaCl10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH7.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，f)中具体方法为：向e)收集的洗脱液中加入2倍洗脱液体积的注射用水，上样到Source30Q阴离子层析柱，上样量为柱体积，使用前用2倍柱体积的B6缓冲液平衡，上样完成后继续用2倍柱体积的B6缓冲液洗柱，然后用B6缓冲液洗脱，含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；
其中，B6缓冲液为：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，还包括对g)中制备的质粒溶液进行过滤除菌的步骤。
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| CN108148831A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-12 | 南京驯鹿医疗技术有限公司 | 一种无内毒素质粒大量制备工艺 |
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2014
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Patent Citations (3)
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