CN106978443B - 一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑珠蛋白重组慢病毒载体，该载体的基因序列由修饰后的β‑珠蛋白基因全长、β‑珠蛋白基因调控区HS2‑HS3、β‑珠蛋白基因5’启动子、β‑珠蛋白基因3’增强子、染色质绝缘体CTCF和pSIN4‑CMV‑K2M质粒构成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述重组慢病毒载体在转染造血干/祖细胞获得正常功能β‑珠蛋白中的应用，实验证实利用该载体表达系统可实现慢病毒载体在红系细胞中特异高效稳定的表达，得到病毒滴度较高的假病毒颗粒，且在转染人造血干/祖细胞后得到正常功能的β‑珠蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组慢病毒载体及其应用，尤其涉及一种含有β珠蛋白基因及相关调控元件的重组慢病毒载体及其应用；属分子生物学技术领域。
背景技术
β珠蛋白基因位于第11号染色体短臂1区2带，总长度为60Kb，包括ε、
δ和β及两个假基因ψβ2和ψβ1，它们紧密连锁，其边接顺序为
每个β基因有两个非编码区(内含子)IVS-1和IVS-2，其长分别为130bp和850bp，它们分别插入到编码区(外显子)的相应于第30与31和104与105密码子的DNA序列之间，而编码区可编码β珠蛋白的146个氨基酸。
基因座控制区(locus control region，LCR)是β-珠蛋白基因表达调控中一个重要的顺式元件，长约20kb，具有增强子及开放染色质结构活性。当LCR与β-珠蛋白相连时，能介导与整合位点无关的红系组织特异性高效表达，而表达量仅与拷贝数有关。人β-LCR由6个DNA酶I高敏的位点(HS)组成，其中位于β-珠蛋白基因的5’端的为HS1～5，近端的4个具有红系特异性，其中HS2、HS3具有较强的增强子功能，是LCR活性的重要组成部分。对LCR的HSs结构进行分析，发现其位点中均含有GATA-1、AP-1/NF-E2以及CACCC等结合基序，每个HS中结合基序数目及空间排列并不完全相同。用重组DNA及转基因鼠技术检测大片段140kb，单个5'-HSs位点缺失如5'-HS3缺失可使ε基因的表达减少，而γ表达增加；缺失5'-HS2则影响较小。LCR复合物的形成也不需要所有5'-HSs位点，5'-HS5和5'-HS1在短暂表达系统、稳定表达系统以及转基因动物中均无增强子活性；而整个LCR以及5'-HS2～4则具有增强子活性。另外珠蛋白基因的表达调控不仅需要LCR的作用，还需要如启动子、内含子及3’端增强子等近侧顺式元件的参与。
典型的β-珠蛋白基因启动子区含有三个保守盒的基序，它们是位于帽位上游约-30bp处的TATA盒，又称Hogness-Goldberg序列；位于-70～-90bp处的CCAAT盒以及-95～-120bp处的CACCC盒对β-珠蛋白基因的时空表达具有重要作用，这些保守盒序列中若发生突变将影响基因的正常转录，导致β-地中海贫血(β-地贫)。因此，最短的β-启动子必须达到103bp，才可在LCR的诱导下发挥启动子的作用，但在病毒载体构建时想要得到β-珠蛋白基因的高表达一般会选择尽量长的启动子，这是因为在远侧启动子中有许多公共转录因子的结合位点，他们通过蛋白间或蛋白与DNA之间的互作关系，调控β-珠蛋白基因的表达。关于β-珠蛋白基因的增强子，研究者已发现并确定了2个增强子，一个是β-珠蛋白基因内含子IVS-2中富含AT基序的372bp的片段，该片段属于基质结合区域；另一个是位于β-珠蛋白基因3’侧翼序列1.5kb内，距离β-珠蛋白基因ployA位点下游550-800bp处。通过复杂的酶切序列分析发现，在δ和β珠蛋白基因间的冗长序列中也存在有复杂的顺式作用元件调控区或网络。
由于特定基因的顺式作用元件结构在机体不同细胞内几乎完全相同，单纯用顺式作用元件不能解释基因表达的组织特异性和发育阶段特异性等特征，即顺式作用元件本身单独并不能调控基因的表达，它需要与反式作用因子等相互作用，并与其它顺式作用元件协同配合才可能发挥其调控基因表达的作用。
研究表明，完整的反式作用因子一般包含两个重要的功能结构域：DNA结合结构域和转录活化结构域，它们是其发挥转录调控功能的必需结构。按照作用机制可将β-珠蛋白的反式作用因子分为3类：通用转录因子、红系特异性反式作用因子及发育阶段特异性反式作用因子。通用转录因子可与启动子的保守域相结合；红系特异性反式作用因子不仅能反式激活携带其结合位点的报告基因，还与其他蛋白因子协同作用，介导LCR与单个基因发生联系，有研究证明红系核因子2(nuclearfactor-erythroid 2，NFE 2)能与LCR中的HS2位点结合，从而介导HS2的增强子活性；发育阶段特异性因子可以在不同阶段与特定的启动子结合，调控基因在不同阶段进行表达。
随着分子生物学和分子遗传学理论和技术的迅速发展，β-珠蛋白基因簇的表达调控机制已基本清楚，如何建立高效的β-珠蛋白表达体系是目前研究的热点。通过检索发现：目前还未见有关利用pSIN慢病毒载体装载β-珠蛋白及其相关的调控元件并在体外高效稳定表达的重组慢病毒载体的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用。
本发明所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述载体的基因序列由修饰后的β-珠蛋白基因全长、β-珠蛋白基因调控区HS2-HS3、β-珠蛋白基因5’启动子、β-珠蛋白基因3’增强子、染色质绝缘体CTCF和pSIN4-CMV-K2M质粒构成，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
上述的β-珠蛋白重组慢病毒载体中：所述修饰后β-珠蛋白基因全长是一段2.9kb的β-珠蛋白基因序列，该β-珠蛋白基因序列5’-3’分别包含一段1671kb的启动子，三段β-珠蛋白基因外显子(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)、两段β-珠蛋白基因内含子(IVS-1，130bp和IVS-2，476bp)和一段132bp的3’尾随序列。上述的HS2-HS3基因序列为β-珠蛋白基因座控制区，长度为2.1kb。
上述的β-珠蛋白重组慢病毒载体中：所述β-珠蛋白基因5’启动子优选是选择包含ATAAAA序列的TATA盒、GGCCAATCT序列的CCAAT元件、CACCC元件和远端多种公共转录因子结合域，其碱基长度1671kb，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；其中，β-珠蛋白基因5’启动子上游特异性引物是5’-GGGTACCCCGCTCCAGATAGCCATAGAAG-3’，其特异性酶切位点为KpnI；β-珠蛋白基因5’启动子下游特异性引物是5’-CTGCAGAAGCAATAGATGGCTCTGCCC-3’，其特异性酶切位点为PstI。
上述的β-珠蛋白重组慢病毒载体中：所述修饰后β-珠蛋白基因全长优选是选择内含子IVS-2删除一段374bp的RsaI/RsaI(GT^AC，CA^TG)片段，该片段含有A/T丰富区和3个反向的poly A信号区，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；其中，内含子IVS-2上游特异性引物是5’-AAGCTTGTGAGTCTATGGGACGCTT-3’，其特异性酶切位点为HindIII；内含子IVS-2下游特异性引物是5’-CCCGGGCTGTGGGAGGAAGATAAGAG-3’，其特异性酶切位点为AvaI。
上述的β-珠蛋白重组慢病毒载体中：所述β-珠蛋白基因3’增强子优选是选择β-珠蛋白基因ploy A位点下游，碱基长度为418bp的序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，β-珠蛋白基因3’增强子上游特异性引物是5’-GATATCAATGATG TATTTAAATTATTTCTG-3’，其特异性酶切位点为EcoRV；β-珠蛋白基因3’增强子下游特异性引物是5’-CCATGGGAAACCATCTCGCCGTA-3’，其特异性酶切位点为NcoI。
上述的β-珠蛋白重组慢病毒载体中：所述染色质绝缘体CTCF为转录因子结合域，阻断增强子活性，可被病毒载体有效容纳，并且不影响病毒滴度，其优选是选择碱基长度为266bp的序列，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；其中，染色质绝缘体CTCF上游特异性引物是5’-CCATGGAGAGCGAGATTCCGTCTCAA-3’，其特异性酶切位点为NcoI；染色质绝缘体CTCF下游特异性引物是5’-ACTAGTACAATGGCTGGCCCATAGTA-3’，其特异性酶切位点为SpeI。
上述的β-珠蛋白重组慢病毒载体中：所述的pSIN4-CMV-K2M的质粒的构建方法参见Nethercott H E,Brick D J,Schwartz P H.Derivation of induced pluripotentstem cells by lentiviral transduction[J].Human Pluripotent Stem Cells:Methodsand Protocols,2011:67-85，长度为8945bp。
本发明所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体在转染造血干/祖细胞获得正常功能β-珠蛋白中的应用。
本发明所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体在与特定的包装质粒和包膜质粒共转染HEK293T细胞获得较高滴度的假病毒颗粒中的应用。
本发明公开了一种含有β珠蛋白基因及相关调控元件的重组慢病毒载体，利用其可方便的得到病毒滴度较高的假病毒颗粒，并在人造血干/祖细胞中正常表达。
具体的，上述载体的使用方法是：
(1)提取正常人外周血标本5ml置含有ACD抗凝剂的离心管中，设计特异性引物，使用Chelex-100法提取总DNA，使用特异引物进行LA-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离后，回收纯化DNA片段，得到所需序列。
(2)将得到的DNA序列按照一定的顺序，使用酶切位点连接，构建得到重组慢病毒载体。将重组慢病毒载体与psPAX2包装质粒和pMD2G包装质粒按照比例混合，共转染HEK293T细胞，得到较高的慢病毒滴度的假病毒颗粒。
本发明提供的β-珠蛋白重组慢病毒载体，是以慢病毒质粒pSIN4-CMV-K2M为基础，通过插入β-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因的启动子、β-珠蛋白基因座控制区HS2和HS3，β-珠蛋白增强子，染色体绝缘子等作用元件构建红系细胞中特异高效稳定的表达系统；利用该表达系统可实现慢病毒载体在红系细胞中特异高效稳定的表达，得到病毒滴度较高的假病毒颗粒，且在转染人造血干/祖细胞后得到正常功能的β-珠蛋白。
附图说明
图1为慢病毒表达质粒和包装质粒图谱。
其中：
A.pSIN4-CMV-HBB慢病毒表达质粒图谱；
B.pSIN 4-CMV-GFP慢病毒表达质粒图谱；
C.psPAX2包装质粒图谱；
D.pMD2G包装质粒图谱。
图2为慢病毒颗粒感染造血干细胞后提取HBB基因琼脂糖凝胶电泳。
其中：
1泳道为HBB基因；
M泳道为Marker。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但列举内容并不限制本发明。
下述实施例所涉及的各种限制性内切酶均购买于New England Biolab公司；血液DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒、RNA提取试剂盒和反转录试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，操作完全按照相应说明书进行；LA-PCR试剂盒为Takara公司产品；大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司；GFP绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N3来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；质粒构建中基因测序和引物合成由华大基因公司完成。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
实施例中所采用的分子生物学技术可参见《分子克隆实验指南》。
实施例中所述LB液体培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。灭菌后使用。
实施例1：特异性β-珠蛋白基因启动子序列的获取
1.使用含抗凝剂的抗凝管采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.根据现有的使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-GGGTACCCCGCTCCAGATAGCCATAGAAG-3’
KpnI
下游引物5’-CTGCAGAAGCAATAGATGGCTCTGCCC-3’
PstI
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
表1
4.使用LightCycler 96PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性10s，63℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.将PCR产物连接到pGEM-T载体(购自全式金生物技术有限公司)进行测序验证，结果如SEQ ID No.2所示。
实施例2：β-珠蛋白基因外显子Ⅰ，内含子IVS-1和外显子Ⅱ序列的获取
1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-CTGCAGACATTTGCTTCTGACACA-3’
PstI
下游引物5’-AAGCTTCCTGAAGTTCTCAGGATC-3’
HindIII
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.将PCR产物连接到pGEM-T载体进行测序。
实施例3：β-珠蛋白基因内含子IVS-2序列的获取
1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-AAGCTTGTGAGTCTATGGGACGCTT-3’
HindIII
下游引物5’-CCCGGGCTGTGGGAGGAAGATAAGAG-3’
AvaI
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.使用RsaI/RsaI(GT^AC，CA^TG)酶切，得到三段DNA片段，分别为86bp，374bp和390bp。
7.使用1％琼脂糖凝胶电泳分别将86bp和390bp的片段切下，并重新连接。
8.将连接产物连接到pGEM-T载体进行测序，结果如SEQ ID No.3所示。
实施例4：β-珠蛋白基因外显子Ⅲ和3’端尾随序列的获取
1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-CCCGGGCTCCTGGGCAACGTGCT-3’
AvaI
下游引物5’-GATATCGCAATGAAAATAAATGTTTTTT-3’
EcoRV
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.将PCR产物连接到pGEM-T载体进行测序。
实施例5：β-珠蛋白基因3’增强子序列的获取
1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-GATATCAATGATGTATTTAAATTATTTCTG-3’
EcoRV
下游引物5’-CCATGGGAAACCATCTCGCCGTA-3’
NcoI
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.将PCR产物连接到pGEM-T载体进行测序，结果如SEQ ID No.4所示。
实施例6：β-珠蛋白基因座控制区HS2-HS3基因序列的获取
1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-GCTGCCCTGTTAGAGTTCTGGCACT-3’
NheI
下游引物5’-GGGGTACCCCAGCTGGTTAGAAGGTTCTA-3’
KpnI
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.将PCR产物连接到pGEM-T载体进行测序。
实施例7：染色质绝缘体CTCF基因序列的获取
1.采集正常人外周血，使用Chelex-100法提取总DNA(参见血液DNA提取试剂盒说明书)。
2.使用Primer Premier 5软件设计特异性引物如下：
上游引物5’-CCATGGAGAGCGAGATTCCGTCTCAA-3’
NcoI
下游引物5’-ACTAGTACAATGGCTGGCCCATAGTA-3’
SpeI
3.按照表1的反应体系进行PCR扩增。
4.Bio-Rad C1000PCR仪(Bio-Rad，美国)进行PCR反应，反应体系为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火10min，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃复性10min，4℃结束反应。
5.使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收(参见琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒说明书)。
6.将PCR产物连接到pGEM-T载体进行测序验证，结果如SEQ ID No.5所示。
实施例8：pSIN4-CMV-HBB慢病毒表达质粒的构建
1.经NhelI和SpeI双酶切pSIN4-CMV-K2M，切除Klf4、IRES2和Myc三个基因，回收慢病毒表达质粒并使其线性，按照下表进行37℃酶切反应2h，酶切反应体系如下：纯化的DNA质粒(1μg/μl)2μl，10×Buffer 5μl，100×BSA 0.5μl，SpeI(10U/μl)1μl，NhelI(10U/μl)1μl，ddH2O 40.5μl。
2.将含有NhelI、KpnⅠ、PstⅠ、HindⅢ、AvaⅠ、EcoR V、NcoⅠ和SpeI等酶切位点的多克隆位点MCS与线性慢病毒载体进行连接，反应体系如下：线性化的慢病毒载体pSIN100ng/μl1μl，T4DNA Ligase Buffer(2×)5μl，多克隆位点MCS片段100ng/μl 1μl，10×T4噬菌体DNA连接酶1μl，dd H2O 2μl；4℃连接过夜。
3.转化，取200μl转移至无菌离心管中，加2μl连接液，混匀，冰上放置30min；42℃恒温水浴加热90s，然后迅速置于冰上冷激2min；将连接转化的混合物加入到500μl无抗生素LB液体培养基中，180rpm，37℃孵育50min，使细菌恢复活力；取200μL菌液均匀地涂抹在含Amp的LB固体培养基平板上，37℃条件下培养过夜。
4.阳性克隆的鉴定及DNA测序
(1)阳性克隆筛选用枪头挑取平板上的白色单克隆菌落，分别接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养5-10小时。
(2)菌液PCR鉴定以菌液为模板，HBB基因全长克隆引物进行10μl体系进行普通PCR鉴定，10μl反应体系：菌液1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)1μl，dNTP Mixture(各2.5mM)0.5μl，TaKaRa LA Taq 0.1μl，ddH2O 6.4μl。
(3)PCR反应反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共33个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，选出阳性克隆。
(4)挑选阳性克隆菌落，使用质粒抽提试剂盒提取质粒(参见质粒提取试剂盒说明书)，进行DNA测序；获得pSIN4-CMV-MCS慢病毒质粒。
5.使用NhelI和KpnⅠ双酶切将pSIN4-CMV-MCS线性化，插入基因片段HS2-HS3，并连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3慢病毒质粒。
6.使用KpnⅠ和PstI双酶切pSIN4-CMV-HS2-HS3质粒使其线性化，将β-珠蛋白基因启动子序列与之连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter慢病毒质粒。
7.使用PstI和HindⅢ双酶切pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter质粒使其线性化，将β-珠蛋白基因外显子Ⅰ，内含子IVS-1和外显子Ⅱ序列与之连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI慢病毒质粒。
8.使用HindⅢ和AvaI双酶切pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI质粒使其线性化，将β-珠蛋白基因内含子IVS-2序列与之连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI-IVS2慢病毒质粒。
9.使用AvaI和EcoR V双酶切pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI-IVS2质粒使其线性化，将β-珠蛋白基因外显子Ⅲ和3’端尾随序列与之连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI-IVS2-HBBⅢ慢病毒质粒。
10.使用EcoR V和NcoI双酶切pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI-IVS2-HBBⅢ质粒使其线性化，将β-珠蛋白基因增强子序列与之连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI-IVS2-HBBⅢ-3’enhancer慢病毒质粒。
11.使用NcoI和SpeI双酶切pSIN4-CMV-HS2-HS3-βpromoter-HBBI-IVS2-HBBⅢ-3’enhancer质粒使其线性化，将染色质绝缘子CTCF与之连接转化，筛选阳性克隆得到pSIN4-CMV-HS2-HS3-HBB-CTCF慢病毒质粒，即本发明所述β-珠蛋白重组慢病毒载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例9：对照质粒pSIN4-CMV-GFP慢病毒表达质粒的构建
1.获取根据NCBI检索的GFP基因序列，检索序列号为NC_011521.1，设计特异性引物获取GFP基因全长。
2.使用Primer Premier 5软件设计GFP基因特异性引物如下：
GFP基因上游引物：5’-GCTAGCGGACTAGTTGAGTAAAGG-3’
NheI
GFP基因下游引物：5’-ACTAGTTTGCGGCCGCTTATTTGTA-3’
SpeI
3.以质粒pEGFP-N3为模板，克隆GFP基因全长，通过琼脂糖凝胶电泳回收GFP基因片段。
4.使用NheI和SpeI对GFP基因片段进行酶切，37℃酶切2h，酶切反应体系如下：GFP基因片段15μl，10×Buffer 5μl，NheI(10U/μl)限制性内切酶1μl，SpeI(10U/μl)限制性内切酶1μl，ddH2O 28μl。
5.经NheI和SpeI双酶切回收pSIN4-CMV慢病毒表达质粒并使其线性，按照下表进行37℃酶切反应2h，酶切反应体系如下：纯化的DNA质粒(1μg/μl)2μl，10×Buffer 5μl，100×BSA0.5μl，SpeI(10U/μl)1μl，NheI(10U/μl)1μl，ddH2O 40.5μl。
6.获得重组质粒
(1)连接，反应体系为：线性化的慢病毒载体pSIN4 100ng/μl 1μl，双酶切得到GFP基因片段100ng/μl 1μl，10×T4噬菌体DNA连接酶2μl，dd H2O 16μl，4℃连接过夜。
(2)转化，取200μl转移至离心管中，加2μl连接液，混匀，冰上放置30min；42℃恒温水浴加热90s，然后迅速置于冰上冷激2min；将连接转化的混合物加入到500μL无抗生素LB液体培养基中，180rpm，37℃孵育50min，使细菌恢复活力；取200μL菌液均匀地涂抹在含Amp的LB固体培养基平板上，37℃条件下培养过夜。
7.阳性克隆的鉴定及DNA测序
(1)阳性克隆筛选用枪头挑取平板上的白色单克隆菌落，分别接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养5-10小时。
(2)菌液PCR鉴定以菌液为模板，GFP基因全长克隆引物进行10μl体系进行普通PCR鉴定，10μl反应体系：菌液1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)1μl，dNTP Mixture(各2.5mM)0.5μl，TaKaRa LA Taq 0.1μl，ddH2O 6.4μl。
(3)PCR反应反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共33个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，选出阳性克隆。
(4)挑选阳性克隆菌落，使用质粒抽提试剂盒提取质粒(参见质粒提取试剂盒说明书)。
获得pSIN4-CMV-GFP慢病毒表达质粒。
实施例10：β-珠蛋白基因重组慢病毒的包装
将pSIN4-CMV-HBB或pSIN4-CMV-GFP与特定的psPAX2包装质粒、pMD2G包装质粒共转染HEK293T细胞，得到假病毒颗粒。
1.HEK293T细胞的预培养：计数8×106个HEK293T细胞(购自美国ATCC公司)接种到10cm细胞培养盘中，加入10ml新鲜的1640培养基(购自美国Hyclone公司)，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，进行全换液，加入5ml 1640培养基，待用。
2.转染
(1)按照以下试剂的顺序和体积分别添加到50ml离心管中，灭菌水3.6ml，pSIN4-CMV-HBB慢病毒表达质粒或pSIN4-CMV-GFP慢病毒表达质粒12μl，psPAX2包装质粒9μl，pMD2G包装质粒3μl；CaCl2溶液147μl，快速摇匀，约10s；
(2)分别加入2×HBS 1250μl，快速摇匀30s，静置2min 30s；
(3)加入1640培养基2.5ml，充分吹打混匀；
(4)将混合液逐滴均匀地分别加入已换液的HEK 293T细胞中，混匀，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
3.培养12-15h后细胞全换液，放回37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养；
4.继续培养细胞36h后，荧光显微镜下观察细胞形态与转染情况，沿培养皿侧壁将病毒上清液吸出至50ml离心管中；
5.使用0.45μm的过滤注射器将收集的病毒上清过滤至病毒收集管中；
6.向病毒收集管中加满1640培养基至病毒管口；
7.50000rpm/min，4℃，离心2.5h；
8.去上清，使用100μl 4℃预冷的PBS重悬病毒，分装，-80℃保存。
实施例11：慢病毒滴度的测定
1.准备96孔板一个，每孔接种2×104个细胞。
2.准备8个1.5ml离心管，编号1～8，每管加入297μl 1640完全培养液，向1号离心管中加入33μl病毒原液，混匀后，吸取30μl加入2号管中混匀，以此类推进行梯度稀释，共做8个梯度浓度，分别是10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。
3.弃去96孔板中原有的培养液，加入不同浓度的病毒液，每个浓度重复三个孔，每孔加入病毒液100μl，同时每孔加入2μl浓度为0.5mg/ml聚凝胺(polybrene)。
7.5d后，吸上清，收集细胞，流式检测GFP％。
8.以流式检测GFP％最接近1的稀释倍数进行计算，用下列公式计算病毒感染滴度：
病毒感染滴度(TU/ml)＝[(2×104细胞/孔)×GFP％]/(病毒液体积×稀释倍数)。
9.测得的慢病毒颗粒的滴度为5.6×108TU/ml，属于病毒滴度的较高水平。
实施例12：β-珠蛋白重组慢病毒在造血干细胞中的表达
1.复苏冻存的重症β-地中海贫血患者外周血单个核细胞，37℃迅速融化，将细胞从冻存管中转移到15ml离心管中，加F12培养基定容至8ml。离心，300g，3min。
3.弃掉上清液，加入1mlFACS冲洗液，重悬细胞，混匀后用70μm细胞筛网过滤到新15ml离心管中。
4.细胞计数。再次离心，500g，10min。弃上清，按照计数的细胞数，每1×108个细胞用300μl培养基重悬细胞，进行CD34细胞免疫磁珠分选(按照美天旎免疫磁珠分选试剂盒说明书操作)。
5.吸100μl细胞，避光加入1μl CD34抗体，4℃，30min。流式检测CD34+细胞的百分比。
10.弃上清，加入X-VIVO 20培养基(购自瑞士Lonza公司)重悬细胞，加入SCF，Flt-3L，IL-3，TPO，PS等因子，充分混匀后将细胞接种到12孔培养板中每孔2ml。
11.细胞全换液后，每孔添加32μl polybrene(聚凝胺)，混匀后静置1～3min。
12.向细胞中每孔加入18μl实施例10中的病毒液，混合均匀。
13.37℃条件下，培养24h后换液。
14.培养48小时后收集细胞，离心，并用新鲜的X-VIVO 20培养基重悬收获。
15.去上清，加入200μl TRIZOL裂解细胞。
16.提取DNA并通过凝胶电泳鉴定(参见DNA提取试剂盒说明书)(如图2)。
序列表
<110>广东铱科基因生物科技有限公司
<120>一种β-珠蛋白重组慢病毒载体及其应用
<141> 2017-5-2
<160> 5
<210> 1
<211> 11183
<212> DNA
<213>人工序列
<221>β-珠蛋白重组慢病毒载体
<222>（1）…（11183）
<400> 1
cggaccgcca ctgccaatta cctgtggttt catttactct aaacctgtga ttcctctgaa 60
ttattttcat tttaaagaaa ttgtatttgt taaatatgta ctacaaactt agtagttgga 120
agggctaatt cactcccaaa gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca 180
aggctacttc cctgattagc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac 240
ctttggatgg tgctacaagc tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa 300
aggagagaac accagcttgt tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag 360
agaagtgtta gagtggaggt ttgacagccg cctagcattt catcacgtgg cccgagagct 420
gcatccggag tacttcaaga actgctgata tcgagcttgc tacaagggac tttccgctgg 480
ggactttcca gggaggcgtg gcctgggcgg gactggggag tggcgagccc tcagatcctg 540
catataagca gctgcttttt gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 600
gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 660
tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 720
ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa 780
agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag 840
aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga 900
gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa 960
aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 1020
cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag 1080
acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt 1140
atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 1200
ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaccaccg cacagcaagc 1260
ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat 1320
ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa 1380
gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg 1440
gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat 1500
tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc 1560
atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg 1620
aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt 1680
gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga 1740
atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact 1800
ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag 1860
ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat 1920
tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta 1980
tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc 2040
cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca 2100
gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgcca caaatggcag tattcatcca 2160
caattttaaa agaaaggggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 2220
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt 2280
tcgggtttat tacagggaca gcagagatcc actttggatt aatagtaatc aattacgggg 2340
tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 2400
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 2460
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 2520
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 2580
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 2640
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 2700
aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 2760
aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 2820
gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 2880
ggtttagtga accgtcagat ccgctagcgc tgccctgtta gagttctggc acttgtcact 2940
atgcctatta tttaacaaat gcatgaatgc ttcagaatat gggaatatta tcttctggaa 3000
tagggaatca agttatatta tgtaacccag gattagaaga ttcttctgtg tgtaagaatt 3060
tcataaacat taagctgtct agcaaaagca agggcttgga aaatctgtga gctcctcacc 3120
atatagaaag cttttaaccc atcattgaat aaatccctat aggggatttc taccctgagc 3180
aaaaggctgg tcttgattaa ttcccaaact catatagctc tgagaaagtc tatgctgtta 3240
acgttttctt gtctgctacc ccatcatatg cacaacaata aatgcaggcc taggcatgac 3300
tgaaggctct ctcataattc ttggttgcat gaatcagatt atcaacagaa atgttgagac 3360
aaactatggg gaagcagggt atgaaagagc tctgaatgaa atggaaaccg caatgcttcc 3420
tgcccattca gggctccagc atgtagaaat ctggggcttt gtgaagactg gcttaaaatc 3480
agaagcccca ttggataaga gtagggaaga acctagagcc tacgctgagc aggtttcctt 3540
catgtgacag ggagcctcct gccccgaact tccagggatc ctctcttaag tgtttcctgc 3600
tggaatctcc tcacttctat ctggaaatgg tttctccaca gtccagcccc tggctagttg 3660
aaagagttac ccatgcagag gccctcctag catccagaga ctagtgctta gattcctact 3720
ttcagcgttg gacaacctgg atccacttgc ccagtgttct tccttagttc ctaccttcga 3780
ccttgatcct cctttatctt cctgaaccct gctgagatga tctatgtggg gagaatggct 3840
tctttgagaa acatcttctt cgttagtggc ctgcccctca ttcccacttt aatatccaga 3900
atcactataa gaagaatata ataagaggaa taactcttat tataggtaag ggaaaattaa 3960
gaggcatacg tgatgggatg agtaagagag gagagggaag gattaatgga cgataaaatc 4020
tactactatt tgttgagacc ttttatagtc taatcaattt tgctattgtt ttccatcctc 4080
acgctaactc cataaaaaaa cactattatt atctttattt tgccatgaca agactgagct 4140
cagaagagtc aagcatttgc ctaaggtcgg acatgtcaga ggcagtgcca gacctatgtg 4200
agactctgca gctactgctc atgggccctg tgctgcactg atgaggagga tcagatggat 4260
ggggcaatga agcaaaggaa tcattctgtg gataaaggag acagccatga agaagtctat 4320
gactgtaaat ttgggagcag gagtctctaa ggacttggat ttcaaggaat tttgactcag 4380
caaacacaag accctcacgg tgactttgcg agctggtgtg ccagatgtgt ctatcagagg 4440
ttccagggag ggtggggtgg ggtcagggct ggccaccagc tatcagggcc cagatgggtt 4500
ataggctggc aggctcagat aggtggttag gtcaggttgg tggtgctggg tggagtccat 4560
gactcccagg agccaggaga gatagaccat gagtagaggg cagacatggg aaaggtgggg 4620
gaggcacagc atagcagcat ttttcattct actactacat gggactgctc ccctataccc 4680
ccagctaggg gcaagtgcct tgactcctat gttttcagga tcatcatcta taaagtaaga 4740
gtaataattg tgtctatctc atagggttat tatgaggatc aaaggagatg cacactctct 4800
ggaccagtgg cctaacagtt caggacagag ctatgggctt cctatgtatg ggtcagtggt 4860
ctcaatgtag caggcaagtt ccagaagata gcatcaacca ctgttagaga tatactgcca 4920
gtctcagagc ctgatgttaa tttagcaatg ggctgggacc ctcctccagt agaaccttct 4980
aaccagctgg gtaccccgct ccagatagcc atagaagaac caaacacttt ctgcgtgtgt 5040
gagaataatc agagtgagat tttttcacaa gtacctgatg agggttgaga caggtagaaa 5100
aagtgagaga tctctattta tttagcaata atagagaaag catttaagag aataaagcaa 5160
tggaaataag aaatttgtaa atttccttct gataactaga aatagaggat ccagtttctt 5220
ttggttaacc taaattttat ttcattttat tgttttattt tattttattt tattttattt 5280
tgtgtaatcg tagtttcaga gtgttagagc tgaaaggaag aagtaggaga aacatgcaaa 5340
gtaaaagtat aacactttcc ttactaaacc gacatgggtt tccaggtagg ggcaggattc 5400
aggatgactg acagggccct tagggaacac tgagacccta cgctgacctc ataaatgctt 5460
gctacctttg ctgttttaat tacatctttt aatagcagga agcagaactc tgcacttcaa 5520
aagtttttcc tcacctgagg agttaattta gtacaagggg aaaaagtaca gggggatggg 5580
agaaaggcga tcacgttggg aagctataga gaaagaagag taaattttag taaaggaggt 5640
ttaaacaaac aaaatataaa gagaaatagg aacttgaatc aaggaaatga ttttaaaacg 5700
cagtattctt agtggactag aggaaaaaaa taatctgagc caagtagaag accttttccc 5760
ctcctacccc tactttctaa gtcacagagg ctttttgttc ccccagacac tcttgcagat 5820
tagtccaggc agaaacagtt agatgtcccc agttaacctc ctatttgaca ccactgatta 5880
ccccattgat agtcacactt tgggttgtaa gtgacttttt atttatttgt atttttgact 5940
gcattaagag gtctctagtt ttttatctct tgtttcccaa aacctaataa gtaactaatg 6000
cacagagcac attgatttgt atttattcta tttttagaca taatttatta gcatgcatga 6060
gcaaattaag aaaaacaaca acaaatgaat gcatatatat gtatatgtat gtgtgtatat 6120
atacacacat atatatatat attttttctt ttcttaccag aaggttttaa tccaaataag 6180
gagaagatat gcttagaacc gaggtagagt tttcatccat tctgtcctgt aagtattttg 6240
catattctgg agacgcagga agagatccat ctacatatcc caaagctgaa ttatggtaga 6300
caaaactctt ccacttttag tgcatcaact tcttatttgt gtaataagaa aattgggaaa 6360
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ggaggatgtt tttagtagca atttgtactg atggtatggg gccaagagat atatcttaga 6480
gggagggctg agggtttgaa gtccaactcc taagccagtg ccagaagagc caaggacagg 6540
tacggctgtc atcacttaga cctcaccctg tggagccaca ccctagggtt ggccaatcta 6600
ctcccaggag cagggagggc aggagccagg gctgggcata aaagtcaggg cagagccatc 6660
tattgcttct gcagacattt gcttctgaca caactgtgtt cactagcaac ctcaaacaga 6720
caccatggtg catctgactc ctgaggagaa gtctgccgtt actgccctgt ggggcaaggt 6780
gaacgtggat gaagttggtg gtgaggccct gggcaggttg gtatcaaggt tacaagacag 6840
gtttaaggag accaatagaa actgggcatg tggagacaga gaagactctt gggtttctga 6900
taggcactga ctctctctgc ctattggtct attttcccac ccttaggctg ctggtggtct 6960
acccttggac ccagaggttc tttgagtcct ttggggatct gtccactcct gatgctgtta 7020
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agctgcacgt ggatcctgag aacttcagga agcttgtgag tctatgggac gcttgatgtt 7200
ttctttcccc ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg 7260
tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc 7320
ttttaatata cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 7380
ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 7440
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tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat 7620
catgttcata cctcttatct tcctcccaca gcccgggctc ctgggcaacg tgctggtctg 7680
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agtggtggct ggtgtggcta atgccctggc ccacaagtat cactaagctc gctttcttgc 7800
tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata 7860
ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgcga 7920
tatcaatgat gtatttaaat tatttctgaa tattttacta aaaagggaat gtgggaggtc 7980
agtgcattta aaacataaag aaatgaagag ctagttcaaa ccttgggaaa atacactata 8040
tcttaaactc catgaaagaa ggtgaggctg caaacagcta atgcacattg gcaacagccc 8100
ctgatgcata tgccttattc atccctcaga aaaggattca agtagaggct tgatttggag 8160
gttaaagttt tgctatgctg tattttacat tacttattgt tttagctgtc ctcatgaatg 8220
tcttttcact acccatttgc ttatcctgca tctctcagcc ttgactccac tcagttctct 8280
tgcttagaga taccaccttt cccctgaagt gttccttcca tgttttacgg cgagatggtt 8340
tcgatatcag agcgagattc cgtctcaaag aaaaaaaaag taatgaaatg aataaaatga 8400
gtcctagagc cagtaaatgt cgtaaatgtc tcagctagtc aggtagtaaa aggtctcaac 8460
taggcagtgg cagagcagga ttcaaattca gggctgttgt gatgcctccg cagactctga 8520
gcgccacctg gtggtaattt gtctgtgcct cttctgacgt ggaagaacag caactaacac 8580
actaacacgg catttactat gggccagcca ttgtactagt actagttcga aggatccgca 8640
ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg 8700
ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg 8760
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 8820
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 8880
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 8940
gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag 9000
agagtgagag gccttgacat tataatagat ttagcaggaa ttgaactagg agtggagcac 9060
acaggcaaag ttctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 9120
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 9180
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 9240
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 9300
gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggg cgcgcccctc 9360
gaggccgcca tggtcatagc tgtttgacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 9420
gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 9480
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 9540
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 9600
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 9660
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 9720
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 9780
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 9840
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 9900
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 9960
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 10020
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 10080
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 10140
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 10200
ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 10260
tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 10320
ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 10380
aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 10440
ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 10500
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 10560
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 10620
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 10680
cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 10740
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 10800
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 10860
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 10920
aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 10980
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 11040
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 11100
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 11160
ttttacggtt cctggccttt tgc 11183
<210> 2
<211> 1671
<212> DNA
<213>人工序列
<221> β-珠蛋白基因5’启动子
<222>（1）…（1671）
<400> 2
gctccagata gccatagaag aaccaaacac tttctgcgtg tgtgagaata atcagagtga 60
gattttttca caagtacctg atgagggttg agacaggtag aaaaagtgag agatctctat 120
ttatttagca ataatagaga aagcatttaa gagaataaag caatggaaat aagaaatttg 180
taaatttcct tctgataact agaaatagag gatccagttt cttttggtta acctaaattt 240
tatttcattt tattgtttta ttttatttta ttttatttta ttttgtgtaa tcgtagtttc 300
agagtgttag agctgaaagg aagaagtagg agaaacatgc aaagtaaaag tataacactt 360
tccttactaa accgacatgg gtttccaggt aggggcagga ttcaggatga ctgacagggc 420
ccttagggaa cactgagacc ctacgctgac ctcataaatg cttgctacct ttgctgtttt 480
aattacatct tttaatagca ggaagcagaa ctctgcactt caaaagtttt tcctcacctg 540
aggagttaat ttagtacaag gggaaaaagt acagggggat gggagaaagg cgatcacgtt 600
gggaagctat agagaaagaa gagtaaattt tagtaaagga ggtttaaaca aacaaaatat 660
aaagagaaat aggaacttga atcaaggaaa tgattttaaa acgcagtatt cttagtggac 720
tagaggaaaa aaataatctg agccaagtag aagacctttt cccctcctac ccctactttc 780
taagtcacag aggctttttg ttcccccaga cactcttgca gattagtcca ggcagaaaca 840
gttagatgtc cccagttaac ctcctatttg acaccactga ttaccccatt gatagtcaca 900
ctttgggttg taagtgactt tttatttatt tgtatttttg actgcattaa gaggtctcta 960
gttttttatc tcttgtttcc caaaacctaa taagtaacta atgcacagag cacattgatt 1020
tgtatttatt ctatttttag acataattta ttagcatgca tgagcaaatt aagaaaaaca 1080
acaacaaatg aatgcatata tatgtatatg tatgtgtgta tatatacaca catatatata 1140
tatatttttt cttttcttac cagaaggttt taatccaaat aaggagaaga tatgcttaga 1200
accgaggtag agttttcatc cattctgtcc tgtaagtatt ttgcatattc tggagacgca 1260
ggaagagatc catctacata tcccaaagct gaattatggt agacaaaact cttccacttt 1320
tagtgcatca acttcttatt tgtgtaataa gaaaattggg aaaacgatct tcaatatgct 1380
taccaagctg tgattccaaa tattacgtaa atacacttgc aaaggaggat gtttttagta 1440
gcaatttgta ctgatggtat ggggccaaga gatatatctt agagggaggg ctgagggttt 1500
gaagtccaac tcctaagcca gtgccagaag agccaaggac aggtacggct gtcatcactt 1560
agacctcacc ctgtggagcc acaccctagg gttggccaat ctactcccag gagcagggag 1620
ggcaggagcc agggctgggc ataaaagtca gggcagagcc atctattgct t 1671
<210> 3
<211> 476
<212> DNA
<213>人工序列
<221> β-珠蛋白基因内含子IVS-2
<222>（1）…（476）
<400> 3
gtgagtctat gggacgcttg atgttttctt tccccttctt ttctatggtt aagttcatgt 60
cataggaagg ggataagtaa cagggtacac atattgacca aatcagggta attttgcatt 120
tgtaatttta aaaaatgctt tcttctttta atatactttt ttgtttatct tatttctaat 180
actttcccta atctctttct ttcagggcaa taatgataca atgtatcatg cctctttgca 240
ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc aatagcaata tctctgcata 300
taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt ttcatattgc taatagcagc 360
tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg ataaggctgg attattctga 420
gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct tatcttcctc ccacag 476
<210> 4
<211> 418
<212> DNA
<213>人工序列
<221> β-珠蛋白基因3’增强子
<222>（1）…（418）
<400> 4
aatgatgtat ttaaattatt tctgaatatt ttactaaaaa gggaatgtgg gaggtcagtg 60
catttaaaac ataaagaaat gaagagctag ttcaaacctt gggaaaatac actatatctt 120
aaactccatg aaagaaggtg aggctgcaaa cagctaatgc acattggcaa cagcccctga 180
tgcatatgcc ttattcatcc ctcagaaaag gattcaagta gaggcttgat ttggaggtta 240
aagttttgct atgctgtatt ttacattact tattgtttta gctgtcctca tgaatgtctt 300
ttcactaccc atttgcttat cctgcatctc tcagccttga ctccactcag ttctcttgct 360
tagagatacc acctttcccc tgaagtgttc cttccatgtt ttacggcgag atggtttc 418
<210> 5
<211> 266
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 染色质绝缘体CTCF
<222>（1）…（266）
<400> 5
agagcgagat tccgtctcaa agaaaaaaaa agtaatgaaa tgaataaaat gagtcctaga 60
gccagtaaat gtcgtaaatg tctcagctag tcaggtagta aaaggtctca actaggcagt 120
ggcagagcag gattcaaatt cagggctgtt gtgatgcctc cgcagactct gagcgccacc 180
tggtggtaat ttgtctgtgc ctcttctgac gtggaagaac agcaactaac acactaacac 240
ggcatttact atgggccagc cattgt 266
Claims (6)
1.一种β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述载体的基因序列由修饰后的β-珠蛋白基因全长、β-珠蛋白基因调控区HS2-HS3、β-珠蛋白基因5’启动子、β-珠蛋白基因3’增强子、染色质绝缘体CTCF和pSIN4-CMV-K2M质粒构成，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。
2.根据权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述β-珠蛋白基因5’启动子是选择包含ATAAAA序列的TATA盒、GGCCAATCT序列的CCAAT元件、CACCC元件和远端多种公共转录因子结合域，其碱基长度1671bp，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；其中，β-珠蛋白基因5’启动子上游特异性引物是5’-GGGTACCCCGCTCCAGATAGCCATAGAAG-3’，其特异性酶切位点为Kpn I；β-珠蛋白基因5’启动子下游特异性引物是5 ’-CTGCAGAAGCAATAGATGGCTCTGCCC-3’，其特异性酶切位点为PstI。
3.根据权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述修饰后β-珠蛋白基因全长是选择内含子IVS-2删除一段374bp的RsaI/RsaI片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；其中，内含子IVS-2上游特异性引物是5’-AAGCTTGTGAGTCTATGGGACGCTT-3’，其特异性酶切位点为Hind III；内含子IVS-2下游特异性引物是5 ’-CCCGGGCTGTGGGAGGAAGATAAGAG-3’，其特异性酶切位点为AvaI。
4.根据权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述β-珠蛋白基因3’增强子是选择β-珠蛋白基因ploy A位点下游，碱基长度为418bp的序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示；其中，β-珠蛋白基因3’增强子上游特异性引物是5’-GATATCAATGATGTATTTAAATTATTTCTG-3’，其特异性酶切位点为EcoRV；β-珠蛋白基因3’增强子下游特异性引物是5’-CCATGGGAAACCATCTCGCCGTA-3’，其特异性酶切位点为NcoI。
5.根据权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体，其特征在于：所述染色质绝缘体CTCF是选择碱基长度为266bp的序列，其核苷酸序列如SEQ ID No .5所示；其中，染色质绝缘体CTCF上游特异性引物是5’-CCATGGAGAGCGAGATTCCGTCTCAA-3’，其特异性酶切位点为NcoI；染色质绝缘体CTCF下游特异性引物是5’-ACTAGTACAATGGCTGGCCCATAGTA-3’，其特异性酶切位点为SpeI。
6.权利要求1所述的β-珠蛋白重组慢病毒载体在与特定的包装质粒和包膜质粒共转染HEK 293T细胞获得较高滴度的假病毒颗粒中的应用。
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