CN111363756B - 一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用，所述慢病毒载体包括P2A‑T2A连接肽连接的经优化的多个珠蛋白基因，在蛋白质水平上实现了珠蛋白的高效表达，载体的长度得到实质性缩减，显著提高了慢病毒包装效率，降低了生产工艺的复杂程度和质控要求，从根本上解决了珠蛋白慢病毒载体的低效高能耗的缺陷，为高性价比大规模稳定生产基因治疗药物提供了创新方案。

Description

一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用，尤其涉及一种HBB和HBG2双表达慢病毒载体及其应用。
背景技术
当前国际上正在开展的地中海贫血基因治疗试验主要由BlueBird公司领衔，该公司以BB305载体为骨架生产的慢病毒药物LentiGlobin已经进入II期和III期临床试验阶段，结果振奋人心，HGB-204和HGB-205等对地中海贫血具有显著的治疗效果。其主要治疗方案流程为：首先采集患者自体造血干细胞，经体外慢病毒感染后，将整合有正确珠蛋白表达模块的造血干细胞回输到患者体内，经稳定造血重建后即可恢复HBB珠蛋白基因的表达。
然而，慢病毒载体携带的珠蛋白表达模块必须包含4～5个长片段顺式调控元件，才能维持RNA水平的高效转录；由此导致转录组长度达7～8kb，接近慢病毒包装极限，导致病毒效价低，包装批次不稳定，生产成本高。近期，BlueBird公司宣布因生产工艺的调整，LentiGlobin的上市时间会有延后，随后又宣布解决了生产工艺问题，可以按期上市。可见，载体的大负荷显著影响了药物的生产，药物的稳定性和转导效率也受到很大影响。
CN110106203A公开了一种新型HBB过表达载体及其设计方法和应用，所述HBB过表达载体包括HBB表达模块；所述HBB表达模块包括串联放置的DNase I核心高敏位点、启动子、HBB表达框和下游高敏位点；所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3、HS2和3’E等；所述HBB表达模块的总长度小于4kb。本发明通过精简和优化顺式作用元件和HBB表达框，不仅显著缩短了HBB表达模块的长度，而且提高了HBB表达模块的转录激活强度，实现了HBB珠蛋白基因的高效稳定特异性激活。然而，客观上载体的长度处于有限的缩短，没有发生质的改变。
因此，进一步缩短珠蛋白表达模块的长度，对于地中海贫血的基因治疗具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用，在不降低珠蛋白表达水平的基础上，从根本上缩短了珠蛋白表达模块的长度，极大缩短了慢病毒的包装长度，为高性价比大规模稳定生产基因治疗药物提供了创新方案。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种连接肽基因，所述连接肽基因包括串联的P2A和T2A；
所述连接肽基因包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：
GATATCggatctggaGCCACCAACTTCTCTCTCCTGAAACAGGCTGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCAGGGCCCggatctggaGAGGGAAGGGGATCTCTCCTGACCTGCGGAGATGTGGAGGAGAACCCTGGACCACCCGGGaccATGacc。
本发明中，将两个2A序列porcine teschovirus-1(P2A)和Thosea asigna virus(T2A)相串联，得到的连接肽有利于实现对串联的多肽的完美切割分离，性能优于单独的2A序列；本发明根据HBB表达框和HBG2表达框，对P2A-T2A进行序列优化，在保证P2A-T2A可以正常翻译的情况下，实现了HBB和HBG2两个多肽的彻底分离。
第二方面，本发明提供了一种融合基因，所述融合基因包括如第一方面所述的连接肽基因。
优选地，所述融合基因包括HBB表达框。
本发明中，采用如第一方面所述的连接肽基因连接多个同源性低的HBB基因，构建得到如HBB-P2A-T2A-HBB、HBB-P2A-T2A-HBB-P2A-T2A-HBB等的融合基因，有利于在降低RNA转录强度的同时，实现对珠蛋白的高效表达。
优选地，所述融合基因包括HBG2表达框。
本发明中，采用如第一方面所述的连接肽基因连接多个同源性低的HBG2基因，构建得到如HBG2-P2A-T2A-HBG2、HBB-P2A-T2A-HBG2、HBB-P2A-T2A-HBG2-P2A-T2A-HBE1等的融合基因，有利于在降低RNA转录强度的同时，实现对珠蛋白的高效表达。
优选地，所述融合基因包括如第一方面所述的连接肽基因连接的第一HBB表达框和第二HBB表达框。
优选地，所述融合基因包括如第一方面所述的连接肽基因连接的第一HBB表达框和第一HBG2表达框。
优选地，所述融合基因包括如第一方面所述的连接肽基因连接的第一HBB表达框和第二HBG2表达框。
优选地，所述第一HBB表达框包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
SEQ ID NO:2：
ATGGTGCACCTGACCCCCGAGGAGAAGAGCGCCGTGACCGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGACGAGGTGGGCGGCGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTGTACCCCTGGACCCAGAGGTTCTTCGAGAGCTTCGGCGACCTGAGCACCCCCGACGCCGTGATGGGCAACCCCAAGGTGAAGGCCCACGGCAAGAAGGTGCTGGGCGCCTTCAGCGACGGCCTGGCCCACCTGGACAACCTGAAGGGCACCTTCGCCACCCTGAGCGAGCTGCACTGCGACAAGCTGCACGTGGACCCCGAGAACTTCAGGCTGCTGGGCAACGTGCTGGTGTGCGTGCTGGCCCACCACTTCGGCAAGGAGTTCACCCCCCCCGTGCAGGCCGCCTACCAGAAGGTGGTGGCCGGCGTGGCCAACGCCCTGGCCCACAAGTACCAC。
本发明中，根据野生型HBB蛋白的氨基酸序列以及人蛋白组密码子的翻译使用频率，将HBB的开放阅读框(ORF)优化为最高密码子使用频率组合，增强了HBB在mRNA水平的翻译效率，得到如SEQ ID NO:2所示的HBB表达框，共包含50bp 5’-UTR和441bp ORF。
优选地，所述第二HBB表达框包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
SEQ ID NO:3：
ATGGGCCATTTCACAGAGGAAGACAAAGCCACAATCACAAGTCTCTGGGGAAAAGTCAATGTCGAGGACGCCGGAGGAGAAACACTCGGACGCCTCCTCGTCGTCTATCCATGGACACAACGCTTTTTTGACTCCTTTGGAAATCTCTCTAGTGCTAGTGCTATCATGGGAAATCCTAAAGTCAAAGCACATGGGAAAAAAGTCCTCACCAGCCTGGGAGATGCAATCAAGCATCTCGATGATCTCAAAGGAACATTTGCTCAGCTCTCCGAACTCCATTGTGATAAACTCCATGTCGATCCAGAAAATTTTAAACTCCTCGGGAATGTCCTCGTCACAGTCCTCGCTATTCATTTTGGAAAAGAGTTTACACCTGAGGTCCAAGCTTCTTGGCAAAAAATGGTCACAGGAGTCGCTTCTGCACTCAGCAGCCGCTATCAT。
本发明中，以第一HBB表达框为比对对象，将野生型HBB基因进行逐个碱基突变，降低了与第一HBB表达框的同源性，获得第二HBB表达框。
优选地，所述第一HBG2表达框包括如SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
SEQ ID NO:4：
ATGGGCCACTTCACCGAGGAGGACAAGGCCACCATCACCAGCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGAGGACGCCGGCGGCGAGACCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTGTACCCCTGGACCCAGAGGTTCTTCGACAGCTTCGGCAACCTGAGCAGCGCCAGCGCCATCATGGGCAACCCCAAGGTGAAGGCCCACGGCAAGAAGGTGCTGACCAGCCTGGGCGACGCCATCAAGCACCTGGACGACCTGAAGGGCACCTTCGCCCAGCTGAGCGAGCTGCACTGCGACAAGCTGCACGTGGACCCCGAGAACTTCAAGCTGCTGGGCAACGTGCTGGTGACCGTGCTGGCCATCCACTTCGGCAAGGAGTTCACCCCCGAGGTGCAGGCCAGCTGGCAGAAGATGGTGACCGGCGTGGCCAGCGCCCTGAGCAGCAGGTACCAC。
本发明中，根据密码子使用频率对野生型HBG2表达框进行初步优化，获得第一HBG2表达框。
优选地，所述第二HBG2表达框包括如SEQ ID NO:5所示的核酸序列。
SEQ ID NO:5：
ATGGGCCATTTCACAGAGGAAGACAAAGCCACAATCACAAGTCTCTGGGGAAAAGTCAATGTCGAGGACGCCGGAGGAGAAACACTCGGACGCCTCCTCGTCGTCTATCCATGGACACAACGCTTTTTTGACTCCTTTGGAAATCTCTCTAGTGCTAGTGCTATCATGGGAAATCCTAAAGTCAAAGCACATGGGAAAAAAGTCCTCACCAGCCTGGGAGATGCAATCAAGCATCTCGATGATCTCAAAGGAACATTTGCTCAGCTCTCCGAACTCCATTGTGATAAACTCCATGTCGATCCAGAAAATTTTAAACTCCTCGGGAATGTCCTCGTCACAGTCCTCGCTATTCATTTTGGAAAAGAGTTTACACCTGAGGTCCAAGCTTCTTGGCAAAAAATGGTCACAGGAGTCGCTTCTGCACTCAGCAGCCGCTATCAT。
本发明中，对第一HBG2表达框的ORF编码的147个氨基酸进行逐个优化，确保其基因组序列与HBB的完全不一致，不存在连续5bp以上的同源匹配区域，降低HBB和HBG2的同源性，避免在病毒包装和基因组整合过程中发生同源重组。
本发明中，采用如第一方面所述的连接肽连接HBB表达框和HBG2表达框，其中，P2A-T2A连接肽确保了HBB表达框和HBG2表达框的100％自然切割，串联的第一HBB表达框和第二HBG2表达框合计约1.5kb，长度得到实质性缩短，有利于构建慢病毒载体，在蛋白质水平上实现珠蛋白的高效表达。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第一方面所述的连接肽基因和/或如第二方面所述的融合基因。
优选地，所述表达载体还包括DNase I高敏位点、启动子或终止子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述DNase I高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2。
优选地，所述HS2包括如SEQ ID NO:6所示的核酸序列；
SEQ ID NO:6：
CAGGTGCTTCAAAACCATTTGCTGAATGATTACTATACTTTTTACAAGCTCAGCTCCCTCTATCCCTTCCAGCATCCTCATCTCTGATTAAATAAGCTTCAGTTTTTCCTTAGTTCCTGTTACATTTCTGTGTGTCTCCATTAGTGACCTCCCATAGTCCAAGCATGAGCAGTTCTGGCCAGGCCCCTGTCGGGGTCAGTGCCCCACCCCCGCCTTCTGGTTCTGTGTAACCTTCTAAGCAAACCTTCTGGCTCAAGCACAGCAATGCTGAGTCATGATGAGTCATGCTGAGGCTTAGGGTGTGTGCCCAGATGTTCTCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTGGGTCCCCAGCAGGATGCTTACAGGGCAGATGGCAAAAAAAAGGAGAAGCTGACCACCTGACTAAAACTCCACCTCAAACGGCATCATAAAGAAAATGGATGCCTGAGACAGAATGTGACATATTCTAGAATATATTATTTCCTGAATATATATATATATATACACATATACGTATATATATATATATATATATATTTGTTGTTATCAATTGCCATAGAATGATTAGTTATTGTGAATCAAATATTTATCTTGCAGGTG。
优选地，所述HS3包括如SEQ ID NO:7所示的核酸序列；
SEQ ID NO:7：
TATCTTTATTTTGCCATGACAAGACTGAGCTCAGAAGAGTCAAGCATTTGCCTAAGGTCGGACATGTCAGAGGCAGTGCCAGACCTATGTGAGACTCTGCAGCTACTGCTCATGGGCCCTGTGCTGCACTGATGAGGAGGATCAGATGGATGGGGCAATGAAGCAAAGGAATCATTCTGTGGATAAAGGAGACAGCCATGAAGAAGTCTATGACTGTAAATTTGGGAGCAGGAGTCTCTAAGGACTTGGATTTCAAGGAATTTTGACTCAGCAAACACAAGACCCTCACGGTGACTTTGCGAGCTGGTGTGCCAGATGTGTCTATCAGAGGTTCCAGGGAGGGTGGGGTGGGGTCAGGGCTGGCCACCAGCTATCAGGGCCCAGATGGGTTATAGGCTGGCAGGCTCAGATAGGTGGTTAGGTCAGGTTGGTGGTGCTGGGTGGAGTCCATGACTCCCAGGAGCCAGGAGAGATAGACCATGAGTAGAGGGCAGACATGGGAAAGGTGGGGGAGGCACAGCATAGCAGCATTTTTCATTCTACTACTACATGGGACTGCTCCCCTATACCCCCAGCTAGGGGCAAGTG。
优选地，所述HS4包括如SEQ ID NO:8所示的核酸序列；
SEQ ID NO:8：
ACAAAGACAAGCACGTGGACCTGGGAGGAGGGTTATTGTCCATGACTGGTGTGTGGAGACAAATGCAGGTTTATAATAGATGGGATGGCATCTAGCGCAATGACTTTGCCATCACTTTTAGAGAGCTCTTGGGGACCCCAGTACACAAGAGGGGACGCAGGGTATATGTAGACATCTCATTCTTTTTCTTAGTGTGAGAATAAGAATAGCCATGACCTGAGTTTATAGACAATGAGCCCTTTTCTCTCTCCCACTCAGCAGCTATGAGATGGCTTGCCCTGCCTCTCTACTAGGCTGACTCACTCCAAGGCCCAGCAATGGGCAGGGCTCTGTCAGGGCTTTGATAGCACTATCTGCAGAGCCAGGGCCGAGAAGGGGTGGACTCCAGAGACTCTCCCTCCCATTCCCGAGCAGGGTTTGCTTATTTATGCATTTAAATGATATATTTATTTTAAAAGAAATAACAGGAGACTGCCCAGCCCTGGCTGTGACATGGAAACTATGTAGAATATTTTGGGTTCCATTTTTTTTTCCTTCTTTCAGTTAGAGGAAAAGGGGCTCACTGCACATACACTAGACAGAAAGTCAGGAGCTTTGAATCCAAGCCTGATCATTTCCATGTCATACTGAGAAAGTCCCCACCCTTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCTTTTTATAAGTAGGAGTCTGGAGTAAATGATTTCCAATGGCTCTCATTTCAATACAA。
优选地，所述启动子包括如SEQ ID NO:9所示的核酸序列；
SEQ ID NO:9：
AAGCTGTGATTCCAAATATTACGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTT。
优选地，所述终止子包括如SEQ ID NO:10所示的核酸序列；
SEQ ID NO:10：
TAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC。
优选地，所述表达载体包括串联的HS4、HS3、HS2、HBB启动子、第一HBB表达框、连接肽基因、第二HBB表达框和终止子。
优选地，所述表达载体包括串联的HS4、HS3、HS2、HBB启动子、第一HBB表达框、连接肽基因、第一HBG2表达框和终止子。
优选地，所述表达载体包括串联的HS4、HS3、HS2、HBB启动子、第一HBB表达框、连接肽基因、第二HBG2表达框和终止子。
本发明中，在已有研究的基础上，删除了HBB表达载体中的次要元件，如3-HS、HBB-2号内含子的增强子等，虽然在RNA水平上的转录活性可能有所减弱，但是通过将多个珠蛋白表达框相串联，在蛋白质水平上实现了珠蛋白的高效表达；同时表达载体中的第一HBB和第二HBG2双表达模块仅3425bp，长度得到实质性缩减，显著提高了慢病毒包装效率，降低了生产工艺的复杂程度和质控要求，从根本上解决了珠蛋白慢病毒载体的低效高能耗的缺陷，明显改善了地中海贫血基因治疗药物的生产稳定性和转导效率。
优选地，所述表达载体包括病毒载体。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用如第三方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供了一种重组造血干细胞，所述重组造血干细胞包含如第一方面所述的连接肽基因、如第二方面所述的融合基因、如第三方面所述的表达载体或如第四方面所述的重组慢病毒。
第六方面，本发明提供了一种如第五方面所述的重组造血干细胞的制备方法，所述方法包括将如第一方面所述的连接肽基因、如第二方面所述的融合基因、如第三方面所述的表达载体或如第四方面所述的重组慢病毒导入造血干细胞的步骤。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的连接肽基因、如第二方面所述的融合基因、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的重组慢病毒或如第五方面所述的重组造血干细胞。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供了一种如第一方面所述的连接肽基因、如第二方面所述的融合基因、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的重组慢病毒、如第五方面所述的重组造血干细胞或如第七方面所述的药物组合物在制备地中海贫血治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明对HBB表达框进行优化，移除次要的顺式元件，在增强HBB在mRNA水平的翻译效率的同时，显著缩短了HBB表达框的长度，并根据HBB表达框对HBG2表达框进行了优化，降低HBB和HBG2的同源性，将HBB表达框和HBG2表达框相串联，实现了对珠蛋白的高效表达；
(2)本发明同时根据HBB表达框对野生型HBB表达框进行了优化，降低了不同HBB表达框的同源性，将HBB表达框相串联，实现了对珠蛋白的高效表达；
(3)本发明将两个2A序列porcine teschovirus-1(P2A)和Thosea asigna virus(T2A)相串联，并根据HBB表达框和HBG2表达框对连接肽进行优化，得到的P2A-T2A作为连接肽连接HBB和HBG2，实现了对HBB和HBG2的完全切割；
(4)本发明构建的HBB和HBG2双表达载体仅3425bp，长度得到实质性缩减，显著提高了慢病毒包装效率，降低了生产工艺的复杂程度和质控要求，从根本上解决了珠蛋白慢病毒载体的低效高能耗的缺陷，明显改善了地中海贫血基因治疗药物的生产稳定性和转导效率，为高性价比大规模稳定生产基因治疗药物提供了创新方案。
附图说明
图1(A)为第一HBB表达框(1stHBB)和第二HBB表达框(2ndHBB)的比对结果，图1(B)为第一HBB表达框(1stHBB)和第一HBG2表达框(1stHBG2)的比对结果，图1(C)为第一HBB表达框(1stHBB)和第二HBG2表达框(2ndHBG2)的比对结果；
图2为HBB和HBG2双表达慢病毒载体结构示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1HBB和HBG2融合基因的设计
根据野生型HBB蛋白的氨基酸序列以及人蛋白组密码子的翻译使用频率，重新设计HBB蛋白的编码序列，优化5’UTR的二级结构，移除次要的顺式元件如3-HS、HBB-2号内含子的增强子等，获得如SEQ ID NO:2所示的第一HBB表达框，共包含50bp 5’-UTR和441bpORF；
以第一HBB表达框为比对对象，将野生型HBB基因进行逐个碱基突变，降低与第一HBB表达框的同源性，获得如SEQ ID NO:3所示的第二HBB表达框；
根据密码子使用频率对HBG2表达框进行初步优化，获得如SEQ ID NO:4所示的第一HBG2表达框；
对第一HBG2的ORF编码的147个氨基酸进行逐个优化，确保其基因组序列与HBB的完全不一致，不存在连续5bp以上的同源匹配区域，降低HBB和HBG2的同源性，避免在病毒包装和基因组整合过程中发生同源重组，获得如SEQ ID NO:5所示的第二HBG2表达框。
不同表达框的比对结果如图1(A)、图1(B)和图1(C)所示，两者的同源性得到显著降低，有利于进行串联表达。
由于单独的2A肽作为连接肽有时不能实现对不同多肽的完全切割，本实施例将两个2A序列porcine teschovirus-1(P2A)和Thosea asigna virus(T2A)相串联，根据HBB表达框和HBG2表达框的序列，对P2A-T2A进行序列优化，获得如SEQ ID NO:1所示的连接肽P2A-T2A。
采用P2A-T2A作为连接肽，将不同的表达框相串联，得到珠蛋白基因双表达的融合基因1stHBB-P2A-T2A-2ndHBB、1stHBB-P2A-T2A-1stHBG2、1stHBB-P2A-T2A-2ndHBG2。
实施例2慢病毒载体的制备
人工合成1stHBB-P2A-T2A-2ndHBB、1stHBB-P2A-T2A-1stHBG2、1stHBB-P2A-T2A-2ndHBG2融合基因，并从基因组中克隆得到如SEQ ID NO:6～8所示的HS2、HS3和HS4，如SEQID NO:9所示的HBB启动子βpro，如SEQ ID NO:10所示的HBB polyA终止子，通过酶切连接和同源重组方式组装得到完整的珠蛋白基因双表达模块，其中，1stHBB-P2A-T2A-2ndHBG2全长约3.5kb，与BB305相比节省了约2kb的载荷，反向装载入慢病毒载体中，构建得到如图2所示的HBB和HBG2双表达慢病毒载体。
实施例3重组慢病毒的制备
本实施例采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80-90％时，进行慢病毒包装：
病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；
配制如表1所示的质粒混合液：
表1
试剂 剂量
珠蛋白表达质粒 7μg
psPAX2 7μg
pVSVG-Rev 7μg
表达质粒包括：表达1stHBB-P2A-T2A-2ndHBB的慢病毒载体、表达1stHBB-P2A-T2A-1stHBG2的慢病毒载体、或表达1stHBB-P2A-T2A-2ndHBG2的慢病毒载体，将各种表达质粒分别加至500μL opti-MEM培养基内，混匀；
将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；
将质粒与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；
将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293细胞上；
培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；
包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；
1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，分别得到表达串联的HBB的重组慢病毒或表达串联的HBB和HBG2的重组慢病毒，4℃保存待用。
实施例4重组造血干细胞的制备
根据美天旎说明书，使用anti-CD34磁珠分选CD34+HSC细胞，体外感染上述的珠蛋白表达慢病毒，经体外红系分化模型验证珠蛋白表达效能。
与蓝鸟公司的BB305载体相比，该双表达慢病毒的包装滴度显著提高，病毒完整性大幅度改善，生产工艺要求进一步降低；使用RT Q-PCR、Western Blot、FACS、HPLC等技术考察珠蛋白表达效能，新型载体的HBB在蛋白水平上得到显著提升。
综上所述，本发明对HBB表达框和HBG2表达框进行了优化，构建的HBB和HBG2双表达载体仅3425bp，长度得到实质性缩减，显著提高了慢病毒包装效率，从根本上解决了珠蛋白慢病毒载体的低效高能耗的缺陷，为高性价比大规模稳定生产基因治疗药物提供了创新方案。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）
<120> 一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用
<130> 20200326
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatatcggat ctggagccac caacttctct ctcctgaaac aggctggaga tgtggaggag 60
aaccctggac cagggcccgg atctggagag ggaaggggat ctctcctgac ctgcggagat 120
gtggaggaga accctggacc acccgggacc atgacc 156
<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggtgcacc tgacccccga ggagaagagc gccgtgaccg ccctgtgggg caaggtgaac 60
gtggacgagg tgggcggcga ggccctgggc aggctgctgg tggtgtaccc ctggacccag 120
aggttcttcg agagcttcgg cgacctgagc acccccgacg ccgtgatggg caaccccaag 180
gtgaaggccc acggcaagaa ggtgctgggc gccttcagcg acggcctggc ccacctggac 240
aacctgaagg gcaccttcgc caccctgagc gagctgcact gcgacaagct gcacgtggac 300
cccgagaact tcaggctgct gggcaacgtg ctggtgtgcg tgctggccca ccacttcggc 360
aaggagttca ccccccccgt gcaggccgcc taccagaagg tggtggccgg cgtggccaac 420
gccctggccc acaagtacca c 441
<210> 3
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atgggccatt tcacagagga agacaaagcc acaatcacaa gtctctgggg aaaagtcaat 60
gtcgaggacg ccggaggaga aacactcgga cgcctcctcg tcgtctatcc atggacacaa 120
cgcttttttg actcctttgg aaatctctct agtgctagtg ctatcatggg aaatcctaaa 180
gtcaaagcac atgggaaaaa agtcctcacc agcctgggag atgcaatcaa gcatctcgat 240
gatctcaaag gaacatttgc tcagctctcc gaactccatt gtgataaact ccatgtcgat 300
ccagaaaatt ttaaactcct cgggaatgtc ctcgtcacag tcctcgctat tcattttgga 360
aaagagttta cacctgaggt ccaagcttct tggcaaaaaa tggtcacagg agtcgcttct 420
gcactcagca gccgctatca t 441
<210> 4
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
atgggccact tcaccgagga ggacaaggcc accatcacca gcctgtgggg caaggtgaac 60
gtggaggacg ccggcggcga gaccctgggc aggctgctgg tggtgtaccc ctggacccag 120
aggttcttcg acagcttcgg caacctgagc agcgccagcg ccatcatggg caaccccaag 180
gtgaaggccc acggcaagaa ggtgctgacc agcctgggcg acgccatcaa gcacctggac 240
gacctgaagg gcaccttcgc ccagctgagc gagctgcact gcgacaagct gcacgtggac 300
cccgagaact tcaagctgct gggcaacgtg ctggtgaccg tgctggccat ccacttcggc 360
aaggagttca cccccgaggt gcaggccagc tggcagaaga tggtgaccgg cgtggccagc 420
gccctgagca gcaggtacca c 441
<210> 5
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atgggccatt tcacagagga agacaaagcc acaatcacaa gtctctgggg aaaagtcaat 60
gtcgaggacg ccggaggaga aacactcgga cgcctcctcg tcgtctatcc atggacacaa 120
cgcttttttg actcctttgg aaatctctct agtgctagtg ctatcatggg aaatcctaaa 180
gtcaaagcac atgggaaaaa agtcctcacc agcctgggag atgcaatcaa gcatctcgat 240
gatctcaaag gaacatttgc tcagctctcc gaactccatt gtgataaact ccatgtcgat 300
ccagaaaatt ttaaactcct cgggaatgtc ctcgtcacag tcctcgctat tcattttgga 360
aaagagttta cacctgaggt ccaagcttct tggcaaaaaa tggtcacagg agtcgcttct 420
gcactcagca gccgctatca t 441
<210> 6
<211> 602
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
caggtgcttc aaaaccattt gctgaatgat tactatactt tttacaagct cagctccctc 60
tatcccttcc agcatcctca tctctgatta aataagcttc agtttttcct tagttcctgt 120
tacatttctg tgtgtctcca ttagtgacct cccatagtcc aagcatgagc agttctggcc 180
aggcccctgt cggggtcagt gccccacccc cgccttctgg ttctgtgtaa ccttctaagc 240
aaaccttctg gctcaagcac agcaatgctg agtcatgatg agtcatgctg aggcttaggg 300
tgtgtgccca gatgttctca gcctagagtg atgactccta tctgggtccc cagcaggatg 360
cttacagggc agatggcaaa aaaaaggaga agctgaccac ctgactaaaa ctccacctca 420
aacggcatca taaagaaaat ggatgcctga gacagaatgt gacatattct agaatatatt 480
atttcctgaa tatatatata tatatacaca tatacgtata tatatatata tatatatatt 540
tgttgttatc aattgccata gaatgattag ttattgtgaa tcaaatattt atcttgcagg 600
tg 602
<210> 7
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tatctttatt ttgccatgac aagactgagc tcagaagagt caagcatttg cctaaggtcg 60
gacatgtcag aggcagtgcc agacctatgt gagactctgc agctactgct catgggccct 120
gtgctgcact gatgaggagg atcagatgga tggggcaatg aagcaaagga atcattctgt 180
ggataaagga gacagccatg aagaagtcta tgactgtaaa tttgggagca ggagtctcta 240
aggacttgga tttcaaggaa ttttgactca gcaaacacaa gaccctcacg gtgactttgc 300
gagctggtgt gccagatgtg tctatcagag gttccaggga gggtggggtg gggtcagggc 360
tggccaccag ctatcagggc ccagatgggt tataggctgg caggctcaga taggtggtta 420
ggtcaggttg gtggtgctgg gtggagtcca tgactcccag gagccaggag agatagacca 480
tgagtagagg gcagacatgg gaaaggtggg ggaggcacag catagcagca tttttcattc 540
tactactaca tgggactgct cccctatacc cccagctagg ggcaagtg 588
<210> 8
<211> 722
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
acaaagacaa gcacgtggac ctgggaggag ggttattgtc catgactggt gtgtggagac 60
aaatgcaggt ttataataga tgggatggca tctagcgcaa tgactttgcc atcactttta 120
gagagctctt ggggacccca gtacacaaga ggggacgcag ggtatatgta gacatctcat 180
tctttttctt agtgtgagaa taagaatagc catgacctga gtttatagac aatgagccct 240
tttctctctc ccactcagca gctatgagat ggcttgccct gcctctctac taggctgact 300
cactccaagg cccagcaatg ggcagggctc tgtcagggct ttgatagcac tatctgcaga 360
gccagggccg agaaggggtg gactccagag actctccctc ccattcccga gcagggtttg 420
cttatttatg catttaaatg atatatttat tttaaaagaa ataacaggag actgcccagc 480
cctggctgtg acatggaaac tatgtagaat attttgggtt ccattttttt ttccttcttt 540
cagttagagg aaaaggggct cactgcacat acactagaca gaaagtcagg agctttgaat 600
ccaagcctga tcatttccat gtcatactga gaaagtcccc acccttctct gagcctcagt 660
ttctcttttt ataagtagga gtctggagta aatgatttcc aatggctctc atttcaatac 720
aa 722
<210> 9
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
aagctgtgat tccaaatatt acgtaaatac acttgcaaag gaggatgttt ttagtagcaa 60
tttgtactga tggtatgggg ccaagagata tatcttagag ggagggctga gggtttgaag 120
tccaactcct aagccagtgc cagaagagcc aaggacaggt acggctgtca tcacttagac 180
ctcaccctgt ggagccacac cctagggttg gccaatctac tcccaggagc agggagggca 240
ggagccaggg ctgggcataa aagtcagggc agagccatct attgctt 287
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
taagctcgct ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc taagtccaac 60
tactaaactg ggggatatta tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct aataaaaaac 120
atttattttc attgc 135

Claims (13)

1.一种连接肽基因，其特征在于，所述连接肽基因包括串联的P2A和T2A；
所述连接肽基因包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
2.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因包括如权利要求1所述的连接肽基因；
所述融合基因包括如权利要求1所述的连接肽基因连接的第一HBB表达框和第二HBB表达框；或
所述融合基因包括如权利要求1所述的连接肽基因连接的第一HBB表达框和第一HBG2表达框；或
所述融合基因包括如权利要求1所述的连接肽基因连接的第一HBB表达框和第二HBG2表达框；
所述第一HBB表达框包括如SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
所述第二HBB表达框包括如SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
所述第一HBG2表达框包括如SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
所述第二HBG2表达框包括如SEQ ID NO:5所示的核酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的连接肽基因和/或如权利要求2所述的融合基因；
所述表达载体还包括DNase I高敏位点、启动子或终止子中的任意一种或至少两种的组合；
所述DNaseI高敏位点包括串联表达的HS4、HS3和HS2；
所述HS2包括如SEQ ID NO:6所示的核酸序列；
所述HS3包括如SEQ ID NO:7所示的核酸序列；
所述HS4包括如SEQ ID NO:8所示的核酸序列；
所述启动子包括如SEQ ID NO:9所示的核酸序列；
所述终止子包括如SEQ ID NO:10所示的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括串联的HS4、HS3、HS2、HBB启动子、第一HBB表达框、连接肽基因、第二HBB表达框和终止子；或
所述表达载体包括串联的HS4、HS3、HS2、HBB启动子、第一HBB表达框、连接肽基因、第一HBG2表达框和终止子；或
所述表达载体包括串联的HS4、HS3、HS2、HBB启动子、第一HBB表达框、连接肽基因、第二HBG2表达框和终止子。
5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；
所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。
7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用如权利要求3-6任一项所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
8.根据权利要求7所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种重组造血干细胞，其特征在于，所述重组造血干细胞包含如权利要求1所述的连接肽基因、如权利要求2所述的融合基因、如权利要求3-6任一项所述的表达载体或如权利要求7或8所述的重组慢病毒。
10.一种如权利要求9所述的重组造血干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1所述的连接肽基因、如权利要求2所述的融合基因、如权利要求3-6任一项所述的表达载体和/或如权利要求7或8所述的重组慢病毒导入造血干细胞的步骤。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1所述的连接肽基因、如权利要求2所述的融合基因、如权利要求3-6任一项所述的表达载体、如权利要求7或8所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的重组造血干细胞。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
13.一种如权利要求1所述的连接肽基因、如权利要求2所述的融合基因、如权利要求3-6任一项所述的表达载体、如权利要求7或8所述的重组慢病毒、如权利要求9所述的重组造血干细胞或如权利要求11或12所述的药物组合物在制备地中海贫血治疗药物中的应用。
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