CN110699381A - 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途 - Google Patents
地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110699381A CN110699381A CN201910879585.1A CN201910879585A CN110699381A CN 110699381 A CN110699381 A CN 110699381A CN 201910879585 A CN201910879585 A CN 201910879585A CN 110699381 A CN110699381 A CN 110699381A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant vector
- hbb
- vector
- promoter
- thalassemia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 title claims description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 6
- 208000022806 beta-thalassemia major Diseases 0.000 title description 3
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 101150013707 HBB gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims description 9
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 claims description 5
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 8
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007513 Hemoglobin A Human genes 0.000 description 2
- 108010085682 Hemoglobin A Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100038617 Hemoglobin subunit gamma-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010065973 Iron Overload Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 102000055151 human KITLG Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- ZMRUPTIKESYGQW-UHFFFAOYSA-N propranolol hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 ZMRUPTIKESYGQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种表达人β球蛋白HBB基因的重组慢病毒载体及其制备。其中，该载体是自身失活的第三代慢病毒载体，所述的HBB基因的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了该载体的制备方法，以及该载体在制备治疗地中海贫血病药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人β珠蛋白及其表达载体构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia)，又称作珠蛋白生成障碍性贫血或海洋性贫血，这是一种因血红蛋白A合成异常导致的遗传性血液类疾病。血红蛋白A是血红细胞中的含铁蛋白，是人体内负责氧运输的关键，它的异常会导致血红细胞存活时间变短且无法有效的携氧，重度患者甚至不能有效制造血红细胞导致长期的溶血性贫血，完全无法正常生活。血红蛋白A是由两种珠蛋白肽链(α珠蛋白和β珠蛋白)的四条肽链组合而成(α2β2)，根据受影响的珠蛋白肽链的不同，地中海贫血主要可分为α地中海贫血和B地中海贫血两大类。地中海贫血是一类最常见的人类单基因遗传病，据估计，携带有α地中海贫血相关突变的人群比例为5％，在我国南方的某些地区，α地中海贫血相关突变的携带者比例甚至高达40％。而每年新生儿中地中海贫血的发病率为0.44/千人。
根据携带突变的不同，地中海贫血的患者症状也有很大差异，轻度患者的生活接近正常人群，然而重度患者由于血红素的不足和血红细胞的低携氧能力，导致体内造血器官造血功能过载而引发严重的症状，因而需要终生的输血和药物治疗。α地中海贫血和β地中海贫血这两类主要的地中海贫血中，β地中海贫血的症状尤为严重，通常需要终生治疗。就目前而言，地中海贫血重度患者的治疗依然以维持性治疗为主：他们需要终生输血，同时需要服用各种药物预防长期输血带来的铁过载、内分泌异常和骨质疏松等并发症。要想治愈地中海贫血，现有的策略是用健康个体正常的造血干细胞(骨髓、脐带血、血液中的造血干细胞)替换患者受损的造血系统(造血干细胞移植)，然而造血干细胞移植存在较高的风险，且在配型方面困难重重，因此更有潜力的治愈方案是直接修复患者受损的珠蛋白基因，即基因疗法。
基因治疗最先开展于原发性免疫缺陷病的治疗中，经过多年的摸索，研究者已经证实，慢病毒载体在安全性和有效性两方面能够满足临床治疗的需求。因β地中海贫血的部分患者症状最为严重且需要终生输血治疗，故也是近年来基因治疗研究的重点。研究者证实，慢病毒载体可以高效感染造血干细胞并表达高水平的β球蛋白或γ球蛋白(具备与β球蛋白相近的功能)，采用该策略能有效治疗地中海贫血的小鼠模型的症状。
发明内容
本发明的提供了一种重组载体，其特征在于，该重组载体包含自身失活的慢病毒载体序列和HBB编码多核苷酸的至少一部分，其中HBB编码多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。
所述自身失活的慢病毒载体包含CMV启动子和增强子、5’LTR truncated、HIV-1Ψ、RRE、cPPT/CTS、启动子(例如UbC、CAG、或EF1α启动子)、WPRE元件、bGH poly(A)sinal、fiori，进一步也可以包含EGFP、SV 40启动子、EM7启动子、BleoR、SV40poly(A)、AmpR、AmpR启动子。
在一个具体实施例中，所述重组载体的序列如SEQ ID NO：2-4中任一个序列所示。
在一个具体实施例中，所述重组载体使用的启动子选自UbC启动子、EF1α启动子和CAG启动子中任一种。
在一个具体实施例中，所述重组载体的序列包括WPRE元件。
如前所述的重组载体，所述重组载体是在所述所述自身失活的慢病毒载体的多克隆位点中连接了HBB基因序列。
本发明提供了一种重组载体的制备方法，其特征在于，
将HBB编码多核苷酸的至少一部分连接到自身失活的慢病毒载体的多克隆位点中构建重组载体，再将阳性重组载体转染宿主细胞培养，获得所述的重组载体，所述HBB编码多核苷酸基因序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个实施例中，所述重组载体的序列如SEQ ID NO：2-4中任一个所示。
在一个实施例中，所述重组载体的启动子选自UbC启动子、EF1α启动子和CAG启动子中的一种。
如前所述的制备方法，其特征在于，在所述HBB编码多核苷酸连接入慢病毒载体所采用的酶切位点为BamHI和EcoRI酶切位点。
在一个实施例中，所述重组载体包括WPRE元件。
在一个具体实施例中，所述连接采用的是T4连接酶。
在一个具体实施例中，所述宿主细胞是293T细胞。
在一个具体实施例中，所述方法包括筛选阳性重组载体的步骤：通过大肠杆菌感受态TOP10转化，单克隆挑选，PCR鉴定，测序确定。
本发明还提供了一种病毒，其包含如前所述的重组载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如前所述的重组载体。其中，所述宿主细胞选自293T细胞。
本发明还提供了一种治疗性细胞，所述宿主细胞包含如前所述的重组载体。其中，所述细胞为造血干细胞。
本发明还提供了一种组合物，所述的组合物包含如前所述的重组载体或如前所述的病毒或如前所述的宿主细胞中的至少一种。
本发明还进一步提供了如前所述的重组载体或如前所述的病毒或如前所述的宿主细胞或如前所述的组合物在制备预防或治疗地中海贫血病药物中的用途。
在一个具体实施例中，所述地中海贫血病包括α地中海贫血和β地中海贫血。
在如前所述的用途中，所述的药物还包含可药用的稀释剂、赋形剂或给药载体。
再一方面，本发明还提供了一种预防或治疗地中海贫血病的方法，包括向所需受试者施用有效量的如前所述的重组载体或病毒或细胞或如组合物。
在一个实施例中，所述细胞为造血干细胞。
在一个实施例中，所述受试者为哺乳动物，优选为人类。
发明的有益效果
本发明采用第三代自失活的慢病毒载体RL-LENTI，并创造性的使用了多种增强启动子与病毒载体专用的WPRE序列组合，得到了增强表达HBB的慢病毒载体，适用于地中海贫血的基因治疗应用。本发明的有益效果在于利用安全性更高的慢病毒载体，构建HBB过表达的RL-LENTI病毒载体，且该载体表达的蛋白效率更高。
本发明的关键在于是否能在病人体内表达足够量的HBB蛋白，因此病毒载体内的设计非常关键。在病毒载体中，HBB基因的启动子和3’UTR就是直接影响到基因表达量的关键因素，因此本发明采用了三种增强的启动子，与创新性的3’UTR(WPRE)，并测试了基因表达效果。目前Bluebird公司的pLenti-Globin载体采用LCR的基因启动子，经过比较，本发明的启动子与WPRE组合对HBB基因的表达效果远远优于LCR启动子组合。
附图说明
图1示出地中海贫血的基因治疗示意图，分离患者的造血干细胞，借助于基因工程技术替代/修复受损基因，修复完成的造血干细胞重新导入患者体内(Vijay G Sankaranet.al.Nature medicine，2015)。
图2示出RL-LENTI-UbC-HBB载体图谱，对应SEQ ID NO：2。
图3示出RL-LENTI-EF1α-HBB载体图谱，对应SEQ ID NO：3。
图4示出RL-LENTI-CAG-HBB载体图谱，对应SEQ ID NO：4。
图5示出含有不同启动子载体表达目的蛋白的表达效率。
图6示出红细胞数检测结果图。
图7示出血红蛋白含量图。
图8示出红细胞比容图。
图9示出红细胞平均血红蛋白量图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
术语“载体”是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子，包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。本发明中，术语“病毒载体”利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制，发生于完整活体(in vivo)或是细胞培养(in vitro)中，也可应用于包括但不限于基础研究、基因疗法或疫苗开发等领域。
术语“RL-LENTI载体”也称为RL-LENTI质粒，其包括但不限于经过启动子改造的载体，其中启动子包括但不限于：UbC启动子、EF1α启动子或CAG启动子。
术语“UbC”、“Ubi”、“UBI”具有相同含义，是一类启动子，有两种形式：一种是人类泛素启动子，UbC；另一种是植物泛素启动子Ubi。因此，在人类疾病领域中，“Ubi”与“UbC”具有相同含义.
术语“HBB”是指β-地中海贫血β珠蛋白。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
具体实施例：
实施例1.RL-LENTI-HBB构建
发明重组人β球蛋白基因的序列是根据GenBank数据库提供的HBB基因序列进行人工合成而成(如SEQ ID NO：1所示)。
重组人β球蛋白基因的重组应用慢病毒载体的构建方法，其步骤包括：
人工合成重组人β球蛋白基因(HBB)片段，(序列如SEQ ID NO：1所示)，通过酶切(PacI和XbaI酶)的方式连入慢病毒载体RL-LENTI中。连接产物通过大肠杆菌感受态TOPl0转化，挑选单克隆，PCR鉴定，送测序确定为阳性后转染293T细胞验证。
其中进行了启动子筛选和载体元件的筛选，结果显示相比其他启动子，hUbi、EFl、和CAG启动子，结合WPRE元件，产生的载体表达HBB的效率更高。
合成EF1启动子序列，通过酶切的方式连入慢病毒载体RL-LENTI中。连接产物通过大肠杆菌感受态TOP10转化，挑选单克隆，PCR鉴定，送测序确定为阳性后转染293T细胞验证。
合成CAG启动子序列。连接产物通过大肠杆菌感受态TOP10转化，挑选单克隆，PCR鉴定，送测序确定为阳性后转染293T细胞验证。
实施例2.RL-Lenti-HBB的验证
阳性克隆经转染293T细胞验证。RL-Lenti-UbC-HBB、RL-Lenti-EF1α-HBB、RL-Lenti-CAG-HBB表达载体分别转染293细胞后，48小时提取总蛋白，进行Western Blot分析，发现RL-Lenti-UbC-HBB、RL-Lenti-EF1α-HBB、RL-Lenti-CAG-HBB均表达正常。
实施例3.和不同载体表达效果的比较
经构建RL-LENTI-UbC/CAG/EF1A/LCR-Flag-HBB-2a-GFP载体，感染人类白血病淋巴母细胞系K562后检测表达效果。我们发现UBi、CAG、EFla启动子均能比LCR启动子具有更强的驱动HBB-2a-GFP基因表达，绿色荧光信号明显比LCR组更强，经统计显示有显著增强(图5)。
实施例4.RL-LENTI-HBB重组慢病毒的应用
经构建RL-LENTI-UbC/CAG/EF1A-HBB-2a-GFP载体，MOI 100去感染小鼠骨髓造血干细胞细胞两次以后，用GFP荧光蛋白表达来检测病毒感染效率，感染效率在12％左右。
实施例5.造血干细胞富集、骨髓移植
1.小鼠造血干细胞的富集与病毒感染：
取4只Hbb-/+小鼠双后侧大腿骨与小腿骨的全骨髓，使用磁珠分选(EasySepTMMouseHematopoietic Progenitor Isolation Kit，#19856，Stem Cell Technology)的方式对小鼠造血干细胞进行富集。将富集后的小鼠造血干细胞以5×105/孔进行铺板，24孔板提前用0.2mg/M1 Retronectin(重组型人纤维粘连蛋白)(TAKARA，CH-296)进行预处理，使用含有10％FBS及10ng/mL的mIL-3(白细胞介素3)(Peprotech，213-13)、10ng/mL的mIL-6(白细胞介素6)(Peprotech，216-16)、50ng/mL的mSCF(重组型人干细胞因子)(Peprotech，250-03)的IMDM培养基预刺激培养过夜。离心收集细胞，并将培养液和病毒液(空载体病毒和不同启动子的HBB基因治疗组病毒)以40∶1的体积比进行离心感染(1800rpm，120min)，37℃、5％CO2培养8小时，更换新鲜10％FBS的IMDM培养基(含mIL-3、mIL-6、mSCF)进行过夜培养。细胞重复感染空载病毒和不同启动子的HBB病基因治疗组病毒，并继续培养24小时
2.小鼠辐照与移植：
将4只HBB-/+受体鼠进行亚致死剂量的辐照，分别设为阴性对照组(空载体病毒)、实验组(HBB-CAG组、HBB-EF1α组)、空白对照组(不作处理的野生型小鼠)。移植的细胞数以GFP阳性细胞数为计算依据，每只小鼠移植52w个GFP阳性的造血祖细胞。移植后常规饮食饮水，加喂5％拜诺欣7日。
3.小鼠血液指标检测：
HBB-/+受体鼠接受骨髓移植两周后，取全血，加抗凝剂，流式分选检测血液中GFP阳性细胞比例。利用动物血常规测定仪(Perlong XFA6030)检测移植后各小鼠血液指标。与阴性对照组(空载体组)相比，实验组(HBB-CAG组、HBB-eflα组)小鼠红细胞数(cell numberof RBC)、血红蛋白含量(concentration of HGB)、红细胞比容(HCT)以及红细胞平均血红蛋白量(MCH)四项指标均有显著增加，其中HBB-CAG组效果最显著，接近空白对照组(不作处理的野生型小鼠)各项指标。这表明，利用我们的病毒系统，通过感染HBB-/+型小鼠造血干细胞并结合骨髓移植技术移植回输，能有效挽救HBB-/+型小鼠造血能力，实现血红蛋白和红细胞的全面回升(图6-9)。而目前现有技术中使用的载体病毒均没有能够实现血红蛋白和红细胞的全面回升。可见本发明使用的载体在表达效率以及体内真实的治疗效果中均具有预料不到的技术效果。
以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 合肥瑞灵生物科技有限公司
<120> 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途
<130> AJ645019001CN
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgcatctga ctcctgagga gaagtctgcc gttactgccc tgtggggcaa ggtgaacgtg 60
gatgaagttg gtggtgaggc cctgggcagg ctgctggtgg tctacccttg gacccagagg 120
ttctttgagt cctttgggga tctgtccact cctgatgctg ttatgggcaa ccctaaggtg 180
aaggctcatg gcaagaaagt gctcggtgcc tttagtgatg gcctggctca cctggacaac 240
ctcaagggca cctttgccac actgagtgag ctgcactgtg acaagctgca cgtggaccct 300
gagaacttca ggctcctggg caacgtgctg gtctgtgtgc tggcccatca ctttggcaaa 360
gagttcaccc caccagtgca ggctgcctat cagaaagtgg tggctggtgt ggctaatgcc 420
ctggcccaca agtatcac 438
<210> 2
<211> 9662
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta acccgtgtcg gctccagatc tggcctccgc gccgggtttt 2640
ggcgcctccc gcgggcgccc ccctcctcac ggcgagcgct gccacgtcag acgaagggcg 2700
cagcgagcgt cctgatcctt ccgcccggac gctcaggaca gcggcccgct gctcataaga 2760
ctcggcctta gaaccccagt atcagcagaa ggacatttta ggacgggact tgggtgactc 2820
tagggcactg gttttctttc cagagagcgg aacaggcgag gaaaagtagt cccttctcgg 2880
cgattctgcg gagggatctc cgtggggcgg tgaacgccga tgattatata aggacgcgcc 2940
gggtgtggca cagctagttc cgtcgcagcc gggatttggg tcgcggttct tgtttgtgga 3000
tcgctgtgat cgtcacttgg tgagtagcgg gctgctgggc tggccggggc tttcgtggcc 3060
gccgggccgc tcggtgggac ggaagcgtgt ggagagaccg ccaagggctg tagtctgggt 3120
ccgcgagcaa ggttgccctg aactgggggt tggggggagc gcagcaaaat ggcggctgtt 3180
cccgagtctt gaatggaaga cgcttgtgag gcgggctgtg aggtcgttga aacaaggtgg 3240
ggggcatggt gggcggcaag aacccaaggt cttgaggcct tcgctaatgc gggaaagctc 3300
ttattcgggt gagatgggct ggggcaccat ctggggaccc tgacgtgaag tttgtcactg 3360
actggagaac tcggtttgtc gtctgttgcg ggggcggcag ttatggcggt gccgttgggc 3420
agtgcacccg tacctttggg agcgcgcgcc ctcgtcgtgt cgtgacgtca cccgttctgt 3480
tggcttataa tgcagggtgg ggccacctgc cggtaggtgt gcggtaggct tttctccgtc 3540
gcaggacgca gggttcgggc ctagggtagg ctctcctgaa tcgacaggcg ccggacctct 3600
ggtgagggga gggataagtg aggcgtcagt ttctttggtc ggttttatgt acctatcttc 3660
ttaagtagct gaagctccgg ttttgaacta tgcgctcggg gttggcgagt gtgttttgtg 3720
aagtttttta ggcacctttt gaaatgtaat catttgggtc aatatgtaat tttcagtgtt 3780
agactagtaa attgtccgct aaattctggc cgtttttggc ttttttgtta gacgaagctt 3840
gggctgcagg tcgactctag agatggacta caaggatgac gatgacaagg tgcatctgac 3900
tcctgaggag aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg atgaagttgg 3960
tggtgaggcc ctgggcaggc tgctggtggt ctacccttgg acccagaggt tctttgagtc 4020
ctttggggat ctgtccactc ctgatgctgt tatgggcaac cctaaggtga aggctcatgg 4080
caagaaagtg ctcggtgcct ttagtgatgg cctggctcac ctggacaacc tcaagggcac 4140
ctttgccaca ctgagtgagc tgcactgtga caagctgcac gtggaccctg agaacttcag 4200
gctcctgggc aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac tttggcaaag agttcacccc 4260
accagtgcag gctgcctatc agaaagtggt ggctggtgtg gctaatgccc tggcccacaa 4320
gtatcactaa aattcgatat caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt 4380
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 4440
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 4500
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 4560
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 4620
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 4680
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 4740
tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 4800
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 4860
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 4920
tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacctc gagacctaga aaaacatgga 4980
gcaatcacaa gtagcaatac agcagctacc aatgctgatt gtgcctggct agaagcacaa 5040
gaggaggagg aggtgggttt tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 5100
aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt 5160
cactcccaac gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc 5220
cctgattggc agaactacac accagggcca gggatcagat atccactgac ctttggatgg 5280
tgctacaagc tagtaccagt tgagcaagag aaggtagaag aagccaatga aggagagaac 5340
acccgcttgt tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtatta 5400
gagtggaggt ttgacagccg cctagcattt catcacatgg cccgagagct gcatccggac 5460
tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 5520
aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt 5580
ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc 5640
tctagcaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 5700
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 5760
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 5820
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 5880
tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg 5940
gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 6000
cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 6060
tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 6120
ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 6180
tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 6240
taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 6300
tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 6360
aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca 6420
ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt 6480
ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 6540
gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 6600
cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct 6660
gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 6720
aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc agcacgtgtt gacaattaat 6780
catcggcata gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatggcca 6840
agttgaccag tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct 6900
ggaccgaccg gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc 6960
gggacgacgt gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg gacaacaccc 7020
tggcctgggt gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt 7080
ccacgaactt ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg 7140
ggcgggagtt cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc 7200
aggactgaca cgtgctacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct 7260
tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg 7320
agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 7380
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 7440
aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt 7500
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 7560
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 7620
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 7680
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 7740
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 7800
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 7860
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 7920
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 7980
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 8040
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 8100
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 8160
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 8220
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 8280
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 8340
acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 8400
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 8460
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 8520
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 8580
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 8640
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 8700
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 8760
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 8820
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 8880
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 8940
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 9000
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 9060
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 9120
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 9180
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 9240
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 9300
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 9360
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 9420
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 9480
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 9540
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 9600
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 9660
ac 9662
<210> 3
<211> 8992
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta agcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 2640
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 2700
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 2760
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 2820
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 2880
acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 2940
ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 3000
cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 3060
ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 3120
agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 3180
gggcgtctag agatggacta caaggatgac gatgacaagg tgcatctgac tcctgaggag 3240
aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg atgaagttgg tggtgaggcc 3300
ctgggcaggc tgctggtggt ctacccttgg acccagaggt tctttgagtc ctttggggat 3360
ctgtccactc ctgatgctgt tatgggcaac cctaaggtga aggctcatgg caagaaagtg 3420
ctcggtgcct ttagtgatgg cctggctcac ctggacaacc tcaagggcac ctttgccaca 3480
ctgagtgagc tgcactgtga caagctgcac gtggaccctg agaacttcag gctcctgggc 3540
aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac tttggcaaag agttcacccc accagtgcag 3600
gctgcctatc agaaagtggt ggctggtgtg gctaatgccc tggcccacaa gtatcactaa 3660
aattcgatat caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 3720
ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 3780
tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 3840
tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 3900
tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 3960
ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 4020
gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat 4080
catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 4140
tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 4200
ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 4260
ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacctc gagacctaga aaaacatgga gcaatcacaa 4320
gtagcaatac agcagctacc aatgctgatt gtgcctggct agaagcacaa gaggaggagg 4380
aggtgggttt tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg 4440
tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac 4500
gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc cctgattggc 4560
agaactacac accagggcca gggatcagat atccactgac ctttggatgg tgctacaagc 4620
tagtaccagt tgagcaagag aaggtagaag aagccaatga aggagagaac acccgcttgt 4680
tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtatta gagtggaggt 4740
ttgacagccg cctagcattt catcacatgg cccgagagct gcatccggac tgtactgggt 4800
ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 4860
ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 4920
actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg 4980
cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 5040
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 5100
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 5160
gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg 5220
gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac 5280
gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 5340
acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 5400
ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 5460
gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 5520
tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 5580
ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 5640
gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 5700
gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag 5760
caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 5820
caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 5880
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 5940
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 6000
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 6060
gagcttgtat atccattttc ggatctgatc agcacgtgtt gacaattaat catcggcata 6120
gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatggcca agttgaccag 6180
tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct ggaccgaccg 6240
gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc gggacgacgt 6300
gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg gacaacaccc tggcctgggt 6360
gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt ccacgaactt 6420
ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg ggcgggagtt 6480
cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc aggactgaca 6540
cgtgctacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt 6600
tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc 6660
ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 6720
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 6780
tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc 6840
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 6900
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6960
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 7020
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 7080
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 7140
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 7200
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 7260
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 7320
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 7380
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 7440
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 7500
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 7560
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 7620
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 7680
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 7740
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 7800
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 7860
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 7920
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 7980
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 8040
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 8100
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 8160
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 8220
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 8280
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 8340
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 8400
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 8460
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 8520
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 8580
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 8640
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 8700
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 8760
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 8820
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 8880
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 8940
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg ac 8992
<210> 4
<211> 9357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta agtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt 2640
acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt 2700
gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc 2760
ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc 2820
tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt 2880
tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat 2940
ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag 3000
cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag 3060
tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc 3120
tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc 3180
ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag 3240
tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg 3300
gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct 3360
ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact 3420
gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt 3480
ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag 3540
gtgtcgtgac tctagagatg gactacaagg atgacgatga caaggtgcat ctgactcctg 3600
aggagaagtc tgccgttact gccctgtggg gcaaggtgaa cgtggatgaa gttggtggtg 3660
aggccctggg caggctgctg gtggtctacc cttggaccca gaggttcttt gagtcctttg 3720
gggatctgtc cactcctgat gctgttatgg gcaaccctaa ggtgaaggct catggcaaga 3780
aagtgctcgg tgcctttagt gatggcctgg ctcacctgga caacctcaag ggcacctttg 3840
ccacactgag tgagctgcac tgtgacaagc tgcacgtgga ccctgagaac ttcaggctcc 3900
tgggcaacgt gctggtctgt gtgctggccc atcactttgg caaagagttc accccaccag 3960
tgcaggctgc ctatcagaaa gtggtggctg gtgtggctaa tgccctggcc cacaagtatc 4020
actaaaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 4080
attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat 4140
gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc 4200
ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg 4260
cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct 4320
ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct 4380
tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg 4440
gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac 4500
gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct 4560
gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct 4620
ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg acctcgagac ctagaaaaac atggagcaat 4680
cacaagtagc aatacagcag ctaccaatgc tgattgtgcc tggctagaag cacaagagga 4740
ggaggaggtg ggttttccag tcacacctca ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc 4800
agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc 4860
ccaacgaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga 4920
ttggcagaac tacacaccag ggccagggat cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta 4980
caagctagta ccagttgagc aagagaaggt agaagaagcc aatgaaggag agaacacccg 5040
cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tattagagtg 5100
gaggtttgac agccgcctag catttcatca catggcccga gagctgcatc cggactgtac 5160
tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 5220
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 5280
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 5340
cagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 5400
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 5460
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 5520
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 5580
atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc 5640
cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 5700
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 5760
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 5820
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 5880
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 5940
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 6000
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 6060
ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc 6120
cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa 6180
gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac 6240
catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 6300
tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc 6360
tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct 6420
cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg 6480
gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg 6540
accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc 6600
gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac 6660
gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc 6720
tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg 6780
aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg 6840
gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac 6900
tgacacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga 6960
atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc 7020
ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 7080
acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 7140
atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 7200
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 7260
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 7320
gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 7380
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 7440
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 7500
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7560
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7620
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7680
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7740
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7800
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7860
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 7920
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 7980
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 8040
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 8100
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 8160
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 8220
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 8280
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 8340
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 8400
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 8460
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 8520
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 8580
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 8640
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 8700
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 8760
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 8820
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 8880
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 8940
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 9000
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 9060
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 9120
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 9180
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 9240
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 9300
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgac 9357
Claims (20)
1.一种重组载体，其特征在于，该重组载体包含自身失活的慢病毒载体序列和HBB编码多核苷酸基因序列的至少一部分，其中所述HBB编码多核苷酸基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的序列如SEQ ID NO：2-4中任一个序列所示。
3.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体使用的启动子选自UbC启动子、EF1α启动子和CAG启动子中的一种。
4.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括WPRE元件。
5.如权利要求1至4任一项所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在所述自身失活的慢病毒载体的多克隆位点中连接了HBB基因序列。
6.一种重组载体的制备方法，其特征在于，
将HBB编码多核苷酸的至少一部分连接到自身失活的慢病毒载体的多克隆位点中构建重组载体，再将阳性重组载体转染宿主细胞培养，获得重组载体，所述HBB编码多核苷酸基因序列如SEQ ID NO：1所示。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体的序列如SEQ ID NO：2-4中任一个所示。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体的启动子选自UbC启动子、EF1α启动子和CAG启动子中的一种。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述HBB编码多核苷酸连接入慢病毒载体所采用的酶切位点为BamHI和EcoRI酶切位点。
10.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括WPRE元件。
11.一种病毒，其包含权利要求1-4任一项所述的重组载体。
12.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-4任一项所述的重组载体。
13.一种组合物，所述的组合物包含权利要求1-4任一项所述的重组载体或权利要求11所述的病毒或权利要求12所述的细胞中的一种或一种以上。
14.如权利要求1-4任一项所述的重组载体或权利要求11所述的病毒或权利要求12所述的细胞或权利要求13所述的组合物在制备用于预防和治疗地中海贫血病药物中的用途。
15.如权利要求14所述的用途，所述地中海贫血病包括α地中海贫血和β地中海贫血。
16.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的药物还包含可药用的稀释剂、赋形剂或给药载体。
17.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述细胞为造血干细胞。
18.一种预防或治疗地中海贫血病的方法，包括向所需受试者施用有效量的如权利要求1-4任一项所述的重组载体或权利要求11所述的病毒或权利要求12所述的细胞或如权利要求13所述的组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细胞为造血干细胞。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述受试者为哺乳动物，优选为人类。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910879585.1A CN110699381A (zh) | 2019-09-17 | 2019-09-17 | 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910879585.1A CN110699381A (zh) | 2019-09-17 | 2019-09-17 | 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110699381A true CN110699381A (zh) | 2020-01-17 |
Family
ID=69194865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910879585.1A Pending CN110699381A (zh) | 2019-09-17 | 2019-09-17 | 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110699381A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363756A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-07-03 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6022738A (en) * | 1995-03-03 | 2000-02-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Vectors for expression of globin genes |
| CN1522160A (zh) * | 2001-06-29 | 2004-08-18 | ˹¡-�����ְ�֢�о��� | 编码人珠蛋白基因的载体及其在治疗血红蛋白病中的应用 |
| CN1807650A (zh) * | 2006-02-10 | 2006-07-26 | 南京中脉生物医药有限公司 | 源于hiv－1病毒的缺陷型慢病毒载体 |
| US20090156534A1 (en) * | 2007-09-13 | 2009-06-18 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Globin lentiviral vectors for treatment of disease |
| CN102140442A (zh) * | 2010-02-01 | 2011-08-03 | 北京大学深圳医院 | 重组慢病毒及其制备方法和应用 |
| CN104769112A (zh) * | 2012-11-01 | 2015-07-08 | 菲克特生物科学股份有限公司 | 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品 |
| CN106350541A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-01-25 | 苏州兰希亚生物科技有限公司 | 先天性免疫缺陷基因治疗载体构建方法及其用途 |
| CN106497976A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-15 | 广东铱科基因科技有限公司 | 一种用于矫正重症β‑地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒 |
| CN107208093A (zh) * | 2014-09-04 | 2017-09-26 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 用于治疗血红蛋白病的球蛋白基因治疗 |
| US20170296630A1 (en) * | 2014-09-11 | 2017-10-19 | The United State of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Service | Lentiviral vector for treating hemoglobin disorders |
| CN107532182A (zh) * | 2015-02-23 | 2018-01-02 | 克里斯珀医疗股份公司 | 治疗血红蛋白病的材料和方法 |
| CN107805628A (zh) * | 2017-10-26 | 2018-03-16 | 安徽农业大学 | 一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法 |
| CN110106203A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-09 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 一种新型hbb过表达载体及其设计方法和应用 |
-
2019
- 2019-09-17 CN CN201910879585.1A patent/CN110699381A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6022738A (en) * | 1995-03-03 | 2000-02-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Vectors for expression of globin genes |
| CN1522160A (zh) * | 2001-06-29 | 2004-08-18 | ˹¡-�����ְ�֢�о��� | 编码人珠蛋白基因的载体及其在治疗血红蛋白病中的应用 |
| CN1807650A (zh) * | 2006-02-10 | 2006-07-26 | 南京中脉生物医药有限公司 | 源于hiv－1病毒的缺陷型慢病毒载体 |
| US20090156534A1 (en) * | 2007-09-13 | 2009-06-18 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Globin lentiviral vectors for treatment of disease |
| CN102140442A (zh) * | 2010-02-01 | 2011-08-03 | 北京大学深圳医院 | 重组慢病毒及其制备方法和应用 |
| CN104769112A (zh) * | 2012-11-01 | 2015-07-08 | 菲克特生物科学股份有限公司 | 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品 |
| CN107208093A (zh) * | 2014-09-04 | 2017-09-26 | 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 | 用于治疗血红蛋白病的球蛋白基因治疗 |
| US20170296630A1 (en) * | 2014-09-11 | 2017-10-19 | The United State of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Service | Lentiviral vector for treating hemoglobin disorders |
| CN107532182A (zh) * | 2015-02-23 | 2018-01-02 | 克里斯珀医疗股份公司 | 治疗血红蛋白病的材料和方法 |
| CN106350541A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-01-25 | 苏州兰希亚生物科技有限公司 | 先天性免疫缺陷基因治疗载体构建方法及其用途 |
| CN106497976A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-15 | 广东铱科基因科技有限公司 | 一种用于矫正重症β‑地中海贫血患者自体造血干细胞的HBB基因试剂盒 |
| CN107805628A (zh) * | 2017-10-26 | 2018-03-16 | 安徽农业大学 | 一种稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin‑4的细胞系及其构建方法 |
| CN110106203A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-09 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 一种新型hbb过表达载体及其设计方法和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MA Q等: "NM_000518.5", 《GENBANK》 * |
| MICHAEL ANGASTINIOTIS等: "Thalassemias: An Overview", 《INT J NEONATAL SCREEN》 * |
| 刘华颖等: "地中海贫血的基因治疗", 《中国实用儿科杂志》 * |
| 梅兴国主编: "《微载体药物递送系统》", 华中科技大学出版社 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363756A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-07-03 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用 |
| CN111363756B (zh) * | 2020-04-02 | 2023-01-17 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种珠蛋白基因双表达慢病毒载体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2443242T3 (en) | Production cells for replicative retroviral vectors | |
| KR101724162B1 (ko) | 유전자 요법 벡터와 시토신 디아미나아제 | |
| KR102162096B1 (ko) | Adcc 활성의 개선된 정량화를 위한 산물들 및 시스템 | |
| CA3112654A1 (en) | Recombinant poxviruses for cancer immunotherapy | |
| KR20160029124A (ko) | Pd－１ 항원 또는 pd－１ 리간드 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자 | |
| US20040197910A1 (en) | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector | |
| US20040185556A1 (en) | DNA cloning vector plasmids and methods for their use | |
| KR101757083B1 (ko) | 키메라 시토메갈로바이러스 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하는 발현 벡터 | |
| CA2443258A1 (en) | Replicons derived from positive strand rna virus genomes useful for the production of heterologous proteins | |
| CN113831394B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗 | |
| CN108348594A (zh) | 犬科动物细小病毒(cpv)病毒样颗粒(vlp)疫苗及其用途 | |
| CN100366747C (zh) | 低氧诱导因子小干扰rna质粒 | |
| CN109666647B (zh) | 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110699381A (zh) | 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途 | |
| CN106755100A (zh) | 可控性hiv‑1基因组靶向编辑系统和其靶向载运系统 | |
| US20040096972A1 (en) | Chimeric plasmid comprising a replicative retroviral genome, and uses | |
| US20210010031A1 (en) | Lentiviral vectors for high-titer transduction of primary human cells | |
| CN108715864A (zh) | 一种用于小鼠胚胎干细胞的基因插入突变系统及其突变方法和应用 | |
| CN109913499A (zh) | 一种适用于长链非编码rna构建及表达的整合型慢病毒载体系统及其应用 | |
| CN109609554B (zh) | 一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| KR20220050073A (ko) | 뇌 조직으로 유전자를 전달하기 위한 조성물 및 이의 용도 | |
| CN112442512A (zh) | 基于tRNA-gRNA-cRNA进行日本青鳉胚胎和细胞的基因编辑系统 | |
| RU2724431C1 (ru) | Рекомбинантная клеточная линия CYTO-CAR-YT-Lact, проявляющая повышенную цитотоксическую активность по отношению к PSCA-позитивным раковым клеткам человека | |
| CN114107394B (zh) | 一种慢病毒转移载体、表达PylRS及tRNACUA的细胞系及制备方法与应用 | |
| CN114835822B (zh) | 猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200117 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |