CN1522160A - 编码人珠蛋白基因的载体及其在治疗血红蛋白病中的应用 - Google Patents
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Abstract
重组慢病毒载体,所述载体含有一个编码功能性珠蛋白基因的区域;和β-珠蛋白基因座调控区的大部分区域,该区域包括I型DNA酶超敏位点HS2、HS3和HS4,当导入哺乳动物如人时,它可使β-珠蛋白在体内表达。任选地,该载体进一步包括一个编码二氢叶酸还原酶的区域。该载体可以用于治疗血红蛋白病,包括β-地中海贫血和镰状细胞贫血病。例如,造血祖细胞或干细胞可以在体外被转化,然后再回输到患者。可采用选择步骤以提高回输群体中转化细胞的百分率。例如,采用一种可使转化细胞比未转化的细胞具有更强药物抗性的选择标记便可用相应的药物处理细胞以进行选择。
Description
关于政府基金的声明
本申请由NHLBI提供基金支持,号码为HL57612。美国政府可享有本发明的某些权利。
关于相关申请的声明
本申请要求2001年6月29日提交的美国临时申请US 60/301,816和2001年7月2日提交的美国临时申请号US 60/302,852的优先权,在此将其并入以供参考。
发明背景
本申请涉及一种包含哺乳动物尤其是人珠蛋白基因的载体,并涉及其在治疗包括β-地中海贫血症和链状细胞贫血病在内的血红蛋白病中的应用。
对于β-地中海贫血症,现有的治疗方式包括血红细胞输血加上铁离子鳌合作用(可以延长生存时间,但是麻烦、昂贵并且是一种不完全的治疗方法),或者异体骨髓移植(该方法存在致命的危险并且对于大多数患者来说也是不适用的)。因此,需要一种替换方法来推动治疗进程。本发明提供一种自身移植造血干细胞的基因校正方法,从而采用基因治疗提供一种低危险和更加有效的长期治疗方法。
尽管基因治疗已经提出了许多年,但在努力发展基因治疗载体中所面临的一个重大挑战是分泌预期蛋白或肽达到治疗有效水平的能力。本发明提供一种迄今为止能够提供治疗意义水平上人珠蛋白的载体。这种能力的提高来自于转入了大量的可调控治疗基因表达的基因调控序列。
发明概述
本发明提供了一种重组慢病毒载体,它包含:
(a)包含功能性珠蛋白基因的区域;和
(b)β-珠蛋白基因座调控区的大部分,其中包括DNA酶I超敏位点HS2、HS3和HS4的大部分。该区域可以是完整位点或者是与如下特定序列具有相同功能的截短的位点。等该载体被导入哺乳动物如人时,它可使β-珠蛋白在体内表达。任选地,该载体进一步包含一个编码二氢叶酸还原酶的区域。
通过导入不同的珠蛋白基因,本发明的载体可以用于治疗血红蛋白病,包括α-和β-地中海贫血和镰刀状细胞贫血疾病。例如,造血祖细胞或干细胞可以在体外被转化,然后再回输到患者。可以加入选择步骤对回输细胞群进行选择以提高转化细胞的百分率。如一种选择标记,其使转化的细胞比未转化的细胞具有更强的药物抗性,可以用相应的药物处理后进行细胞的选择。选择和/或富集也可以在体内进行,例如用氨甲喋呤或类似的叶酸拮抗物来选择由于载体中二氢叶酸还原酶(DHFR)表达而具有抗性的细胞。
附图说明
图1显示本发明重组致癌逆转录病毒载体的基因组结构。
图2显示在本发明范围内的重组致癌逆转录病毒载体的基因组结构。
图3显示证明转化的MEL细胞中平均β-珠蛋白表达升高的实验结果。
图4显示外周血细胞中的平均载体拷贝数,检测周期为24周,上述结果进一步表明应用本发明的载体可以对细胞进行高效率的基因传递。
图5A和B显示,在引入用本发明的载体转化的细胞12天和22周后,每个内源等位基因表达人β-珠蛋白的情况。
图6显示用未选择的TNS9-转导Hbbth3/+骨髓移植15周后的血细胞比容水平、血红细胞计数、网织红细胞计数和血红蛋白水平。
发明详述
本发明的第一个方面提供了一种重组的慢病毒载体,它包含:
(a)一个包含功能性珠蛋白基因的区域;和
(b)β-珠蛋白基因座调控区的大部分,其中包含DNA酶I超敏位点HS2、HS3和HS4。
在本说明书和权利要求中,术语″重组慢病毒载体″指一种人工合成的多核苷酸载体,由一种慢病毒载体和大量的附加片段装配而成,是人类干涉和操作处理的结果。
术语“功能性珠蛋白”指一种核酸序列其表达出一种不会引起血红蛋白病的珠蛋白,并且对于珠蛋白基因缺陷的个体提供治疗上的有效作用。功能性珠蛋白基因可编码一种野生型珠蛋白,适用于被治疗的哺乳动物,或者它可以是一种突变型的珠蛋白,在某一方面具有优良特性,例如较高的氧运输特性。功能性珠蛋白基因包括外显子和内含子,还有珠蛋白启动子和剪接供体/受体。合适地,珠蛋白基因可以编码α-珠蛋白、β-珠蛋白、或者γ-珠蛋白,β-珠蛋白启动子可以用于上述各珠蛋白基因。
本发明的重组载体还包括基因座调控区(LCR)的大部分区域,该基因座调控区包含DNA酶I型超敏位点HS2、HS3和HS4。在先前的研究中,利用了HS2、HS3和HS4的核心区域的较小核酸片段。Sadelain等,Proc.Nat′l Acad.Sci.(USA)92:6728-6732(1995);Lebouich等,EMBO J.13:3065-3076(1994)。术语“大部分区域”指转座子调控区域的一部分,其包含高度敏感位点的大部分区域,与在先研究中使用的仅仅包含核心序列的片段是不同的。该区域可以是完整的位点序列,也可以是与如下特定序列功能相同的截短的位点序列。在本发明优选的实施例中,基因座调控区域的大部分区域是由多个包含DNA酶I型超敏位点的片段装配而成的。另外,该基因座调控区在HS3和HS4的连接处引入两个GATA-1结合位点。虽然不能预期到是何种特定机制,但可以相信这些转录因子结合位点的引入可以加强该载体的效力。
图1显示了本发明载体的一个实施例(TNS9)的基因组结构,TNS9合并了人β-珠蛋白基因(位于-618到+2484),该基因包含一个延长的启动子序列和一个3′-增强子元件。任选地,可去掉慢病毒骨架的3′U3区域部分以提高安全性。在图1中,人β-珠蛋白基因的外显子和内含子表现为开放盒形式,命名为接合供体(SD)、接合受体(SA)、包装区(ψ)、反向响应元件(RRE)、人β-珠蛋白启动子(P)和′-β-珠蛋白增强子(E)。因而,在载体TNS9内,存在一个功能性8-珠蛋白基因,其同时包括该基因的外显子、内含子和人β-珠蛋白基因座相关调控序列,并与基因座调控区的大片段相连接。3.2kb的LCR被组合到dTNS9,其由840bp的HS2片段(SnaBI-BstXl),1308bp的HS3片段(HindIII-BamHI)和1069bp的HS4片段(BamHI-BanII)组成。
本发明的另一个方面,上述β-珠蛋白基因编码序列可以被γ珠蛋白基因(用于镰状细胞贫血症)或α珠蛋白基因(用于α地中海贫血症)替换和取代。在一个方案中,β-珠蛋白基因的NcoI-PstI片段被相应的γ珠蛋白基因片段NcoI-HindE或α珠蛋白基因片段NcoI-PstI所取代。这些片段起始于每一相应珠蛋白基因的翻译起始位点(跨越NcoI位点),并且末端包括它们各自的多聚A(poly-A)信号。在第二个方案中,仅交换这些基因三个外显子之一的编码序列形成嵌合基因。从而,对于γ珠蛋白基因,生成如下的载体,包含β珠蛋白启动子、β珠蛋白5′非翻译区、γ外显子1编码区、γ内含子1、γ外显子2、β内含子2、γ外显子3和β3′非翻译区。因此载体TNS9的所有元件(启动子、增强子、5′和3′非翻译区、LCR元件、两个额外的GATA-1结合位点和β-珠蛋白基因的内含子(至少是最重要的内含子2))仍留在远处。在第三个方案中,修饰γ珠蛋白基因外显子3的遗传密码子,使其序列尽可能类似于β珠蛋白基因。原因在于β珠蛋白基因是最容易被表达的。
本发明的载体还可以包括附加元件以利于该载体在治疗中的应用。如,该载体可以包括选择标记,来确定该载体是否表达,或者作为选择转化的细胞和未转化的细胞的依据,或者包括调控标记,能够使转化细胞靶向终止,从而选择性去除这样的细胞,终止治疗。
在一个进一步详细的实施例中,本发明的载体包括鼠PGK启动子和人二氢叶酸还原酶(DHFR)cDNA作为一个转录单元。DHFR的突变形式可以提高DHFR对药物如氨甲喋呤的抗药性,适合于应用。如,本发明应用了氨基酸22和31位突变的DHFR单链和双链突变体,该突变体在PCT公开号WO 97/33988中有所记载。
图2显示了在本发明范围内的载体的基因组构成。该载体包括一个截短的LTR序列(HIV LTR的-456到-9)和来自于鼠磷酸甘油激酶1基因的PGK启动子(530bp),它还包括一个DHFR-编码区,其编码氨基酸位点22存在s/f突变的人DHFR,基因座调控区和β-珠蛋白区与载体TSN9相同。该载体被定名为dTNS9-PD。该载体结合了DHFR,从而使转化细胞具有了氨甲喋呤抗性,因此,在体内或体外,氨甲喋呤和其它叶酸拮抗物可以作为一种选择手段以提高功能性血红蛋白的水平。造血干细胞用dTNS9-PD进行转化并再输入小鼠,然后给予NMBPR-P(0.5mg剂量)和TMTX(0.5mg剂量)处理5天,发现其表达人β-珠蛋白的水平远远高于对选择的转导细胞先用TMTX和NMBPR-P进行处理再用DTNS9-PD载体进行转导的小鼠。
本发明的载体可用于血红蛋白病患者的治疗。在本发明的一个实施例中,造血祖细胞或干细胞在体外进行转化,再回输到患者。在本说明书和权利要求书中,术语“造血祖细胞和干细胞”包含造血细胞和非造血干细胞,如胚胎干细胞,造血干细胞前体,或任何经体细胞核移植后生成的细胞。现有技术已知,应用慢病毒载体可以把有效基因转移到胚胎干细胞。
可以加入选择步骤以提高回输细胞群体中转化细胞的百分率,例如,采用一种可使转化细胞比未转化的细胞具有更强药物抗性的选择标记便可用相应的药物处理细胞以进行选择。当以DHFR作为选择标记时,该标记可以用于在体外富集转导细胞,或者在体内加以选择以保持载体的有效性。
现结合以下非限制性的实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
为制造载体TNS9,将人β-珠蛋白基因从Mp6L(Sadelain等,Proc.Nat′lAcad.Sci.(USA)92:6728-6732(1995))亚克隆到慢病毒pHR′LacZ(Zuffery等,Nature15:871-875(1997)),取代CMV-LacZ序列。pHR′eGFP的构建是通过eGFP序列取代LacZ(克隆技术)。病毒原种由重组载体pCMVAR8.9(Zuffrey等)经过三次转染得到,293T细胞中的pMD.G参照Dull等,J.Virol.72:8463-8471(1998)中的描述。假模标本病毒颗粒通过超速离心浓缩,重悬浮和滴定测量参照Gallardo等,Blood 90:952-957(1997)中的描述。RSN1用作对照,其具有类似的结构,区别仅在于其LCR仅包含HS2、HS3和HS4的核心部分。Northern杂交分析显示转录了全长的RNA,表明重组慢病毒基因组是稳定的。Southern杂交分析转导细胞的基因组DNA,对其每一长末端重复序列(LTR)消化一次,结果得到与预期载体大小相对应的单条带,表明前病毒没有发生结构重排。
实施例2
为了研究编码人β-珠蛋白基因载体表达水平的组织特异性和阶段特异性,将RNS1和TNS9转导到MEL细胞,淋巴Jurkat细胞和骨髓HL-60细胞。离细胞病毒上清液在1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚基聚甲溴化物(polybrene)(8μg/ml)存在下转染C88MEL细胞。转导的MEL细胞通过限量稀释进行亚克隆,并通过PCR筛选转导细胞,所用引物为人β-珠蛋白启动子序列(pPS,5′-GTCTAAGTGATGACAGCCGTACCTG-3′)和HS2(C2A,5′-TCAGCCTAGAGTGATGACTCCTATCTG-3′)。载体拷贝数和整合位点分析通过Southern杂交分析。转导的MEL细胞用5mM N,N′-环己二乙酰胺(HMBA,Sigma)培养5天直至诱导成熟。
为了诱导β-珠蛋白的转录,转导的MEL细胞库用环己二乙酰胺(HMBA)进行分化。人β-珠蛋白和鼠β-珠蛋白的转录通过定量引物延伸进行测定。对载体拷贝数和内源β-珠蛋白等位基因的表达进行标准化处理,在RNS1和TNS9 MEL细胞库中人β-珠蛋白表达水平分别为14.2±4.7%和71.3±2.3%(图2a)。MEL,Jurkat和HL-60细胞用RNS1,TNS9或对照GFP重组慢病毒进行转导。在HMBA诱导的MEL细胞(灰色带)中人β-珠蛋白RNA的表达通过定量引物延伸进行测定,并与鼠β-珠蛋白RNA每一基因座的表达进行标准化处理,再与通过Southern杂交得到的载体拷贝数进行标准化处理。在未诱导的MEL(黑色带)、Jurkat(白色带)或HL-60(阴影带)细胞中没有检测到人β-珠蛋白RNA的表达,表明珠蛋白表达具有细胞种类和分化特异性。在未诱导的MEL,Jurkat和HL-60细胞(图3)中未检测到人β-珠蛋白的表达,表明人β-珠蛋白的表达是受适当调控的,具有组织特异性和分化阶段特异性。为了区分用TNS9转导的HMBA处理的MEL细胞比用RNS1转导表达增加是每个细胞中β-珠蛋白表达增加的结果还是表达人β-珠蛋白的细胞数量增加的结果,我们生成了一系列的MEL细胞克隆,其携带的载体只有一个拷贝。转导的MEL细胞在转导后立即进行有限稀释亚克隆,避免在药物选择中任何有利的染色体整合位点的偏离。表达人珠蛋白的克隆的比例在两种载体间存在显著不同,十个RNS1阳性克隆中有一个产生可检测的人β-珠蛋白转录,而12个TNS9阳性克隆中有12个高水平表达β-珠蛋白,与在RNS1表达水平相比(P<0.01,费雪(Fisher)精确测试)。TNS9细胞比RNS1具有更高的人β-珠蛋白表达水平(P<0.01,Wilcoxon等级综合测试(Wilcoxon rank sumtest))。这些发现表明在随机整合位点,载体TNS9的表达水平和表达概率都提高了。
实施例3
人β-珠蛋白RNA的定量测定
从MEL,Jurkat和HL-60细胞,或鼠脾和血中,用TRIzol提取总量RNA。定量引物延伸分析应用引物延伸系统AMV逆转录试剂盒(Promega),含有[32P]dATP末端标记引物,该引物特异于衍生逆转录病毒人β-珠蛋白(5′-CAGTAACGGCAGACTTCTCCTC-3′)和鼠珠蛋白(5′-TGATGTCTGTTTCTGGGGTTGTG-3′),分别产生90bp和53bp的延伸产物。探针检测到相同长度的产物βmaj,βmin,βs和βt,引物退火得到4μg RNA,反应过程参照厂商说明,磷放射自显影(BioRad)定量分析放射性条带,从A85.68鼠20分离得到的RNA作为阳性对照。引物标记校正后,人到鼠RNA信号通过重复实验结果为29±1%每基因拷贝(n>8),与基于RT-PCR20的发现是一致的。在骨髓嵌合体中得到的数值以在A85.68 RNA样品中得到的数值为标准进行标准化。在图2和3c、d中,测定每一载体拷贝所表达的人β表达量,并以内源基因转录为参照进行标准化(参照两个内源等位基因)。在图3b中人β-珠蛋白RNA转录以总量比表示,反应载体编码转录的绝对贡献值。
实施例4
载体在体内功能的研究,转导并移植未加选择的鼠骨髓细胞,致死量照射受试鼠,骨髓供体从8到16周C57BL/6或Hbbth3/+小鼠(Jackson Laboratories)雄鼠腿骨中得到,之前6天静脉(i.v.)注射5-氟尿嘧啶(5-FU,Pharmacia;每千克体重150mg)。骨髓细胞重悬浮于无血清介质,加入IL-1α(10ng/ml)、IL-3(100U/mL)、IL-6(150U/ml)、Kit配体(10ng/ml)(Genzyme)、β-巯基乙醇(0.5mM;Sigma)、L-谷氨酰胺(200mM)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100ug/ml),并培养18小时。受体小鼠为11-14周龄的C57/BL6或Hbbth3/+小鼠),在移植当天用10.5Gy(单独剂量2×5.25Gy)照射。骨髓细胞呈球状悬浮在包含浓缩慢病毒上清液的无血清介质中,并加入1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚基聚甲溴化物(8μg/mL),L-谷氨酸盐(200mM),青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/mL),并培养6小时。转导的骨髓细胞(1×105或5×105)静脉注入每一个经照射的雌性小鼠,分别设立短期和长期的骨髓嵌合体。
在短期的研究中,移植后12天取出脾,提取总RNA和基因组DNA。对于长期嵌合体,每4-6周收集2-3毛细管的血,并提取基因组DNA、总RNA和血红蛋白。纯化脾红细胞群,检查长期动物中载体功能的可靠性。单细胞悬浮液与鼠对鼠TER-119单克隆抗体共温育(PharMingen)。在表面抗体脾细胞中加入羊对鼠IgG dynabeads(M-450,Dynal公司),并参照制造商的方法进行纯化。载体拷贝数,整合方式和嵌合体通过Southern杂交进行分析。受体和供体DNA的片段采用剥离和重探针技术进行测定,杂交用[32p]dCTP-标记探针,该探针特异于Y染色体,并参照鼠内源条带进行标准校正。放射性条带通过磷放射自显影进行定量测定。随机选择5个长期骨髓细胞嵌合体(移植30周后),提取血清,用Amplicor HIV-1检测试剂盒(Roche)通过RT-PCR测试对HIV-1gag的抗性。
载体拷贝数和人β-珠蛋白RNA转录,在分别用RNS1(n=8)或TNS9(n=10)转导的骨髓移植到鼠体内24周之内进行测定,a,载体拷贝数采用southern杂交分析,基因组DNA来自于6、10、16、24周鼠的外周血。外周血细胞中的平均载体拷贝数在24周时测定(图4),结果显示在两种载体中产生了高效的基因转导(平均每个细胞载体拷贝数为1.8+0.6和0.8+0.6,同期β-珠蛋白转录水平在10-20%之间)。为了评估每个载体拷贝的转录活性,测定了CFU-S12和脾红细胞TER-119+稳定期的RNA转录和载体拷贝数。移植12天后人β-珠蛋白每内源等位基因的表达显示在图中(图5a),12周后这些数值分别是0.5±0.1%(显著低于12天时的值,P=0.02)和15.8±0.9%(图5b)。
上述发现证明大的LCR片段可以提高珠蛋白在体内的表达,并且,进一步提示TNS9比RNS1具有更高的转录沉默抗性。
TNS9编码人β-珠蛋白的水平可以被测定。测定了外周血红细胞中的血红蛋白四聚体、编码人βA载体和内源鼠α-珠蛋白(命名为Hbbhu),红细胞在醋酸纤维素凝胶分级后裂解,移植24周后发现Hbbhu的水平接近总量血红蛋白的13%(图3e,增补页中的表1)。在同样的化验中,包含一个人工合成的含有完整的β-珠蛋白样基因的230-kb酵母染色体(YAC)拷贝的转基因鼠显示为总血红蛋白量的14%。在带有RNS1的鼠中没有发现含有人βA的血红蛋白四聚体(增补页中表1)。人βA和TER-119的双重着色显示,在大多数的TNS9骨髓嵌合体中,成熟的表达人βA外周血细胞的比例是很高的。相比之下,转导RNS1的骨髓嵌合体,着色弱不能确定是红血球βA阳性的比例很高。βA成熟红细胞流动分级计数,在YAC转基因鼠中,包含编码βA慢病毒的血红蛋白平均量为64%。
实施例5
为了确定被转导的确实是HSCs,我们从原受体收集移植24周后的骨髓,进行了第二次移植,移植13周后,在所有的二次受体中很容易检测到TNS9和RNS 1载体,所有的TNS9转导骨髓受体,都保留了人β-珠蛋白的表达。整合位点的分析进一步验证了HSCs转导成功。移植13周后,收集第二次骨髓移植受体的骨髓、脾和胸腺,对其基因组DNA作Southern杂交分析(显示第二次移植受体RNS1的一个代表,和TNS9的两个代表。在鼠C57BL/6(B6)基因组DNA发现了两个内源条带。
实施例6
关于表达水平高的研究,我们检测了载体TNS9纠正地中海贫血症细胞的程度,应用了β-地中海贫血症杂合子鼠,该鼠缺少一个b1和b2 β-珠蛋白基因拷贝(Hbbth3/+)21。这些杂合子临床表型类似于人地中海贫血症并表现出变性贫血(血球容积为28-30%,血红蛋白为8-9g/dl)并且红细胞大少、形状不正常(红血球大少不等症,异形红细胞症)。用未选择的TNS9转导Hbbth3/+骨髓移植,15周后,血球容积水平、血红细胞计数、网织红细胞计数和血红蛋白水平,在所有5个受试鼠中全部出现了显著的升高(图6)。含有载体TNS9的嵌合体外周血涂片显示,红血球大少不等症和异形红细胞症显著降低。对照鼠用Hbbth3/+骨髓细胞进行移植,该骨髓细胞用编码绿色荧光蛋白的载体进行转导(eGFP),对照全部表现为严重的贫血(n=5,图6)并且红细胞的形状依然异常。这些结果证明TNS9产生的血红蛋白确实可用于治疗。
TNS9中,携带β-珠蛋白基因和LCR构造的重组慢病毒载体具有高效的基因转导和不发生基因重排的特点,使TNS9表达治疗范围内的人β-珠蛋白。与RNS1相比,TNS9的这种高表达特性,是与MEL细胞中较高比例的整合位点和骨髓嵌合体中较高比例的包括血红细胞在内的人βA有关。携带一个较弱增强子的RNS1一直表现的很沉默,而同期的TNS9却保持持续的转录活性,在二次移植受体中也是如此。
在TNS9转导Hbbth3/+骨髓移植受体的外周血样品中得到了较高水平的鼠α2:人βA 2四聚体(总血红蛋白量的21±3%,n=5,用Hbb+/+骨髓移植的仅为6±4%,n=10)。这两组实验反应了外周血载体拷贝数和人β-珠蛋白RNA水平的对比(分别为0.8±0.2比0.8±0.6和16.8±6%比10.8±7%)。这个发现与鼠β-珠蛋白比人β-珠蛋白在与鼠α-珠蛋白联合时具有更强的竞争优势的结果是一致的22。在地中海贫血病患者,加入人β链,导致α∶β链不均衡,从而提高患者红细胞的寿命并改善红细胞的生成。在镰状细胞贫血病患者中,导入βA链预期在与两个内源基因产生的βs链竞争α-链时是有利的23。S/β地中海贫血患者,其HbA仅占血红蛋白总量的10-30%,给予后反应很温和1,24,这样的干涉在临床上将是非常有意义的。
实施例7
为了研究转导的人β-珠蛋白基因的长期表达和治疗效果,我们制备了骨髓嵌合体,该嵌合体由TNS9转导Hbbth3/+骨髓细胞(n=5),并研究了40周的时间。
从8-16周龄c57/BL6或Hbbth3/+雄性鼠23的腿骨中得到供体骨髓,该鼠得自于Jackson实验室(Bar Harbor,ME),之前6天静脉注射5-氟尿嘧啶(5-FU,购自Pharmacia(Piscataway,NJ)),每千克体重150mg。骨髓细胞重悬浮在X-VIVO-15无血清介质中并加入10ng/mL白介素-Iα(IL-1α)、100U/mL IL-3、150U/mL IL-6、10ng/mL配体(购自Genzyme,Cambridge,MA)、0.5mM β-巯基乙醇(购自Sigma,圣路易斯,MO)、200mM L-谷氨酸盐、100IU/mL青霉素和100ug/mL链霉素。骨髓细胞呈球状并重悬浮于无血清介质,包括浓缩的慢病毒上清液并加入8mg/mL的1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚基聚甲溴化物(Sigma)、200mM L-谷氨酸盐、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和如上的细胞因子,并培养8小时。转导的骨髓细胞(5×105)静脉注入照射后的雌性受体,以建立骨髓嵌合体。受体鼠为11-14周龄的C57/BL6或Hbbth3/+在移植当天照射,剂量共为10.5Gy,分两次,每次为5.25Gy。
同龄嵌合体(age-matched chimera)用eGFP转导的Hbbth3/+(n=5)嫁接,并以Hbb+/+(n=5)骨髓细胞作为对照。采用Southern杂交检测外周血中的载体拷贝数,发现平均在0.5和1.0拷贝/细胞之间,而且很稳定。采用定量血红蛋白分析来评估蛋白表达量,以估量血红蛋白四聚体的比例,四聚体由人βA(Hbbhu,mu a2:huβA 2)或鼠β-珠蛋白(Hbbmu,muα2:muβ2)和免疫荧光素,并测定包含人βA蛋白的成熟RBCs的比例。作为对照的转基因鼠带有一个230-kb酵母人工染色体的拷贝,该染色体包含完整的人β-珠蛋白样基因簇28,总血红蛋白中有14%含有人βA和100%βA+RBCs19,28。在TNS9嵌合体中Hbbhu量占到血红蛋白总量的19%-22%。移植40周后仍然保持这样的水平,同期,通过人βA和TER-119的双重着色显示,表达人βA成熟外周RBCs的比例也保持较高水平并且很稳定(约为70%到80%)。
实施例8
长期改善贫血的研究
在外周血中检测到,编码βA的TNS9表达很稳定性,从而提示可以用于长期血液和全身治疗。为了研究Hbbhu产物是否足以用于贫血症的治疗,我们进行了40周的血红蛋白监测。在此阶段,血红蛋白浓度、RBC计数和血球容积一直保持显著的增加。接受eGFP转导Hbbth3/+骨髓细胞移植的对照鼠,表现为严重的贫血症状,表明移植过程本身不改变贫血状况。在TNS9处理的嵌合体中,网状细胞计数减少到5%-8%,同时在对照组eGFP处理的Hbbth3/+嵌合体中和同龄Hbbth3/+鼠中,该值为19%-21%,表明RBC寿命延长、红血球生成活性降低。
实施例9
为检测人β-珠蛋白基因的持续表达对造血作用的影响,我们研究了1岁龄嵌合体和同龄对照鼠的脾肿大的程度和EMH。TNS9处理的Hbbth3/+合体与接受eGFP转导正常骨髓的受体相比,检测到的脾重量没有显著差别,同时每个脾的细胞总数量也没有显著差别。相比之下,接受eGFP-转导Hbbth3/+骨髓细胞的鼠,脾重量和细胞总数增加了大约3倍。TNS9骨髓嵌合体脾重量的校正与总造血祖细胞容量校正标准相同。在eGFP-转导的Hbbth+/+骨髓受体中,脾CFU-Es、BFUEs和CFUs-GM水平降低,而在嫁接了eGFP-转导的Hbbth3/+骨髓细胞的对照嵌合体中和同龄Hbbth3/+鼠中,保持高水平,与先前在其它β-地中海贫血症鼠科模型中的发现相同29。
长期嵌合体和同龄对照,脾和肝脏的形态学检查验证了EMH的退化。移植了eGFP-转导的Hbbth3/+骨髓的鼠的脾组织病理学与对照Hbbth3/+鼠脾相同。尤其是,代表性区域的红髓显著增加,达到80%-90%,并且有核红细胞前体的浓度增加。在代表性区域,白髓相应地减少,并且由于有核的RBCs数量巨大使边缘区域变得模糊不清,反应了红髓和红细胞前体的扩展。在TNS9-处理的嵌合体中,红髓的量显著减少,仅约占代表性区域的50%-60%,同时,在红髓中有核红细胞前体的数目也降低了。红髓中存在其它的未成熟的造血细胞,但出现频率远低于对照Hbbth3/+地中海贫血症鼠的脾。TNS9-处理嵌合体的肝脏与正常对照鼠的肝脏相似,未检测到EMH。相反,移植eGFP-转导的Hbbth3/+骨髓细胞的鼠的肝脏,在窦状小管内发现有小的EMH转化灶。
实施例10
RBC的破坏和胃肠铁离子的增加导致有毒铁离子在地中海贫血病患者组织内的积聚。为了检测载体TNS9的持续表达是否会减少铁离子的过量负荷,我们研究了肝脏和心脏的组织切片,用Gomori铁离子染色剂进行染色。在正常Hbb+/+对照鼠中未发现铁离子沉积,而Hbbth3/+鼠显示铁离子总量的变化,包括一些巨大的集合体。TNS9-转导处理的嵌合体的肝脏中的铁离子水平低到无法检测,而在所有的接受eGFP-转导的Hbbth3/+骨髓细胞移植的小鼠中,肝脏中的铁离子很容易被检测到。在处理和对照鼠心脏中,均未发现铁离子的沉积,与先前在另外鼠β-地中海模型中的发现相一致,与在人类疾病中的发现是相反的。1-3
实施例11
为了评估转化了本发明珠蛋白和DHFR编码序列载体的细胞在体内的选择效能,应用二氢叶酸,采取如下的可供选择的方案。在方案1中,受体鼠在转导了骨髓细胞6周后,连续5天,每天用MTX(25mg/Kg)和NBMPR-P(20mg/Kg)进行处理。在方案2中,受体鼠在转导了骨髓细胞6周后,连续5天,每天用TMTX(40mg/Kg)和NBMPR-P(20mg/Kg)进行处理。在方案3中,用白消安(二甲磺酸丁酯)代替γ-照射处理的受体鼠,在转导了骨髓细胞4周后,连续5天,每天用TMTX(40mg/Kg)和NBMPR-P(20mg/Kg)进行处理。(TMTX(Neutrexin;US Bioscience);>MTX(氨甲喋呤LPF钠盐(Methotrexate LPF Sodium);Immunex);NBMPR-P(硝基苄基硫代5′-单磷酸双钠盐(Nitrobenzylthioinosine 5′-monophpsphate disodium salt);Alberta核苷疗法)。方案3的独特之处在于,不照射受体并且不进行骨髓离体处理(myeloablativeconditioning regimen)。它们的处理条件相对温和,包括“非骨髓离体”剂量的白消安(二甲磺酸丁酯)。预期,结合DHFR/TMTX调节的“体内选择”可以减少移植前处理给移植受体所带来的痛苦,这将是治疗严重血红蛋白病的一个方向。
Claims (12)
1.一种重组慢病毒载体,其特征在于,所述载体包括:
(a)一个包含功能性珠蛋白基因的区域;
(b)β-珠蛋白基因座调控区的大部分区域,其包括完整的DNA酶I超敏位点HS2、HS3和HS4,当导入哺乳动物时所述载体可使β-珠蛋白在体内表达;
(c)一个二氢叶酸还原酶编码区。
2.如权利要求1所述的载体,其特征在于,它进一步包括一个鼠PGK启动子,其中所述鼠PGK启动子调控二氢叶酸还原酶编码区的表达。
3.如权利要求1或2所述的载体,其特征在于,所述珠蛋白基因编码人β-珠蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的载体,其特征在于,所述二氢叶酸还原酶是人二氢叶酸还原酶。
5.如权利要求4所述的载体,其特征在于,所述人二氢叶酸还原酶是一种突变形式,它与野生型人二氢叶酸相比具有增强的二氢叶酸拮抗物抗性,所述突变形式与野生型人二氢叶酸还原酶在氨基酸序列上是不同的,这是一组突变的结果。
6.如权利要求5所述的载体,其特征在于,该组突变包括对应于野生型序列氨基酸22的氨基酸突变和对应于野生型序列氨基酸31的氨基酸突变。
7.如权利要求1-6中任一项所述载体在转导造血祖细胞或干细胞以在患有血红蛋白病的哺乳类个体中治疗血红蛋白病的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,在体外进行采用二氢叶酸拮抗物的选择步骤以制造转化细胞数目增加的细胞群体。
9.如权利要求8的所述应用,其特征在于,所述二氢叶酸拮抗物是氨甲喋呤。
10.被权利要求1-6中任一项所述重组载体转导的哺乳动物造血祖细胞或干细胞。
11.一种制造用于治疗哺乳类个体血红蛋白病的治疗组合物的方法,其特征在于,所述方法包括制备如权利要求1-6中任一项所述的重组载体,从哺乳类个体获得造血祖细胞或干细胞,以及用重组载体转导细胞的步骤。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述方法进一步包括用二氢叶酸拮抗物进行体外选择的步骤。
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