JP2004537539A

JP2004537539A - ヒトグロビン遺伝子をコードするベクターとその異常ヘモグロビン血症の治療におけるその使用

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Publication number: JP2004537539A
Application number: JP2003508393A
Authority: JP
Inventors: サデライン、ミッチェル; メイ、チャド; ベルティノ、ヨゼフ; リベラ、ステファノ
Original assignee: スローン − ケッタリングインスティチュートフォーキャンサーリサーチ
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2002-07-01
Publication date: 2004-12-16
Also published as: WO2003002155A1; CA2451173C; EP1409025A1; EP1409025B1; US7541179B2; WO2003002155B1; ATE535260T1; CA2451173A1; US20030022303A1; EP2359868B1; ES2582028T3; IL159371A; IL159371A0; EP2359868A1; EP1409025A4; CN1522160A; US8058061B2; US20090274671A1; BR0211307A

Abstract

機能性グロビン遺伝子コード化する領域を有する組み換えレンチウイルスおよび哺乳動物、例えばヒトにｉｎｖｉｖｏで導入された時に、ＤＮａｓｅ過敏亢進部位、ＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４を含むβグロビン座制御領域の大きな部分がβグロビンの発現を提供する。該ベクターは更に任意にジヒドロ葉酸還元酵素をコード化する領域を含む。該ベクターをβサラセミアおよび鎌状赤血球細胞疾患を含む異常メモグロビン血症の治療に使用できる。例えば造血前駆細胞または幹細胞はｅｘｖｉｖｏで形質変換し、ついで患者に返してもよい。戻った集団中の形質変換された細胞の割合を増加するために選択プロセスを使用してもよい。例えば、形質変換された細胞が形質変換されていない細胞よりもより薬物抵抗性にする選択マーカーの選択によって、対応した薬物による細胞の治療ごとの選択が可能になる。

Description

【技術分野】
【０００１】
政府の資金援助に関する陳述
本出願はＮＨＬＢＩ認可Ｎｏ．ＨＬ５７６１２の下で提供された資金で支援された。米国政府は本発明に一定の権利を有することができる。
関連出願に関する陳述
本出願は２００１年６月２９日に受理された米国仮出願第６０／３０１，８６１および２００１年７月２日に受理された米国仮出願第６０／３０２，８５２の便益を請求する。両仮出願を参考資料として本明細書に組み入れる。
【０００２】
本出願は哺乳類の遺伝子、特にヒトのグロビン遺伝子を含むベクターと、αおよびβサラセミアおよび鎌状赤血球細胞疾患を含む異常メモグロビン血症の治療におけるその使用に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在のβサラセミアの治療様式は赤血球の輸血と鉄のキレート化（生存を延長するが、扱い難く、高価で、且つ不完全な治療である）または同種異型の骨髄移植（致死的なリスクを伴い、患者の大部分に利用できない）のいずれかからなる。従って改良された治療法の実質的なニーズがある。本発明はリスクの少ない、より有効な長期の治療を提供するために、遺伝子治療を用いる自己造血幹細胞中の遺伝子の修正を提供する。
【０００４】
遺伝子治療は長年に亘って提案されているが、遺伝子治療のベクターを開発するための努力が直面している重要な課題は、治療上有用なレベルの所望の蛋白またはペプチドを産生する能力である。本発明は持続した時間に亘って、治療上意義のあるレベルのヒトグロビンの供給が可能なベクターを提供する。この能力は治療遺伝子の発現を制御する大きなゲノムの調節配列を伝える能力から生れる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に従って、
（ａ）機能的グロビン遺伝子を含む領域および
（ｂ）ＤＮａｓｅＩ過敏亢進部位ＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４の大きな部分を含むβグロビン座制御領域の大きな部分を含む組換えレンチウイルスベクターが提供される。その領域は、以下に設定する特別な配列と同じ機能性を提供する完全な部位または若干小さな部位であってもよい。このベクターはｉｎｖｉｖｏで哺乳類、例えばヒトに導入された時に、βグロビンの発現を提供する。そのベクターは更にジヒドロ葉酸還元酵素をコード化する領域を含むことを任意に選択できる。
【０００６】
異なったグロビン遺伝子を組み込むことによって、本発明のベクターはαおよびβサラセミアおよび鎌状赤血球細胞疾患を含む異常メモグロビン血症の治療に用いることができる。例えば、造血前駆細胞または幹細胞はｅｘｖｉｖｏで形質転換し、ついで患者に返してもよい。戻った集団中の形質転換された細胞の割合を増加するために選択プロセスを使用してもよい。例えば、形質転換された細胞が形質転換されない細胞よりもより薬物抵抗性になる選択マーカーを選ぶことによって、対応した薬物による細胞の治療ごとの選択が可能になる。選択および／または強化は、例えばメトトレキセートまたは類似の葉酸拮抗薬を使用して、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のベクターからの発現によって抵抗性を付与された細胞を選択するためにｉｎｖｉｖｏで実施してもよい。
【０００７】
本発明の最初の態様において、組換えレンチウイルスベクターは
（ａ）機能的グロビン遺伝子を含む領域、および
（ｂ）ＤＮａｓｅＩ過敏亢進部位ＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４を含むβグロビン座制御領域の大きな部分、
を含んで提供される。
【０００８】
明細書とその請求項に用いられているように、「組換えレンチウイルスベクター」はヒトでのインターベンションと操作の結果であるレンチウイルベクターと複数の追加断片から組み立てられる人工的に作られたポリヌクレオチドベクターを意味する。
【０００９】
「機能性グロビン遺伝子」はヌクレオチド配列であって、その発現の結果、ヘモグロビン異常症表現型を生じないグロビンができ、グロビン遺伝子欠損の固体に治療の便益を提供するのに有効なヌクレオチド配列である。機能性グロビン遺伝子は治療される哺乳類の固体に適切な野生型のグロビンをコード化してもよく、または、グロビンの変異体型であってもよく、例えば優れた酸素運搬性のような優れた性質のグロビンの変異体型がより好ましい。機能性グロビン遺伝子はグロビンプロモーターおよびスプライスドナー／アクセプターとともにエクソンとイントロンの両方を含む。グロビン遺伝子は適切にαグロビン、βグロビンまたはγグロビンをコード化してもよい。βグロビンプロモーターはそれぞれのグロビン遺伝子に適している。
【００１０】
本発明の組換えベクターはＤＮａｓｅＩ過敏亢進部位ＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４を含む座制御領域（ＬＣＲ）の大きな部分を含む。以前の研究では、ＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４のコア部分にまたがる小さなヌクレオチド断片が使用されている。Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６７２８−６７３２（１９９５）；Ｌｅｂｏｕｉｃｈｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１３：３０６５−３０７６（１９９４）。用語「大きな部分」は以前に試験されたコア要素だけを含む断片とは反対に過敏亢進部位の大きな部分を包含する座領域の部分を意味する。その領域は、以下に設定する特別な配列と同じ機能性を提供する完全な部位または若干小さな部位であってもよい。本発明の好ましい実施形態では、座制御領域の大きな部分は、それぞれがＤＮａｓｅＩ過敏亢進部位の１つにまたがる多数の断片から組み立てられる。更に座制御領域はＨＳ３とＨＳ４の間の接合部で導入された２つのＧＡＴＡ結合部位を有する。特別な機構に縛られることを意図しないが、これらの転写因子の結合部位の組み入れはベクターの有効性を増強すると考えられている。
【００１１】
本発明のベクターの１つの実施形態のゲノムの構造（ＴＮＳ９）を図１に示す。ＴＮＳ９は、延在したプロモーター配列と３’エンハンサー要素を含むヒトβグロブリン遺伝子（−６１８の位置から＋２４８４の位置まで）を組み込んでいる。図１に、ヒトのβグロブリン遺伝子のエクソンとイントロンを■と□で示す。スプライスドナー（ＳＤ）、スプライスアクセプター（ＳＡ）、包装領域（Ψ）、ｒｅｖ応答要素（ＲＥＳ）、ヒトβグロブリンプロモーター（Ｐ）および３’グロブリンエンハンサー（Ｅ）の位置を示す。従って、ベクターＴＮＳ９において、機能性βグロブリン遺伝子は遺伝子のエクソンとイントロンの両方とヒトのβグロブリン座からの関連した制御配列を含む。これらは座制御領域の大きな断片と結合している。ｄＴＮＳ９中に組み立てられた３．２ｋｂＬＣＲは８４０ｂｐＨＳ２断片（ＳｎａＢＩ−ＢｓｔＸＩ）、１３０８ｂｐＨＳ３断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ）および１０６９ｂｐＨＳ４断片（ＢａｍＨＩ−ＢａｎＩＩ）を含む。
【００１２】
本発明の更なる態様において、配列をコード化しているβグロブリン遺伝子はγグロブリン遺伝子（鎌形赤血球細胞疾患）またはαグロブリン遺伝子（αサラセミア）のいずれかと交換または置換できる。１つのストラテジーでは、βグロブリン遺伝子のＮｃｏｌ−ＰｓｔＩ断片は対応したγグロブリン遺伝子のＮｃｏｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片またはヒトαグロブリン遺伝子のＮｃｏｌ−ＰｓｔＩ断片で置換される。これらの断片はそれぞれのグロブリン遺伝子の翻訳開始点（Ｎｃｏｌ部位にまたがる）から出発し、それらのそれぞれのポリアデニル化信号を過ぎて終わる。第二のストラテジーでは、これらの遺伝子の３つのエクソンのそれぞれ１つのコード化配列を交換するだけでキメラ遺伝子が生成できる。従ってガンマグロブリン遺伝子については、その結果は、ベータグロブリンプロモーター、ベータグロブ５’非翻訳領域、ガンマエクソン１コード化領域、ガンマイントロン１、ガンマエクソン２、ベータイントロン２、ガンマエクソン３およびベータ３’非翻訳領域を含むベクターである。従ってＴＮＳ９ベクターのすべての要素はちゃんと残っている（プロモータ、エンハンサー、５’および３’非翻訳領域、ＬＣＲ要素、２つの追加のＧＡＴＡ−１結合部位およびベータグロブリンのイントロン（少なくとも最も重要なイントロン２））。第三のストラテジーでは、ガンマグロブリン遺伝子のエクソン内のコドンの使用によって、その配列がベータグロブリン遺伝子の配列とできるだけ類似するように修正できる。これを試験する理由はベータグロブリン遺伝子が常に最大に発現されているからである。
【００１３】
治療におけるベクターの利用を容易にするために、ベクターに追加の要素を含めてもよい。例えばベクターは、ベクターの発現を確認するために、または形質転換されていない細胞よりも形質転換された細胞を選択する根拠を提供するために選択可能なマーカーまたは形質転換された細胞を標的にした破壊を可能にし、従って治療の中止の必要が生じた場合に選択的にそのような細胞を除去するコントロールマーカーを含んでもよい。
【００１４】
更に特別な実施形態では、本発明のベクターはマウスＰＧＫプロモーターおよび転写単位としてヒトジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のｃＤＮＡを含む。メトトレキセートのような薬物に抵抗性を与えるＤＨＦＲの能力を増加するＤＨＦＲの変異型が適切に使用される。例えば、参考としてここに組み入れる共同譲渡されたＰＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ９７／３３９８８に記載されているように、アミノ酸２２と３１に変異を有する１回または２回の変異体を有利に使用してもよい。
【００１５】
図２は本発明の範囲内の特別なベクターのゲノムの構造を示す。ベクターはＨＩＶＬＴＲの−４５６から−９を削除したＬＴＲとネズミのホスホグリセレートキナーゼ１遺伝子からのＰＧＫプロモーター（５３０ｂｐ）を含む。それはまた、ヒトＤＨＦＲをコード化するアミノ酸２２におけるＳ／Ｆ変異を伴ったＤＨＦＲコード化領域を含む。座制御領域およびベータグロブリン領域はＴＳＮ９におけるのと同じである。このベクターはｄＴＮＳ９−ＰＤと指定されている。このＤＨＦＲのベクターへの組み入れは形質転換された細胞にメトトレキセート抵抗性表現型を与える。その結果、メトトレキセートおよび他の葉酸拮抗薬がｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで機能性ヘモグロビンのレベルを亢進するための選択的道具として使用できる。造血幹細胞がｄＴＮＳ９−ＰＤを用いて形質転換され、マウスに導入された。そのマウスはついでＮＭＢＰＲ−Ｐ（０．５ｍｇ／投与）およびＴＭＴＸ（０．５ｍｇ／投与）で５日間治療された。発現したヒトβグロブリンの観察されたレベルは、形質導入された細胞の選択のためにＴＭＴＸとＮＭＢＰＲ−Ｐで処理後、ｄＴＮＳ９−ＰＤの形質導入マウスでより高かった。
【００１６】
本発明のベクターは異常ヘモグロビン症患者の治療に用いられる。本発明の１つの実施形態において、造血前駆細胞または幹細胞がｅｘｖｉｖｏで形質転換され、ついで患者に戻された。この明細書と請求項に使用されているように、「造血前駆細胞および幹細胞」と言う用語は造血細胞と非造血細胞、例えば胚幹細胞、造血幹細胞前駆体または体細胞から核転移によって生じる後者のいずれをも包含する。ヒト胚幹細胞への効率的な遺伝子転移はレンチウイルスベクターを用いて達成できることが技術分野で知られている。
【００１７】
戻った母集団における形質転換された細胞の割合を増加するために選択プロセスを使用してもよい。例えば形質転換されない細胞よりも形質転換された細胞をより薬物抵抗性にする選択マーカーは対応する薬物による細胞の処理毎の選択を可能にする。ＤＨＦＲを選択マーカーに使用すると、それはｉｎｖｉｔｒｏで形質導入された細胞を増やすために、またはベクターの有効性を維持するためのｉｎｖｉｖｏの選択のために使用できる。
【００１８】
本発明を以下の非限定的実施例を参照して更に記載する。
【実施例１】
【００１９】
ベクターＴＮＳ９を製造するために、ヒトβグロブリン遺伝子を、ＣＭＶ−ＬａｃＺ配列を置き換えて、レンチウイルスベクターｐＨＲ’ＬａｃＺ（Ｚｕｆｆｅｒｙｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１５：８７１−８７５（１９９７））にＭβ６Ｌ（Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６７２８−６７３２（１９９５））からサブクローニングした。ＬａｃＺをｅＧＦＰ配列（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で置き換えてｐＨＲ’ｅＧＦＰを構成した。２９３Ｔ細胞中で、以前にＤｕｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１（１９９８）に記載されているように、組換えベクターｐＣＭＶΔＲ８．９（Ｚｕｆｆｅｒｙｅｔａｌ．）およびｐＭＤ．Ｇの三重トランスフェクションによってウイルスのストックを得た。Ｇａｌｌａｒｄｏｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９０：９５２−９５７（１９９７）に記載されているように偽型ビリオンを超遠心分離で濃縮し、再懸濁し、力価を測定した。比較のために、ＬＣＲがＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４のコア部分だけを含む以外は類似の構造を有するＲＳＮ１を用いた。ノザンブロット分析は完全長のＲＮＡ転写を示し、これは組換えレンチウイルスゲノムが安定していることを示す。各長い末端の繰り返し（ＬＴＲ）において一度消化され、形質導入された細胞からのゲノムのＤＮＡのサザンブロット分析はベクターに予想される大きさに対応した単一鎖を示し、これはプロウイルス構造が配列されていないことを示す。
【実施例２】
【００２０】
ベクターコード化ヒトβグロブリン遺伝子の組織特異性、段階特異性および発現したレベルを調べるために、ＲＮＳ１とＴＮＳ９をＭＥＬ細胞、リンパ球様Ｊｕｒｋａｔ細胞および骨髄性ＨＬ−６０細胞に形質導入した。ポリベン（８μｇ／ｍｌ）の存在下でＣ８８ＭＥＬ細胞を感染するために細胞を含まないウイルス上澄を用いた。形質導入されたＭＥＬ細胞を限定希釈してサブクローニングし、ヒトβグロブリンプロモーター配列（ΒＰＳ，５’ＧＴＣＴＡＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧ−３’）およびＨＳ２（Ｃ２Ａ、５’−ＴＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＴＣＴＧ−３’）中でアニールするプライマーを用いてＰＣＲで形質導入³⁰がスクリーニングした。ベクターのコピー数と組み込み部位分析はサザンブロット分析⁹で側定した。形質導入されたＭＥＬ細胞は５ｍＭＮ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスアセタミド（ＨＭＢＡ，Ｓｉｇｍａ）中で５日間培養して成熟に誘導した。
【００２１】
βグロブリンの転写を誘導するために、ヘキサメチレンビスアセタミドを用いて形質導入し、集めたＭＥＬ細胞を差別化した。ヒトβグロブリン（Β^A）およびマウスΒグロブリン転写は定量プライマー伸長法で測定した。ベクターコピー数および１対立遺伝子当たりの内因性βグロブリン発現に正規化後、集められたＭＥＬ細胞のヒトβグロブリンレベルはＲＮＳ１では１４．２±４．７％、ＴＮＳ９で７１．３±２．３％であった。（図２ａ）。ＭＥＬ，ＪｕｒｋａｔおよびＨＬ−６０細胞にＲＮＳ１、ＴＮＳ９または対照ＧＦＰ組換えレンチウイルスを形質導入した。ＨＭＢＡ誘導ＭＥＬ細胞Ｘ中のヒトβグロブリンＲＮＡ発現（灰色の棒線）を定量プライマー伸長法で測定し、座当たりのマウスβグロブリンＲＮＡ発現に正規化した。ついで、発現をサザンブロットで測定したベクターコピー数で正規化した。非誘導ＭＥＬ（黒い棒線），Ｊｕｒｋａｔ（白い棒線）およびＨＬ−６０細胞（破線の棒線）にはヒトβグロブリンＲＮＡ発現は検出されなかった。これはグロブリン発現が赤血球と分化に特異的であることを示す。非誘導ＭＥＬ，ＪｕｒｋａｔおよびＨＬ−６０細胞にはヒトβグロブリンの発現は検出されず（図３）、これはヒトβグロブリンの発現が組織特異的および分化の状態によって適切に制御されていたことを示す。ＲＮＳ１よりもむしろＴＮＳ９形質導入ＨＭＢＡ処理Ｍｅｌ細胞中で得られた発現の増加が細胞当たりのβ^A発現の増加の結果であるのかヒトβグロブリンを発現している細胞の割合の増加の結果であるのかを識別するために、いずれかのベクターの単一のコピーを有するＭＥＬ細胞のパネルを作った。形質導入直後に、薬物の選択⁵によって生じる好ましい染色体組み込みへのすべてのバイアスを避けて、限定希釈によって形質導入されたＭＥＬ細胞をサブクローニングした。ヒトβグロブリンを発現しているクローンの割合は２つのベクター間で顕著に変化した。ＲＮＳ１陽性の１０個のクローンの内、１つが測定可能なヒトβグロブリン転写を生じたのに対し、ＴＮＳ９では１２個の内１２個がＲＮＳ１陽性クローンよりも高いレベルのヒトβグロブリンを発現した（Ｐ＜０．０１，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓｅｘａｃｔｔｅｓｔ）。ＴＮＳ９を提示した細胞はＲＮＳ１を提示した細胞よりも高いレベルのヒトβグロブリンを発現した（Ｐ＜０．０１，Ｗｉｌｃｏｘｏｎｒａｎｋｓｕｍｔｅｓｔ）。これらの所見は無作為組み込み部位におけるレベルと確率がＴＮＳ９ベクターによって増加したことを明確にした。
【実施例３】
【００２２】
ヒトβグロブリンｍＲＮＡの定量
ＭＥＬ，ＪｕｒｋａｔおよびＨＬ−６０細胞またはマウス脾臓と血液からＴＲＩｚｏｌを用いて総ＲＮＡを抽出した。それぞれ予想される９０ｂｐと５３ｂｐの伸長法産生物を有するレトロウイルス誘導ヒトβグロブリン（５’ＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣ−３’）およびマウスβグロブリン（５’−ＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧ−３’）に特異的な［³²Ｐ］ｄＡＴＰ末端標識プライマーを有するＰｒｉｍｅｒＥｘｔｅｎｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ−ＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量プライマー伸長法アッセイを行った。検体はβ^maj、β^min、β^sおよびβ^tについて同じ長さの製品を生じた。プライマーを４μｇＲＮＡにアニールし、製造業者のプロトコールに従って反応を行った。放射活性帯域はｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒで定量した（ＢｉｏＲａｄ）。Ａ８５．６８マウス²⁰から単離したＲＮＡを陽性対照として用いた。プライマーの標識を補正後、マウスＲＮＡ信号に対するヒトＲＮＡ信号は、繰り返し実験（ｎ＞８）において遺伝子複製当たり２９±１％で、これはＲＴ−ＰＣＲ²⁰に基づく以前の所見と一致している。別の実験で得られた骨髄キメラの測定値をＡ８５．６８ＲＮＡ試料で得られた値に対して標準化した。図２と３ｃとｄにヒトβグロブリンの発現をベクターコピー当たりで表し、内因性転写（２つの内因性対立遺伝子を説明する）に対して正規化した。図３ｂに、ヒトの転写をベクターコード化転写の絶対的寄与を反映するために全βグロブリンＲＮＡ（Ｈｕβ／Ｈｕβ＋Ｍｕβ）の関数として報告する。
【実施例４】
【００２３】
ｉｎｖｉｖｏでのベクターの機能を調べるために、ネズミの骨髄細胞を選択せずに同系の致死的照射移植マウスに形質導入し、移植した。ドナーの骨髄は６日前に５フルオロウラシル（５ＦＵ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ；１５０ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与された８−１６週令のＣ５７ＢＬ６またはＨｂｂ^the3/+mice（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の大腿から洗い流された。骨髄細胞を血清を含まない培地に再懸濁し、ＩＬ−１アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−３（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１５０Ｕ／ｍｌ）、Ｋｉｔｌｉｇａｎｄ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ），ベータメルカプトエタノール（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、Ｌグルタミン（２００ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補給し１８時間培養した。移植マウス（１１−１４週令のＣ５７／ＢＬ６またはＨｂｂ^th3+マウス）には、移植日に１０．５Ｇｙ（分割照射量２ｘ５．２５Ｇｙ）を照射した。骨髄細胞はペレット化し、濃縮レンチウイルス上澄を含む血清を含まない培地に再懸濁し、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）、Ｌグルタミン（２００ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補給し６時間培養した。ついで、形質導入された骨髄細胞（１ｘ１０⁵または５ｘ１０⁵）を照射された雌移植動物のそれぞれに静脈内注射し、それぞれ短期および長期の骨髄キメラを確立した。
【００２４】
短期的な試験では、総ＲＮＡおよびゲノムのＲＮＡを抽出するために移植１２日後に脾臓を切除した。長期のキメラを観察するために、４−６週間ごとに２−３の細管に血液を採取し、それからゲノムのＤＮＡ、総ＲＮＡおよびヘモグロビンを抽出した。長期の動物におけるベクターの機能を、信頼性を以って調べるために脾臓から赤血球細胞集団を精製した。単一細胞の懸濁液をラット抗マウスＴＥＲ−１１９モノクロナール抗体（ＰｈａｒＭＩｎｇｅｎ）と培養した。ヒツジ抗ラットＩｇＧｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−４５０，ＧｙｎａｌＩｎｃ）を抗体でコーティングした脾臓細胞に加え、製造業者が推奨している通り精製した。サザンブロット分析で、ベクターコピー数、組み込みパターンおよびキメラリズムを測定した。ブロットを、Ｙクロモソームに特異的な［³²Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブでストリップし、再プローブして、内因性マウス帯域に正規化してレシピエントに対するドナーＤＮＡの分画を測定した。放射線帯域はｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析で定量した。無作為に選んだ５つの長期の骨髄キメラ（移植後３０日）からの血清はＡｍｐｌｉｃｏｒＨＩＶ−１モニターキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用したＲＴ−ＰＣＲでＨＩＶ−１ｇａｇに対して陰性であった。
【００２５】
ベクターコピー数およびヒトβグロブリンＲＮＡ転写をＲＮＳ１（ｎ＝８）またはＴＮＳ９（ｎ＝１０）を形質導入した骨髄を移植したマウスで２４週間測定した。ベクターコピー数は末梢血から６週目、１０週目、１６週目おとび２４週目に分離したゲノムのＤＮＡのサザンブロット分析で評価した。定期的に２４週間測定した抹消血細胞中の平均ベクターコピー数（図４）は両ベクターの高効率の転移を示した（同じ期間中、１０−２０％の範囲のΒグロブリン転写レベルに対して、細胞当たり１．８±０．６および０．８±０．６平均ベクターコピー数）。ベクターコピーあたりの転写活性を評価するために、溜めたＣＦＵ−Ｓ₁₂および赤血球のＴＥＲ−１１９＋脾臓細胞中で定常状態のＲＮＡ転写とベクターコピー数を定量した。移植１２日後の、内因性対立遺伝子当たりのヒトΒグロブリンの発現を図５に示す。２０週後のこれらの値はそれぞれ０．５±０．１％（１２日目よりも有意に低い、Ｐ＝０．０２）および１５．８±０．９％であった（図５ｂ）。これらの所見は大きなＬＣＲ断片はｉｎｖｉｖｏでグロブリンの発現を増加することを明確化し、またＴＮＳ９はＲＮＳ１よりも転写の不活性に、より抵抗性であることを示唆した。
【００２６】
ＮＴＳ９をコード化したヒトβグロブリンレベルを製造できた。ベクターコード化ヒトβ^A内因性ネズミαグロビン（Ｈｂｂ^hu）を組み込んだヘモグロビン４量体をセルローズアセテートゲルで分別後、末梢血溶解産物中で定量した。移植２４週間後、全ヘモグロビンの１３％ものＨｂｂ^huレベルが見られた（図３ｅ補足情報の表１）。同じアッセイでヒトβグロブリン様遺伝子クラスター²⁰全体を包含する２３０ｋｂ酵母人工クロモソーム（ＹＡＣ）のコピーを提示したトランスジェニックマウスはヒトβ^Aを組み込んだ全ヘモグロビンの１４％を示した。ＲＮＳ１を提示したいずれのマウスでも、ヒトβ^Aを含むヘモグロビン４量体は測定できなかった（補足情報の表１）。ヒトβ^Aを発現している成熟した末梢血赤血球の割合は、ヒトβ^AとＴＥＲ−１１９の二元染色で示されるように、殆どのＴＮＳ９骨髄キメラで上昇した。対照的に、ＲＮＳ１が形質導入された骨髄を移植したキメラは弱く染色されたβ^A陽性赤血球の分画の大きな変動を示した。循環成熟β^A陽性赤血球の分画に正規化すると、レンチウイルス−コード化β^Aを含むヘモグロビンのレベルはＹＡＣトランスジェニックマウスで得られた値の平均６４％であった。
【実施例５】
【００２７】
確かにＨＳｃが形質導入された事を確認するために、移植２４週後に採取した最初のレシピエントの骨髄を使用して二回目の移植を行った。ＴＮＳ９とＲＮＳ１ベクターは移植１３週後に二回目のすべてのレシピエントで容易に検出された。ヒトβグロブリンの発現は、ＴＮＳ−９が形質導入された骨髄のすべてのレシピエントで維持されていた。組み込み部位の解析で、ＨＳＣの形質導入の成功が確認された。移植１３週間後に採取された二次骨髄移植レシピエントの骨髄、脾臓および胸腺から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロットが行われた（ＲＮＳ１二次移植レシピエントの代表例１つとＴＮＳ９二次移植レシピエントの代表例２つを示す）。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスのゲノムＤＮＡに２つの内因性帯域が認められた。
【実施例６】
【００２８】
発現のレベルが高いことから、ｂ１およびｂ２βグルブリン遺伝子（Ｈｂｂ^th3/+）のコピーが欠損しているβ⁰−サラセミアヘテロ接合体マウスを用いて、ＴＮＳ９ベクターがサラセミア細胞の表現型をどの程度修正できたかを試験した。これらのヘテロ接合体はヒト中等症サラセミアに類似した臨床表現型を有し、慢性貧血（ヘマトクリット２８−３０％、ヘモグロビン８−９ｇ／ｄｌ）および赤血球のサイズ（赤血球不同症）と形（変形赤血球症）の異常を示した。選択されていないＴＮＳ９形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄移植１５週間後、５匹のレシピアントマウス中５匹で、ヘマトクリットレベル、赤血球数、網状赤血球数およびヘモグロビンレベルが顕著に改善した（図６）。赤血球不同症と変形赤血球症はＴＮＳ９ベクターを提示したキメラの末梢血塗抹で顕著に減少した。増強緑色蛍光蛋白（ｅＧＦＰ）をコード化したベクターを形質導入したＨｂｂ^th3/+骨髄を移植された対照マウスはすべて重度の貧血（ｎ＝５、図６）のままで、赤血球の異常な形態を維持した。これらの結果はＴＮＳ９を用いて得られた循環ヘモグロビンレベルが臨床的に関係していることを明確にしている。
【００２９】
遺伝子転移の高い効率とＴＮＳ９に採用されたβグロブリン遺伝子とＬＣＲ形状を有する組換えレンチウイルスによって与えられたベクターの再配列がないことの組み合わせの効果によって、治療域でヒトβ^Aの発現をもたらした。ＲＮＳ１に比べてＴＮＳ９で得られた高い発現は、ＭＥＬ細胞中の組み込みが許される部位のより高い分画と骨髄キメラ中のヒトβ^Aを含む赤血球細胞のより高い分画に関係した。二次移植レシピエントで、より弱いエンハンサーを含むＲＮＳ１は期間に亘って不活発であったが、ＴＮＳ９は、同じ期間に亘って転写活性の低下はなかった。
【００３０】
Ｈｂｂ^+/+骨髄を移植したレシピエント（全ヘモグロビンの６±４％、ｎ＋１０）に比べて、ＴＮＳ−９形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄を移植したレシピエントの抹消血液サンプル中で、ネズミα₂：ヒトβ₂ ^A４量体のより高いレベルが得られた（全ヘモグロビンの２１±３％、ｎ＝５）。２つの群は同程度の末梢ベクターコピー数とヒトβグロブリンＲＮＡのレベルを示した（それぞれ０．８±０．６に比べて０．８±０．２、１０．８±７％に比べて１６．８±６％）。この観察はネズミαグロブリンに関連して、ヒトβグロブリンに比べたネズミβグロブリン²²の競合的利点と一致する。サラセミア患者において、付加されたヒトβグロブリン合成はα：β鎖の不均衡を是正し、従って赤血球の生存を増し、これらの患者の有効でない赤血球生成を改善する。鎌状赤血球細胞疾患の患者で、形質導入されたβ^A鎖は、利用できるα鎖に拮抗して両内因性遺伝子によって作られるβ^S鎖よりも利点が期待できる²³。ＨｂＡが全ヘモグロビンの１０−３０％を示すＳ／βサラセミア患者への影響は非常に軽度であるので^1,24、このような介入の臨床上の利点は非常に重要である。
【実施例７】
【００３１】
形質導入されたヒトβグロブリン遺伝子の長期の発現とその治療効果を調べるために、ＴＮＳ９が形質導入されたＨｂｂ^th3/+骨髄細胞（ｎ＝５）を移植した骨髄キメラを作り、４０週間に亘って試験した。
【００３２】
ドナーの骨髄は、６日前にＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得た５−フルウラシル（５−ＦＵ）を１５０ｍｇ／ｋｇ体重静脈内注入されたＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得た８−１６週令の雄のｃ５７／ＢＬ６またはＨｂｂ^th3/+マウス²³の大腿から洗い流された。骨髄細胞をＸ−ＶＩＶＯ−１５血清を含まない培地に再懸濁し、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）（１０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−３（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１５０Ｕ／ｍｌ）、キットリガンド（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ），ベータメルカプトエタノール（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｌグルタミン（２００ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補給した。ついで骨髄細胞をペレット化し、濃縮レンチウイルス上澄を含み、血清を含まない培地に再懸濁し、ポリベン（８μｇ／ｍｌ）、Ｌグルタミン（２００ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および上記のサイトカインを補給し、８時間培養した。形質導入された骨髄細胞（５ｘ１０⁵）を照射された各雌レシピエントにＩＶ注入し骨髄キメラを確立した。レシピエントマウス（１１−１４週令のＣ５７／ＢＬ６またはＨｂｂ^th3/+マウス）は移植当日、１０．５Ｇｙ（分割用量２ｘ５．２５Ｇｙ）で照射された。
【００３３】
ｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+（ｎ＝５）とＨｂｂ^+/+（ｎ＝５）骨髄細胞を移植した年齢が対応したキメラを対照に使用した。ベクターコピー数は末梢血の定量的サザンブロット分析でモニターし、平均０．５および１．０コピー／細胞で安定して残っていることが判った（データは示していない）。定量的ヘモグロビン分析で蛋白発現を評価して、ヒトβ^A（Ｈｂｂ^hu、ｍｕ α₂：ｈｕβ₂ ^A）またはネズミβグロビン（Ｈｂｂ^mu、ｍｕ α₂：ｍｕβ₂）を含むヘモグロビン４量体の割合を測定し、免疫蛍光法でヒトβ^A蛋白を含む成熟ＲＢＣの分画を測定した。ヒトβグロビン様遺伝子クラスター²⁸の全体を包含する２３０−ｋｂの酵母の人工的クロモソームの１つのコピーを提示した対照に使ったトランスジェニックマウスは、ヒトβ^Aと１００％のβ^A＋ＲＢＣｓＨｂｂ^huを組み入れた全ヘモグロビンの１４％がＴＮＳ９キメラ中の全ヘモグロビンの１９％から２２％に相当した。これらのレベルは移植後４０週まで安定であった。この同じ期間に亘って、ヒトβ^Aを発現している成熟末梢ＲＢＣｓの割合もまた、ヒトβ^AとＴＥＲ−１１９の二元染色で示されるように、上昇し、安定（約７０％から８０％まで）したままであった。
【実施例８】
【００３４】
貧血の長期改善
末梢血で検出されたＴＮＳ９コード化β^A発現の安定性は長期の血液学的および全身性の治療ベネフィットが得られることを示唆した。Ｈｂｂ^huの産生が貧血の治療を満足させるか否かを調べるために、４０週間に亘ってヘモグロビンパラメーターを十分観察した。ヘモグロビン濃度、ＲＢＣ数およびヘマトクリットの顕著な増加はこの期間持続した。ｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞の移植を受けた対照マウスは重度の貧血のままで、移植の手技自身は貧血状態を変えないことを示している。網状赤血球数はＴＮＳ９で処理したキメラでは５％から８％まで低下したが、対照のｅＧＦＰ処理Ｈｂｂ^th3/+キメラおよび年齢対応Ｈｂｂ^th3/+マウスでは１９％から２１％まで低下し、これはＲＢＣの寿命の増加と赤血球生成活性の低下を示唆している。
【実施例９】
【００３５】
持続するヒトβグロブリン遺伝子の発現の造血への影響を測定するために、１年令のキメラおよび年齢が対応した対照マウスで脾臓の肥大およびＥＭＨの程度を検討した。ＴＮＳ９処理Ｈｂｂ^th3/+キメラで測定した脾臓重量は、脾臓当たりの全細胞数と同様、ｅＧＦＰ形質導入正常骨髄のレシピエントと区別できなかった。対照的に、ｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞を移植されたマウスは約３倍大きい脾臓重量と全細胞数を示した。ＴＮＳ９骨髄キメラでの脾臓重量の修正は造血前駆細胞数の同時の正常化に対応した。脾臓のＣＦＵ−Ｅｓ、ＢＦＵＥおよびＣＦＵｓ−ＧＭはｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞のレシピエントで測定されたレベルに低下したが、ｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞を移植された対照のキメラおよび年齢が対応したＨｂｂ^th3/+マウスでは、βサラセミアの他のネスミのモデルで前に観察されたように²⁹、それらは上昇したままであった。
【００３６】
ＥＭＨの回復は長期キメラおよび年齢対応対照の脾臓と肝臓の形態的検討によって立証された。ｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞の移植を受けたマウスの脾臓の組織病理は対照のＨｂｂ^th3/+マウスの脾臓の組織病理と実質上、同じであった。特に赤脾髄は顕著に広がり、断面積の８０％から９０％を占め、核のある赤血球前駆体によって密に占められた。断面積に基づく白脾髄は、相対的に減少し、縁帯は核のある多数のＲＢＣで不明瞭で、これは脾髄と赤血球前駆体の大きな拡張を反映している。ＴＮＳ９で処理されたキメラにおいて、赤脾髄の量はかなり減少し、断面積の僅か５０％から６０％に過ぎない。さらに赤脾髄中の核のある赤血球前駆体の数は減少した。その他の未成熟な造血細胞が赤脾髄にあったが、対照のＨｂｂ^th3/+サラセミアマウスの脾臓中に比べ頻度は少なかった。ＴＮＳ９で処理されたキメラの肝臓はＥＭＨが検出されなかった正常な対照マウスの肝臓と類似していた。対照的にｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞を移植されたマウスの肝臓は洞様毛細血管内ＥＭＨの連続した小さな病巣を示した。
【実施例１０】
【００３７】
サラセミア患者の臓器中の毒性の鉄の蓄積はＲＢＣの破壊と胃腸の鉄の取り込みの増加の結果である。ＴＮＳ９ベクターからの発現の持続が鉄の過負荷を減少したか否かを決定するために、Ｇｏｍｏｒｉ鉄染色を用いて染色した肝臓と心臓の組織切片を検討した。正常Ｈｂｂ^+/+対照マウスの肝臓には鉄の沈着は見られなかったが、Ｈｂｂ^th3/+マウスでは鉄の量が変化し、幾つかの大きな集合体が含まれた。ＴＮＳ９形質導入処理されたキメラで、鉄は肝臓で低いレベルまたは検出できないレベルであったが、ｅＧＦＰ形質導入Ｈｂｂ^th3/+骨髄細胞の移植を受けたすべてのマウスの肝臓では鉄は容易に検出された。ヒトの疾患¹ ⁻ ³で見られたことと対照的に、βサラセミア³⁰のもう一つのネズミのモデルで以前に観察されたように、処理されたマウスまたは対照のマウスの心臓に鉄の蓄積は見られなかった。
【実施例１１】
【００３８】
本発明に従ってグロビンとＤＨＦＲコード化ベクターを形質導入された細胞のｉｎｖｉｖｏでの選択の効率を葉酸拮抗薬を用いて評価するために、次の別のプロトコールを用いた。プロトコール１では、レシピエントのマウスは形質導入された骨髄細胞の投与６週間後から、ＭＴＸ（２５ｍｇ／ｋｇ）およびＮＢＭＰＲ（２０ｍｇ／ｋｇ）で毎日５日間処理された。プロトコール２では、レシピエントのマウスは形質導入された骨髄細胞の投与６週間後から、ＴＭＴＸ（４０ｍｇ／ｋｇ）およびＮＢＭＰＲ―Ｐ（２０ｍｇ／ｋｇ）で毎日５日間処理された。プロトコール３では、ガンマ線照射ではなくブスルファンで条件づけられたレシピエントのマウスは、形質導入された骨髄細胞の投与４週間後から、ＴＭＴＸ（４０ｍｇ／ｋｇ）およびＮＢＭＰＲ―Ｐ（２０ｍｇ／ｋｇ）で毎日５日間処理された（ＴＭＴＸ（Ｎｅｕｔｒｅｘｉｎ；ＵＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；＞ＭＴＸ（ＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅＬＰＦＳｏｄｉｕｍ；Ｉｍｍｕｎｅｘ）；ＮＢＭＰＲ―Ｐ（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｔｈｉｏｉｎｏｓｉｎｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ；Ａｌｂｅｒｔａｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））。プロトコール３はレシピエントが照射されず、さらに「骨髄剥離条件付けプログラム」で処理されないので、原則的に最も魅力的なプロトコールである。マウスは「非骨髄剥離」用量のブスルファンからなる比較的穏やかな条件付けプログラムで処理される。ＤＨＦＲ／ＴＭＴＸによって媒介される「ｉｎｖｉｖｏ選択」との組み合わせで、レシピエントは、厳しい前移植処置を受けないで、満足に移植されることが望まれる。これが重症のヘモグロビン血症の患者の治療に到達する道である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明による組換えオンコレトロウイルスベクターのゲノムの構造を示す。
【図２】本発明の範囲内の組換えオンコレトロウイルスベクターのゲノムの構造を示す。
【図３】形質導入されたＭＥＬ細胞中の平均βグロビン発現の増加を示す実験結果を示す。
【図４】末梢血液細胞中の２４週間に亘って定期的に測定した平均ベクターコピー数を示し、これは、本発明のベクターの形質導入細胞中で示された高い遺伝子転移を確認する。
【図５】本発明のベクターで形質導入された細胞の導入１２日および２２週間後の内因性対立遺伝子あたりのヒトβグロビン発現を示す。
【図６】非選択のＴＮＳ９が形質導入されたＨｂｂ^th3/+骨髄移植１５週後のヘマトクリットレベル、赤血球数、網状赤血球数およびヘモグロビンレベルを示す。

Claims

（ａ）機能性グロビン遺伝子を含む領域、
（ｂ）完全なＤＮａｓｅ過敏亢進部位、ＨＳ２，ＨＳ３およびＨＳ４を含み、該ベクターがイン・ビトロ（ｉｎｖｉｖｏ）で哺乳動物に導入された時にβグロビンの発現を提供する、βグロビン座制御領域の大きな部分、
（ｃ）ジヒドロ葉酸還元酵素をコード化する領域、
を含む組換えレンチウイルスベクター。
さらにマウスのＰＧＫプロモーターを含み、該マウスのＰＧＫプロモーターがジヒドロ葉酸還元酵素をコード化する領域の発現を制御する請求項１記載のベクター。
グロビン遺伝子がヒトβグロビンをコード化する請求項１または２に記載のベクター。
該ジヒドロ葉酸還元酵素がヒトジヒドロ葉酸還元酵素である請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
該ヒトジヒドロ葉酸還元酵素が、野生型ヒトジヒドロ葉酸還元酵素に比べて、葉酸拮抗薬に対する抵抗性が増加した変異体であり、一組の変異の結果、アミノ酸配列において、該変異体の形が野生型ヒトジヒドロ葉酸還元酵素と異なる請求項４記載のベクター。
該一組の変異が該野生型の配列のアミノ酸２２に対応したアミノ酸における変異と該野生型の配列のアミノ酸３１に対応したアミノ酸における変異を含む請求項５記載のベクター。
異常ヘモグロビン血症を患っている哺乳動物固体の異常ヘモグロビン血症の治療のために造血前駆細胞または幹細胞を形質導入するための請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
形質導入された細胞の数が増加した細胞集団を作るために、エクス・ビボ（ｅｘｖｉｖｏ）で葉酸拮抗薬を使用する選択段階を実施する請求項７記載の使用。
該葉酸拮抗薬がメトトレキセートである請求項８記載の使用。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えベクターで形質導入された哺乳動物の造血前駆細胞または幹細胞。
哺乳動物固体の異常ヘモグロビン血症を治療するための治療組成物を作る方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えベクターを調製する段階と、哺乳動物固体から造血前駆細胞または幹細胞を得る段階と、該細胞を該組換えベクターで形質導入する段階とを含む方法。
葉酸拮抗薬を使用してエクス・ビボ（ｅｘｖｉｖｏ）の選択を実施する段階を更に含む請求項１１記載の方法。