JP2023502626A - ヒト造血幹前駆細胞におけるアルファ－グロビン遺伝子座での標的化組み込み - Google Patents

ヒト造血幹前駆細胞におけるアルファ－グロビン遺伝子座での標的化組み込み Download PDF

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Abstract

本開示は、造血幹前駆細胞（HSPC）を、特に、HSPC中のHBA1またはHBA2遺伝子座を、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子と置き換えることによって、遺伝子改変するための方法および組成物を提供する。TIFF2023502626000036.tif103159

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年11月15日に出願された米国仮特許出願第62/936,248号の優先権を主張するものであり、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
連邦政府支援による研究開発に基づいてなされた発明の権利に関する言明
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された認可番号HL135607のもと、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
β-サラセミアは、世界的発生率が100,000人に1人の世界で最も一般的な遺伝性血液障害の1つである（1）。この疾患の患者は、重度の貧血を患い、集中治療を受けたとしても、平均余命は30年である（2～4）。この疾患の最も重症型であるβ-サラセミアメジャーは、β-グロビン（HBB）遺伝子全体のホモ接合型（または複合ヘテロ接合型）機能喪失変異によって引き起こされる。これは、HBBタンパク質の喪失をもたらし、これによって、重度貧血が起こり、赤血球（RBC）の全身への酸素供給能が低下する。不対α-グロビン（HBA1遺伝子およびHBA2遺伝子に由来）の蓄積は、劇的な赤血球毒性を導き、これが患者において見られる貧血の原因となる。実際に、疾病重症度は、β-グロビン鎖とα-グロビン鎖との間の不均衡の程度と直接相関していることが知られている（5）。β-サラセミアの現行の標準治療は、鉄キレート療法と組み合わせた頻回の輸血を必要とし、このことから、この疾患は、若年成人において非常に犠牲の大きな遺伝子疾患の1つになっている（6）。現在のところ、この疾患に対する唯一の治療戦略は、免疫学的に適合するドナーからの同種造血幹細胞移植（HSCT）である。しかしながら、ほとんどの場合、同種HSCTに利用できる適合ドナーは存在せず、たとえ同一と確認されたとしても、これらのドナーからの移植は、免疫拒絶および移植片対宿主病のリスクを伴う（7）。
有望で理想的な処置は、患者由来の造血幹前駆細胞（HSPC）の単離、HBBタンパク質レベルを回復させるためのHBBの導入、それに続く、免疫拒絶のリスクを伴わないであろう患者自身の補正されたHSPCの自家HSCTを必要とするであろう。この論理を用いて、β-サラセミアの有望な治癒的手段として、主にレンチウイルスベクターを使用するHBB導入遺伝子の送達を通じた遺伝子療法がいくつか開発されている（8、9）。これらのアプローチは、β-サラセミアのヒト臨床試験においてHBBを治療レベルまで回復させることを示している（10）一方で、レンチウイルスおよびレトロウイルスベクターによる送達は、腫瘍抑制遺伝子を不活性化するまたはがん遺伝子を活性化する能力のあるセミランダムなゲノム組み込みをもたらす。実際に、HSPCにおけるセミランダムな組み込みは、クローン増殖、骨髄異形成および急性骨髄性白血病を導くことが示されており（11～14）、そのうちの1つは命に係わるものである（15）。そのうえ、レンチウイルス遺伝子療法アプローチは、比較的軽い輸血依存性β-サラセミアでは治験段階（registration status）に進んでいる一方、この疾患の重症型では輸血非依存状態に至っていない。
依然として残るこれらの安全性と有効性の課題のため、ゲノム編集（ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびCRISPR/Cas9システムが挙げられる）を用いて部位特異的DNA二本鎖切断（DSB）を起こして胎児ヘモグロビンのリプレッサーを不活性化する代替戦略が開発されており、胎児ヘモグロビンのアップレギュレーションは、HBBの不足を補うことができるだろう（16）。しかしながら、結果として生じる胎児ヘモグロビンのアップレギュレーションは、β-グロビン：α-グロビン不均衡を救済するには十分でない可能性があり、また、このアップレギュレーションは、胎児ヘモグロビンが自然に抑制されている成人患者において持続しない可能性があるという、いくつかの懸念がある（17、18）。そのうえ、このアプローチは、HBBの不活性化というβ-サラセミアの遺伝的要因に取り組んでおらず、またインビボで疾患表現型を十分に救済しない可能性がある。さらに、これらの療法はすべて、HBBの不足だけを補うようにしか作用せず、α-グロビンのレベルを減少させることはない。
したがって、HBBまたは他の治療用導入遺伝子を自家HSPCおよび赤血球にインビボまたはエクスビボで導入するための新しい安全かつ効果的なアプローチが必要とされている。本開示は、この必要性に応え、他の利点も提供する。
簡単な概要
一局面では、本開示は、対象由来の造血幹前駆細胞（HSPC）を遺伝子改変する方法であって、方法が、HSPCに、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズする配列を含むガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナーテンプレートとを導入する工程を含み、RNAガイドヌクレアーゼが、細胞において、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列を切断するが、両方を切断はせず；導入遺伝子が、切断されたHBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれ、それにより、遺伝子改変されたHSPCが生成され；組み込まれた導入遺伝子が、遺伝子改変されたHSPCにおいてタンパク質の発現をもたらす、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、対象由来の造血幹前駆細胞（HSPC）を遺伝子改変する方法であって、方法が、HSPCに、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズする配列を含むガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナーテンプレートとを導入する工程を含み、RNAガイドヌクレアーゼが、細胞において、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列を切断するが、両方を切断はせず；導入遺伝子が、切断されたHBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれ、それにより、遺伝子改変されたHSPCが生成され；該導入が、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートと、HBA1遺伝子配列およびHBA2遺伝子配列の両方にハイブリダイズするガイドRNAとの導入と比較して、HSPCのゲノム内で転座イベントの低減をもたらす、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、対象由来の造血幹前駆細胞（HSPC）を遺伝子改変する方法であって、方法が、HSPCに、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズする配列を含むガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、タンパク質をコードする導入遺伝子とを含むドナーテンプレートを導入する工程を含み、RNAガイドヌクレアーゼが、細胞において、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列を切断するが、両方を切断はせず；導入遺伝子が、切断されたHBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれ、それにより、遺伝子改変されたHSPCが生成され；該導入が、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートと、HBA1遺伝子配列およびHBA2遺伝子配列の両方にハイブリダイズするガイドRNAとの導入と比較して、HSPCのゲノム内でドナーテンプレートのオフターゲット組み込みの低減をもたらす、方法を提供する。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの態様では、本方法は、ガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートの導入前に、対象からHSPCを単離する工程をさらに含む。いくつかの態様では、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列は、3' UTR領域を含む。いくつかの態様では、RNAガイドヌクレアーゼは、HBA1遺伝子配列を切断するが、HBA2遺伝子配列は切断しない。いくつかの態様では、HBA1遺伝子配列は、SEQ ID NO：5の配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBA1遺伝子配列に組み込まれる。いくつかの態様では、RNAガイドヌクレアーゼは、HBA2遺伝子配列を切断するが、HBA1遺伝子配列は切断しない。いくつかの態様では、HBA2遺伝子配列は、SEQ ID NO：2の配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBA2遺伝子配列に組み込まれる。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの態様では、HSPCは、野生型HBB遺伝子と比較して変異を含むHBB遺伝子を含む。いくつかの態様では、変異は、疾患を引き起こす。いくつかの態様では、疾患は、ベータ-サラセミアである。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBB、PDGFB、IDUA、FIX（例えば、パドヴァバリアント）、LDLR、およびPAHからなる群より選択される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBBである。いくつかの態様では、HBBは、HSPCにおいて発現され、ガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートの導入前と比較して、HSPCにおける成人ヘモグロビン四量体のレベルを増加させる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBBであり、ガイドRNAは、SEQ ID NO：5の配列にハイブリダイズし、HBBは、HBA1遺伝子配列の該部位で組み込まれる。
いくつかの態様では、対象は、β-サラセミアを有し、HBB導入遺伝子を発現する遺伝子改変されたHSPCが対象に再導入される。いくつかの態様では、組み込まれた導入遺伝子の発現は、内因性HBA1またはHBA2プロモーターによって駆動される。いくつかの態様では、組み込まれた導入遺伝子は、HSPCのゲノム内でHBA1またはHBA2コード配列と置き換わる。いくつかの態様では、組み込まれた導入遺伝子は、HSPCのゲノム内でHBA1またはHBA2オープンリーディングフレーム（ORF）と置き換わる。いくつかの態様では、タンパク質は、分泌タンパク質である。いくつかの態様では、タンパク質は、治療用タンパク質である。
いくつかの態様では、ガイドRNAは、1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾を含む。いくつかのそのような態様では、1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾は、ガイドRNAの5'端および3'端の3つの末端ヌクレオチドに存在する。いくつかの態様では、RNAガイドヌクレアーゼは、Cas9である。いくつかの態様では、ガイドRNAおよびRNAガイドヌクレアーゼは、エレクトロポレーションによってリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体としてHSPCに導入される。いくつかの態様では、ドナーテンプレートは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターを使用してHSPCに導入される。いくつかのそのような態様では、rAAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの態様では、導入する工程は、エクスビボで実施される。いくつかの態様では、本方法は、遺伝子改変されたHSPCを対象に導入する工程をさらに含む。いくつかの態様では、本方法は、遺伝子改変されたHSPCを、インビトロまたはエクスビボで赤血球（RBC）に分化するように誘導する工程をさらに含む。いくつかの態様では、対象は、ヒトである。
別の局面では、本開示は、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズするが両方にはハイブリダイズしない配列を含むガイドRNAを提供する。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列の3' UTRにハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA1遺伝子配列にハイブリダイズする。いくつかの態様では、HBA1遺伝子配列は、SEQ ID NO：5の配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA2遺伝子配列にハイブリダイズする。いくつかの態様では、HBA2遺伝子配列は、SEQ ID NO：2の配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾を含む。いくつかのそのような態様では、1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾は、ガイドRNAの5'端および3'端の3つの末端ヌクレオチドに存在する。
別の局面では、本開示は、本明細書に開示されるガイドRNAのいずれかを含むHSPCを提供する。
別の局面では、本開示は、HBA1またはHBA2遺伝子配列に組み込まれているが両方には組み込まれていない導入遺伝子を含む遺伝子改変されたHSPCを提供する。いくつかの態様では、遺伝子改変されたHSPCは、本明細書に開示される方法のいずれかを使用して生成される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBB、PDGFB、IDUA、FIX（例えば、パドヴァバリアント）、LDLR、およびPAHからなる群より選択される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBBである。いくつかの態様では、HBBは、HBA1遺伝子配列で組み込まれる。いくつかの態様では、HBB導入遺伝子は、遺伝子改変されたHSPCのゲノム内で内因性HBA1コード配列と置き換わっている。いくつかの態様では、HBB導入遺伝子は、遺伝子改変されたHSPCのゲノム内で内因性HBA1オープンリーディングフレームと置き換わっている。
別の局面では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変されたHSPCのいずれかの分化をインビトロまたはエクスビボで誘導することによって産生される赤血球を提供する。
別の局面では、本開示は、それを必要とする対象におけるベータ-サラセミアを処置するための方法であって、本明細書に開示される遺伝子改変されたHSPCを対象に投与する工程を含み、遺伝子改変されたHSPCが、対象中に生着し、投与前と比較して対象における成人ヘモグロビン四量体のレベルの増加をもたらし、それにより、対象におけるベータ-サラセミアを処置する、方法を提供する。
該方法のいくつかの態様では、遺伝子改変されたHSPCは、対象に由来する。
別の局面では、本開示は、細胞に、細胞内の標的遺伝子中の標的遺伝子座を切断するプログラム可能なヌクレアーゼ；および導入遺伝子を含むドナーテンプレートを含む核酸を導入する工程を含む、細胞を改変する方法であって、導入遺伝子が、標的遺伝子座に組み込まれ、かつ導入遺伝子が、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）の全部または一部と置き換わる、方法を提供する。
いくつかの態様では、導入遺伝子は、5' UTR、1つまたは複数のエクソン、1つまたは複数のイントロン、3' UTR、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的遺伝子の領域と置き換わる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、標的遺伝子のイントロンおよびエクソンと置き換わる。いくつかの態様では、細胞は、初代細胞である。いくつかの態様では、細胞は、造血幹前駆細胞（HSPC）である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、治療用タンパク質をコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBB、PDGFB、IDUA、FIX（例えば、パドヴァバリアント）、LDLR、およびPAHからなる群より選択される。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBBである。いくつかの態様では、標的遺伝子は、疾患に関連する変異を含む。いくつかの態様では、標的遺伝子は、疾患に関連する2つ以上の変異を含む。いくつかの態様では、標的遺伝子は、疾患に関連するタンパク質をコードし、かつ導入遺伝子は、タンパク質の野生型をコードする。いくつかの態様では、標的遺伝子は、セーフハーバー遺伝子である。いくつかの態様では、標的遺伝子は、HBA1遺伝子である。いくつかの態様では、標的遺伝子は、HBA2遺伝子である。
本明細書に開示される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入遺伝子は、第1のホモロジーアームおよび第2のホモロジーアームによって挟まれており、第1のホモロジーアームは、標的遺伝子座に隣接する第1の配列との相同性を含み、かつ第2のホモロジーアームは、標的遺伝子座に隣接する第2の配列との相同性を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアームは、標的遺伝子の5'端にある配列との相同性を含み、かつ第2のホモロジーアームは、標的遺伝子の3'端にある配列との相同性を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアームまたは第2のホモロジーアームは、標的遺伝子の5' UTRの一部分との相同性を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアームまたは第2のホモロジーアームは、標的遺伝子の3' UTRの一部分との相同性を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアームまたは第2のホモロジーアームは、標的遺伝子の開始コドンの5'である一部分との相同性を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアームは、標的遺伝子の3' UTRの一部分との相同性を含み、かつ第2のホモロジーアームは、標的遺伝子の転写開始部位の5'である一部分との相同性を含む。
いくつかの態様では、第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方は、少なくとも約200塩基対を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方は、少なくとも約400塩基対を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方は、少なくとも約500塩基対を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方は、少なくとも約800塩基対を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方は、少なくとも約850塩基対を含む。いくつかの態様では、第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方は、少なくとも約900塩基対を含む。
いくつかの態様では、ドナーテンプレートは、SEQ ID NO：6に対して少なくとも約85％の配列同一性を含む。いくつかの態様では、ドナーテンプレートは、SEQ ID NO：6の配列を含む。いくつかの態様では、組み込まれた導入遺伝子の発現は、標的遺伝子のプロモーターによって調節される。いくつかの態様では、プロモーターは、細胞のゲノム内の内因性プロモーターである。いくつかの態様では、導入する工程は、エクスビボで実施される。いくつかの態様では、プログラム可能なヌクレアーゼは、CRISPR-Casタンパク質である。いくつかの態様では、プログラム可能なヌクレアーゼは、Cas9タンパク質である。いくつかの態様では、プログラム可能なヌクレアーゼは、Cpf1タンパク質である。いくつかの態様では、プログラム可能なヌクレアーゼは、標的遺伝子座で二本鎖切断を生成する。いくつかの態様では、ドナーテンプレートは、組換えAAV（rAAV）ベクターで細胞に導入される。いくつかのそのような態様では、rAAVベクターは、AAV6ベクターである。
いくつかの態様では、本方法は、細胞にガイドRNAを導入する工程をさらに含み、ガイドRNAが、プログラム可能なヌクレアーゼに、標的遺伝子中の標的遺伝子座を切断するように指令する。いくつかの態様では、ガイドRNAは、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズする配列を含む。いくつかの態様では、ガイドRNAは、本明細書に記載されるガイドRNAのいずれかである。
α-グロビン遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化のためのsgRNA＆AAV6の設計。図1A：HBA2およびHBA1のゲノムDNAの略図。3' UTR領域における2つの遺伝子間の配列差を赤色の星印として描写する。5つの有望なsgRNAの場所を表示している。 α-グロビン遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化のためのsgRNA＆AAV6の設計。図1B：ヒトCD34+ HSPCにおけるHBA2とHBA1の両方での各ガイドのインデル頻度をそれぞれ橙色と青色で描写する。バーは、中央値±四分位範囲を表す。*：P＜0.05；**：P＜0.005；***：P＜0.0005（対応のないt検定を使用して決定された）。 α-グロビン遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化のためのsgRNA＆AAV6の設計。図1C：SFFV-GFP-BGH組み込みを導入するためのAAV6 DNA修復ドナーの設計図をHBA2およびHBA1遺伝子座で描写する。 α-グロビン遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化のためのsgRNA＆AAV6の設計。図1D：フローサイトメトリーによって決定した場合の、HBA2およびHBA1特異的ガイドならびにCSおよびWGR SFFV-GFP AAV6ドナーを使用したGFP+細胞の割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。*：P＜0.05（対応のないt検定を使用して決定された）。 α-グロビン遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化のためのsgRNA＆AAV6の設計。図1E：オフターゲット組み込みが意図しない遺伝子で起こるかどうかを決定するための、ddPCRによって決定した場合のHBA2およびHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。*：P＜0.05；***：P＜0.0005（対応のないt検定を使用して決定された）。 α-グロビン遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化のためのsgRNA＆AAV6の設計。図1F：BD FACSAria IIプラットフォームによって決定した場合の各標的化イベントにわたるGFP+細胞のMFI。バーは、中央値±四分位範囲を表す。***：P＜0.0005（対応のないt検定を使用して決定された）。 T2Aスキームを使用したα-遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化。図2A：HBB-T2A-YFP組み込みを導入するためのAAV6 DNA修復ドナーの設計図をHBA1遺伝子座で描写する。 T2Aスキームを使用したα-遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化。図2B：フローサイトメトリーによって決定した場合のRBC表面マーカーGPAおよびCD71を獲得するCD34-/CD45- HSPCの割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。 T2Aスキームを使用したα-遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化。図2C：フローサイトメトリーによって決定した場合の、HBA2およびHBA1特異的ガイドならびにHBB-T2A-YFP AAV6ドナーを使用したGFP+細胞の割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。**：P＜0.005（対応のないt検定を使用して決定された）。 T2Aスキームを使用したα-遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化。図2D：ddPCRによって決定した場合のHBA2およびHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。***：P＜0.0005（対応のないt検定を使用して決定された）。 T2Aスキームを使用したα-遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化。図2E：BD FACSAria IIプラットフォームによって決定した場合の各標的化イベントにわたるGFP+細胞のMFI。バーは、中央値±四分位範囲を表す。 T2Aスキームを使用したα-遺伝子座のCRISPR/AAV6媒介標的化。図2F：HBB-T2A-YFP（HBA1 UTR）を用いてHBA1で標的化され、14日間のプロトコルを通じてRBCへと分化させた、ヒトHSPCの代表的なフローサイトメトリー染色およびゲーティングスキーム。これは、RBC（CD34-/CD45-/CD71+/GPA+）だけが、組み込まれたT2A-YFPマーカーを発現できることを示している。分析は、BD FACS Aria IIプラットフォームで実施した。 SCD HSPCにおけるα-グロビン遺伝子座でのCRISPR/AAV6媒介標的化。図3A：HBA1遺伝子座で全遺伝子置換HBB導入遺伝子組み込みを導入するためのAAV6 DNA修復ドナーの設計図。図3B：フローサイトメトリーによって決定した場合のRBC表面マーカーGPAおよびCD71を獲得するCD34-/CD45- HSPCの割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図3C：ddPCRによって決定した場合のHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。*：P＜0.05（対応のないt検定を使用して決定された）。 SCD HSPCにおけるα-グロビン遺伝子座でのCRISPR/AAV6媒介標的化。図3D：ヒトSCD CD34+ HSPCの標的化およびRBC分化後の処置毎の代表的なHPLCプロット。HgbAおよびHgbS四量体ピークの保持時間は、それぞれ約6.6および約9.8で表示される。図3E：総ヘモグロビン四量体のうちのHgbAの割合を示しているすべてのHPLC結果の概要。バーは、中央値±四分位範囲を表す。*：P＜0.05（対応のないt検定を使用して決定された）。図3F：RBCに分化させてHPLCによって分析したHBA1 UTR標的試料におけるHgbA％と標的アレル％との間の相関関係を描写しているプロット。それぞれのベクターの色は、図に描写している通りである。R2値およびトレンドライン式を示す。 NSGマウスへのα-グロビン標的化ヒトHSPCの生着。図4A：NSGマウスへの標的化ヒトCD34+ HSPCの骨髄移植の16週間後、骨髄を採取し、生着率を決定した。mCd45+またはhHLA+のいずれかであった細胞の総数からhHLA+であったmTerr119-細胞（非RBC）の割合を描写する。それぞれ1.2M、750Kまたは250K個の細胞を最初に移植した大用量、中用量および小用量の実験を色分けして示す。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図4B：生着したヒト細胞の中で、CD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）または他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の分布を示す。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図4C：インビトロ（移植前）標的化HSPCおよびバルク生着HSPC間、ならびにCD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）およびCD34+（HSC）系統間の、ddPCRによって決定した場合のHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図4D：移植前インビトロヒトHSPC集団のバルク標的化率と比較した生着ヒト細胞間のHBA1での標的アレル頻度。各マウスは異なる色で表される。バーは、中央値±四分位範囲を表す。 NSGマウスへのα-グロビン標的化ヒトHSPCの生着。図4E：一次生着に続き、生着したヒト細胞をNSGマウスの骨髄に再び移植した。移植後16週目に、骨髄を採取し、生着率を決定した。mCd45+またはhHLA+のいずれかであった細胞の総数からhHLA+であったmTerr119-細胞（非RBC）の割合を描写する。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図4F：二次移植実験における、バルク試料中の生着ヒト細胞間ならびにCD19+（B細胞）およびCD33+（骨髄細胞）系統間の、ddPCRによって決定した場合のHBA1での標的アレル頻度。各マウスは異なる色で表される。バーは、中央値±四分位範囲を表す。 β-サラセミア由来HSPCのおけるα-グロビン遺伝子座の標的化。図5A：ddPCRによって決定した場合のβ-サラセミア由来HSPCにおけるHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。*：P＜0.05（対応のないt検定を使用して決定された）。図5B：標的化HSPCのRBCへの分化に続き、mRNAを採取してcDNAへと変換した。HBA（HBA1とHBA2を区別しない）およびHBB導入遺伝子の発現をGPA発現に対して正規化した。図5C：標的化β-サラセミア由来HSPCのNSGマウスへの骨髄移植の16週間後、骨髄を採取し、生着率を決定した。mCd45+またはhHLA+のいずれかであった細胞の総数からhHLA+であったmTerr119-細胞（非RBC）の割合を描写する。バーは、中央値±四分位範囲を表す。 β-サラセミア由来HSPCのおけるα-グロビン遺伝子座の標的化。図5D：生着したヒト細胞の中で、B細胞、骨髄細胞または他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の分布を示す。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図5E：二次移植実験における、バルク試料中の生着ヒト細胞間ならびにCD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）および他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の、ddPCRによって決定した場合のHBA1での標的アレル頻度。各マウスは異なる色で表される。バーは、中央値±四分位範囲を表す。 内因性遺伝子座にHBB導入遺伝子を導入することの期待される成果。図6A：分岐していない完全長HBB（イントロンを有する）をβ-サラセミア患者に由来するHSPCの内因性遺伝子座に組み込んだ際の期待される成果。図において様々な疾患原因変異に注釈を付ける。図6B：分岐した完全長HBB（イントロンを有する）をβ-サラセミア患者に由来するHSPCの内因性遺伝子座に組み込んだ際の期待される成果。図6C：分岐したHBB cDNA（イントロンなし）をβ-サラセミア患者に由来するHSPCの内因性遺伝子座に組み込んだ際の期待される成果。 α-グロビン遺伝子座を標的化するCas9 sgRNAの分析。図7A：ガイドRNA配列の表。PAMを灰色で示し、HBA1とHBA2との間の差異をガイド毎に赤色で強調する。 α-グロビン遺伝子座を標的化するCas9 sgRNAの分析。図7B：HBA1 sg5に関するCOSMIDによるオンターゲット部位および40の最も高度に予測されたオフターゲット部位でのrhAmpSeq標的化配列決定結果の概要。値は、実験反復毎の各遺伝子座でのモック処置のインデル頻度を差し引いた後のRNP処置のインデル頻度である。N＝3、すべての値を表示しているわけではないが、モックインデル頻度を差し引いた後、一部は＜0.01％であった。バーは、中央値を表す。 α-グロビン遺伝子座を標的化するCas9 sgRNAの分析。図7C：HBA1 sg5に関するCOSMIDによる40の最も高度に予測されたオフターゲット部位についてのゲノム座標の一覧。 GFP-HBA組み込みベクターによるHSPCの標的化。図8A：GFP-HBA組み込みベクターで標的化されたHSPCの編集および分析の時系列。 GFP-HBA組み込みベクターによるHSPCの標的化。図8B：編集後14日目にCRISPR/AAV6方法論によって標的化されたヒトHSPCの代表的なフローサイトメトリー画像を描写する。これは、全遺伝子置換（whole gene replacement）（WGR）組み込みが、HBA1遺伝子座での（cut-site）切断部位（CS）組み込みよりも大きなMFI/GFP+細胞を生じることを示している。分析は、BD Accuri C6プラットフォームで実施した。全反復にわたるMFI中央値を各フローサイトメトリー画像の下に示し、組み込みベクターの略図を上に示す。 HBB-T2A-YFP-HBA組み込みベクターでHSPCを標的化する時系列。HBB-T2A-YFP組み込みベクターによるHSPCの標的化、RBCへの分化および後続の分析の時系列。 標的化およびRBCの分化率を分析するために使用される代表的な染色およびゲーティングスキーム。図10A：HBB-T2A-YFP（HBA1 UTR）を用いてHBA1で標的化され、14日間のプロトコルを通じてRBCへと分化させた、ヒトHSPCの代表的なフローサイトメトリー染色およびゲーティングスキーム。これは、RBC（CD34-/CD45-/CD71+/GPA+）だけが、組み込まれたT2A-YFPマーカーを発現できることを示している。分析は、BD FACS Aria IIプラットフォームで実施した。 標的化およびRBCの分化率を分析するために使用される代表的な染色およびゲーティングスキーム。図10B：HBA1 UTR、HBA2 UTRおよびHBB UTRベクターで標的化されたHSPCに由来するRBC（CD34-/CD45-/CD71+/GPA+）の代表的なYFP×FSCフローサイトメトリー画像。ベクター毎にAAV単独対照を使用してゲーティングスキームを確立し、画像全体で陽性／陰性カットオフの変動をわずかにした。 メチルセルロースにプレーティングされたHSPCのコロニー形成単位の分析。図11A：図11Bおよび11Dに表示されるメチルセルロースコロニーの遺伝子型の分布。各カテゴリーに対応するクローンの数を円グラフに含める。 メチルセルロースにプレーティングされたHSPCのコロニー形成単位の分析。図11B：健常ドナー由来のインビトロ（生着前）生存CD34+ HSPCを、コロニー形成アッセイのために半固体メチルセルロース培地を含有する96ウェルプレートに単一細胞ソーティングした。ソーティング後14日目に、細胞の形態を分析した。各系統（CFU-E＝赤血球系統；CFU-GEMM＝多系統；またはCFU-GM＝顆粒球／マクロファージ系統）で形成されたコロニーの数をコロニーが利用可能なウェルの総数で割って描写する。 メチルセルロースにプレーティングされたHSPCのコロニー形成単位の分析。図11C：図11Aについての処置毎のすべてのコロニー間の各系統の分布パーセント。 メチルセルロースにプレーティングされたHSPCのコロニー形成単位の分析。図11D：インビトロ（生着前）生存CD34+ β-サラセミア患者由来のHSPCを、コロニー形成アッセイのために半固体メチルセルロース培地を含有する96ウェルプレートに単一細胞ソーティングした。ソーティング後14日目に、細胞の形態を分析した。各系統（B＝BFU-EおよびC＝CFU-E（赤血球系統）；GE＝CFU-GEMM（多系統）；またはGM＝CFU-GM（顆粒球／マクロファージ系統））で形成されたコロニーの数をコロニーが利用可能なウェルの総数で割って描写する。 メチルセルロースにプレーティングされたHSPCのコロニー形成単位の分析。図11E：図11Cについての処置毎のすべてのコロニー間の各系統の分布パーセント。 臨床用ベクターの開発のためにスクリーニングされた組み込みカセット。設計図および対応する論理的根拠ならびにベクターS1～15の最終結果を表示する。 HSPCの標的化およびマウスへの移植の時系列。HBB組み込みベクターによるHSPCの標的化、マウスへの移植（1o生着と2o生着の両方）および後続の分析の時系列。 ヒトHSPCのNSGマウスへの生着および標的化率を分析するために使用される代表的な染色およびゲーティングスキーム。NSGマウスの骨髄に移植したヒトHSPCの標的化および生着率を分析するために使用される代表的なフローサイトメトリー染色およびゲーティングスキーム。この試料は、HBA1遺伝子座でのUbC-GFP組み込みで標的化した。これは、ヒト細胞（hHLA+）だけがGFPを発現できることを実証している。分析は、BD FACS Aria IIプラットフォームで実施した。 α-グロビン遺伝子座でGFPにより標的化されたヒトHSPCのNSGマウスへの生着。図15A：UbC-GFP組み込みベクターによるHSPCの標的化、マウスへの移植（1o生着と2o生着の両方）および後続の分析の時系列。 α-グロビン遺伝子座でGFPにより標的化されたヒトHSPCのNSGマウスへの生着。図15B：UbC-GFP-BGH組み込みを導入するためのAAV6 DNA修復ドナー設計図をHBA1遺伝子座で描写する。図15C：NSGマウスへの標的化ヒトCD34+ HSPCの骨髄移植の16週間後、骨髄を採取し、生着率を決定した（1o）。mCd45+またはhHLA+のいずれかであった細胞の総数からhHLA+であったmTerr119-細胞（非RBC）の割合を描写する。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図15D：生着したヒト細胞の中で、CD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）または他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の分布を示す。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図15E：移植前（インビトロ、ソーティング後）集団および生着に成功した集団間、両バルクHSPC間ならびにCD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）および他の系統間のGFP+細胞の割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。図15F：一次生着に続き、生着したヒト細胞をNSGマウスの骨髄に再び移植した。移植後16週目に、骨髄を採取し、生着率を決定した（2o）。mCd45+またはhHLA+のいずれかであった細胞の総数からhHLA+であったmTerr119-細胞（非RBC）の割合を描写する。図15G：二次移植由来の生着に成功した集団間のGFP+細胞の割合を図15Fに描写する。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16A：フローサイトメトリーによって決定した場合のRBC表面マーカーGPAおよびCD71を獲得するCD34-/CD45- HSPCの割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。各処置群についてN＝4。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16B：ddPCRによって決定した場合のβ-サラセミア由来HSPCにおけるHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。モック処置ではN＝3、RNP単独およびHBA1 UTR処置ではN＝2、ならびにHBA1 UTRロングHA処置ではN＝5。**：P＜0.005（対応のないt検定を使用して決定された）。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16C：標的化HSPCのRBCへの分化に続き、mRNAを採取してcDNAへと変換した。HBA（HBA1とHBA2を区別しない）およびHBB導入遺伝子の発現をHBG発現に対して正規化した。バーは、中央値±四分位範囲を表す。N＝1のHBA1 UTRを除き、各処置群についてN＝3。**：P＜0.05（対応のないt検定を使用して決定された）。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16D：HgbFに対して正規化されたHgbAを示しているヘモグロビン四量体HPLC結果の概要。バーは、中央値±四分位範囲を表す。各処置群についてN≧3。***：P＜0.0001（対応のないt検定を使用して決定された）。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16E：HSPCの標的化およびRBC分化後の処置毎の代表的なヘモグロビン四量体HPLCプロット。HgbFおよびHgbA四量体ピークの保持時間を表示する。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16F：β-グロビンの曲線下面積（AUC）/α-グロビンのAUCを示している逆相グロビン鎖HPLC結果の概要。バーは、中央値±四分位範囲を表す。各処置群についてN≧4。***：P＜0.0001（対応のないt検定を使用して決定された）。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図16G：HSPCの標的化およびRBC分化後の処置毎の代表的な逆相グロビン鎖HPLCプロット。HgbFおよびHgbA四量体ピークの保持時間を表示する。 β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データ。図17A：標的化β-サラセミア由来HSPCのNSGマウスへの骨髄移植の16週間後、骨髄を採取し、生着率を決定した。mCd45+またはhHLA+のいずれかであった細胞の総数からhHLA+であったmTerr119-細胞（非RBC）の割合を描写する。バーは、中央値±四分位範囲を表す。N＝10。図17B：生着したヒト細胞の中で、B細胞、骨髄細胞または他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の分布を示す。バーは、中央値±四分位範囲を表す。N＝9。図17C：二次移植実験における、バルク試料中の生着ヒト細胞間ならびにCD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）および他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の、ddPCRによって決定した場合のHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。モック処置群ではN＝3および標的化処置群ではN＝10。 HBA1標的化gRNA 5によって生成されたインデルスペクトルに関する追加情報。図18A：ゲノム遺伝子座での5つすべてのガイド配列の場所を描写する略図。図18B：TIDEソフトウェアによって生成されたHBA1特異的sg5の代表的なインデルスペクトル。 HSPCにおける標的化後の生存率データ。HSPC生存率を編集後2～4日目にフローサイトメトリーによって定量した。GhostRed生存色素について陰性染色された細胞の割合を描写する。細胞はすべて、標準的な条件（すなわち、Cas9 RNP+sg5、5K MOIのAAVのエレクトロポレーション、および24時間でのAAV洗浄なし）を使用して、本発明者らの最適化されたHBB遺伝子置換ベクターで編集した。バーは、中央値±四分位範囲を表す。WT：モック処置群ではN＝5、RNP単独処置群ではN＝3、AAV単独処置群ではN＝1、およびRNP+AAV処置群ではN＝6；SCD：N＝4のRNP+AAVを除き、各処置群についてN＝2；β-thal：モック処置群ではN＝3、RNP単独処置群ではN＝1、およびRNP+AAV処置群ではN＝7。 HBA1を標的化した際の単一アレルおよび両アレル編集頻度についての洞察を得るためにデュアルカラー標的化ベクターによって生成されたデータ。図20A：HBA1-WGR-GFP AAV6（図16Cに示される）およびHBA1-WGR-mPlum AAV6によって同時標的化されたCD34+ HSPCの代表的なFACSプロット。 HBA1を標的化した際の単一アレルおよび両アレル編集頻度についての洞察を得るためにデュアルカラー標的化ベクターによって生成されたデータ。図20B：GFPのみ、mPlumのみおよび両方の色で標的化された集団の％を示している表。次いで、以下の方程式：（標的化された細胞の総％＋（デュアルカラーの％）*2）／2＝標的アレルの総％によって、編集された細胞のパーセントを編集されたアレル％に変換した。 HBA1を標的化した際の単一アレルおよび両アレル編集頻度についての洞察を得るためにデュアルカラー標的化ベクターによって生成されたデータ。図20C：図20Bに示されるデータについて編集された細胞のパーセントを編集されたアレル％に対してプロットした。多項式回帰（R2＝0.9981）を使用して、編集されたアレル％から編集された細胞％へ（逆もまた同様）変換する方程式を決定した。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21A：フローサイトメトリーによって決定した場合のRBC表面マーカーGPAおよびCD71を獲得するCD34-/CD45- HSPCの割合。バーは、中央値±四分位範囲を表す。各処置群についてN＝5。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21B：ddPCRによって決定した場合の初代HSPCにおけるHBA1での標的アレル頻度。バーは、中央値±四分位範囲を表す。各処置群についてN＝3。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21C：FIX ELISAによって決定した場合の初代HSPCにおける標的化および赤血球分化後の細胞溶解物および上清中のFIX（第IX因子）産生。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21D：導入遺伝子発現プラスミドがエレクトロポレーションされた293T細胞の上清中のPAH活性の代理としてのチロシン産生。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21E：フローサイトメトリーによって決定した場合のRBC分化の経過中の構成的GFPおよびプロモーターレスYFP組み込みベクターによりHBA1で標的化された初代HSPCのRBCの％。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21F：フローサイトメトリーによって決定した場合の図21Eに示される標的化されたHSPCのGFPの％。 赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込みの更新データ。図21G：フローサイトメトリーによって決定した場合の図21Fに示されるGFP+集団のd0測定にわたるMFI倍率変化。
詳細な説明
1. 序論
本開示は、導入遺伝子、例えば、HBB、IDUA、PAH、PDGFB、FIX（例えば、第IX因子パドヴァバリアント）、LDLRなどの治療用遺伝子を、造血幹前駆細胞（HSPC）中のHBA1またはHBA2遺伝子座に組み込むための方法および組成物を提供する。
本方法は、導入遺伝子、例えば、プロモーターまたは他の調節エレメント（例えば、エンハンサー、リプレッサードメイン）、イントロン、WPRE、ポリA領域、UTR（例えば、3' UTR）などの任意のエレメントを有するコード配列を、HSPCのHBA1またはHBA2遺伝子座に特異的に導入するために使用することができる。特に、本開示は、HBA2ではなくHBA1またはHBA1ではなくHBA2を特異的に認識して、Cas9などのRNA指令ヌクレアーゼによるHBA1またはHBA2のいずれかの選択的切断を可能にする、ガイドRNA配列を提供する。導入遺伝子を含むドナーテンプレートの存在下でHBA1またはHBA2を切断するが両方を切断はしないことによって、導入遺伝子は、相同性指向組換え（HDR）によってゲノム内の切断部位に組み込まれ、例えば、内因性HBA1またはHBA2遺伝子と置き換わることができる。
特定の態様では、本方法は、HBB導入遺伝子をHBA1に送達するために使用することができ、このことは、HBBのどの変異が疾患の原因となるかに関係なく、β-サラセミア患者のための普遍的治療戦略として使用することができる。特に、この遺伝子座での組み込みは、成人ヘモグロビン四量体を形成可能である高レベルの機能的導入遺伝子を生成することができる。また、この遺伝子座での部位特異的組み込みを、他の治療上関連性のある導入遺伝子のRBC媒介送達に使用することも可能である。
2. 概略
本開示を実施する上で分子生物学分野のルーチン技術を利用する。本開示において役に立つ一般的方法を開示している基本的なテキストとしては、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)）が挙げられる。
核酸に関して、サイズは、キロベース（kb）、塩基対（bp）またはヌクレオチド（nt）のいずれかで与えられる。一本鎖DNAおよび／またはRNAのサイズは、ヌクレオチドで与えられ得る。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または公開されているDNA配列から導出される推定値である。タンパク質に関して、サイズは、キロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、由来するアミノ酸配列から、または公開されているタンパク質配列から推定される。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)によって最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載されているように自動合成装置を使用して化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野において認識されている戦略、例えば、非変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはPearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)に記載されているような陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して実施される。
3. 定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は、別途指定される場合を除き、それらに帰属される意味を有する。
「1つの（a）」、「1つの（an）」または「その（the）」という用語は、本明細書において使用される場合、1つのメンバーに関する局面を含むだけでなく、1つより多いメンバーに関する局面も含む。例として、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに別途規定している場合を除き、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つの細胞（a cell）」への言及は、複数のそのような細胞（等々）を含む。
「約」および「およそ」という用語は、本明細書において使用される場合、一般に、測定の性質または精度を前提とした、測定される量に対する許容される誤差の程度を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の20パーセント（％）以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内である。「約X」へのあらゆる言及は、具体的には、少なくとも、値X、0.8X、0.81X、0.82X、0.83X、0.84X、0.85X、0.86X、0.87X、0.88X、0.89X、0.9X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X、1.1X、1.11X、1.12X、1.13X、1.14X、1.15X、1.16X、1.17X、1.18X、1.19X、および1.2Xを指す。したがって、「約X」は、例えば「0.98X」の特許請求の範囲の限定に対する文章での説明支援を教示し、かつ提供することを意図している。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）およびそのポリマーのことを指す。具体的に限定される場合を除き、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途指示される場合を除き、特定の核酸配列はまた、明確に示された配列に加えて、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、SNPおよび相補的配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する。遺伝子は、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
「プロモーター」は、核酸の転写を指令する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書において使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位近くの必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメント）を含む。プロモーターはまた、任意で、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。プロモーターは、異種プロモーターであることができる。
「発現カセット」は、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の指定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成によって作製された核酸構築物である。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現カセットは、プロモーターに機能的に連結された、転写されるべきポリヌクレオチドを含む。プロモーターは、異種プロモーターであることができる。ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとの関連において、「異種プロモーター」は、天然の産物において（例えば、野生型の生物において）見いだされるものと同じポリヌクレオチドにそのように機能的に連結されていないプロモーターのことを指す。
本明細書において使用される場合、第1のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、生物または第2のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと比較して外来種から生じる場合、または、同じ種由来であるなら、その元の形態から改変されている場合、第1のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物または第2のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列に対して「異種」である。例えば、プロモーターが異種コード配列に機能的に連結されていると言われる場合、そのコード配列がある1つの種に由来するが、プロモーター配列は別の異なる種に由来すること；または、両方が同じ種に由来するならば、そのコード配列がプロモーターに天然に関連しない（例えば、遺伝子操作されたコード配列である）ことを意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーのことを指す。3つの用語はすべて、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書において使用される場合、この用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
「発現」および「発現された」という用語は、例えば、HBB cDNA、導入遺伝子またはコードされたタンパク質の、転写および／または翻訳産物の産生のことを指す。いくつかの態様では、この用語は、遺伝子またはその一部分によってコードされる転写および／または翻訳産物の産生のことを指す。細胞におけるDNA分子の発現のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または細胞によって産生されるDNAによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて評価され得る。
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変されたバリアント」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸のことを指すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列のことを指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例として、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされたポリペプチドを変化させることなく、コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、その核酸のあらゆる可能なサイレント変異を表す。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して機能的に同一の分子を生成することができることを認識するであろう。したがって、記載される各配列には、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が暗に意味されている。
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一アミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、付加するまたは欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、その変更によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換される場合、「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提示する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、多型バリアント、種間ホモログ、およびアレルに加えて、それらを排除しない。いくつかの場合、タンパク質の保存的に改変されたバリアントは、本明細書に記載されるように、増加した安定性、会合および活性を有することができる。
以下の8つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984)を参照のこと）
アミノ酸は、本明細書において、その一般に公知の3文字表記によって、またはIUPAC-IUB生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって承認されている1文字表記によって言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられているその1文字表記によって言及され得る。
本出願では、アミノ酸残基は、未修飾の野生型ポリペプチド配列において1と番号付けされる最も左側の残基からのその相対位置に従って番号付けされる。
本明細書において使用される場合、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、2つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の説明との関連において、同じである2つ以上の配列または指定のサブ配列のことを指す。「実質的に同一である」2つの配列は、配列比較アルゴリズムを使用するまたは特定の領域が指定されない場合には手動アライメントおよび目視検査による測定で、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最大限一致するように比較およびアライメントしたときに、少なくとも60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有する。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義はまた、試験配列の相補体のことも指す。アミノ酸配列に関して、いくつかの場合、同一性は、少なくとも約50アミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたり、またはより好ましくは75～100アミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたり存在する。
配列比較のために、典型的には、一方の配列が参照配列の役割を果たし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。初期設定のプログラムパラメーターを使用することもできるし、または代替のパラメーターを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが算出される。核酸およびタンパク質の配列比較のために、BLAST 2.0アルゴリズムおよび以下に考察される初期設定パラメーターが使用される。
「比較ウインドウ」は、本明細書において使用される場合、2つの配列を最適にアライメントさせた後に一方の配列を同じ連続位置数の参照配列と比較することができる、20～600、一般的には約50～約200、より一般的には約100～約150からなる群より選択される連続位置数のいずれか1つのセグメントを指すことを含む。
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するためのアルゴリズムは、Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されているBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイトncbi.nlm.nih.govにおいて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントした場合に一致するかまたはいくらかの正値の閾値スコアTを満たす、問い合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（HSP）を最初に同定することを伴う。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、前記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見いだす検索を開始するための出発点として働く。ワードヒットは、その後、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターM（一致残基の対に対する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜0）を使用して算出される。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するためにスコアリング行列が使用される。ワードヒットの各方向への延長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ減少した場合；1つもしくは複数の負のスコアを有する残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列について）は、初期設定として、ワードサイズ（W）28、期待値（E）10、M＝1、N＝-2、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、初期設定として、ワードサイズ（W）3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリング行列を使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと）。
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する、最小和確率（P(N)）である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、該核酸は該参照配列と類似していると見なされる。
「CRISPR-Cas」システムは、外来核酸に対する防御のための細菌システムの一種のことを指す。CRISPR-Casシステムは、広範囲の細菌および古細菌生物において見いだされる。CRISPR-Casシステムは、I、II、III、IV、VおよびVIの6つのタイプならびに多くのサブタイプを有する2つのクラスに分類され、クラス1は、タイプIおよびIIIのCRISPRシステムを含み、クラス2は、タイプII、IV、VおよびVIを含む；クラス1サブタイプは、例えば、サブタイプI-A～I-Fを含む。例えば、Fonfara et al., Nature 532, 7600 (2016)；Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015)；Adli et al. (2018)を参照されたい。内因性CRISPR-Casシステムは、ウイルスおよび他の可動遺伝因子由来の配列に対応する非反復スペーサー配列によって分離された反復クラスターを含有するCRISPR遺伝子座、ならびにスペーサー獲得、CRISPR遺伝子座からのRNAプロセシング、標的識別および切断を含む複数の機能を実行するCasタンパク質を含む。クラス1システムでは、これらの活性は、複数のCasタンパク質によって果たされるが（Cas3はエンドヌクレアーゼ活性を提供する）、クラス2システムでは、これらはすべて、単一のCas、すなわちCas9によって実行される。
「相同修復テンプレート」は、DNA中の二本鎖切断（DSB）、例えば、本明細書に記載される方法および組成物を使用して誘導されるようなHBA1またはHBA2遺伝子座でのCRISPR/Cas9媒介切断を修復するために使用できるポリヌクレオチド配列のことを指す。相同修復テンプレートは、DSBを取り囲むゲノム配列との相同性を含む、すなわち、HBA1またはHBA2ホモロジーアームを含む。いくつかの態様では、2つの別々の相同領域がテンプレート上に存在し、各領域は、対応するゲノム配列と少なくとも50、100、200、300、400、500、600、700、800、900またはより多くのヌクレオチドまたはそれ以上の相同性を含む。特定の態様では、テンプレートは、sgRNA標的部位のいずれかの部位から伸長する約500ヌクレオチドの相同性を含む2つのホモロジーアームを含む。修復テンプレートは、任意の形態で、例えば、細胞に導入されるプラスミド上で、浮遊性の二本鎖DNAテンプレート（例えば、細胞中でプラスミドから遊離するテンプレート）として、または一本鎖DNAとして存在することができる。特定の態様では、テンプレートは、ウイルスベクター、例えば、AAV6などのアデノ随伴ウイルスベクター内に存在する。本開示のテンプレートはまた、導入遺伝子、例えば、HBB導入遺伝子を含むこともできる。
HBA1およびHBA2（それぞれ、ヘモグロビンサブユニットアルファ1および2）は、ヘモグロビンの一成分であるアルファ-グロビンをコードする、密接に関連しているが同一ではない遺伝子である。HBA1およびHBA2は、ヒトの第16染色体上に位置するアルファ-グロビン遺伝子座内に位置している。それらのコード配列は、同一であるが、その遺伝子は、例えば、5' UTR、イントロン、特に3' UTRにおいて分散している。HBA1のNCBI遺伝子IDは3039であり、HBA2のNCBI遺伝子IDは3040であり、その開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
HBB（ヘモグロビンサブユニットベータ）は、ヘモグロビンのベータサブユニットをコードする遺伝子であり、正常な成人では、2つのアルファ鎖および2つのベータ鎖を含む。HBBにおける、例えば、HBB発現または機能の低減または喪失を引き起こす変異は、β-サラセミアを引き起こし得る。ヒトHBBのNCBI遺伝子ID番号は3043であり、UniProt IDはP68871であり、その開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において使用される場合、「相同組換え」または「HR」は、相同性指向修復機序を介したDNA中の二本鎖切断の修飾中のヌクレオチド配列の挿入のことを指す。このプロセスは、二本鎖切断を修復するためのテンプレートとして、切断の領域中のヌクレオチド配列と相同性を持つ「ドナーテンプレート」または「相同修復テンプレート」を使用する。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを容易にする。ドナー配列は、物理的に組み込まれるか、または相同組換えを介した切断の修復のためのテンプレートとして使用され、ヌクレオチド配列の全部または一部の導入をもたらし得る。このプロセスは、メガヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）およびCRISPR-Cas9遺伝子編集システムなどの、二本鎖切断を生成するいくつかの異なる遺伝子編集プラットフォームによって使用される。特定の態様では、HRは、CRISPR-Cas9によって誘導される二本鎖切断を伴う。
4. HBA1またはHBA2遺伝子座を特異的に標的化するCRISPR/Casシステム
本開示は、RNAガイドヌクレアーゼによるHBA1またはHBA2の切断を特異的に指令するが両遺伝子の切断を導くことのない、CRISPRガイド配列の同定に一部基づく。本開示は、両遺伝子座で高い標的化組み込み率を達成できるCRISPR/AAV6媒介ゲノム編集法を提供する。組み込まれた導入遺伝子は、機能的導入遺伝子のRBC特異的発現を示し、この遺伝子座で編集された細胞は、長期生着および造血再構築が可能である。
HBA1およびHBA2の余剰性のため、この遺伝子座での組み込みは、不利益な細胞効果を引き起こす両アレルの組み込みリスクを伴うことなく、RBC特異的発現のための導入遺伝子の送達を可能にする。さらに、β-サラセミアの処置では、その病理がHBBの欠如と不対アルファ-グロビンの凝集の両方によって引き起こされるため、HBBをHBA1にノックインすることは、単一のゲノム編集イベントで両方の問題に対処し、HBBレベルの増加とアルファ-グロビンのレベルの減少を同時に可能にする。また、b様グロビン導入遺伝子をアルファ-グロビン遺伝子座に導入する試みもなされているが、これらのアプローチは、編集時に、大きな欠失の生成、逆位または他の有害な再配列を含む多数の潜在的な遺伝的事象を生じさせ得る。
sgRNA
本開示の単一ガイドRNA（sgRNA）は、HBA1またはHBA2遺伝子座を標的とする。sgRNAは、Cas9などの部位特異的ヌクレアーゼと相互作用して、細胞のゲノム内の標的核酸に特異的に結合するまたはハイブリダイズし、その結果、sgRNAと部位特異的ヌクレアーゼが細胞のゲノム中の標的核酸に共局在化する。本明細書において使用される場合のsgRNAは、HBA1またはHBA2遺伝子座での標的DNA配列との相同性（または相補性）を含む標的化配列、およびCas9または別のRNAガイドヌクレアーゼへの結合を媒介する定常領域を含む。sgRNAは、PAM配列に隣接するHBA1またはHBA2内の任意の配列を標的とすることができる。特定の態様では、sgRNAは、HBA1遺伝子またはHBA2遺伝子のいずれか内の配列を標的とするが、両遺伝子内の配列は標的としない、すなわち、sgRNAは、2つの遺伝子間で別々のPAM配列に隣接するHBA1またはHBA2内の配列を標的とする。特定の態様では、sgRNAは、HBA1を標的とするが、HBA2を標的としない（例えば、sgRNAは、HBA1に特異的に結合しかつ／もしくはその切断を導くがHBA2にはそうしない、および／または、その標的配列は、HBA1内の配列に対して100％同一であるがHBA2内の配列に対して100％同一ではない）。いくつかのそのような態様では、sgRNAは、SEQ ID NO：5の配列を標的とする。特定の態様では、sgRNAは、HBA2を標的とするが、HBA1を標的としない（例えば、sgRNAは、HBA2に特異的に結合しかつ／もしくはその切断を導くがHBA1にはそうしない、および／または、その標的配列は、HBA2内の配列に対して100％同一であるがHBA1内の配列に対して100％同一ではない）。いくつかのそのような態様では、sgRNAは、SEQ ID NO：2の配列を標的とする。特定の態様では、単一ガイドRNAまたはsgRNAが使用される。いくつかの態様では、標的配列は、HBA1またはHBA2のイントロン2または3' UTR内である。特定の態様では、標的配列は、HBA1またはHBA2の3' UTR内である。特定の態様では、標的配列は、HBA1とHBA2との間で3、4、5またはより多くのヌクレオチドが異なる。いくつかの態様では、標的配列は、SEQ ID NO：1～5として示される配列の1つ、またはSEQ ID NO：1～5の1つと1、2、3もしくはより多くのミスマッチを含む配列を含む。特定の態様では、標的配列は、sg2（SEQ ID NO：2）またはsg5（SEQ ID NO：5）の標的配列を含む。いくつかの態様では、sgRNAは、HBA1またはHBA2遺伝子内（すなわち、コード配列、5' UTR、イントロン、または3' UTR内）の配列を標的とするが、HBA1遺伝子とHBA2遺伝子との間の遺伝子間領域中の配列を標的としない。いくつかの態様では、sgRNAは、ゲノム内の単一部位のみを標的とする。
いくつかの態様では、sgRNAは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。例えば、sgRNAのポリヌクレオチド配列はまた、RNA類似体、誘導体、またはそれらの組み合わせも含み得る。例えば、プローブを、その塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格（例えば、ホスホロチオエート）で修飾することができる。いくつかの態様では、sgRNAは、1つまたは複数のヌクレオチドに、3’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、2'-O-メチル-3'-ホスホアセテート修飾、2'-フルオロ-ピリミジン、S-拘束化エチル糖修飾、または他のものを含む。特定の態様では、sgRNAは、1つまたは複数のヌクレオチドに2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾を含む（例えば、Hendel et al. (2015) Nat. Biotech. 33 (9): 985-989を参照されたく、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる）。特定の態様では、2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾がsgRNAの5'端および3'端の3つの末端ヌクレオチドにある。
sgRNAは、いくつかの手法のいずれかで得ることができる。sgRNAのために、例えば、Applied Biosystems、Biolytic Lab Performance、Sierra Biosystems、または他社によって販売されているようなオリゴ合成装置を使用して、実験室でプライマーを合成することができる。あるいは、任意の所望の配列および／または修飾を有するプライマーおよびプローブを、数多くの供給業者、例えば、ThermoFisher、Biolytic、IDT、Sigma-Aldritch、GeneScriptなどのいずれかから容易に注文することができる。
RNAガイドヌクレアーゼ
任意のCRISPR-Casヌクレアーゼ（すなわち、ガイドRNAと相互作用して、ガイドRNAによって規定されるような標的部位でそのDNAを切断することが可能である、CRISPR-Casヌクレアーゼ）を該方法において使用することができる。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1である。特定の態様では、ヌクレアーゼは、Cas9である。本方法において使用されるCas9または他のヌクレアーゼは、本明細書に記載されるようなsgRNAに結合して、sgRNAの標的化配列によって標的化される特異的なHBA1またはHBA2配列にガイドされそれを切断することが可能である限り、どんな供給源に由来するものであってもよい。特定の態様では、Cas9は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のものである。
また、HBA1またはHBA2遺伝子座でDNAを標的化してそれを切断するCRISPR/CasまたはCRISPR/Cpf1システムも本明細書に開示される。例示的なCRISPR/Casシステムは、（a）Cas（例えば、Cas9）もしくはCpf1ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸と、（b）HBA1もしくはHBA2に特異的にハイブリダイズするsgRNA、または前記ガイドRNAをコードする核酸とを含む。いくつかの事例では、本明細書に記載されるヌクレアーゼシステムは、本明細書に記載されるようなドナーテンプレートをさらに含む。特定の態様では、CRISPR/Casシステムは、HBA1またはHBA2を標的とするsgRNAとCas9などのCasタンパク質とを含むRNPを含む。
CRISPR/Cas9プラットフォーム（これはII型CRISPR/Casシステムである）に加えて、I型CRISPR/Casシステム、III型CRISPR/Casシステム、およびV型CRISPR/Casシステムを含む代替システムも存在する。いくつか挙げると、ストレプトコッカス・ピオゲネスCas9（SpCas9）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9（StCas9）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Cas9（CjCas9）およびナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）Cas9（NcCas9）を含む、様々なCRISPR/Cas9システムが開示されている。Casシステムに代わるものとして、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Cpf1（FnCpf1）、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus sp.）Cpf1（AsCpf1）、およびラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）ND2006 Cpf1（LbCpf1）システムが挙げられる。HBA1またはHBA2遺伝子座で一本鎖または二本鎖切断を導入して本明細書に開示される方法を行うために、上記CRISPRシステムのいずれを使用してもよい。
細胞へのsgRNAおよびCasタンパク質の導入
ガイドRNAおよびヌクレアーゼは、任意の適切な方法を使用して、例えば、ガイドRNAおよびヌクレアーゼをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを、細胞に、例えば、ウイルスベクターなどのベクターまたは裸のDNAもしくはRNAとして送達されるベクターを使用して導入することによって、ガイドRNAおよびヌクレアーゼが細胞内で発現されるように、細胞に導入することができる。特定の態様では、ガイドRNAおよびヌクレアーゼは、細胞に送達される前にリボヌクレオタンパク質（RNP）へと組み立てられ、RNPは、細胞に、例えば、エレクトロポレーションによって導入される。
エクスビボ、インビトロまたはインビボで改変された動物細胞、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞が想定される。また、他の霊長類；哺乳動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットなどの商業上関連する哺乳動物を含む）；鳥類（家禽類、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよび／またはシチメンチョウなどの商業上関連する鳥類を含む）の細胞も含まれる。
いくつかの態様では、細胞は、胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞もしくは間葉系間質細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、角化細胞、骨格幹細胞、筋幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）である。特定の態様では、細胞は、CD34+造血幹前駆細胞（HSPC）、例えば、臍帯血由来（CB）、成人末梢血由来（PB）または骨髄由来のHSPCである。
HSPCは、対象から、例えば、動員末梢血を収集し、次いで、CD34マーカーを使用してHSPCを濃縮することによって単離することができる。いくつかの態様では、細胞は、β-サラセミアを有する対象由来のものである。そのような態様では、HSPCのゲノムに組み込まれる導入遺伝子は、例えばHBA1遺伝子座での、HBBである。一態様では、対象から単離された複数のHSPCをHBB遺伝子がHBA1遺伝子座で組み込まれるように遺伝子改変する工程、およびHSPCを対象に再導入する工程を含む、β-サラセミアを有する対象を処置する方法が提供される。いくつかのそのような態様では、HSPCは、インビボで赤血球（RBC）へと分化し、RBCは、本方法に供されていない対象由来のRBCにおけるレベルと比較して、より高レベルのベータ-グロビンおよびより低レベルのアルファ-グロビンを発現する。
対象に投与した際の改変された細胞の免疫拒絶を回避するために、改変されるべき細胞は、好ましくは、対象自身の細胞に由来する。したがって、好ましくは、哺乳動物細胞は、改変された細胞で処置されるべき対象に由来する自家細胞である。
いくつかの態様では、細胞は、対象から採取され、そして、ある特定の細胞タイプを選択する工程、任意で細胞を拡大増殖させる工程および任意で細胞を培養する工程を含みことができ、かつ、HBA1またはHBA2遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子を含有する細胞を選択する工程を追加で含むことができる、本明細書に開示される方法に従って改変される。特定の態様では、そのような改変された細胞は、その後、対象に再導入される。
さらに、細胞に（a）HBA1またはHBA2遺伝子座でDNAを標的化してそれを切断する本開示のRNPと（b）本明細書に記載されるような相同ドナーテンプレートまたはベクターとを導入する工程を含む、本明細書に記載される改変された宿主細胞を産生するために前記ヌクレアーゼシステムを使用する方法が本明細書に開示される。各成分は、細胞に直接導入することもできるし、前記1つまたは複数のヌクレアーゼシステムの成分をコードする核酸を導入することによって細胞中で発現させることもできる。
そのような方法は、エクスビボで宿主細胞内の内因性HBA1またはHBA2遺伝子座での機能的導入遺伝子、例えば、HBB導入遺伝子の組み込みを標的化する。そのような方法は、（a）ドナーテンプレートまたはベクターを、細胞に、任意で前記細胞を拡大増殖させた後にまたは任意で前記細胞を拡大増殖させる前に導入する工程、および（b）任意で細胞を培養する工程をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、本明細書における開示は、改変された哺乳動物宿主細胞を産生する方法であって、哺乳動物細胞に（a）Cas9などのCasヌクレアーゼとHBA1またはHBA2遺伝子座に特異的なsgRNAとを含むRNPと、（b）本明細書に記載されるような相同ドナーテンプレートまたはベクターとを導入する工程を含む方法を想定している。
これらの方法のいずれにおいても、ヌクレアーゼは、HBA1もしくはHBA2遺伝子座内で1つもしくは複数の一本鎖切断、またはHBA1もしくはHBA2遺伝子座内で二本鎖切断を生成することができる。これらの方法では、HBA1またはHBA2遺伝子座は、前記ドナーテンプレートまたはベクターによる相同組換えによって改変され、該遺伝子座への導入遺伝子の挿入をもたらす。本方法は、（c）HBA1またはHBA2遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子を含有する細胞を選択する工程をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、非相同末端結合（NHEJ）による組み込みと比べてドナーテンプレートの相同性指向修復（HDR）による組み込みを促進するために、i53（Canny et al. (2018) Nat Biotechnol 36:95）が細胞に導入される。例えば、i53をコードするmRNAを、、例えば、エレクトロポレーションによってsgRNA-Cas9 RNPと同時に細胞に導入することができる。i53の配列は、とりわけ、www.addgene.org/92170/sequences/で探し出すことができる。
機能的タンパク質（酵素、サイトカイン、抗体および細胞表面受容体を含む）を発現可能な導入遺伝子（大きな導入遺伝子を含む）の挿入技術は、当技術分野において公知である（例えば、Bak and Porteus, Cell Rep. 2017 Jul 18；20 (3): 750-756（EGFRの組み込み）；Kanojia et al., Stem Cells. 2015 Oct;33 (10): 2985-94（抗Her2抗体の発現）；Eyquem et al., Nature. 2017 Mar 2;543 (7643): 113-117（CARの部位特異的組み込み）；O’Connell et al., 2010 PLoS ONE 5 (8): e12009（ヒトIL-7の発現）；Tuszynski et al., Nat Med. 2005 May;11 (5): 551-5（線維芽細胞におけるNGFの発現）；Sessa et al., Lancet. 2016 Jul 30;388 (10043): 476-87（MLDを処置するためのエクスビボ遺伝子療法におけるアリールスルファターゼAの発現）；Rocca et al., Science Translational Medicine 25 Oct 2017: Vol. 9, Issue 413, eaaj2347（フラタキシンの発現）；Bak and Porteus, Cell Reports, Vol. 20, Issue 3, 18 July 2017, Pages 750-756（大きな導入遺伝子カセットの単一遺伝子座への組み込み）、Dever et al., Nature 17 November 2016: 539, 384-389（改変された細胞を選択および濃縮するための造血幹細胞（HSC）およびHSPCへのtNGFRの添加）を参照のこと；それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
オフターゲット効果、逆位および／または転座が低減された導入遺伝子組み込み
ある局面では、標的ゲノムへの外因性核酸の導入のためのドナーテンプレートのランダム組み込みを低減させるための方法が本明細書に提供される。ドナーテンプレートのオフターゲットまたはランダム組み込みは、内因性または外因性のDNA切断機序、例えば、ヌクレアーゼによって、意図したゲノム配列ではない二本鎖切断が生じたときに起こり得る。オフターゲットまたはランダム組み込みは、標的ゲノムにおいて意図しない遺伝子発現の増加または減少をもたらす可能性があり、また有害な影響を有する可能性がある。いくつかの態様では、本明細書において使用されるガイドRNAは、標的ゲノム中の1つの標的配列に特異的に結合し、それにより、標的ゲノムのオフターゲット結合および切断を低減させる。いくつかの態様では、プログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、ガイドRNAによって指令されるCasヌクレアーゼ、または本明細書に提供されるジンクフィンガータンパク質もしくはTALENタンパク質は、標的ゲノム中の単一の特異的標的配列に特異的に結合して、その切断をもたらす。いくつかの態様では、標的遺伝子は、高い配列類似性を共有する複数の遺伝子を含む遺伝子ファミリーまたは遺伝子座に属し得る。例えば、本明細書において使用されるガイドRNAは、HBA1またはHBA2遺伝子を標的化し得る。いくつかの態様では、本明細書において使用されるガイドRNAは、HBA1遺伝子またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、両方にはそうしない。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA1遺伝子の3' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA2遺伝子の3' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA1遺伝子の5' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA2遺伝子の5' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、HBA1またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNAは、HBA1とHBA2の両遺伝子中の標的配列とハイブリダイズするガイドRNAと比較して、宿主ゲノム中のオフターゲット切断の低減をもたらす。いくつかの態様では、HBA1またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNAは、HBA1とHBA2の両遺伝子中の標的配列とハイブリダイズするガイドRNAと比較して、宿主ゲノム中のDNAドナーテンプレートのオフターゲット組み込みの低減をもたらす。いくつかの態様では、HBA1またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNAは、宿主ゲノム中のDNAドナーテンプレートのオフターゲット組み込みをもたらさない。いくつかの態様では、HBA1またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNAは、HBA1とHBA2の両遺伝子中の標的配列とハイブリダイズするガイドRNAと比較して、宿主ゲノム中のDNAドナーテンプレートのオフターゲット組み込みを少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、75％、90％、95、または99％低減させる。
染色体転座は、2つの異種領域または染色体に由来するゲノム中でNDAセグメントを連結する。転座イベントは、二本鎖切断（DSB）（Cas9ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによって生成されたDSBを含む）の誤った修復から起こり得る。ある局面では、転座イベントが低減された標的ゲノムへの1つまたは複数の導入遺伝子の組み込みのための方法および組成物が本明細書に提供される。例えば、本明細書に提供されるガイドRNAは、プログラム可能なヌクレアーゼ、例えばCas9に、標的ゲノムの1つの特定の遺伝子座で二本鎖切断を生成するように指令することができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、単一の標的配列または単一の標的遺伝子座を特異的に標的化するガイドRNAまたはプログラム可能なヌクレアーゼは、標的配列での特異的切断を可能にする。いくつかの態様では、標的遺伝子は、高い配列類似性を共有する複数の遺伝子を含む遺伝子ファミリーまたは遺伝子座に属する。例えば、本明細書において使用されるガイドRNAは、HBA1またはHBA2遺伝子を標的化し得る。いくつかの態様では、本明細書において使用されるガイドRNAは、HBA1遺伝子またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、両方にはそうしない。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA1遺伝子の3' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA2遺伝子の3' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA1遺伝子の5' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、ガイドRNAは、HBA2遺伝子の5' UTR配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、HBA1またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNAは、標的ゲノム中で単一の切断イベントをもたらす。いくつかの態様では、ガイドRNAは、プログラム可能なヌクレアーゼに、HBA1遺伝子配列中で切断を生じさせるように指令し、HBA2遺伝子配列中ではそうしない。いくつかの態様では、ガイドRNAは、プログラム可能なヌクレアーゼに、HBA2遺伝子配列中で切断を生じさせるように指令し、HBA1遺伝子配列中ではそうしない。いくつかの態様では、HBA1またはHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNAは、HBA1とHBA2の両遺伝子中の標的配列とハイブリダイズするガイドRNAと比較して、標的ゲノム中の転座または逆位イベントの低減をもたらす。いくつかの態様では、HBA2遺伝子ではなくHBA1遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNA、ドナーテンプレートおよびRNAにガイドされるプログラム可能なヌクレアーゼが、細胞集団に導入される。いくつかの態様では、導入後、細胞集団は、HBA1またはHBA2遺伝子配列で3つの組み込み結果だけを含む：1）組み込みなし、2）インデルがHBA1配列中に生成され、HBA2配列中には生成されない、および3）HBA1配列と置き換わるドナーテンプレートの組み込み。いくつかの態様では、導入後、細胞集団は、HBA1またはHBA2遺伝子配列で以下の組み込み結果のいずれも含まない：1）HBA2配列中にインデル、2）HBA1とHBA2の両配列中にインデル、3）HBA1とHBA2の両配列の欠失、4）HBA2配列と置き換わるドナーテンプレートの組み込み、5）HBA2配列の欠失、6）HBA1配列中に組み込みおよびHBA2配列中にインデル、7）HBA2配列中に組み込みおよびHBA1配列中にインデル、8）HBA1およびHBA2遺伝子配列を含有する標的ゲノム領域の逆位、または9）染色体転座。
いくつかの態様では、HBA1遺伝子ではなくHBA2遺伝子中の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドRNA、ドナーテンプレートおよびRNAにガイドされるプログラム可能なヌクレアーゼが、細胞集団に導入される。いくつかの態様では、導入後、細胞集団は、HBA1またはHBA2遺伝子配列で3つの組み込み結果だけを含む：1）組み込みなし、2）インデルがHBA2配列中に生成され、HBA1配列中には生成されない、および3）HBA2配列と置き換わるドナーテンプレートの組み込み。いくつかの態様では、導入後、細胞集団は、HBA1またはHBA2遺伝子配列で以下の組み込み結果のいずれも含まない：1）HBA1配列中にインデル、2）HBA1とHBA2の両配列中にインデル、3）HBA1とHBA2の両配列の欠失、4）HBA1配列と置き換わるドナーテンプレートの組み込み、5）HBA1配列の欠失、6）HBA1配列中に組み込みおよびHBA2配列中にインデル、7）HBA2配列中に組み込みおよびHBA1配列中にインデル、8）HBA1およびHBA2遺伝子配列を含有する標的ゲノム領域の逆位、または9）染色体転座。いくつかの態様では、標的ゲノム中の1つの標的配列を特異的に標的化するプログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、標的ゲノム中のHBA1配列またはHBA2配列に特異的にハイブリダイズするが両方にはそうしないgRNAによって指令されるCas9は、HBA1配列とHBA2配列の両方にハイブリダイズするgRNAによって指令されるCas9と比較して低減された転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、転座イベントの頻度は、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、または10倍超低減される。いくつかの態様では、標的ゲノム中の1つの標的配列を特異的に標的化するプログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、HBA1配列またはHBA2配列に特異的にハイブリダイズするが両方にはそうしないgRNAによって指令されるCas9、およびドナーテンプレートが、細胞、例えばHSPC細胞の集団に導入される。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の10％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の50％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の5％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の5％未満、10％未満、15％未満、20％未満、25％未満、30％未満、35％未満、40％未満、45％未満、50％未満、55％未満、または60％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の1％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の0.5％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、細胞集団の0.1％未満で転座イベントをもたらす。いくつかの態様では、導入は、参照または対照の細胞集団（参照細胞集団には、例えばプログラム可能なヌクレアーゼが導入され、ガイドRNAは導入されない）と比較して、細胞集団において検出可能でない転座イベントをもたらす。
転座イベントは、DNA定量化のための標準的なTaqManアッセイによって検出してもよく、該アッセイでは、PCRは、DNAへのアニーリングとその後のDNAポリメラーゼによる分解でフルオロフォアを放出するプローブと共に実施される。無傷のプローブでは、共有付着した消光剤との相互作用を介して、フルオロフォアシグナルは抑制される。プローブは、PCRプライマーによって増幅される領域内部にアニーリングするように設計される。検出された蛍光シグナルは、したがって、試料中に存在するアンプリコンの量に比例する。Burman et al., Genome Biology 16, 146 (2015)に記載されているような転座の検出法が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
別の局面では、本開示は、本明細書に開示される任意の方法を使用して作製された、2つ以上の標的核酸に変更を有する細胞集団であって、5％未満の転座頻度を有する細胞集団を提供する。一態様では、転座頻度は、4％未満である。一態様では、転座頻度は、3％未満である。一態様では、転座頻度は、2％未満である。一態様では、転座頻度は、1％未満である。一態様では、転座頻度は、0.5％未満である。一態様では、転座頻度は、0.25％未満である。一態様では、転座頻度は、0.1％未満である。一態様では、細胞集団は、参照細胞集団（参照細胞集団には、例えばプログラム可能なヌクレアーゼが導入され、ガイドRNAは導入されない）の転座頻度よりも低い転座頻度を含む。
相同修復テンプレート
ポリヌクレオチドまたはドナー構築物によって含まれる組み込むべき導入遺伝子は、その遺伝子産物が赤血球中で望ましい任意の導入遺伝子であることができる。例えば、導入遺伝子は、β-サラセミアを有する対象における欠陥遺伝子、例えば、欠陥HBB遺伝子と置き換えるまたはそれを補うために使用することもできる。他の態様では、遺伝子改変されたHSPCを対象に導入して赤血球へと分化させることでき、その後、赤血球がインビボで循環してコードされたタンパク質を分泌するように、導入遺伝子は、対象において有望な治療有益性を提供する分泌タンパク質を発現させることもできる。適切な導入遺伝子の例示的な非限定的な一覧は、PDFGB（血小板由来成長因子サブユニットB；例えば、NCBI Gene ID No. 5155を参照のこと）、IDUA（アルファ-L-イズロニダーゼ；例えば、NCBI Gene ID No. 3425を参照のこと）、PAH（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ；例えば、NCBI Gene ID No. 5053を参照のこと）、第IX因子（またはFIX；例えば、NCBI Gene ID NO. 2158を参照のこと）、例えば、高活性第IX因子パドヴァまたはパドヴァバリアント（例えば、Simioni et al., (2009) NEJM 361: 1671-1675；Cantore et al. (2012) Blood 120: 4517-4520；Monahan et al., (2015) Hum. Gene. Ther. 26:69-81を参照のこと）、LDLR（低密度リポタンパク質受容体；例えば、NCBI Gene ID No. 3949を参照のこと）などを含む。
導入遺伝子は、プロモーターまたは他の調節エレメント（例えば、エンハンサー、リプレッサードメイン）、イントロン、WPRE、ポリA領域、UTR（例えば、3' UTR）などの任意のエレメントを有する、遺伝子、例えば、対象において欠陥のある遺伝子の機能的コード配列を含む。
いくつかの態様では、相同修復テンプレート中の導入遺伝子は、対応する遺伝子のcDNAを含むかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、相同修復テンプレート中の導入遺伝子は、対応する遺伝子由来のコード配列および1つまたは複数のイントロンを含む。いくつかの態様では、相同修復テンプレート中の導入遺伝子は、コドン最適化されており、例えば、対応する野生型コード配列またはcDNA、またはその断片に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはより多くの相同性を含む。
特定の態様では、テンプレートは、cDNAの3'端に、ポリA配列またはシグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリA配列またウサギベータ-グロビンポリA配列をさらに含む。特定の態様では、導入遺伝子の発現を増加させるために、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）が、テンプレートの3' UTR内、例えば、コード配列の3'端とポリA配列の5'端の間に含まれる。任意の適切なWPRE配列を使用することができる；例えば、Zufferey et al. (1999) J. Virol. 73 (4): 2886-2892；Donello, et al. (1998). J Virol 72: 5085-5092；Loeb, et al. (1999). Hum Gene Ther 10: 2295-2305を参照のこと；その開示全体は、参照により本明細書に組み入れられる）。
相同組換えを容易にするために、導入遺伝子は、ポリヌクレオチドまたはドナー構築物内で標的ゲノム配列と相同である配列によって挟まれる。例えば、導入遺伝子は、ガイドRNAによって規定されるような切断部位を取り囲む配列によって挟まれることができる。特定の態様では、導入遺伝子は、導入遺伝子のHDR媒介組み込み時にHBA1またはHBA2遺伝子が置き換えられるように、HBA1もしくはHBA2遺伝子またはコード配列の3'端および5'端と相同である配列によって挟まれる。そのような一態様では、導入遺伝子は、一方の側でHBA1またはHBA2遺伝子の3' UTRに対応する配列によって、他方の側上でHBA1またはHBA2の転写開始部位の領域、例えば、開始部位の5'だけに対応する配列によって挟まれる。相同性領域は、任意のサイズ、例えば、100～1000bp、300～800bp、400～600bp、または約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、またはより大きなbpのものであることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、インビボで導入遺伝子の発現を駆動するように、プロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む。特定の態様では、導入遺伝子は、その発現が内因性HBA1またはHBA2プロモーターによって駆動されるように、HBA1またはHBA2のコード配列と置き換わる。特定の態様では、ドナーテンプレートは、SEQ ID NO：6またはその断片に対して少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはより大きな同一性を含む配列を含む。特定の態様では、ドナーテンプレートは、SEQ ID NO：6として示される配列またはその断片を含む。
本明細書に記載されるように、標的ゲノム中の標的配列へ導入するための導入遺伝子は、タンパク質またはその部分もしくは断片をコードするポリヌクレオチド、遺伝子の調節配列、遺伝子の非翻訳領域、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、発現カセット、発現タグ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ポリヌクレオチドであり得る。いくつかの態様では、導入遺伝子（または、例えば、コード配列もしくはその断片、調節配列、イントロン、エクソン、発現カセットまたはタグ、例えば、蛍光タグの挿入のためのポリヌクレオチド）は、標的ゲノム中の核酸配列と配列相同性または同一性を有する1つまたは複数のホモロジーアームによって挟まれる。例えば、導入遺伝子は、導入遺伝子の5'端または3'端のいずれかで第1のホモロジーアームおよび／または第2のホモロジーアームによって挟まれ得る。いくつかの態様では、第1のホモロジーアームおよび／または第2のホモロジーアームは、標的遺伝子の3'端および／または5'端と相同である配列を含む。例えば、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ得、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の5'フランキング配列と相同である、または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の3’フランキング配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の5'フランキング配列と相同であり、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の3’フランキング配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の5' UTR配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の3' UTR配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の5' UTR配列の5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の3' UTR配列の3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の5' UTR配列のすぐ5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の3' UTR配列のすぐ3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子のコード領域の5'末端の5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子のコード領域の3'末端の3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子のコード領域の5'末端のすぐ5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子のコード領域の3'末端のすぐ3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子のオープンリーディングフレームの5'末端の5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子のオープンリーディングフレームの3'末端の3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子のオープンリーディングフレームの5'末端のすぐ5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子のオープンリーディングフレームの3'末端のすぐ3'側の配列と相同である。本明細書において使用される場合、オープンリーディングフレームは、前駆体mRNAおよび／またはタンパク質へと転写される能力を有する遺伝子のリーディングフレームのことを指す。ORFは、開始コドン（例えば、ATG）から始まり、停止コドン（例えば、UAA）で終結し得る。いくつかの態様では、タンパク質は、ORFから完全長および／または機能的タンパク質として翻訳される。
いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の全コード配列の5'末端の5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の全コード配列の3'末端の3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームおよび3'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の全コード配列の5'末端のすぐ5'側の配列と相同である、および／または、3'ホモロジーアームは、標的遺伝子の全コード配列の3'末端のすぐ3'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の転写開始の開始部位の5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の転写開始の開始部位のすぐ5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最初のエクソンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最初のエクソンのすぐ5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最初のイントロンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最初のイントロンのすぐ5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終イントロンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終イントロンのすぐ5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終イントロンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終イントロンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終エクソンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終エクソンのすぐ5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終エクソンの5'側の配列と相同である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、5'ホモロジーアームによって挟まれ、この場合、5'ホモロジーアームは、標的遺伝子の最終エクソンの5'側の配列と相同である。
いくつかの態様では、標的遺伝子の一部または断片が、導入遺伝子に置き換えられる。いくつかの態様では、標的遺伝子の全コード配列が、導入遺伝子に置き換えられる。いくつかの態様では、導入遺伝子のコード配列および調節配列が、導入遺伝子に置き換えられる。いくつかの態様では、導入遺伝子に置き換えられる標的遺伝子配列は、オープンリーディングフレームを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子に置き換えられる標的遺伝子配列は、発現カセットを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子に置き換えられる標的遺伝子配列は、前駆体mRNAへと転写される配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子に置き換えられる標的遺伝子配列は、5' UTR、1つまたは複数のイントロン、1つまたは複数のエクソン、および3' UTRを含む。
全遺伝子置換は、本明細書に提供される方法および組成物を用いて実施され得る。ヌクレアーゼ、例えば、Cas9 RNPが、フランキング相同性配列を通じて、所望の遺伝子に切断部を導入する場合、全ゲノムが置き換わり得る。いくつかの態様では、置き換えられる標的遺伝子は、HBA遺伝子座に属する。いくつかの態様では、置き換えられる標的遺伝子は、HBA1またはHBA2である。いくつかの態様では、導入遺伝子は、レポータータンパク質（例えば、GFP）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、HBBタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、左側ホモロジーアームは、切断部位の上流にある。いくつかの態様では、左側ホモロジーアームは、切断部位の下流にある。いくつかの態様では、切断部位は、非コード領域中にある。いくつかの態様では、切断部位は、コード領域中にある。いくつかの態様では、切断部位は、非翻訳領域（UTR）の一部である。いくつかの態様では、切断部位は、イントロンにある。
いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、少なくとも100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp長またはより長い。いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、100bp、150bp、200bp、250bp、275bp、300bp、325bp、350bp、375bp、400bp、450bp、または500bpを超える長さである。いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、少なくとも400bp長である。いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、少なくとも500bp、600bp、700bo、800bp、900bp、または1000bp長である。いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、少なくとも850bp長である。いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、400～500bpである。いくつかの態様では、5'ホモロジーアームは、400～500bp、400～550bp、400～600bp、400～650bp、400～700bp、400～750bp、400～800bp、400～850bp、400～900bp、400～950bp、400～1000bp、400～1100bp、400～1200bp、400～1300bp、400～1400bp、450～500bp、450～550bp、450～600bp、450～650bp、450～700bp、450～750bp、450～800bp、450～850bp、450～900bp、450～950bp、450～1000bp、450～1100bp、450～1200bp、450～1300bp、450～1450bp、500～600bp、500～650bp、500～700bp、500～750bp、500～800bp、500～850bp、500～900bp、500～950bp、500～1000bp、500～1100bp、500～1200bp、500～1300bp、500～1500bp、550～600bp、550～650bp、550～700bp、550～750bp、550～800bp、550～850bp、550～900bp、550～950bp、550～1000bp、550～1100bp、550～1200bp、550～1300bp、550～1500bp、600～650bp、600～700bp、600～750bp、600～800bp、600～850bp、600～900bp、600～950bp、600～1000bp、600～1100bp、600～1200bp、600～1300bp、600～1600bp、650～700bp、650～750bp、650～800bp、650～850bp、650～900bp、650～950bp、650～1000bp、650～1100bp、650～1200bp、650～1300bp、650～1500bp、700～700bp、700～750bp、700～800bp、700～850bp、700～900bp、700～950bp、700～1000bp、700～1100bp、700～1200bp、700～1300bp、700～1500bp、750～800bp、750～850bp、750～900bp、750～950bp、750～1000bp、750～1100bp、750～1200bp、750～1300bp、750～1500bp、800～850bp、800～900bp、800～950bp、800～1000bp、800～1100bp、800～1200bp、800～1300bp、800～1500bp、850～900bp、850～950bp、850～1000bp、850～1100bp、850～1200bp、850～1300bp、850～1500bp、900～950bp、900～1000bp、900～1100bp、900～1200bp、900～1300bp、900～1500bp、1000～1100bp、1100～1200bp、1200～1300bp、1300～1400bp、または1400～1500bp長である。
いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、少なくとも100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp長またはより長い。いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、100bp、150bp、200bp、250bp、275bp、300bp、325bp、350bp、375bp、400bp、450bp、または500bpを超える長さである。いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、少なくとも400bp長である。いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、少なくとも500bp、600bp、700bo、800bp、900bp、または1000bp長である。いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、少なくとも850bp長である。いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、400～500bpである。いくつかの態様では、3'ホモロジーアームは、400～500bp、400～550bp、400～600bp、400～650bp、400～700bp、400～750bp、400～800bp、400～850bp、400～900bp、400～950bp、400～1000bp、400～1100bp、400～1200bp、400～1300bp、400～1400bp、450～500bp、450～550bp、450～600bp、450～650bp、450～700bp、450～750bp、450～800bp、450～850bp、450～900bp、450～950bp、450～1000bp、450～1100bp、450～1200bp、450～1300bp、450～1450bp、500～600bp、500～650bp、500～700bp、500～750bp、500～800bp、500～850bp、500～900bp、500～950bp、500～1000bp、500～1100bp、500～1200bp、500～1300bp、500～1500bp、550～600bp、550～650bp、550～700bp、550～750bp、550～800bp、550～850bp、550～900bp、550～950bp、550～1000bp、550～1100bp、550～1200bp、550～1300bp、550～1500bp、600～650bp、600～700bp、600～750bp、600～800bp、600～850bp、600～900bp、600～950bp、600～1000bp、600～1100bp、600～1200bp、600～1300bp、600～1600bp、650～700bp、650～750bp、650～800bp、650～850bp、650～900bp、650～950bp、650～1000bp、650～1100bp、650～1200bp、650～1300bp、650～1500bp、700～700bp、700～750bp、700～800bp、700～850bp、700～900bp、700～950bp、700～1000bp、700～1100bp、700～1200bp、700～1300bp、700～1500bp、750～800bp、750～850bp、750～900bp、750～950bp、750～1000bp、750～1100bp、750～1200bp、750～1300bp、750～1500bp、800～850bp、800～900bp、800～950bp、800～1000bp、800～1100bp、800～1200bp、800～1300bp、800～1500bp、850～900bp、850～950bp、850～1000bp、850～1100bp、850～1200bp、850～1300bp、850～1500bp、900～950bp、900～1000bp、900～1100bp、900～1200bp、900～1300bp、900～1500bp、1000～1100bp、1100～1200bp、1200～1300bp、1300～1400bp、または1400～1500bp長である。
任意の適切な方法を使用して、ポリヌクレオチドまたはドナー構築物を細胞に導入することができる。いくつかの事例では、ドナーテンプレートは、一本鎖、二本鎖、プラスミドまたはDNA断片である。いくつかの事例では、プラスミドは、プロモーターおよび任意で3' UTRを含む複製に必須のエレメントを含む。ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス（組み込み適格型と組み込み欠損型の両方のレンチウイルスベクター）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのベクターであることができる。ウイルスベクターは、ウイルスベクターの複製に必須の遺伝子をさらに含み得る。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、例えば、rAAV6を使用して導入される。
いくつかの態様では、標的化構築物は、（1）ウイルスを生成するための、ウイルスベクター骨格、例えばAAV骨格；（2）標的部位への高レベルの再現性のある標的化を確実にするための、両側に少なくとも200bpであるが理想的には少なくとも400bpの標的部位と相同性のアーム（Porteus, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 56:163-190 (2016)を参照のこと；これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）；（3）機能的タンパク質をコードしかつ機能的タンパク質を発現可能な導入遺伝子、ポリA配列、および任意でWPREエレメント；ならびに任意で（4）改変された宿主細胞の濃縮および／またはモニタリングを可能にする追加のマーカー遺伝子を含む。当技術分野において公知である任意のAAVを使用することができる。いくつかの態様では、主なAAV血清型は、AAV6である。いくつかの態様では、ドナーテンプレートを含むベクター、例えば、rAAV6ベクターは、約1～2kb、2～3kb、3～4kb、4～5kb、5～6kb、6～7kb、7～8kb、またはより大きい。
いくつかの態様では、ウイルスベクター、例えば、AAV6ベクターは、例えば、約1×103個、5×103個、1×104個、5×104個、1×105個、2×104～1×105個、または1×105個未満のウイルス／細胞の感染多重度（MOI）で形質導入される。
適切なマーカー遺伝子は、当技術分野において公知であり、Myc、HA、FLAG、GFP、短縮型NGFR、短縮型EGFR、短縮型CD20、短縮型CD19、ならびに抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。いくつかの態様では、相同修復テンプレートおよび／またはベクター（例えば、AAV6）は、ユビキチンCプロモーターなどのプロモーターに機能的に連結された短縮型神経成長因子受容体（tNGFR）のコード配列を含む発現カセットを含む。
いくつかの態様では、ドナーテンプレートまたはベクターは、HBA1またはHBA2遺伝子座の断片と相同であるヌクレオチド配列を含むか、または、ヌクレオチド配列は、HBA1またはHBA2遺伝子座の少なくとも200、250、300、350、400、450、500またはより多くの連続ヌクレオチドに対して少なくとも85％、88％、90％、92％、95％、98％または99％同一である。
挿入される構築物はまた、急性毒性に起因して急速な細胞除去が必要となる状況では、他の安全スイッチ、例えば、標準的な自殺遺伝子（例えば、iCasp9）を遺伝子座中に含むこともできる。本開示は、体内に移植された任意の操作された細胞を、例えば、栄養要求因子の除去によって排除できるような、ロバストな安全スイッチを提供する。これは、操作された細胞ががん性細胞に形質転換された場合に特に重要である。
本方法は、内因性HBA1またはHBA2遺伝子座でのドナーテンプレートの効率的な組み込みを可能にする。いくつかの態様では、本方法は、20％、25％、30％、35％、40％またはより多くの細胞、例えば、β-サラセミアを有する個体由来の細胞においてドナーテンプレートの挿入を可能にする。本方法はまた、組み込まれた導入遺伝子を有する細胞、例えば、β-サラセミアを有する個体由来の細胞における、コードされたタンパク質の高い発現レベル、例えば、健常な対照細胞における発現と比べて少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％またはより大きな発現レベルを可能にする。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなCRISPR媒介システム（例えば、ガイドRNA、RNAガイドヌクレアーゼ、および相同修復テンプレートを含む）は、例えば動員末梢血または臍帯血に由来するような、初代HSPCにおいて評価される。そのような態様では、HSPCは、WT初代HSPC（例えば、該システムの初期試験向け）であるか、または患者由来HSPC（例えば、前臨床インビトロ試験向け）に由来するものであることができる。
5. 処置の方法
HSPCのゲノムへの導入遺伝子の組み込みおよびコードされた治療用タンパク質の発現の確認に続き、複数の改変されたHSPCを対象に再導入することができる。一態様では、HSPCは、これらが骨髄に定植し、例えば赤血球へと分化することができるように、大腿骨内注射によって導入される。いくつかの態様では、HSPCは、インビトロで赤血球へと分化するように誘導され、改変された赤血球は、その後、対象に再導入される。
本明細書において、いくつかの態様では、それを必要とする個体における遺伝性障害、例えば、β-サラセミアを処置する方法であって、該個体に、本明細書に開示されるゲノム改変法を使用したタンパク質置換療法を提供する工程を含む方法が開示される。いくつかの事例では、本方法は、HBA1またはHBA2遺伝子座に組み込まれた機能的導入遺伝子、例えばHBB導入遺伝子を含む、エクスビボの改変された宿主細胞であって、個体において不足しているコードされたタンパク質を発現する、改変された宿主細胞を含み、それにより、個体において遺伝性障害を処置する。
薬学的組成物
いくつかの態様では、薬学的組成物、治療法および投与の方法を含む、改変された細胞の使用のための方法、組成物およびキットが本明細書に開示される。本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、主としてヒトへの投与に適した薬学的組成物を対象としているが、そのような組成物は、一般に任意の動物への投与に適することが当業者によって理解されよう。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような改変された自家宿主細胞を含む薬学的組成物が提供される。改変された自家宿主細胞は、HBA1またはHBA2遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子を含むように遺伝子操作される。本明細書における開示の改変された宿主細胞は、例えば、（1）安定性を増加させる；（2）生体分布を変える（例えば、細胞株を特異的な組織または細胞タイプに標的化する）；（3）コードされた治療用因子の放出プロファイルを変えるために、1つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化され得る。
本開示の製剤は、非限定的に、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、およびそれらの組み合わせを含むことができる。本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるかまたはその後開発される任意の方法によって調製することができる。本明細書において使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、少なくとも1つの活性成分（例えば、改変された宿主細胞）と任意で1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物のことを指す。本開示の薬学的組成物は、無菌であり得る。
本開示に従う薬学的組成物中の活性成分（例えば、改変された宿主細胞）、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の身元、サイズおよび／または状態に応じて、さらには組成物が投与されようとする経路に応じて変動し得る。例えば、組成物は、0.1％～99％（w/w）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、0.1％～100％、例えば、0.5～50％、1～30％、5～80％、または少なくとも80％（w/w）の活性成分を含み得る。
本明細書において使用される場合の賦形剤としては、望ましい特定の剤形に適するようなあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、保存料などが挙げられるが、それらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技術が当技術分野において公知である（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照のこと；参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的影響を生じるかまたはそれ以外の点で薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって物質またはその誘導体と適合しない可能性がある場合を除き、本開示の範囲内であると想定され得る。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉砂糖などおよび／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通す濾過によって、および／または、使用前に滅菌水もしくは他の無菌の注射可能な媒体に溶解もしくは分散させることができる無菌の固体組成物の形態で滅菌剤を組み入れることによって滅菌され得る。
投薬および投与
上述した薬学的組成物中に含まれる本開示の改変された宿主細胞は、治療上有効な結果をもたらす任意の送達経路、全身送達または局所送達によって投与され得る。これらの送達としては、腸内、胃腸内、硬膜外、経口、経皮（transdermal）、脳内、脳室内、皮膚上、皮内、皮下、鼻、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、脊髄内、実質内、腹腔内、膀胱内、硝子体内、海綿体内）、間質内、腹部内、リンパ管内、骨髄内、肺内、髄腔内、滑液嚢内、脊髄内、管内、非経口、経皮（percutaneous）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、軟組織および局所が挙げられるが、それらに限定されない。特定の態様では、細胞は、静脈内に投与される。
いくつかの態様では、対象は、細胞移植の前に前処置を受けるだろう。例えば、造血幹細胞移植の前に、対象は、同じ対象を起源とする幹細胞であっても幹細胞移植の拒絶反応を防ぐために骨髄機能廃絶療法、非骨髄機能廃絶療法または用量減量前処置を受ける場合がある。前処置は、細胞毒性薬の投与が必要な場合がある。前処置はまた、免疫抑制、抗体、および放射線照射を含む場合もある。他の考えられる前処置としては、抗体媒介前処置（例えば、Czechowicz et al., 318 (5854) Science 1296-9 (2007)；Palchaudari et al., 34 (7) Nature Biotechnology 738-745 (2016)；Chhabra et al., 10:8 (351) Science Translational Medicine 351ra105 (2016)を参照のこと）およびCAR T媒介前処置（例えば、Arai et al., 26 (5) Molecular Therapy 1181-1197 (2018)を参照のこと；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）が挙げられる。例えば、関心対象のタンパク質を送達するために、操作された造血幹細胞（HSC）に由来するミクログリアが移動するための空間を脳内に作るために前処置が使用される必要がある（ALDおよびMLDの最近の遺伝子療法治験と同様）。前処置はまた、移植された細胞が生着および増殖するための場所を体内に持つことができるようなニッチな「空間」を作るように設計される。HSC移植では、例えば、前処置は、移植されたHSCが生着するためのニッチな空間を骨髄に作る。前処置なしには、移植されたHSCは生着できない。
本開示のある特定の局面は、本開示の改変された宿主細胞を含む薬学的組成物を哺乳動物対象の標的組織に提供する方法であって、標的組織と改変された宿主細胞を含む薬学的組成物とを、該組成物がそのような標的組織中に実質的に保持されるような条件下で接触させることによる方法を対象とする。いくつかの態様では、改変された宿主細胞を含む薬学的組成物は、1つまたは複数の細胞透過剤を含むが、薬学的に許容される賦形剤を有するまたは有しない「ネイキッド」製剤（例えば、細胞透過剤または他の薬剤を有しない）も想定される。
本開示は追加的に、本開示に従う改変された宿主細胞を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。改変された宿主細胞を含む薬学的組成物、および本開示の組成物は、障害、例えば、β-サラセミアを予防、治療または管理するのに有効な任意の投与量および任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象毎に異なる。対象は、ヒト、哺乳動物または動物であり得る。任意の特定の個体に対する具体的な治療上または予防上有効な用量レベルは、処置されている障害およびその障害の重症度；用いられた特定のペイロードの活性；用いられた特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路；処置の持続期間；用いられた特定の改変された宿主細胞と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野において周知である類似の因子を含む多種多様な要因に依存する。
ある特定の態様では、本開示に従う改変された宿主細胞の薬学的組成物は、例えば、約1×104～1×105個、1×105～1×106個、1×106～1×107個もしくはより多くの改変された細胞を対象に送達するのに十分な投薬レベル、または所望の治療もしくは予防効果を得るのに十分な任意の量で投与され得る。本開示の改変された宿主細胞の所望の投与量は、一度にまたは複数回で投与され得る。いくつかの態様では、改変された宿主細胞の対象への送達は、治療効果を少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年または10年超にわたり提供する。
改変された宿主細胞は、1つまたは複数の他の治療薬、予防薬、研究薬もしくは診断薬、または医学的手技と組み合わせて、連続的にまたは同時にいずれかで使用され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。
また、β-サラセミアまたは他の遺伝性障害の処置のための本開示に従う改変された哺乳動物宿主細胞の使用も本開示によって包含される。
本開示はまた、本開示の組成物または構成成分、例えば、sgRNA、Cas9、RNP、i53および／または相同テンプレート、ならびに、任意で、例えば構成成分を細胞に導入するための試薬を含む、キットも想定している。キットはまた、1つまたは複数の容器またはバイアル、ならびに本明細書に記載される方法に従って細胞を改変および対象を処置するための組成物の使用説明書を含むこともできる。
6. 実施例
本開示は、具体的な実施例を用いてさらに詳しく説明される。以下の実施例は、例証を目的としてのみ提供されるものであって、いかなる形においても本開示を限定することを意図していない。当業者は、本質的に同じ結果を得るために変更または改変することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識するだろう。
実施例1. α-グロビンとβ-グロビンとの遺伝子置換は、β-サラセミア由来造血幹前駆細胞におけるヘモグロビンバランスを回復させる
序論
この研究では、本発明者らは、Cas9/AAV6組み合わせゲノム編集法を活用して、事実上同一のHBA2遺伝子を混乱させることなく、HBA1遺伝子座への完全長HBB導入遺伝子の部位特異的組み込みを媒介した。本発明者らは、このプロセスによって、HBA1のコード領域全体をHBB導入遺伝子で高頻度に置き換えることが可能になり、このことが、β-サラセミア由来HSPCにおいてβ-グロビン：α-グロビン不均衡を正常化し、かつ、RBCにおいて機能的成人ヘモグロビン四量体を救済することを見いだした。免疫不全NSG（非肥満糖尿病scidガンマ）マウスへの移植実験後、本発明者らは、編集されたHSCが、インビボで造血系に再定植することができ、長期生着を増強できることを見いだし、このことは、この編集プロセスが、正常な造血幹細胞機能を妨害しないことを示している。
遺伝子置換戦略の高い効率は、このアプローチが、特定の遺伝子全体に点在する機能喪失変異によって引き起こされる広範な単一遺伝子疾患に広く適用可能であり、したがって、このゲノム編集ツールボックスを、相同組換えを使用する新たな方法を通して、治療上関連性のあるヒト初代細胞のゲノムを精密に操作することに拡大できることを示唆する。
結果
Cas9/AAV6媒介ゲノム編集は、大きなゲノム組み込みを、HSPCを含む広範な細胞タイプにおいて多くの遺伝子座にわたって高頻度に導入可能なロバストなシステムである（19～22）。実際、このシステムを用いて、HBB遺伝子座にある鎌状赤血球症（SCD）の原因となる疾患原因変異をHSPCにおいて高頻度に補正することに成功している（23）。しかしながら、β-サラセミアは、SCDの原因となる単一遺伝子多型というよりむしろHBB全体にわたって点在する機能喪失変異によって引き起こされる。それゆえ、すべての患者に向けたユニバーサルな補正スキームは、HBBの完全長コピーの送達が必要である。それを行うための最も簡単な方法は、内因性遺伝子座に機能的HBB導入遺伝子をノックインすることであろう。しかしながら、このアプローチは、いくつかの技術的課題を抱えている：1）HBBにおけるCas9媒介DSBは、β-サラセミアマイナー患者とβ-サラセミアインターメディエイト患者において機能的アレルを部分的に破壊するだろう；2）Cas9 DSB部位周辺の部分的組換えを防ぐために、内因性遺伝子座に完全長β-グロビンcDNAを組み込むのにコドン分岐が要求されるが、このことは導入遺伝子の発現レベルに悪影響を及ぼし得る（24）；3）イントロンは、合理的に分岐できないので除去されなければならないが、これは、遺伝子調節においてHBBイントロンが担うことが知られている重要な機能的役割を破壊する恐れがある（25、26）；4）周辺の調節領域における疾患原因変異は、分岐したcDNAの組み込み後も持続する可能性が高い；および、5）この戦略は、β-グロビン遺伝子座の大きな欠失によって引き起こされる疾患を有する多くの患者にとって有効でないだろう（図6）（27）。
先行研究は、α-グロビンレベルの低下したβ-サラセミア患者が、あまり重症でない疾患表現型を表すことを示している（5、28）。それゆえ、α-グロビン遺伝子座での完全長HBBのノックインは、HBBを内因性遺伝子座に導入することに特有の問題を克服しながら、β-グロビン：α-グロビン不均衡を単一のゲノム編集イベントで最も効果的に改善することができるだろう。
α-グロビン遺伝子における効率的かつ特異的なインデル形成
α-グロビンは、HSPCがRBCへと分化するときに2つの遺伝子（HBA1およびHBA2）から発現されるので、本発明者らは、HBBを1つのα-グロビン遺伝子に部位特異的に組み込むことで、重要なα-グロビン産生を排除することなくRBC特異的HBB発現を達成可能であろうと仮説を立てた。HBA1およびHBA2遺伝子は事実上区別できないが（5' UTR、3つすべてのエクソンおよびイントロン1は、100％同一である；イントロン2は、94.0％同一である；3' UTRは、83.8％同一である）、本発明者らは、一方のα-グロビン遺伝子のみの切断を容易にすると期待される限られた数のCRISPR/Cas9単一ガイドRNA（sgRNA）部位（sg1～5と呼ばれる；例えば、SEQ ID NO：1～5を参照のこと）を特定することができた（図1A）。この2つの遺伝子を区別するガイドのスクリーニングが極めて重要であった理由は、Cas9/sgRNAリボヌクレオタンパク質送達系がCD34+ HSPCにおいて効果が高すぎるために（>90％の挿入／欠失（インデル））、本発明者らは、両方のα-グロビン遺伝子で活性であったsgRNAを有することによって4遺伝子ノックアウトα-サラセミアを生じさせたくなかったからである。それゆえ、本発明者らは、3' UTR内に位置する2つの遺伝子の配列差を利用したガイドを調べることにした。そのために、本発明者らは、5つの3' UTRガイドのうちのどれが、意図した遺伝子で最も効率的かつ特異的にインデル（挿入／欠失）を誘導できるかを決定するため、Cas9リボヌクレオタンパク質（RNP）と事前に複合体化された各化学修飾されたsgRNA（29）をエレクトロポレーションによってヒトCD34+ HSPCに送達した。次に、本発明者らは、HBA2とHBA1の両方の3' UTR領域をPCR増幅させ、TIDE分析を使用して対応するサンガー配列をインデル頻度について分析した（30）。本発明者らは、5つのガイドのうち4つが高頻度のインデル形成を容易にし、そのうち2つがHBA1とHBA2の識別を可能にし（sg2はHBA2を切断し、sg5はHBA1を切断する）、そのうち2つはそうしないことを見いだした（sg1とsg4は、HBA2とHBA1の両方を切断する）（図1B）。sg1とsg4のHBA1およびHBA2標的配列は、PAMから19位で一塩基対異なっていただけであり（図7A）、これが特異性の欠如の主要因の可能性が高い。その一方で、高度に特異的なsg2とsg5の標的配列は、五塩基対異なっていた。加えて、これらのsgRNAの1つのオフターゲット活性を決定するために、本発明者らは、sg5と複合体化させた高忠実度Cas9（31）を細胞にエレクトロポレーションし、次いで、COSMIDによって予測された40の最も可能性の高いオフターゲット部位のターゲットシーケンシングを実施した（32）。このことから、HBA1特異的sg5が極めて特異的であり、平均オンターゲット活性が66.6％で、40の予測部位のうち2つだけが検出閾値を上回る活性を示していることが判明した（オフターゲット部位1および12で、それぞれ中央値で0.31％および0.14％の活性）（図7B）。これらのオフターゲット部位は、それぞれPTGFRNおよびRAPGEF1遺伝子の3' UTRに位置しており、これらの領域は非コード化であるので、小さなインデルの生成は機能的影響を及ぼさないと予測される（図7C）。
上流ホモロジーアーム戦略は、カスタム組み込みによるα-グロビンの置換を可能にする
HBA1特異的およびHBA2特異的なガイドの特定後、本発明者らは、これらの遺伝子座でのAAV6媒介相同組換え（HR）の頻度を調べた。本発明者らは、GFP発現カセットをCas9 RNPが誘導する切断部位に直接組み込むAAV6ドナーテンプレートベクターを設計した。これは、各sgRNAの切断部位（本明細書において以降「CS」と呼ぶ）にすぐ隣接する400bpホモロジーアームによって容易になった（図1C）。本発明者らは、Cas9 RNPと複合体化させた最も特異的なガイド（HBA2を標的とするsg2およびHBA1を標的とするsg5）をエレクトロポレーションによってヒトCD34+ HSPCに送達した。エレクトロポレーションがAAV形質導入を補助することができると過去に報告されていたので（33）、本発明者らは、AAV送達を最大限に高めるためにCas9 RNPのエレクトロポレーションの直後に各AAV6ベクターを加えた。何日かして、「AAV単独」対照におけるエピソーム発現が低減した後、本発明者らは、フローサイトメトリーによって組み込み頻度を分析した（図8A）。予想していた通り、本発明者らは、切断部位に隣接するホモロジーアームを有するベクターが、CD34+ HSPCにおいてHBA2とHBA1の両方に効率的に組み込まれたことを、フローサイトメトリーによる決定で見いだした（それぞれ、中央値で16.5％および28.2％の細胞がGFP+であった）（図1D）。しかしながら、切断部位は、遺伝子毎に3' UTR中に存在するので、このアプローチでは、HRの際にどちらのα-グロビン遺伝子のノックアウトも確実にできないだろう。それゆえ、本発明者らはまた、各遺伝子の開始コドンのすぐ5'側400bpにまたがる、切断部位の上流に位置する左側ホモロジーアームを有する修復テンプレートベクターをクローニングした。このアプローチは、HR修復プロセスを利用し、各α-グロビン遺伝子のコード領域の完全置換を容易にすることができ、これによって、α-グロビン産生が低減するだけでなく、組み込まれた導入遺伝子の発現が内因性α-グロビンプロモーターによって駆動されることも可能になった（本明細書において以降「全遺伝子置換」を「WGR」と呼ぶ）（図1C）。全遺伝子置換のプロセスは、TALENによるCD40Lの操作に関してT細胞において低頻度であるが測定可能な頻度で起こることが判明した（34）。本発明者らは、WGR戦略において切断部位の上流に左側ホモロジーアームを有することが、HBA2での編集頻度を有意に低下させることを見いだした（16.5％対13.2％；P＜0.05）（図1D）。驚くべきことに、HBA1でのWGR戦略は、編集頻度の協調的な減少をもたらさなかったので（28.2％対37.8％）、この効果は、遺伝子依存的であるように思われた（図1D）。左側ホモロジーアームは各WGRベクターにおいて同一であったので、本発明者らは、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）を使用して、本発明者らの組み込みが、意図した遺伝子へのみ特異的であり、本発明者らの標的化頻度と良く相関することを、GFP発現による決定で確認した（図1E）。注目すべきことに、これらの細胞に対してフローサイトメトリーを実施したところ、本発明者らは、GFP+細胞の平均蛍光強度（MFI）がCSベクターと比較してWGRベクターで有意に高いことを見いだした（P＜0.0005）（図1F；図8B）。
α-グロビンでの全遺伝子置換は、RBC特異的導入遺伝子発現をもたらす
HBA1でのWGR修復テンプレート設計が、1）CS設計と比較して同等の組み込み頻度を導く、2）CS設計よりも大きなGFP発現レベルをもたらす、そして、3）α-グロビンの1つの遺伝子コピーのノックアウトを確実にするという事実のために、本発明者らは、次に、このスキームを、完全長HBB導入遺伝子をHBA1遺伝子座に組み込むことに適合させた。HBB導入遺伝子発現の追跡を容易にするために、本発明者らは、導入遺伝子をT2A-YFP配列に融合させ、このことで、HBBタンパク質レベルの代わりとして編集頻度の蛍光読み出しが可能になる（図2A）。HBB-T2A-YFPカセットに隣接する非翻訳領域（UTR）（HBB UTRまたは内因性HBA1/2 UTRのいずれか）の重要性、ならびに最大のHBBイントロン（イントロン2,850bp）を除去することの影響を決定するために、本発明者らは、複数の異なるAAV6修復テンプレートベクターを設計し、組み込み頻度および導入遺伝子発現を分析した。本発明者らは、過去に記載の通りHSPCを標的化し、次いで、確立されたプロトコルを使用して細胞を赤血球へと分化させ（35、36）、組み込み頻度および発現レベルをフローサイトメトリーによって決定した（図9）。本発明者らは、HBA1およびHBA2でHSPCを標的化することは、「モック」（すなわち、エレクトロポレーション単独）、「RNP単独」および「AAV単独」の対照と比較して、RBCへと分化する能力に対して識別可能な効果がないことを見いだした（図2B）。標的化頻度をフローサイトメトリーとddPCRの両方によって確認したところ、HBA1 UTRを有するベクターが最も効率的に組み込まれると結論付けることができた（平均で細胞の55.4％がYFP+であり、平均で全アレルの24.4％が標的化された）（図2C～2D）。さらに、本発明者らは、YFP+細胞のMFIが、HBB UTRを有するいずれのベクターと比べてもHBA1 UTRベクターで有意に大きいことを見いだし（P＜0.05）（図2E；図10）、このことは、HBA1調節領域との関連でHBB発現レベルがより高いことを潜在的に示している。HBB-T2A-YFP組み込みは内因性プロモーターによって駆動されるので、本発明者らは、YFPが、GPA+/CD71+RBCにおいてのみ発現されると判断することができ（図2F）、このことによって、HBA1が、HBA2からのα-グロビン産生を混乱させることなく、RBC特異的発現を達成するための効果的なセーフハーバー部位であると結論付けるに至った。
HBA1遺伝子座でのHBB導入遺伝子の組み込みは、成人ヘモグロビン四量体を生成する
HBA1へのHBBの標的化組み込み後のβ-グロビンタンパク質の産生を確認するために、本発明者らは、T2A-YFPなしにHBB導入遺伝子単独を組み込むいくつかのAAV6ベクターをスクリーニングした。これらのベクターは、HBBおよびHBA1 3' UTR、WPRE、ならびにBGHポリA領域などの調節エレメントの様々な組み合わせ、さらには、高度に編集された細胞の集団を特定および濃縮することを可能にするtNGFRを発現する多種多様なベクターを使用した（図3A；図11）。本発明者らはまた、延長された左側および右側ホモロジーアームを有する組み込みベクターを作り、そうすることで、細胞が相同性領域（特に、切断部位の上流にある左側アーム内の）を識別するのを助け、それにより本発明者らのHBB導入遺伝子の組み込み頻度を増加させることができると仮説を立てた。これらのベクターをスクリーニングするために、本発明者らは、鎌状ヘモグロビン（HgbS）を排他的に発現するという理由でSCD由来CD34+ HSPCを標的化し、このことで、本発明者らの編集スキームから生じる成人ヘモグロビン（HgbA）救済の程度を決定することができた。以前の通り、標的化されたHSPCを編集し、次いで、RBCへと分化させ、これから、HBA1遺伝子座での編集が、細胞がRBCへと分化する能力にほとんど影響がないことが示された（図3B）。本発明者らは、ホモロジーアームを延長することによって組み込み頻度が有意に改善され、標的アレルが平均で21.1％から36.5％に増加したことを見いだした（P＜0.05）（図3C）。96ウェルプレートにプレーティングされた単一細胞のジェノタイピングから、アレルの36.5％の標的化率が、少なくとも1つの編集イベントを受けた細胞の59.5％に相当すると予想される（図11A）。HPLCによってRBCをヒトヘモグロビンについて分析したところ、本発明者らは、3つのベクターすべてがHgbA四量体を発現および形成できることを見いだした（図3D）。HBB-T2A-YFPベクターによって予測されるように、ローカルなHBA1 UTRをそのままの状態に保つ組み込みがより多くの量のHgbA四量体を生成し、このことは、T2A-YFPシステムが導入遺伝子発現を高度に予測できることを示している。興味深いことに、HBB-T2A-YFPで編集したRBCをHPLCによってヘモグロビン四量体形成について分析したところ、本発明者らは、バックグラウンドを上回るHgbA四量体形成を発見できなかった（図12）。本発明者らは、このことが、タンパク質機能を破壊すると報告されている残存T2A切断尾部に起因し得ると考えている（37）。それにもかかわらず、本発明者らは、ホモロジーアームが伸長されたベクターが、400bpホモロジーアームを有するベクターよりも有意に高い組み込み頻度を生じるだけでなく、有意により大きな割合のHgbA四量体も生成したことを見いだした（P＜0.05）（図3E）。重要なことに、ホモロジーアームが伸長されたベクターは、より短い400bpホモロジーアームを有するHBA1 UTRベクターと同一のゲノム編集イベントを導入するので、本発明者らは、このHgbA産生の増加が、単に、長いホモロジーアームベクターが組み込みできるより大きな頻度によるものであると予想する。この仮説と一致して、本発明者らは、標的化頻度とHgbA四量体産生との間に強い相関関係を見いだし（R2＝0.8695）（図3F）、このことは、あらゆるHBB標的化HBA1アレルが内因性タンパク質レベルに寄与することを示している。
HBA1でHBBにより標的化されたHSPCは、NSGマウスにおいて長期生着および造血再構築が可能である
編集プロセスがインビボの骨髄細胞およびリンパ球系統に生着および再構築するHSPCの能力に影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明者らは、HBA1遺伝子座で標的化されたヒトHSPCの免疫欠陥NSGマウスへの移植実験を実施した。臨床HSCTプロセスを可能な限り厳密に再現するために、G-CSFおよびPlerixaforを使用して健常ドナー由来のHSPCを動員させた（38）。動員末梢血を収集し、次いで、CD34マーカーを使用してHSPCを濃縮し、上記の通りHBA1で標的化した。標的化後2日目に、メチルセルロース培地を含有する96ウェルプレートに生存CD34+HSPCを単一細胞ソーティングし、14日間のインキュベーション後にコロニー形成能をスコア化した。これから、編集されたHSPCが、すべての系統の細胞を生じさせることができることが示された（図11B～11C）。編集プロセスは、コロニーの総数を低減するように思われるが、その低減は、主として顆粒球／マクロファージ系統におけるコロニー形成能に起因し、多系統および赤血球系統のコロニー形成ならびにそれらの相対分布に影響を及ぼすことはない。
コロニー形成アッセイに対して使用していない編集された細胞の全バルク集団を、骨髄中の造血幹細胞ニッチを除去するために致死量以下の照射を受けた免疫不全NSGマウスに大腿骨内注射した（図13）。実験を3名の別々の健常HSPCドナーに対して実施し、これらの間で拡大増殖率が一定でないため、移植のための総細胞数は反復間で変動していた。それゆえ、本発明者らは、これらを、マウス1匹当たり注射される120万個、750,000個および250,000個の細胞の注射にそれぞれ対応する、大用量、中用量および小用量として設計した。注射後16週目に、これらのマウス由来の骨髄を採取し、マーカーとしてヒトHLA-A/B/Cを使用してヒト細胞の生着を決定した（図14）。本発明者らは、すべての処置群間の3種の投与量すべてで、骨髄へうまく生着させることができることを見いだした（図4A）。本発明者らは、中用量と小用量間で、過去に観察されたように（22、23）、細胞の生着能が、モックエレクトロポレーション対照およびRNP単独対照と比較してAAV単独処置およびRNP+AAV処置において負の影響を受けたことを見いだした。しかしながら、より多くの数の細胞を移植したところ、本発明者らは、もはや処置群間で生着にいかなる有意差も観察できなかった。本発明者らはまた、編集プロセスが、ヒトHSPCの骨髄細胞およびリンパ球系統のインビボ再構築能力に影響を及ぼさず、生着したヒト細胞の中でこれらの系統内の分布に対して識別可能な影響がないことも見いだした（図4B）。次に、本発明者らは、ddPCRを使用して、生着した細胞集団内の所望の標的化イベントの頻度を決定した。本発明者らは、本発明者らの生着に成功したHSPCのバルク集団内で中央値で全アレルの11.0％が適切に標的化され（図4C）、これは、少なくとも1つの編集イベントを受けた細胞の17.9％に相当すると予想されることを見いだした。本発明者らはまた、生着した細胞をCD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）およびLin-/CD10-/CD34+（HSPC）の集団に系統ソーティングし、これらのサブ集団間のアレル標的化頻度を決定したところ、それぞれ中央値で7.8％、14.9％および17.2％であった。本発明者らは、インビトロの移植前集団から生着に成功した細胞集団へ標的アレル頻度の適度な低減を観察し（図4D）、これは過去の報告において観察されたものと合致しており（23、39）、Pattabhiらによって最近報告されたよりそれほど急激な低下ではない（40）。臨床上関連するHBB組み込みベクターによる編集に加えて、本発明者らはまた、細胞をWGR修復テンプレートベクターで標的化して、HBA1遺伝子を強いUbCプロモーターによって発現されるGFPと置き換えた（図15A～15E）。本発明者らは、中央値で8.7％のヒト細胞の生着率を見いだし、これは、HBA1遺伝子の置換がHSPCの生着能力にほとんど影響がないことを示している。本発明者らはまた、フローサイトメトリーを使用して、生着に成功した細胞の編集頻度が、中央値で25.6％、そして、B細胞、骨髄細胞およびHSPC系統ではそれぞれ中央値で1.0％、15.9％および0.9％であることが明らかになり、このことは、編集された細胞が、様々な系統の生着および再構築を可能にしたことを示している。
初期移植実験で生着に成功した細胞を採取した後、本発明者らは、これらの細胞を二次移植として新たなマウスに静脈内注射して、編集プロセスが、2番目のマウスにおいて造血系に長期間生着および再定植する細胞の能力に影響を及ぼすかどうかを決定した。実際に、対照のモックエレクトロポレーション処置もRNP/AAV6で標的化された細胞も>20％で生着することができた（図4E）。次に、本発明者らは、ddPCRを以前の通り使用し、この第2ラウンドの移植においてうまく生着することができたヒト細胞集団内の組み込み頻度を決定した。その際、本発明者らは、バルク試料で、かつ、初期移植実験において生着した細胞間で観察された率と合致した系統内で、組み込み率を観察した（図4F）。これらの結果を、本発明者らのWGR GFPベクターによる標的化によってさらに確認し、このことから、編集された（GFP+）細胞が、2番目のマウスから骨髄を採取したところ、長期間生着できたことも実証された（図15F～15G）。
β-サラセミア由来HSPCにおけるHBB導入遺伝子の送達は、α-グロビン：β-グロビン不均衡を補正する
WTドナーに由来する長期再構築性HSCにおけるHBA1遺伝子座での安定な組み込み頻度を実証した後、本発明者らは、この戦略をβ-サラセミア由来HSPCに適用した。β-サラセミア患者から保存されたバックアップG-CSFおよびPlerixafor動員末梢血からCD34+細胞を単離した。以前のように、本発明者らは、これらのHSPCを拡大増殖させ、HBA1 UTRベクターを使用して標的化し（図3A）、コロニー形成アッセイのために、単一の生存CD34+ HSPCを96ウェルプレートの各ウェルにソーティングした。本発明者らは、編集されたHSPCが、すべての系統の細胞を生じさせることができることを見いだした（図11D～11E）。系統の偏りは明らかでなかったが、編集されたβ-サラセミア由来HSPCのコロニーを形成する能力全体は、わずかに低減されたように思われ、このことは、Cas9/AAV6媒介ゲノム編集後の先行報告と合致している（41）。
コロニー形成アッセイに加えて、標的化されたHSPCの一部を編集後2日目にRBC分化させた。本発明者らは、両ベクターが、これらのβ-サラセミア由来HSPCをうまく標的化できたこと、また過去に示されているように、ホモロジーアームを延長させることが、これらの細胞において編集頻度を有意に改善させたことを、ddPCRによる決定で見いだした（13.8％対48.5％；P＜0.05）（図5A）。本発明者らの編集スキームがα-グロビンおよびβ-グロビンの発現にどのように影響を及ぼすかについての洞察を得るために、本発明者らは、α-グロビンのmRNA発現（HBA1とHBA2を区別しない）ならびに組み込まれたHBB導入遺伝子からのmRNA発現を評価可能にするddPCRプライマー／プローブを設計した。予期した通り、発現をRBCマーカーのGPAに対して正規化したところ、本発明者らは、400bpホモロジーアームHBA1 UTRベクターで編集された細胞が、α-グロビン発現の適度な減少ならびに適度なレベルの導入遺伝子発現を提示したことを見いだした（図5B）。おそらく伸長されたホモロジーアームベクターを用いて達成されたより高い編集頻度に起因して、本発明者らは、さらに大きなα-グロビン発現の減少ならびにβ-グロビン導入遺伝子発現の増加を観察した。実際に、本発明者らは、伸長されたホモロジーアームベクターが、1：1比のα-グロビン：β-グロビンのmRNA発現をほぼ達成できることを見いだした。
標的化されたβ-サラセミア由来HSPCは、NSGマウスにおいて長期生着および造血再構築が可能である
RBC分化および分析に加えて、本発明者らは、標的化されたβ-サラセミア由来HSPCを致死量以下の照射を受けたNSGマウスに注射することによって生着実験を実施した。移植後16週目に、本発明者らは、マウスから骨髄を採取し、生着および標的化頻度をそれぞれフローサイトメトリーおよびddPCRによって決定した。本発明者らは、実際に、HBA1遺伝子座で本発明者らの導入遺伝子によって標的化された患者由来のHSPCが、骨髄中に中央値でヒト細胞の19.8％でうまく生着することができたことを見いだした（図5C）。本発明者らはまた、本発明者らの編集プロトコルが、生着に成功した細胞の系統分布にほとんど関わりがないことも観察した（図5D）。ddPCRを使用して、本発明者らはまた、生着に成功した細胞が、バルク集団において5.5％の頻度中央値で、ならびに、B細胞、骨髄細胞およびHSPC系統においてそれぞれ1.5％、17.1％および1.7％の頻度中央値で編集されたことも明らかにした（図5E）。
考察
まとめると、本発明者らは、疾患の原因となる分子的要因の両方、すなわちβ-グロビンの喪失と過剰なα-グロビンの蓄積に単一のゲノム編集イベントで取り組む、β-サラセミアの有望な処置のための新規なゲノム編集プロトコルを開発した。過去のデータは、骨髄中のおよそ25％の編集細胞のキメラ現象が、サラセミア患者において輸血非依存状態が達成される閾値であると思われることを示している（42）。β-サラセミア由来HSPCにおいて本発明者らが達成した編集頻度は、インビトロで標的化されたアレルの48.5％であり、これは、少なくとも1つの編集されたアレルを保有する細胞の79.0％に相当すると予想される。本発明者らのアプローチは、部位特異的であり、また患者自身の細胞を使用するので、このアプローチは、1）免疫学的に適合するドナーの不足を克服する；2）定期的な輸血および／または鉄キレート療法の必要性を排除する；3）同種HSCTに伴って起こる免疫拒絶の可能性を排除する；そして、4）ゲノム中のウイルスベクターのセミランダムな組み込みのリスクを回避するだろう。これらの理由から、本発明者らが記載したこの技術は、現行の治療戦略の落とし穴を克服する助けとなる。
β-サラセミアの処置に対する直接的な影響を超えて、本発明者らはまた、本発明者らの結果がゲノム編集分野全体に広く関連性を持つと考えている。先行研究は、全遺伝子置換がT細胞において低頻度で起こり得ると実証したが（34）、本発明者らの研究は、全遺伝子置換の頻度をHSPCにおいて有意に増加させかつ利用することができることを実証している。ほとんどの劣性遺伝性疾患は、特定の遺伝子全体の機能喪失変異によって引き起こされるため、本発明者らが開発したスキームは、広範囲の遺伝性障害に対する汎用的な処置戦略にすることができ、このゲノム編集ツールボックスを効果的に拡大させることができる。
本発明者らの研究はまた、蛍光レポーターと組み合わせたT2A切断ペプチドシステムが、導入遺伝子発現を高度に予測できることを示した。このことは、このシステムが、編集に成功した細胞を迅速に特定する際に、また多種多様な組み込みベクターの比較（すなわち、異なる調節領域を有するか、特定のイントロンの有無、など）に役立つことを実証している。患者由来のHSPCは、とりわけ複数のドナーから入手困難であり得るため、このT2Aスクリーニングシステムはまた、患者由来のHSPCにおいて検証することができる健常HSPCにおける最適な翻訳ベクターの特定も可能にする。最後に、本発明者らは、RBCにおいてのみ発現される遺伝子であるα-グロビン遺伝子座でのカセット組み込みを最適化しているので、この研究は、治療用酵素およびモノクローナルなどのRBCによるペイロードの送達のためのセーフハーバー遺伝子座を特徴付けた。これは、将来の研究が、カスタムベクターをHBA1遺伝子座に高頻度で組み込むことを可能にし、それにより、RBC発生に重要な遺伝子をノックアウトするリスクを伴わず（HBA2は無傷のままであるので）RBC特異的発現を達成することができる。これらの理由から、本発明者らは、この研究の知見が、広範囲の遺伝性障害の補正のための戦略としても多種多様な細胞工学用途のための戦略としても、将来のゲノム編集研究の指針になると期待する。
方法
AAV6ベクターの設計、生産および精製
すべてのAAV6ベクターを、AAV2に由来する逆位末端配列（ITR）を含有するpAAV-MCSプラスミド（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）にクローニングした。各ベクターの作製に、Gibson Assembly Mastermix（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を製造業者の説明書の通り使用した。切断部位（CS）ベクターを、左側および右側ホモロジーアーム（それぞれ「LHA」および「RHA」）がHBA2遺伝子またはHBA1遺伝子のいずれかの切断部位のすぐ隣になるように設計した。全遺伝子置換（WGR）ベクターは、HBA2遺伝子またはHBA1遺伝子のいずれかの5' UTRに隣接するLHAを有する一方で、RHAは、その対応する切断部位の下流にすぐ隣接する。別途注記しない限り、すべてのベクターのLHAおよびRHAは400bpであり、ベクター名称（HBA2/HBA1およびCS/WGR）は、それぞれ、使用される標的組み込み部位およびホモロジーアームを参照する。図1内で、CSおよびWGRベクターは、SFFV-GFP-BGH発現カセットから構成された。また、HBA1に対するWGRベクターの作製に代替プロモーターUbCを使用した（図15）。図2では、WGR-T2A-YFPベクターは、注記しない限り、完全長HBB遺伝子から構成されており、T2A-YFP発現カセットはHBB遺伝子のエクソン3の直後にあり、WGRについて前述したLHAおよびRHAを使用する。これらの完全長HBB-T2A-YFPベクターは、図2Aに表示していように、HBB、HBA2またはHBA1の5'および3' UTRによって挟まれていた。後続の実験では、SCDまたはβ-サラセミア患者由来のCD34+ HSPCの標的化のために、WGRベクターを、HBA1部位を標的とするように設計し、HBA1 UTRまたはHBB UTRのいずれかによって挟まれる完全長HBB遺伝子を含有した。「HBB UTR」および「HBA1 UTR」ベクターは共に400bpのHAを共有する一方で、「HBA1 UTRロングHA」ベクターは880bpのHAを有するように改変された。AAV6ベクターの生産のために記載の通りわずかな改変を加えた（43）。293T細胞（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）を10個の15cm2のディッシュに1プレート当たり13～15×106個の細胞で播種した。24時間後、各ディッシュを、6μgのITR含有プラスミドおよび22μgのpDGM6（AAV6 cap遺伝子、AAV2 rep遺伝子およびAd5ヘルパー遺伝子を含有する）の標準的なポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクションでトランスフェクトした。48～72時間のインキュベーション後、3回の凍結-融解サイクルによって細胞を溶解し、250U/mLのベンゾナーゼ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で処理し、次いで、ベクターを、18℃で2.25時間の48,000 RPMのイオジキサノール勾配遠心分離を通じて精製した。その後、40～58％イオジキサノール境界線で完全カプシドを単離し、次いで、さらなる使用まで80℃で保管した。代替法として、完全AAV6カプシドを抽出するために、48～72時間のインキュベーション期間後に製造業者の説明書の通りAAVPro Purification Kit（All Serotypes）（Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA）も使用した。過去に記載の通り（44）、ddPCRを使用してAAV6ベクターを滴定し、ベクターゲノムの数を測定した。
CD34+ HSPCの培養
ヒトCD34+ HSPCを過去に記載の通り培養した（19、23、33、41、45、46）。CD34+ HSPCは、新鮮臍帯血、凍結臍帯血ならびにPlerixaforおよび／またはG-CSF動員末梢血（AllCells, Alameda, CA, USA and STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada）、SCD患者の凍結Plerixaforおよび／またはG-CSF動員末梢血、ならびにβ-サラセミア患者由来の凍結G-CSFおよびPlerixafor動員末梢血から供給された。CD34+ HSPCを、幹細胞因子（SCF）（100ng/mL）、トロンボポエチン（TPO）（100ng/mL）、FLT3リガンド（100ng/mL）、IL-6（100ng/mL）、UM171（35nM）、20mg/mLストレプトマイシンおよび20U/mLペニシリンが補充されたStemSpan SFEM II（STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada）基礎培地中、2.5×105～5×105個の細胞/mLで培養した。細胞インキュベーター条件は、37℃、5％ CO2および5％ O2であった。
CD34+ HSPCのゲノム編集
HBA2またはHBA1のいずれかのCD34+ HSPCを編集するために使用する化学修飾されたsgRNAは、Synthego（Menlo Park, CA, USA）およびTriLink BioTechnologies（San Diego, CA, USA）から購入し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製した。加えられたsgRNA修飾は、過去に記載された5'および3'端の3つの末端ヌクレオチドでの2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエートであった（29）。sgRNAの標的配列は、以下の通りであった：
Figure 2023502626000002
。使用したCas9タンパク質（Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3）はすべてIntegrated DNA Technologies（Coralville, Iowa, USA）から購入した。エレクトロポレーションの前に、Cas9：sgRNAモル比1：2.5で、25℃で10分間、RNPを複合体化した。CD34+細胞をP3緩衝液（Lonza, Basel, Switzerland）中に複合体化したRNPと共に再懸濁し、Lonza 4D Nucleofector（program DZ-100）を使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、前に記載したサイトカイン補充培地に2.5×105個の細胞/mLでプレーティングした。エレクトロポレーションの直後、AAV6を、ddPCRによって決定された力価に基づいて5×103～1×104個のベクターゲノム／細胞で細胞に供給した。
TIDEによるインデル頻度分析
標的化後2～4日目に、HSPCを採取し、QuickExtract DNA抽出液（Epicentre, Madison, WI, USA）を使用してgDNAを収集した。次いで、製造業者の説明書に従ってCleanAmp PCR 2x Master Mix（TriLink, San Diego, CA, USA）と一緒に、以下のプライマーを使用してHBA2およびHBA1のそれぞれの切断部位を増幅させた：
HBA2（sg1～3）：
Figure 2023502626000003
。次いで、PCR反応液を1％アガロースゲル上に流し、適切なバンドを切り出し、GeneJET Gel Extraction Kit（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を製造業者の説明書に従って使用してゲル抽出した。次いで、ゲル抽出したアンプリコンを、以下のプライマーを用いてサンガーシーケンシングした：
HBA2（sg1～3）：
Figure 2023502626000004
。得られたサンガークロマトグラムを、過去に記載の通り（30）TIDEによるインデル頻度分析のためのインプットとして使用した。
フローサイトメトリーによる遺伝子標的化分析
蛍光組み込みベクターによる標的化後4～8日目に、CD34+ HSPCを採取し、編集された細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定した。Ghost Dye Red 780（Tonbo Biosciences, San Diego, CA, USA）を使用して細胞を生存率について分析し、Accuri C6フローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）またはFACS Aria II（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）のいずれかを使用してレポーター発現を評価した。その後、FlowJo（FlowJo LLC, Ashland, OR, USA）を使用してデータを解析した。
ddPCRによるアレル標的化分析
標的化後2～4日目に、HSPCを採取し、QuickExtract DNA抽出液（Epicentre, Madison, WI, USA）を使用してgDNAを収集した。次いで、BAMH1-HF（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を製造業者の説明書の通り使用して、gDNAを消化した。細胞集団内の標的アレルの割合を、以下の反応混合物を使用したddPCRによって測定した：消化されたgDNAインプット1～4μL、ddPCR SuperMix for Probes（No dUTP）10μL（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）、プライマー／プローブ（1：3.6比；Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA）、20μLまでの容量のH2O。次いで、製造業者（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）の説明書に従ってddPCR液滴を作製した：ddPCR反応液20μL、液滴生成オイル70μL、および液滴試料40μL。Thermocycler（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）設定は、以下の通りであった：1. 98℃（10分）、2. 94℃（30秒）、3. 57.3℃（30秒）、4. 72℃（1.75分）（工程2に戻り×40～50サイクル）、5. 98℃（10分）。QX200 Droplet Digital PCR System（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用して液滴試料の分析を行った。標的化されたアレルの割合を決定するために、ポアソン補正した組み込み体のコピー数/mLをポアソン補正した参照DNAのコピー数/mLで割った。以下のプライマーおよび6-FAM/ZEN/IBFQ標識加水分解プローブを、Integrated DNA Technologies（Coralvilla, IA, USA）から特注のPrimeTime qPCR Assaysとして購入した：すべてのHBA2組み込み化GFPベクター（BGHから400bp HBA2 RHAの外側に及ぶ）：
Figure 2023502626000005
；すべてのHBA1組み込み化GFPベクター（BGHから400bp HBA1 RHAの外側に及ぶ）：
Figure 2023502626000006
；HBA2組み込み化HBB-T2A-YFPベクター（YFPから400bp HBA2 RHAの外側に及ぶ）：
Figure 2023502626000007
；すべてのHBA1組み込み化HBB-T2A-YFPベクター（YFPから400bp HBA1 RHAの外側に及ぶ）：
Figure 2023502626000008
；HBA1組み込み化HBBベクター（400bp HAを有する、T2A-YFPを有しない）（HBBエクソン3から400bp HBA1 RHAの外側に及ぶ）：
Figure 2023502626000009
；HBA1組み込み化HBBベクター（880bp HAを有する、T2A-YFPを有しない）（HBBエクソン3から880bp HBA1 RHAの外側に及ぶ）：
Figure 2023502626000010
。Integrated DNA Technologies（Coralvilla, IA, USA）から特注のPrimeTime qPCR Assaysとして購入したプライマーおよびHEX/ZEN/IBFQ標識加水分解プローブを使用して、CCRL2参照遺伝子を増幅させた：
Figure 2023502626000011
。「HBA1 UTRロングHA」ベクターの長さに起因して、かつ、確実にエピソームAAVが検出されないようにするため、ddPCRアンプリコンは、ddPCR製造業者によって推奨されるテンプレートサイズを超える。データの解析後、このベクターの標的アレルの割合は少なく見積もられる。それゆえ、これらの場合、この過小見積りの原因となる補正因子を、400bp HAを有するHBA1 UTRベクターで標的化されたHSPCから採取されたgDNAを、ddPCRのプライマーとプローブの両セット（400bp HAを有するベクターと880bp HAを有するベクターに対するもの）ならびにCCRL2参照プローブを用いて増幅させることによって決定した。結果として生じる補正因子を、次いで、880bp HAに対するプライマーとプローブで標的化および増幅された試料からの標的アレル割合に適用した。
rhAmpSeqによるオフターゲット活性分析
COSMIDを使用してHBA1 sg5に対する予測オフターゲット部位を特定し、19個のPAM近位塩基およびPAM配列NGG中で最大3つのミスマッチを許容した。40の最も高度に予測されたオフターゲット部位についての総編集頻度を算出するためのマルチプレックスPCRアンプリコンシーケンシングを、rhAmpSeq技術（Integrated DNA Technologies）を使用して実施した。カスタムビルドパイプラインを使用してNGSデータを解析した。PCRアンプリコンをIllumina MiSeq（v2 chemistry；2×150）で配列決定し、Picard tools v2.9（https://github.com/broadinstitute/picard）を使用してデータを逆多重化した。フォワードリードとリバースリードを伸長したアンプリコン（flash v1.2.11）に統合した後（47）、GRCh38ゲノム参照（minimap2 v2.12）に対してアラインメントした（48）。リードをマルチプレックスプライマープール（bedtools tags v2.25）中の標的に割り当て（49）、標的に対して再アラインメントし、インデルが予測されたCas9切断部位近くにあるアラインメント選択を優遇した。各標的で、切断部位の4bpウインドウ内にインデルを含有する総リードの割合として、編集が計算された。
CD34+ HSPCの赤血球へのインビトロ分化
標的化に続き、健常者、SCD患者またはβ-サラセミア患者に由来するHSPCを、過去に記載の通り（35、36）、SFEM II培地（STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada）中、37℃および5％ CO2で14～16日間培養した。SFEMII基礎培地に、100U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、10ng/mL SCF、1ng/mL IL-3（PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA）、3U/mLエリスロポエチン（eBiosciences, San Diego, CA, USA）、200μg/mLトランスフェリン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、3％抗体血清（Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA, USAから、熱不活性化）、2％ヒト血漿（臍帯血）、10μg/mLインスリン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）および3U/mLヘパリン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を補充した。第1段階として、分化の0～7日目に（標的化後2日目を0日とする）、細胞を1×105個の細胞/mLで培養した。第2段階として、7～10日目に、細胞を1×105個の細胞/mLで維持し、培養物からIL-3を除去した。第3段階として、11～16日目に、細胞を1×106個の細胞/mLで培養し、トランスフェリンを培養培地中1mg/mLまで増加させた。
mRNA分析
HSPCの赤血球への分化に続き、細胞を採取し、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用してRNAを抽出した。その後、iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用して、およそ100ngのRNAからcDNAを作製した。Integrated DNA Technologies（Coralvilla, IA, USA）から特注のPrimeTime qPCR Assaysとして購入した以下のプライマーおよび6-FAM/ZEN/IBFQ標識加水分解プローブを使用したddPCRによって、β-グロビン導入遺伝子およびα-グロビンmRNAの発現レベルを定量した：HBB：
Figure 2023502626000012
；HBA（HBA2とHBA1を区別しない）：
Figure 2023502626000013
。RNAインプットに対して正規化するために、Integrated DNA Technologies（Coralvilla, IA, USA）から特注のPrimeTime qPCR Assaysとして購入した以下のプライマーおよびHEX/ZEN/IBFQ標識加水分解プローブを使用して、各試料中でRBC特異的参照遺伝子GPAのレベルを決定した：
Figure 2023502626000014
。ddPCR反応液をそれぞれのプライマーおよびプローブを使用して作製し、上述した通り液滴を生成した。Thermocycler（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）設定は、以下の通りであった：1. 98℃（10分）、2. 94℃（30秒）、3. 59.4℃（30秒）、4. 72℃（30秒）（工程2に戻り×40～50サイクル）、5. 98℃（10分）。QX200 Droplet Digital PCR System（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を使用して液滴試料の分析を行った。相対発現レベルを決定するために、ポアソン補正したHBAまたはHBB導入遺伝子のコピー数/mLをポアソン補正したGPAのコピー数/mLで割った。
分化した赤血球のイムノフェノタイピング
上記赤血球分化に供したHSPCを、14～16日目にFACS Aria II（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を使用して赤血球系統特異的マーカーについて分析した。編集細胞と未編集細胞を、以下の抗体を使用したフローサイトメトリーによって分析した：hCD45 V450（HI30；BD Biosciences, San Jose, CA, USA）、hCD34 APC（561；BioLegend, San Diego, CA, USA）、hCD71 PE-Cy7（OKT9；Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）、およびhCD235a PE（GPA）（GA-R2；BD Biosciences, San Jose, CA, USA）。
定常状態ヘモグロビン四量体分析
上記赤血球分化に供したHSPCを、ペレット化した細胞の3容量に相当する水を使用して溶解した。混合物を室温で15分間インキュベートし、続いて30秒超音波処理した。赤血球ゴーストから溶解物を分離するために、13,000 RPMで5分間遠心分離を実施した。天然型のヘモグロビンのHPLC分析を、室温で、Shimadzu UFLCシステムを使用して、弱陽イオン交換PolyCAT Aカラム（100×4.6-mm、3μm、1,000Å）（PolyLC Inc., Columbia, MD, USA）上にて行った。移動相A（MPA）は、20mM Bis-tris＋2mM KCN（pH 6.96）から構成される。移動相B（MPB）は、20mM Bis-tris＋2mM KCN＋200mM NaCl（pH 6.55）から構成される。清澄な溶血物をMPA中で4倍希釈し、次いで、20μLをカラム上に注入した。流速1.5mL/minおよび以下の勾配を時間（分）／有機溶媒B％で使用した：（0/10％；8/40％；17/90％；20/10％；30/停止）。
メチルセルロースCFUの評価
標的化後2日目に、CD34 APC（561；BioLegend, San Diego, CA, USA）、Ghost Dye Red 780 Viability Dye（Tonbo Biosciences, San Diego, CA, USA）を使用してHSPCを染色し、MethoCult Optimum（STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada）を含有する96ウェルプレートに生存CD34+細胞をソーティングした。12～16日後、盲検下で外観に基づいてコロニーを適切にスコア化した。
免疫不全NSGマウスへのCD34+ HSPC移植
6～8週齢のすべての雌NSGマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA）に、標的化されたHSPC（標的化後2日目）の大腿骨内注射または尾静脈注射を介した移植の12～24時間前、200radsの放射線を使用して照射した。およそ2.5×105～1.3×106個のエレクトロポレーションしたHSPC（図に正確な数を示していない）を、27Gの0.5インチ（12.7mm）針を有するインスリンシリンジを使用して注射した。この実験プロトコルは、スタンフォード大学の実験動物ケアに関する管理委員会によって認可された。マニュスクリプトに報告されているいずれの実験でも、意図しないバイアスを把握するために群割り当てに対する盲検化も、処置無作為化も、データ収集または分析中の除外基準も必要なかった。すべての報告されている実験は、スタンフォード大学の方針に従って実験動物ケアに関する管理委員会（APLAC；プロトコル番号25065）によってスタンフォードで運営されている施設内動物実験委員会（IACUC；プロトコル番号D16-00134）に準じて完了した。この研究で使用した試料サイズは、過去のCas9/AAV6媒介ゲノム編集研究（21～23）において報告されている範囲内であった。
ヒト生着の評価
CD34+編集HSPCの移植後15～17週目に、マウスを安楽死させ、乳棒と乳鉢を使用して脛骨、大腿骨、骨盤、胸骨および脊椎から骨髄を採取した。単核細胞を、室温でFicoll勾配遠心分離（Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare, Chicago, IL）を2,000gで25分間使用して濃縮した。次いで、以下の抗体を用いて試料を4℃で30分間染色した：モノクローナルhCD33 V450（WM53；BD Biosciences, San Jose, CA, USA）；hHLA-A/B/C FITC（W6/32；BioLegend, San Diego, CA, USA）；CD19 PerCp-Cy5.5（HIB19；BD Biosciences）；mTer119 PE-Cy5（TER-119；eBiosciences, San Diego, CA, USA）；mCd45.1 PE-Cy7（A20；eBiosciences, San Diego, CA, USA）；hGPA PE（HIR2；eBiosciences, San Diego, CA, USA）；hCD34 APC（581；BioLegend, San Diego, CA, USA）；およびhCD10 APC-Cy7（HI10a；BioLegend, San Diego, CA, USA）。生着したヒト細胞（Cd45+；HLA-A/B/C+細胞）の骨髄細胞（CD33+）およびB細胞（CD19+）の存在によって多系統生着が確立された。GFPを発現する細胞については、hHLA-FITCではなくhHLA-A/B/C-APC-Cy7（W6/32；BioLegend, San Diego, CA, USA）を使用した。二次移植のために、一次マウス単核細胞集団の一部分だけ染色し、残り（2.5×105個の細胞～1.3×106個の細胞）を、照射前処置した後の6～8週齢のNSGマウスに移植した。2番目のマウスへの移植後16週目に前述と同様に細胞を評価した。
統計解析
図に提示されるすべてのデータ点は、同じ処置の反復測定ではなく別個の処置群から得た。この研究で使用した試料サイズは、過去のCas9/AAV6媒介ゲノム編集研究（21～23）において報告されている範囲内であった。この論文に報告されているいかなる実験遂行前にもデータ除外基準を設けず、実験の結論後もデータを除外しなかった。可能であれば、実験はすべて、最低でも3名以上のCD34+ HSPCドナーにわたって反復した。これに対する1つの例外は、ある1名のHSPCドナーから得られた図5に報告されるデータであり、これはβ-サラセミア患者への面会制限が原因である。実験群に対する統計的検定はすべて、Prism7 GraphPad Softwareを使用して行った。対応のない両側t検定を使用して、処置群間の統計的差異を決定した。試料の分散をすべての処置群について決定し、同等でないことが発見された場合、ウェルチのt検定でも統計的差異を確認した。
実施例2. 追加の実験およびデータ
本発明者らは、β-サラセミア患者由来のHSPCにおける標的化、β-グロビン産生および生着データを調べた。図16Aは、フローサイトメトリーによって決定した場合のRBC表面マーカーGPAおよびCD71を獲得するCD34-/CD45- HSPCの割合を示し、図16Bは、ddPCRによって決定した場合のβ-サラセミア由来HSPCにおけるHBA1での標的アレル頻度を示す。標的化HSPCのRBCへの分化に続き、mRNAを採取してcDNAへと変換し、HBA（HBA1とHBA2を区別しない）およびHBB導入遺伝子の発現をHBG発現に対して正規化した（図16C）。HgbFに対して正規化されたHgbAを示しているヘモグロビン四量体HPLC結果を図16Dに示し、HSPCの標的化およびRBC分化後の処置毎の代表的なヘモグロビン四量体HPLCプロットを図16Eに示す。HgbFおよびHgbA四量体ピークの保持時間を表示する。図16Fは、β-グロビンの曲線下面積（AUC）／α-グロビンのAUCを示している逆相グロビン鎖HPLC結果の概要を提供し、図16Gは、HSPCの標的化およびRBC分化後の処置毎の代表的な逆相グロビン鎖HPLCプロットを提示する。
標的化β-サラセミア由来HSPCのNSGマウスへの骨髄移植の16週間後、骨髄を採取し、生着率を決定した（図17A）。生着したヒト細胞の中で、B細胞、骨髄細胞または他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の分布を図17Bに示す。二次移植実験における、バルク試料中の生着ヒト細胞間ならびにCD19+（B細胞）、CD33+（骨髄細胞）および他の（すなわち、HSPC/RBC/T/NK/Pre-B）系統間の、ddPCRによって決定した場合のHBA1での標的アレル頻度を図17Cに示す。
本発明者らはさらに、HBA1標的化gRNA 5によって生成されたインデルスペクトルの追加の局面を調べた。図18Aは、ゲノム遺伝子座での5つすべてのガイド配列の場所を描写する略図を提供し、図18Bは、TIDEソフトウェアによって生成されたHBA1特異的sg5の代表的なインデルスペクトルを提示する。
本発明者らはまた、HSPCにおける標的化後の生存率データも調べた。編集後2～4日目にフローサイトメトリーによってHSPC生存率を定量し、GhostRed生存色素について陰性染色された細胞の割合を決定した（図19）。細胞はすべて、標準的な条件（すなわち、Cas9 RNP+sg5、5K MOIのAAVのエレクトロポレーション、および24時間でのAAV洗浄なし）を使用して、本発明者らの最適化されたHBB遺伝子置換ベクターで編集した。
本発明者らは、HBA1を標的化した際の単一アレルおよび両アレル編集頻度についての洞察を得るためにデュアルカラー標的化ベクターによってデータを生成した。図20Aは、HBA1-WGR-GFP AAV6およびHBA1-WGR-mPlum AAV6によって同時標的化されたCD34+ HSPCの代表的なFACSプロットを示す。GFPのみ、mPlumのみおよび両方の色で標的化された集団の割合を決定した（図20B）。図20Bに示されるデータの編集アレルのパーセントに対して編集細胞のパーセントもプロットした（図20C）。
本発明者らはまた、赤血球送達に関するHBA1でのカスタム導入遺伝子組み込み（例えば、PAHまたはFXIを導入遺伝子として使用）の更新データを得た。RBC表面マーカーGPAおよびCD71を獲得するCD34-/CD45- HSPCの割合をフローサイトメトリーによって決定した（図21A）。本発明者らはまた、ddPCRによって決定した場合の初代HSPCにおけるHBA1での標的アレル頻度も決定した（図21B）。図21Cは、FIX ELISAによって決定した場合の初代HSPCにおける標的化および赤血球分化後の細胞溶解物および上清中のFIX産生を示し、図21Dは、導入遺伝子発現プラスミドがエレクトロポレーションされた293T細胞の上清中のPAH活性の代理としてのチロシン産生を示す。RBC分化の経過中の構成的GFPおよびプロモーターレスYFP組み込みベクターによりHBA1で標的化された初代HSPCのRBCの割合をフローサイトメトリーによって決定し（図21E）、図21Eに示される標的化されたHSPCのGFPの割合も決定した。図21Gは、図21Fに示されるGFP+集団のd0測定にわたるMFI倍率変化を示す。
実施例3. 疾患特異的治療タンパク質を救済するための例示的なDNAドナー
この実施例は、HBA1またはHBA2遺伝子座に遺伝子をノックインするために使用できるドナーテンプレートのいくつかの非限定例を提供する。
ムコ多糖症1型：IDUA酵素を過剰発現させるためにIDUA cDNAをノックイン
配列エレメント：
左側ホモロジーアーム：1～500bp
PGKプロモーター：501～1001bp
IDUA cDNA：1002～2960bp
T2A-tNGFR：2961～3848bp
BgHポリA：3849～4099bp
右側ホモロジーアーム：4100～4599bp
配列：
Figure 2023502626000015
Figure 2023502626000016
Figure 2023502626000017
創傷治癒因子：タンパク質を過剰発現させるためにPGDFBをノックイン
配列エレメント：
左側ホモロジーアーム：1～538bp
SFFVプロモーター：539～1083bp
PDGF-b cDNA：1084～1806bp
T2A-GFP：1807～2550bp
BgHポリA：2551～2835bp
右側ホモロジーアーム：2836～3255bp
配列：
Figure 2023502626000018
Figure 2023502626000019
Figure 2023502626000020
ベータサラセミア：HBB遺伝子（イントロンを含む）をHBA1遺伝子のエクソン1にノックインしてHBA1遺伝子をHBB遺伝子に置き換える
配列エレメント：
左側ホモロジーアーム：1～880bp
HBB遺伝子：881～2370bp
右側ホモロジーアーム：2371～3249bp
配列：
Figure 2023502626000021
Figure 2023502626000022
参考文献
Figure 2023502626000023
Figure 2023502626000024
Figure 2023502626000025
Figure 2023502626000026
Figure 2023502626000027
前述の開示は、理解の明瞭さを目的として、図面および実施例を用いて、ある程度詳細に記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正が実施できることを認識するであろう。加えて、本明細書に提供される各参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み入れられるのと同程度に、参照によりその全体が組み入れられる。
非公式（部分）配列表
Figure 2023502626000028
SEQ ID NO：6
HBB遺伝子（イントロンを含む）をHBA1遺伝子のエクソン1にノックインしてHBA1遺伝子をHBB遺伝子に置き換えるためのドナーテンプレート
配列エレメント：
左側ホモロジーアーム：1～880bp
HBB遺伝子：881～2370bp
右側ホモロジーアーム：2371～3249bp
Figure 2023502626000029
Figure 2023502626000030
SEQ ID NO：7
FIX（パドヴァバリアント）
遺伝子長（イントロンを有する）：2824bp
配列：
Figure 2023502626000031
Figure 2023502626000032
SEQ ID NO：8
LDLR
cDNA長（イントロンなし）：2460bp
配列：
Figure 2023502626000033
Figure 2023502626000034
Figure 2023502626000035

Claims (93)

  1. 対象由来の造血幹前駆細胞（HSPC）を遺伝子改変する方法であって、
    該方法が、HSPCに、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズする配列を含むガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナーテンプレートとを導入する工程を含み、
    該RNAガイドヌクレアーゼが、細胞において、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列を切断するが、両方を切断はせず；該導入遺伝子が、切断されたHBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれ、それにより、遺伝子改変されたHSPCが生成され；組み込まれた導入遺伝子が、遺伝子改変されたHSPCにおいてタンパク質の発現をもたらす、前記方法。
  2. 対象由来の造血幹前駆細胞（HSPC）を遺伝子改変する方法であって、
    該方法が、HSPCに、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズする配列を含むガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナーテンプレートとを導入する工程を含み、
    該RNAガイドヌクレアーゼが、細胞において、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列を切断するが、両方を切断はせず；該導入遺伝子が、切断されたHBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれ、それにより、遺伝子改変されたHSPCが生成され；該導入が、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートと、HBA1遺伝子配列およびHBA2遺伝子配列の両方にハイブリダイズするガイドRNAとの導入と比較して、HSPCのゲノム内で転座イベントの低減をもたらす、前記方法。
  3. 対象由来の造血幹前駆細胞（HSPC）を遺伝子改変する方法であって、
    該方法が、HSPCに、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズする配列を含むガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナーテンプレートとを導入する工程を含み、
    該RNAガイドヌクレアーゼが、細胞において、HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列を切断するが、両方を切断はせず；該導入遺伝子が、切断されたHBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれ、それにより、遺伝子改変されたHSPCが生成され；該導入が、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートと、HBA1遺伝子配列およびHBA2遺伝子配列の両方にハイブリダイズするガイドRNAとの導入と比較して、HSPCのゲノム内でドナーテンプレートのオフターゲット組み込みの低減をもたらす、前記方法。
  4. ガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートとを導入する工程の前に、対象からHSPCを単離する工程をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列が、3' UTR領域を含む、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. RNAガイドヌクレアーゼが、HBA1遺伝子配列を切断するが、HBA2遺伝子配列は切断しない、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. HBA1遺伝子配列が、SEQ ID NO：5の配列を含む、請求項6記載の方法。
  8. 導入遺伝子が、HBA1遺伝子配列に組み込まれる、請求項6または7記載の方法。
  9. RNAガイドヌクレアーゼが、HBA2遺伝子配列を切断するが、HBA1遺伝子配列は切断しない、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  10. HBA2遺伝子配列が、SEQ ID NO：2の配列を含む、請求項9記載の方法。
  11. 導入遺伝子が、HBA2遺伝子配列に組み込まれる、請求項9または10記載の方法。
  12. HSPCが、野生型HBB遺伝子と比較して変異を含むHBB遺伝子を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 変異が、疾患を引き起こす、請求項12記載の方法。
  14. 疾患がベータ-サラセミアである、請求項13記載の方法。
  15. 導入遺伝子が、HBB、PDGFB、IDUA、FIX（パドヴァバリアント）、LDLR、およびPAHからなる群より選択される、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 導入遺伝子がHBBである、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  17. HBBが、HSPCにおいて発現され、ガイドRNAと、RNAガイドヌクレアーゼと、ドナーテンプレートの導入前と比較して、HSPCにおける成人ヘモグロビン四量体のレベルを増加させる、請求項16記載の方法。
  18. 導入遺伝子が、HBBであり、ガイドRNAが、SEQ ID NO：5の配列にハイブリダイズし、HBBが、HBA1遺伝子配列の部位で組み込まれる、請求項16記載の方法。
  19. 対象がβ-サラセミアを有し、HBB導入遺伝子を発現する遺伝子改変されたHSPCが対象に再導入される、請求項15記載の方法。
  20. 組み込まれた導入遺伝子の発現が、内因性HBA1またはHBA2プロモーターによって駆動される、請求項1～19のいずれか一項記載の方法。
  21. 組み込まれた導入遺伝子が、HSPCのゲノム内でHBA1またはHBA2コード配列と置き換わる、請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
  22. 組み込まれた導入遺伝子が、HSPCのゲノム内でHBA1またはHBA2オープンリーディングフレーム（ORF）と置き換わる、請求項1～21のいずれか一項記載の方法。
  23. タンパク質が分泌タンパク質である、請求項1～22のいずれか一項記載の方法。
  24. タンパク質が治療用タンパク質である、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  25. ガイドRNAが、1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾を含む、請求項1～24のいずれか一項記載の方法。
  26. 1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾が、ガイドRNAの5'端および3'端の3つの末端ヌクレオチドに存在する、請求項25記載の方法。
  27. RNAガイドヌクレアーゼがCas9である、請求項1～26のいずれか一項記載の方法。
  28. ガイドRNAおよびRNAガイドヌクレアーゼが、エレクトロポレーションによってリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体としてHSPCに導入される、請求項1～27のいずれか一項記載の方法。
  29. ドナーテンプレートが、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターを使用してHSPCに導入される、請求項1～28のいずれか一項記載の方法。
  30. rAAVベクターがAAV6ベクターである、請求項29記載の方法。
  31. 導入する工程が、エクスビボで実施される、請求項1～30のいずれか一項記載の方法。
  32. 遺伝子改変されたHSPCを対象に導入する工程をさらに含む、請求項1～31のいずれか一項記載の方法。
  33. 遺伝子改変されたHSPCを、インビトロまたはエクスビボで赤血球（RBC）に分化するように誘導する工程をさらに含む、請求項1～32のいずれか一項記載の方法。
  34. 対象がヒトである、請求項1～33のいずれか一項記載の方法。
  35. HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列にハイブリダイズするが両方にはハイブリダイズしない配列を含む、ガイドRNA。
  36. HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列の3' UTRにハイブリダイズする、請求項35記載のガイドRNA。
  37. HBA1遺伝子配列にハイブリダイズする、請求項35または36記載のガイドRNA。
  38. HBA1遺伝子配列が、SEQ ID NO：5の配列を含む、請求項37記載のガイドRNA。
  39. HBA2遺伝子配列にハイブリダイズする、請求項37または38記載のガイドRNA。
  40. HBA2遺伝子配列が、SEQ ID NO：2の配列を含む、請求項39記載のガイドRNA。
  41. 1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾を含む、請求項35～40のいずれか一項記載のガイドRNA。
  42. 1つまたは複数の2'-O-メチル-3'-ホスホロチオエート（MS）修飾が、ガイドRNAの5'端および3'端の3つの末端ヌクレオチドに存在する、請求項41記載のガイドRNA。
  43. 請求項35～42のいずれか一項記載のガイドRNAを含む、HSPC。
  44. HBA1遺伝子配列またはHBA2遺伝子配列に組み込まれているが両方には組み込まれていない導入遺伝子を含む、遺伝子改変されたHSPC。
  45. 請求項1～28のいずれか一項記載の方法を使用して生成される、請求項44記載の遺伝子改変されたHSPC。
  46. 導入遺伝子が、HBB、PDGFB、IDUA、FIX（パドヴァバリアント）、LDLR、およびPAHからなる群より選択される、請求項44または45記載の遺伝子改変されたHSPC。
  47. 導入遺伝子がHBBである、請求項46記載の遺伝子改変されたHSPC。
  48. HBBが、HBA1遺伝子配列で組み込まれる、請求項47記載の遺伝子改変されたHSPC。
  49. HBB導入遺伝子が、遺伝子改変されたHSPCのゲノム内で内因性HBA1コード配列と置き換わっている、請求項47または48記載の遺伝子改変されたHSPC。
  50. HBB導入遺伝子が、遺伝子改変されたHSPCのゲノム内で内因性HBA1オープンリーディングフレームと置き換わっている、請求項47または48記載の遺伝子改変されたHSPC。
  51. 請求項43～50のいずれか一項記載の遺伝子改変されたHSPCの赤血球へのインビトロまたはエクスビボでの分化を誘導することによって産生される、赤血球。
  52. その必要がある対象におけるベータ-サラセミアを処置するための方法であって、該方法が、遺伝子改変されたHSPCを対象に投与する工程を含み、遺伝子改変されたHSPCが、対象中に生着し、投与前と比較して対象における成人ヘモグロビン四量体のレベルの増加をもたらし、それにより、対象におけるベータ-サラセミアを処置する、前記方法。
  53. 遺伝子改変されたHSPCが、対象に由来する、請求項52記載の方法。
  54. 細胞に、
    細胞内の標的遺伝子中の標的遺伝子座を切断するプログラム可能なヌクレアーゼ；および
    導入遺伝子を含むドナーテンプレートを含む核酸
    を導入する工程
    を含む、細胞を改変する方法であって、
    該導入遺伝子が、標的遺伝子座に組み込まれ、かつ該導入遺伝子が、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）の全部または一部と置き換わる、前記方法。
  55. 導入遺伝子が、5' UTR、1つまたは複数のエクソン、1つまたは複数のイントロン、3' UTR、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的遺伝子の領域と置き換わる、請求項54記載の方法。
  56. 導入遺伝子が、標的遺伝子のイントロンおよびエクソンと置き換わる、請求項54または55記載の方法。
  57. 細胞が初代細胞である、請求項54～56のいずれか一項記載の方法。
  58. 細胞が造血幹前駆細胞（HSPC）である、請求項54～57のいずれか一項記載の方法。
  59. 導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードする、請求項54～58のいずれか一項記載の方法。
  60. 導入遺伝子が、HBB、PDGFB、IDUA、FIX（パドヴァバリアント）、LDLR、およびPAHからなる群より選択される、請求項54～59のいずれか一項記載の方法。
  61. 導入遺伝子がHBBである、請求項54～60のいずれか一項記載の方法。
  62. 標的遺伝子が、疾患に関連する変異を含む、請求項54～61のいずれか一項記載の方法。
  63. 標的遺伝子が、疾患に関連する2つ以上の変異を含む、請求項62記載の方法。
  64. 標的遺伝子が、疾患に関連するタンパク質をコードし、かつ導入遺伝子が、タンパク質の野生型をコードする、請求項62または63記載の方法。
  65. 標的遺伝子が、セーフハーバー遺伝子である、請求項54～61のいずれか一項記載の方法。
  66. 標的遺伝子が、HBA1遺伝子である、請求項54～65のいずれか一項記載の方法。
  67. 標的遺伝子が、HBA2遺伝子である、請求項54～65のいずれか一項記載の方法。
  68. 導入遺伝子が、第1のホモロジーアームおよび第2のホモロジーアームによって挟まれており、第1のホモロジーアームが、標的遺伝子座に隣接する第1の配列との相同性を含み、かつ第2のホモロジーアームが、標的遺伝子座に隣接する第2の配列との相同性を含む、請求項54～67のいずれか一項記載の方法。
  69. 第1のホモロジーアームが、標的遺伝子の5'端にある配列との相同性を含み、かつ第2のホモロジーアームが、標的遺伝子の3'端にある配列との相同性を含む、請求項68記載の方法。
  70. 第1のホモロジーアームまたは第2のホモロジーアームが、標的遺伝子の5' UTRの一部分との相同性を含む、請求項68記載の方法。
  71. 第1のホモロジーアームまたは第2のホモロジーアームが、標的遺伝子の3' UTRの一部分との相同性を含む、請求項68～70のいずれか一項記載の方法。
  72. 第1のホモロジーアームまたは第2のホモロジーアームが、標的遺伝子の開始コドンの5'である一部分との相同性を含む、請求項68～71のいずれか一項記載の方法。
  73. 第1のホモロジーアームが、標的遺伝子の3' UTRの一部分との相同性を含み、かつ第2のホモロジーアームが、標的遺伝子の転写開始部位の5'である一部分との相同性を含む、請求項68～71のいずれか一項記載の方法。
  74. 第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方が、少なくとも約200塩基対を含む、請求項68～73のいずれか一項記載の方法。
  75. 第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方が、少なくとも約400塩基対を含む、請求項68～73のいずれか一項記載の方法。
  76. 第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方が、少なくとも約500塩基対を含む、請求項68～73のいずれか一項記載の方法。
  77. 第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方が、少なくとも約800塩基対を含む、請求項68～73のいずれか一項記載の方法。
  78. 第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方が、少なくとも約850塩基対を含む、請求項68～73のいずれか一項記載の方法。
  79. 第1のホモロジーアーム、第2のホモロジーアーム、または両方が、少なくとも約900塩基対を含む、請求項68～73のいずれか一項記載の方法。
  80. ドナーテンプレートが、SEQ ID NO：6に対して少なくとも約85％の配列同一性を含む、請求項54～79のいずれか一項記載の方法。
  81. ドナーテンプレートが、SEQ ID NO：6の配列を含む、請求項54～79のいずれか一項記載の方法。
  82. 組み込まれた導入遺伝子の発現が、標的遺伝子のプロモーターによって調節される、請求項54～81のいずれか一項記載の方法。
  83. プロモーターが、細胞のゲノム内の内因性プロモーターである、請求項82記載の方法。
  84. 導入する工程が、エクスビボで実施される、請求項54～83のいずれか一項記載の方法。
  85. プログラム可能なヌクレアーゼが、CRISPR-Casタンパク質である、請求項54～84のいずれか一項記載の方法。
  86. プログラム可能なヌクレアーゼが、Cas9タンパク質である、請求項54～85のいずれか一項記載の方法。
  87. プログラム可能なヌクレアーゼが、Cpf1タンパク質である、請求項54～86のいずれか一項記載の方法。
  88. プログラム可能なヌクレアーゼが、標的遺伝子座で二本鎖切断を生成する、請求項54～87のいずれか一項記載の方法。
  89. ドナーテンプレートが、組換えAAV（rAAV）ベクターで細胞に導入される、請求項54～88のいずれか一項記載の方法。
  90. rAAVベクターがAAV6ベクターである、請求項89記載の方法。
  91. 細胞にガイドRNAを導入する工程であって、該ガイドRNAが、プログラム可能なヌクレアーゼに、標的遺伝子中の標的遺伝子座を切断するように指令する、工程
    を含む、請求項54～90のいずれか一項記載の方法。
  92. ガイドRNAが、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズする配列を含む、請求項91記載の方法。
  93. ガイドRNAが、請求項35～42のいずれか一項記載のガイドRNAである、請求項91記載の方法。
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