CN114480505B - 间充质干细胞及其抗炎应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用重组间充质干细胞治疗炎性疾病的方法，所述重组间充质干细胞包含过表达多个细胞因子的慢病毒载体，所述炎性疾病选自胸膜炎、阴道炎和骨关节炎中的一种或多种。本发明还涉及包含所述慢病毒载体的宿主细胞，以及所述慢病毒载体和包含所述慢病毒载体的宿主细胞在制备用于治疗胸膜炎、阴道炎和骨关节炎的药物中的应用。

Description

间充质干细胞及其抗炎应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地涉及病毒表达载体及其在细胞治疗中的应用。
背景技术
急性胸膜炎是一种常见的慢性疾病，其主要表现为发热、胸痛和呼吸困难。病毒、细菌、寄生虫、化学刺激、变态反应和肿瘤均可引起急性胸膜炎。由于急性胸膜炎治疗时间长、容易复发，为了减少患者长期受病痛的折磨，寻找治疗急性渗出性胸膜炎的方法是有需要的。
目前，治疗急性胸膜炎最常用的方法是注射糖皮质激素，而治疗结核性胸膜炎在使用糖皮质激素的同时还会注射抗结核治疗药物，如：链霉素和异烟肼，但无论是糖皮质激素还是抗结核药物，其毒副作用都比较大。近年来，有报道发现中药三叶悬钩子和甘草附子汤对急性炎症胸膜炎治疗都有较好的效果，但用细胞治疗急性胸膜炎少有报道。
阴道炎是一种常见的妇科疾病，由病原微生物感染而引起的各种阴道粘膜疾病的统称。阴道炎可分为多种，包括细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、念珠菌性阴道炎等，经期妇女以及绝经后的女性都容易发生阴道炎性疾病，且容易再次感染。
阴道炎症治疗包括口服药物以及阴道局部给药两种途径，口服主要以抗生素为主，如硝基咪唑类药物，但抗生素在杀灭病菌的同时也会杀死有益菌，严重的甚至破坏了阴道内环境；而局部给药对菌落的影响较少，但效果有时也比较有限。近年来，有报道发现冰硼散和金银花对阴道炎有一定的治疗作用，但是在细胞层面对阴道炎的治疗报道较少。
骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，会导致关节软骨的退化、骨质增生、滑膜损伤甚至关节硬化，对患者造成疼痛、关节变形等严重影响。骨关节炎米钱的治疗手段包括非手术治疗和手术治疗。其中非手术治疗药物多为非甾体抗炎药，存在不可避免的副作用。因此对骨关节炎的治疗需要进一步探索新的治疗方案。近年来，有报道称一些中药如黄芪多糖和紫丁香苷对治疗关节炎模型具有一定疗效。
据报道普通间充质干细胞具有炎症调节功能，对关节炎等已经进行了临床研究。但由于炎症微环境条件恶劣，不利于间充质干细胞的定植和功能发挥，限制了其治疗效果。
目前，尚未有一种方法能有效、快速治愈急性胸膜炎、阴道炎和骨关节炎。因此，需要寻找治疗这些炎症的方法。
发明内容
本发明提供了利用重组干细胞治疗炎性疾病，尤其是胸膜炎、阴道炎和骨关节炎。所述重组干细胞，尤其是重组间充质干细胞(MSCs)能够同时表达IL-10，IL-13和IL-4。
第一方面，本发明提供了表达载体，包含所述表达载体的宿主细胞，或包含所述表达载体以及药学上可接受的赋形剂或载体的细胞药物组合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用，所述表达载体携带表达IL-10，IL-13和IL-4的编码序列，所述炎性疾病选自胸膜炎、阴道炎和骨关节炎中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述表达载体同时表达IL-10，IL-13和IL-4。
在一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒载体。
优选地，所述慢病毒载体包括载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’LTR，3’LTR，在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体包括如下3个质粒：(1)至少含有5’LTR和3’LTR，Ψ序列和目的基因的载体质粒；(2)含有包装所必需的gag和pol且任选含有调控基因rev和tat的包装质粒；以及(3)含有env基因的包膜质粒。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体包括如下4个质粒：(1)至少含5’LTR和3’LTR，Ψ序列和目的基因的载体质粒；(B)含有包装所必需的gag和pol的包装质粒；(C)含有env基因的包膜质粒；以及(D)含有rev的rev表达质粒。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体包括3个质粒：(1)至少含有5’LTR和3’LTR，Ψ序列和目的基因的载体质粒；(B)含有包装所必需的gag和pol的包装质粒；以及(C)含有env表达单元和rev表达单元的质粒。
在一些实施方案中，所述载体质粒的3’LTR和5’LTR包括一个或多个修饰。
在一些实施方案中，所述5’LTR和3’LTR的U3可以被缺失或突变。
优选地，所述3’LTR是缺失了U3区域的3’LTR(ΔU3/3’LTR)。
在一些实施方案中，所述5’LTR是缺失形式的5’LTR(Δ5’LTR)。
在一些实施方案中，所述载体质粒的5’LTR的启动子由选自以下的异源启动子替换：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
在一些实施方案中，与IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作地连接的启动子选自：短延伸因子1α(EF1α)启动子或其转录活性片段，RSV启动子和猿猴病毒40(SV40)启动子。
在一些实施方案中，与IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作地连接有RSV启动子，EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
在一些实施方案中，所述载体质粒还包括筛选标记物。
在一些实施方案中，所述筛选标记物为荧光素酶，增强的绿色荧光蛋白，链霉亲和素结合肽，嘌呤霉素抗性基因，氨苄抗性基因，卡那霉素抗性基因，和/或新霉素抗性基因。
在一些实施方案中，所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白(EGFP)/嘌呤霉素抗性基因(Puro)双报告标记物。
在一些实施方案中，所述载体质粒还包括SV40早期pA。
在一些实施方案中，所述载体质粒的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
在一些实施方案中，所述载体质粒包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节RNA转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地，所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
在一些实施方案中，所述载体质粒可以包含中央多聚嘌呤区(cPPT)或中心终止序列(CTS)作为顺式作用元件，cPPT/CTS序列可以是HIV1的cPPT/CTS，能够提高载体整合和转导效率。
在一些实施方案中，所述载体质粒从5’LTR区到3’LTR区依次包含：RSV启动子，5’LTR，Ψ序列，RRE，cPPT，EF1α启动子，Kozak翻译起始序列，分别由SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3显示的IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸，SV40，Kozak翻译起始序列，EGFR/Puro，WRPE，ΔU3/3’LTR和SV40早期pA。
所述IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸的顺序可以改变，只要是将IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸串联连接。
在一些实施方案中，所述IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸中，IL-10，IL-13和IL-4彼此之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
在一些实施方案中，所述2A肽为T2A肽，P2A肽，E2A肽或F2A肽。优选地，所述2A肽为T2A或P2A肽。
所述2A肽可以避免产生IL-10，IL-13和IL-4的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述EGFR/Puro的编码核苷酸中，EGFR和嘌呤霉素抗性基因之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
本发明的携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体在转染宿主细胞后可以同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子。
本发明的携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体无需制备三种载体质粒，仅需要一种载体质粒同时携带编码IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸，简化了操作成本，减少了转染多个病毒载体对细胞的损伤，有利于后续作为细胞药物制剂的质量控制。
在一些实施方案中，所述宿主细胞能够表达所述慢病毒载体中携带的目的核苷酸。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为干细胞。
在一些实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞可以同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子。所述的间充质干细胞是抗炎功能增强型的赋能间充质干细胞。
所述的间充质干细胞可作为细胞药物制剂的细胞模型。
所述的间充质干细胞可用于治疗炎性疾病，所述的炎性疾病选自胸膜炎、阴道炎和骨关节炎。
转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体，并且过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞在细胞治疗中移植前已经过表达所述的三种抗炎因子，无需在移植后免疫响应，大大提高了所述间充质干细胞移植后的抗炎响应和有效性，在对炎症的治疗中具有起效时间大大缩短，疗效增加的效果。
本发明带有启动子，调节序列，翻译起始序列和筛选标记物，获得了同时携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体；实现了用一个慢病毒载体同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子；本发明构建的慢病毒载体还实现了高感染效率的可重复性，为炎性疾病的细胞治疗提供了有力的候选工具。尤其是，所述载体质粒中，在IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸前联用了RSV启动子、EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列，确保了载体质粒在干细胞内的高表达；三个抗炎因子之间用2肽序列分割，防止产生融合蛋白；同时载体质粒携有增强型GFP和抗生素Puro序列，方便转染效率的观察和必要时的药物筛选。
本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体，并且过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞可用于胸膜炎、阴道炎和骨关节炎的治疗。本发明过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞相对于未进行基因编辑的普通间充质干细胞具有显著增强的抗炎效果。尤其是，在体内小鼠模型中显示出抗炎效果，特别是对于急性炎症的抗炎效果的显著提高。
具体实施方式
在一些实施方案中，本发明构建了过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的慢病毒载体，命名为pLV[Exp]-EF1α>hIL10[NM_000572.3](ns):T2A:hIL13[NM_002188.3](ns):P2A:hIL4[NM_000589.4]-SV40>EGFP:T2A:Puro，所构建的载体设参见图1。载体中在三种抗炎因子基因上游联用了RSVpromoter、EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列，从而确保了病毒质粒在干细胞内的高表达，三个抗炎因子之间用2A肽序列分割，防止产生融合蛋白。同时载体携有增强型GFP和抗生素Puro序列，方便转染效率的观察和必要时的药物筛选。
根据本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞的制备中，优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，所述培养步骤中细胞的接种密度为0.5×105～2.0×105，优选为1.2×105；和/或在转染步骤中，病毒转染复数MOI为10～30，优选为15-25，更优选为17-23，例如17，18，19，20，21，22或23。虽然病毒转染复数(MOI)越高，转染效率越高，但是随着MOI的增加，相应的毒性也会增加，因此要在转染效率和毒性之间进行平衡，本申请发现在用本发明的慢病毒载体转染间充质细胞时MOI选择15以上可以达到80％以上的较高转染效率，在MOI为20时可以达到90％的转染效率。
根据本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞的制备方法所获得的人脐带间充质干细胞中IL-13，IL-10和IL-4的蛋白表达水平相对于基线水平可以分别提高100倍，50000倍，以及40000倍以上。
根据本发明的转染有携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的所述慢病毒载体的间充质干细胞可用于制备细胞药物组合物。
所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻炎性疾病。所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻胸膜炎。所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻阴道炎。所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻骨关节炎。
所述细胞药物组合物可用于预防，治疗或减轻与IL-10，IL-13和IL-4相关的疾病。
本发明的慢病毒载体携带三个基因，无需三种载体质粒，简化了操作和成本，减少多个病毒转染对细胞的损伤，有利于后续药物制剂的质控。
而且，用过表达抗炎因子的慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞，使细胞过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子，在移植前就大量表达，无需移植后才免疫响应，大大提高了人脐带干细胞移植后的抗炎响应和有效性，对炎症相关疾病的治疗具有起效时间缩短、疗效增加的特点。
此外，本发明同时过表达三个抗炎因子IL-10，IL-13和IL-4的慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞相比于现有技术中过表达抗炎因子TGFβ的骨髓间充质干细胞BMSCs，具有促进巨噬细胞向M2(抗炎)表型转化的协同作用，极化效果更加显著。
本发明的转染有同时携带IL-10，IL-13和IL-4编码核苷酸的慢病毒载体，并且同时过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞可用于炎性疾病的治疗。本发明过表达IL-10，IL-13和IL-4三种抗炎因子的间充质干细胞相对于未进行基因编辑的普通间充质干细胞具有显著增强的抗炎效果。尤其是，在体内小鼠模型中显示出抗炎效果，特别是对于急性炎症的抗炎效果的显著提高。
名词解释：
慢病毒载体系统包括包装质粒，包膜质粒和载体质粒，并且可以为二质粒系统，三质粒系统或四质粒系统。三质粒系统是将慢病毒基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，并去除了所有的辅助序列。四质粒系统是在三质粒系统的基础上改进而来的，与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性，第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR，以启动载体质粒的表达。此外，三质粒系统和四质粒系统还有一个可以放置目的基因序列的载体，称作载体质粒。
IL-4主要由活化T细胞产生，其可抑制内皮细胞及单核细胞合成分泌IL-1、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子，起到抑制促炎细胞因子合成，发挥其抑制炎症反应的作用。IL-10主要由Th2细胞、活化的单核细胞和上皮细胞分泌产生，具有明确的免疫抑制活性。IL-13是1993年发现由活化T细胞产生的一种新的细胞因子，其与IL-4的受体α链具有同源性，信号转导途径和生物学活性也非常相似，具有抑制炎症反应的功能。
ψ序列是慢病毒基因组的衣壳化所需要的最小包装信号。
2A肽是来源于病毒的短肽通常为18～25个氨基酸长，通常被称作自我剪切肽，能使得一条转录物产生多种蛋白。
“干细胞”是指未分化的细胞，其能够长期自我更新，或能够产生初始细胞的至少一个相同拷贝；在单细胞水平下分化成多个，且在一些情况下，仅一个特殊的细胞类型；以及实现组织的活体内功能性再生。根据干细胞细的发育潜力将干细胞细分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和寡能干细胞。
间充质干细胞(MSC)因其具有多向分化潜能和免疫调节功能，已被广泛用于再生医学、自身免疫性疾病的临床研究者。与其他干细胞，例如造血干细胞不同，MSC是一类在体外能够扩增的干细胞。在本申请中UMSC是从脐带获得的间充质干细胞，尤其是人脐带间充质干细胞。人脐带间充质干细胞是来源于新生儿脐带的间充质干细胞，具有强大的增殖及多向分化能力。但是本领域技术人员应该知晓间充质干细胞的来源不仅限于人脐带间充质干细胞，其它来源的间充质干细胞也可实现本发明。
巨噬细胞是一种表型异质性的免疫细胞，在炎症(起始和消退)期间都具有重要作用。巨噬细胞经刺激可以极化为两种表型：(1)一种为经典活化(炎症)表型M1，可以被脂多糖(LPS)或干扰素γ(IFN-γ)等诱导，产生促炎细胞因子如TNFα、IL-1β等；(2)另一种为替代活化(伤口愈合)表型M2，可以被IL-4、IL-13等诱导，产生抗炎细胞因子如IL-10、IL-13、Arg1等。M1/M2巨噬细胞极化的平衡决定着一个器官在炎症或损伤中的命运。M1发挥促炎作用在炎症早期对抗刺激，但持续下去会造成组织损伤；M2发挥抗炎作用，促进组织修复、血管再生。
附图说明
图1显示了慢病毒过表达载体图谱。
图2显示了慢病毒转染的hUC-MSCs共聚焦显微镜观察转染效果。
图3显示了免疫荧光和流式检测eGFP表达情况。
图4上图显示了不同的细胞接种密度对细胞融合度的影响，下图显示了不同的Polybrene工作浓度对生长细胞的影响。
图5显示了hUC-MSCs转染病毒72h后，qPCR检测过表达的因子分泌显著增加。
图6显示了hUC-MSCs转染病毒72h/96h后，ELISA检测过表达的因子分泌显著增加。
图7显示了转染效率的可重复性。
图8显示了实施例3中小鼠肺部苏木精-伊红染色(放大5倍)。
图9显示了实施例3中小鼠7小鼠肺部苏木精-伊红染色。
图10显示了实施例4中大鼠阴道炎模型阴道红肿情况。
图11显示了实施例4中大鼠阴道苏木精-伊红染色(放大5倍)。
图12显示了实施例4中大鼠阴道苏木精-伊红染色(放大10倍)。
图13显示了实施例5中大鼠骨关节炎苏木精-伊红染色(放大5倍)。
图14显示了实施例5中大鼠骨关节炎苏木精-伊红染色(放大10倍)。
图15显示了实施例5中大鼠骨关节炎Masson染色(放大5倍)。
图16显示了实施例5中大鼠骨关节炎Masson染色(放大10倍)。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1构建慢病毒载体
首先设计合成了过表达三个抗炎因子IL-10，IL-13和IL-4的慢病毒载体，命名为pLV[Exp]-EF1α>hIL10[NM_000572.3](ns):T2A:hIL13[NM_002188.3](ns):P2A:hIL4[NM_000589.4]-SV40>EGFP:T2A:Puro，载体设计图谱如图1所示。载体在插入的抗炎因子基因上游联用了RSVpromoter、EF1α启动子序列和Kozak翻译起始序列，确保了病毒质粒在干细胞内的高表达，三个抗炎因子之间用2A肽序列分割，防止产生融合蛋白。所构建的慢病毒载体同时载体携有增强型GFP和抗生素Puro序列，方便转染效率的观察和必要时的药物筛选。
分析插入序列以及载体骨架上的限制性内切酶位点，选择能切出合适条带的酶消化质粒DNA，将消化的DNA跑琼脂糖凝胶电泳，EtBr染色，判断DNA片段的大小，设计靶向载体骨架和/或插入序列的引物。通过Sanger测序对核酸序列进行鉴定，比对完全正确。
实施例2慢病毒载体的包装以及转染
病毒载体质粒构建成功后，进行病毒包装，然后转染hUC-MSCs。转导D0天，选择P4-P8代的hUC-MSCs，将细胞按1×105-2×105/孔密度接种到6孔板中，培养基为DMEM/F12+10％FBS，在37℃5％CO2的培养箱中培养18-20h后，待细胞密度融合为30％-50％时进行转染。转导当天(D1)，在冰上解冻病毒液，轻柔混匀，按照MOI(MOI范围为10-30)吸取病毒数，加入到培养基中轻柔混匀。培养基用量以覆盖培养基表面积为宜，用量为100μL/mL，6孔板中培养基用量为1mL/孔。吸出原有培养基，将添加了病毒的培养基加入到培养了hUC-MSCs的6孔板中。同时向每孔中加入5-8μg/mL的辅助转染试剂Polybrene，混匀使病毒覆盖住每一处细胞，在37℃5％CO2的培养箱中培养6-8h。过度暴露于Polybrene会造成细胞中毒，因此转导时间不宜过长，否则可能会影响细胞状态。同时将带有空载体Vector的病毒液作为空白对照以同样的方法进行转导。
第二天，吸出含有病毒的培养基，加入新鲜的DMEM/F12+10％FBS培养基，在37℃5％CO2的培养箱中过夜培养。通常慢病毒携带的基因在转导第2天才开始表达，转染48-72h后可以观察到绿色荧光，命名为3IL-MSCs。每天观察荧光表达，在72h后共聚焦显微镜观察到GFP的绿色荧光蛋白的强表达(参见图2)，计数绿色荧光的百分比，同时流式分析确认感染效率(参见图3)，结果显示MOI为20时有效感染率超过90％。
以不同的细胞接种密度和不同的MOI值进行实验，结果发现，细胞接种密度以1.2×105/孔最佳(参见图4)，转染复数MOI为20转染效率最好(参见图3)，Polybrene适宜的工作浓度为6μg/mL(参见图4)。高密度的细胞和高浓度的辅助转染试剂都不利于细胞的存活，过表达的效果会降低(参见图4)。具体而言，以2×105的密度接种转染72h后细胞过密，会引起接触抑制生长，以1.2×105的密度接种转染当天融合度约为30％，转染72h后细胞融合度约为90％，生长状态良好。Polybrene的工作浓度试验了6μg/mL和8μg/mL，显微镜下荧光差异不大，浓度过大容易引起细胞中毒，因此选择6μg/mL。
为进一步确认过表达的因子的分泌增加，利用实时荧光定量PCR(图5)和ELISA(图6)的方法进行分析，基线水平抗炎因子低表达甚至检测不到，但过表达后细胞基因转录水平(图5)和上清中蛋白分泌水平(图6)显著升高，其中，IL-13蛋白分泌从感染前检测不到(10pg/mL以下)或空载体对照组(约20pg/mL)升高到超过2713pg/mL，分泌水平提高100倍以上；抗炎因子IL-10和IL-4分别提高50000和40000倍(参见图6)。
图5显示了hUC-MSC转染病毒72h后，qPCR检测过表达的细胞因子IL-4，IL-10和IL-13的分泌显著增加，其中UP8 VM10表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为10的表达结果；UP4 LM15表示传代4次的人脐带间充质干细胞MOI为15的表达结果；UP8 L M20表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为20的表达结果。
图6也显示了以不同的MOI进行实验，病毒转染hUC-MSCUMSC 72h/96h后，ELISA检测过表达的因子分泌显著增加，转染复数MOI为20，IL-13，IL-10和IL-4的过表达效果显著。
图7显示了感染效率的可重复性，其中UP8 V M10表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为10的表达结果；UP4 L M15表示传代4次的人脐带间充质干细胞MOI为15的表达结果；UP8 L M20表示传代8次的人脐带间充质干细胞MOI为20的表达结果。
可以看出，通过载体设计和以上转染步骤的优化组合，保证了感染高效率和过表达的成功。
实施例3小鼠急性胸膜炎模型建造以及干细胞治疗的效果评价
将健康的体重相当的小鼠分为4组：正常对照组、模型组、空载间充质干细胞治疗组和IL过表达间充质干细胞治疗组。分别向模型组、空载间充质干细胞治疗组和IL过表达间充质干细胞治疗组中的每只小鼠右胸膜腔内注入30ul 1％的角叉菜胶，正常对照组在与实验组相同部位处注入30ul生理盐水。造模后禁食不禁水。
造模后禁食不禁水，2小时后，在空载间充质干细胞治疗组小鼠的右胸膜腔内注入50ul空载间充质干细胞，在IL过表达间充质干细胞治疗组小鼠的右胸膜腔内注入相同细胞量的IL过表达间充质干细胞。细胞治疗6小时后处死小鼠。
处死小鼠后，打开小鼠胸腔取肺。肺用生理盐水漂洗，滤纸拭干。每组小鼠相同部位的其中一叶肺用4％多聚甲醇固定，石蜡包埋，切片做苏木精-伊红染色(HE染色)(参见图8、图9)。其他肺组织和生理盐水一起制成10％肺组织匀浆，以3500rpm离心10min，取上清，根据试剂盒说明书，用分光光度计测定肺组织中MDA水平和SOD活性。
HE染色发现正常组中，小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡形态、分布正常，支气管壁完整，少见成纤维细胞和炎症细胞。模型组中，小鼠肺泡形态塌陷、萎缩(如蓝色箭头所示)，支气管壁增厚(如黄色箭头所示)，支气管增大，细胞外基质、成纤维细胞以及炎症细胞增多(如绿色箭头所示)。空载间充质干细胞治疗后，小鼠肺泡仍分布不均，支气管壁厚度有所恢复，支气管大小也有所恢复，细胞外基质、成纤维细胞以及炎症细胞较模型组有所减少。IL过表达间充质干细胞治疗后，小鼠肺泡分布均匀虽形态较正常组略差，支气管壁厚度有所恢复，支气管大小也恢复得与正常组相差无异，细胞外基质、成纤维细胞以及炎症细胞较空载间充质干细胞治疗组也有所减少。总的来说，IL过表达间充质干细胞对胸膜炎肺部的治疗效果比空载间充质干细胞治疗效果显著(参见图8、图9)。
实施例4小鼠阴道炎模型建造以及干细胞治疗的效果评价
将健康的体重相当的雌性大鼠分为4组(每组至少5只)：正常对照组、模型组、空载间充质干细胞治疗组和IL过表达间充质干细胞治疗组。配制25％苯酚胶浆(液化苯酚5mL、阿拉伯胶粉1g、甘油4mL加蒸馏水至20mL)，分别向模型组、空载间充质干细胞治疗组和IL过表达间充质干细胞治疗组中的每只大鼠阴道深处约1cm处，用1mL注射器注入25％苯酚胶浆0.2mL液化苯酚造模，每天1次，共4次。
在第四次造模后，在空载间充质干细胞治疗组大鼠的阴道左右两侧注入50μLPBS/1X105空载间充质干细胞，在IL过表达间充质干细胞治疗组大鼠的阴道左右两侧注入相同细胞量的IL过表达间充质干细胞。模型组只注射50μLPBS。细胞治疗7d后处死小鼠。
通过肉眼观察大鼠阴道口部位红肿程度及脓性分泌物流出量，拍照记录(参见图10)。与正常对照组比较，模型组大鼠阴道口中、重度红肿、脓性分必物较多；与模型对照组比较，空载细胞和IL细胞治疗组大鼠阴道口红肿程度明显降低，脓性分泌物流出量较少；且IL过表达间充质干细胞治疗组大鼠阴道口红肿程度降低明显。
处死小鼠后，立刻剖去大鼠阴道组织。用生理盐水漂洗，滤纸拭干。每组大鼠的阴道样品用4％多聚甲醇固定，石蜡包埋，切片做苏木精-伊红染色(HE染色)(参见图11、图12)。
HE染色发现正常组中，大鼠阴道组织结构完整清晰，形态正常，无炎性细胞浸润现象。模型组中，阴道组织粘膜上皮有局灶性变性和坏死，固有层增生，粘膜下皮有较多的炎症细胞浸润。空载间充质干细胞治疗后，大鼠阴道有少量粘膜上皮变性、坏死，固有层增生有少量炎症细胞浸润。IL过表达间充质干细胞治疗后，大鼠阴道形态较正常组略差，腔内未见大量炎性渗出物及坏死组织，未见明显异常改变。总的来说，IL过表达间充质干细胞对阴道的治疗效果比空载间充质干细胞治疗效果显著。
实施例5大鼠骨关节炎模型建造以及干细胞治疗的效果评价
随机将大鼠分为正常对照组、模型组、空载间充质干细胞治疗组和单次注射IL过表达间充质干细胞治疗组和两次注射IL过表达间充质干细胞治疗组。
使用半月板损伤术建立骨关节炎大鼠模型，腹腔内注射阿弗丁麻醉大鼠，剃除左右膝膝关节部位毛并消毒后，切开关节囊，用眼科手术剪刀剪断内侧半月板以及前交叉韧带，缝合并消毒。半月板损伤手术结束后，所有老鼠正常活动和进食。手术4周后，在空载间充质干细胞治疗组大鼠的关节腔内注射50μLPBS/1X106空载间充质干细胞，注射IL过表达间充质干细胞治疗组注射相同细胞量的IL过表达间充质干细胞，模型组注射等量PBS。在手术6周后，两次注射IL过表达间充质干细胞治疗组再注射相同细胞量的IL过表达间充质干细胞。在第10周处死大鼠。
取大鼠膝关节组织并剃除多余肌肉组织，将膝关节组织置于40％多聚甲醛中固定24h以上，再置于10％的乙二胺四乙酸溶液中在摇床上脱钙20d，脱钙液每2d更换1次。梯度脱水后石蜡包埋，切片做苏木精-伊红染色(HE染色)和马松三色染色(Masson染色)。
染色可见(参见图13-16)，正常对照组膝关节软骨组织相对保持完整，表面光滑，软骨组织正常排列，结构层次清晰。模型组出现严重的软骨破坏，软骨表面细胞破损严重且排列紊乱，大量炎性细胞浸润，毛细血管增生。空载间充质干细胞治疗组病理损伤程度减轻，但有炎性细胞浸润、纤维组织增生、毛细血管增生。单次和两次注射IL过表达间充质干细胞治疗组病理损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润、纤维组织增生、排列不规则、毛细血管增生均有不同程度的改善，尤其是两次注射IL过表达间充质干细胞治疗组软骨已有不同程度的恢复。
经试验证实，本发明提供的抗炎功能增强的间充质干细胞可用于治疗急性胸膜炎、阴道炎和关节炎，并且效果优于普通间充质干细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 生物岛实验室
<120> 间充质干细胞及其抗炎应用
<130> CP21060SW
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 534
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60
ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120
cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180
ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240
caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300
caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360
ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420
caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480
tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaac 534
<210> 2
<211> 438
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgcatccgc tcctcaatcc tctcctgttg gcactgggcc tcatggcgct tttgttgacc 60
acggtcattg ctctcacttg ccttggcggc tttgcctccc caggccctgt gcctccctct 120
acagccctca gggagctcat tgaggagctg gtcaacatca cccagaacca gaaggctccg 180
ctctgcaatg gcagcatggt atggagcatc aacctgacag ctggcatgta ctgtgcagcc 240
ctggaatccc tgatcaacgt gtcaggctgc agtgccatcg agaagaccca gaggatgctg 300
agcggattct gcccgcacaa ggtctcagct gggcagtttt ccagcttgca tgtccgagac 360
accaaaatcg aggtggccca gtttgtaaag gacctgctct tacatttaaa gaaacttttt 420
cgcgagggac agttcaac 438
<210> 3
<211> 462
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgggtctca cctcccaact gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg tgccggcaac 60
tttgtccacg gacacaagtg cgatatcacc ttacaggaga tcatcaaaac tttgaacagc 120
ctcacagagc agaagactct gtgcaccgag ttgaccgtaa cagacatctt tgctgcctcc 180
aagaacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 240
agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac 300
aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg 360
aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta 420
aagacgatca tgagagagaa atattcaaag tgttcgagct ga 462

Claims (20)

1.包含表达载体的宿主细胞在制备用于治疗炎性疾病的药物中的应用，所述宿主细胞为间充质干细胞，所述表达载体携带表达IL-10，IL-13和IL-4的编码序列，所述炎性疾病选自胸膜炎和阴道炎中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体，所述慢病毒载体包含载体质粒，所述载体质粒包括含有Ψ序列的5’LTR，3’LTR，在5’LTR和3’LTR之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述3’LTR和/或5’LTR包括一个或多个修饰。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述5’LTR和3’LTR的U3被缺失或突变。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述3’LTR是缺失了U3区域的ΔU3/3’LTR。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述5’LTR是缺失形式的Δ5’LTR。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒的5’LTR的启动子选自：巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子；
与IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1A(EF1α)启动子或其转录活性片段，RSV启动子和猿猴病毒SV40启动子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸可操作连接有EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒还包括筛选标记物的编码核苷酸，所述筛选标记物选自荧光素酶，增强的绿色荧光蛋白，链霉亲和素结合肽，嘌呤霉素抗性基因，氨苄抗性基因，卡那霉素抗性基因和新霉素抗性基因中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述筛选标记物为增强的绿色荧光蛋白EGFP/嘌呤霉素抗性基因Puro双报告标记物，EGFR和嘌呤霉素抗性基因之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述EGFP/Puro双报告标记物的编码核苷酸可操作连接SV40启动子和Kozak编码序列。
12.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒还包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，逆转录病毒输出元件，中央多聚嘌呤区cPPT或中心终止序列CTS。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述逆转录病毒输出元件选自人类免疫缺陷病毒rev应答元件RRE和乙型肝炎病毒转录后调节元件HPRE。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述cPPT或CTS序列为HIV1的cPPT或CTS。
15.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体质粒从5’LTR区到3’LTR区依次包含：RSV启动子，5’LTR，Ψ序列，RRE，cPPT，EF1α启动子，Kozak翻译起始序列，分别由SEQID NO: 1，SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3显示的 IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸，SV40，Kozak翻译起始序列，EGFR /Puro，WRPE，ΔU3/3’LTR和SV40早期pA。
16.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IL-10，IL-13和IL-4的编码核苷酸中，IL-10，IL-13和IL-4彼此之间以编码2A肽的核苷酸序列间隔开。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述2A肽为T2A肽，P2A肽，E2A肽或F2A肽。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述2A肽为T2A或P2A肽。
19.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
20.根据权利要求1-19任一项所述的应用，其特征在于，所述炎性疾病为急性炎性疾病。
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