JPH06343477A - 医薬的および診断的使用のための組み換えフオーミーウイルスベクター、および組み換えフオーミーウイルスベクターの作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 フォーミーウイルス種由来の核酸および外因
性核酸の、遺伝子工学を用いる試験管内組み換えによっ
て作出され、そして適切な宿主細胞もしくは組み換え的
に改変されたパッケージング（ゲノム詰め込み）細胞系
によって作出される新規なベクター系。 【効果】 上記フォーミーウイルスベクター系は、治療
的およびその他の遺伝子の真核細胞中への安全かつ効果
的な導入を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、フォーミーウイルス種由来の核
酸および外因性核酸の、遺伝子工学を用いる試験管内組
み換えによって作出され、そして適切な宿主細胞もしく
は組み換え的に改変されたパッケージング（ゲノム詰め
込み）細胞系によって産生される新規なベクター系の作
製に関する。特に好適なパッケージング細胞系の組み換
え的作製は、同様に本発明の構成をなす。本発明は、フ
ォーミーウイルスベクターによる、治療的およびその他
の遺伝子の真核細胞中への安全かつ効果的な伝達を特徴
とする。

【０００２】フォーミーウイルスベクターは、著しく広
範なスペクトルの真核細胞にわたり：それらは非常に幅
広い種の哺乳動物細胞を変換する；それらは、特に、ヒ
トにおける多くの異なる体細胞中に遺伝子を導入するた
めに使用することができる。フォーミーウイルスベクタ
ーは、外因性ＤＮＡ断片に対して大きな受容能を有する
ことを特徴とする。

【０００３】フォーミーウイルベクター中の外因性ＤＮ
Ａの発現は、例えば、もし外因性のプロモーターが、そ
のベクター中に用いられない場合には、ウイルスのトラ
ンスアクチベーターｂｅｌ−１によって、厳格に調節す
ることができる。

【０００４】フォーミーウイルスから誘導されるフォー
ミーウイルスベクターは、ヒトには病原性はなく、それ
ゆえに使用上安全である。ヒトのフォーミーウイルスが
人間に対して病理学的作用を引き起こすという証拠はな
い。ヒトのフォーミーウイルスが、神経学的疾病、グレ
ーヴス病、その他の自己免疫症状、カーベーンの甲状腺
炎もしくは筋委縮性側索硬化症に関与していることを推
論するこれまでの報告は、現在では、そのような臨床例
のおけるフォーミーウイルスに関する徹底的解析を基
に、明白に否定することができる。フォーミーウイルス
の使用に関する安全性は、また、フォーミーウイルスベ
クターと細胞ＤＮＡの相同組み換えを起こし得る相同な
ＤＮＡ配列が、ヒト染色体ＤＮＡには存在しないという
事実に由来する。フォーミーウイルスは、他のレトロウ
イルスとは系統発生的に区別されるものである。

【０００５】フォーミーウイルス、およびそれからのベ
クターは、発癌性をもたないことが知られている。

【０００６】中でも、複製能のあるフォーミーウイルス
ベクターは、ウイルス遺伝子ｂｅｌ−２およびｂｅｌ−
３を欠失させることによって作製される。

【０００７】例えば、フォーミーウイルスベクターｐＦ
ＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２およびｐＦＯＶ−３は、通常、
ｂｅｌ−１遺伝子に隣接する３’方向に約４２０塩基対
の欠失を有する。

【０００８】さらに、遺伝子工学によって同様に作製さ
れるパッケージング細胞系において生産することができ
るところの、例えば、ｐＦＯＶ−４のような複製不能の
フォーミーウイルスベクターが作製された。

【０００９】フォーミーウイルスベクターは、治療学的
に活性なタンパク質もしくはアンチセンスＲＮＡもしく
はデコイ（ｄｅｃｏｙ）ＲＮＡを形成するために、ヒト
もしくは動物細胞において外因性ＤＮＡを発現させるの
に適している。フォーミーウイルスベクターは、体液性
免疫および／または細胞性免疫をつくるために、ヒトも
しくは動物において外因性ＤＮＡを発現させるのに適し
ている。

【００１０】そのベクターの外因性核酸を選択すること
により、フォーミーウイルスベクターは、相同組み換え
によって、ヒトもしくは動物における標的細胞の染色体
ＤＮＡにおける望ましくない遺伝子を不活化するため
に、または遺伝子欠損を相補するために適切に使用する
ことができる。

【００１１】標的組織のレポーター遺伝子の発現を調節
することによって、またはその他の遺伝子構築によっ
て、フォーミーウイルスベクターは、診断薬として使用
するために適切である。

【００１２】ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）は、レ
トロウイルスのスプーマウイルス・ファミリーに属して
いる。レトロウイルスのスプーマウイルスファミリー
は、他のレトロウイルスとは明らかに異なる［R.M. Fue
gel et al., EMBO J. 6, 2077-2084 (1987); B. Maurer
et al., J. Virol, 62, 1590-1597 (1988); A. Rethwi
lm et al., Nucleic AcidS Res. 18, 733-738 (1990)
］。

【００１３】ＨＦＶ分離株が、これまでヒトにおいて病
原性が見出されていないことは、本発明のために特に重
要なことである。さらにまた、ＨＦＶは、ヒト組織に各
種型の多重性を導入するので、ベクターは、“遺伝子送
達系”として開発されたものであって、それは感染性分
子クローンｐＨＳＲＶ［A. Rethwilm et al., Nucleic
Acid Research 18, 733-738 1990)］から得られ、そし
て本発明の主題である。“遺伝子送達”のためのベクタ
ーとしてのその使用において、フォーミーウイルスは新
規である。

【００１４】ＨＦＶベクターは、例えば、ＭｏＭＬＶ
（モロニー・マウス白血症ウイルス）、それからは広く
普及されたＮ２ベクター［A.D. Miller et al., Biotec
hniques 7, 980-990 (1989)］が得られるが、ＨＦＶは
いかなる発癌性ももたず、ＨＦＶベクターは使用上安全
であると考えられる点で、そのような他のレトロウイル
スベクターとは根本的に異なる。そのうえ、フォーミー
ウイルスは、繊維芽様細胞、上皮様細胞およびリンパ細
胞を含む非常に広範な宿主スペクトルに感染する。さら
に、もしフォーミーウイルスのＬＴＲ（ロング・ターミ
ナル・リピート）が転写活性をもつならば、ウイルスの
トランスアクチベーターｂｅｌ−１の存在が、命令とな
るという事実のゆえに、ＨＦＶ誘導体は安全なベクター
を代表するものとなる。しかしながら、もしそのベクタ
ーが、ｂｅｌ−１トランスアクチベーターに関する遺伝
情報を有していなければ、移動可能な複製能のある、例
えば発癌性をもつＨＦＶベクターは、ＬＴＲ塩基配列
が、トランスアクチベーターｂｅｌ−１遺伝子なしでは
転写を活性化しないので、その細胞内に産生することは
できない。挿入変異誘発による細胞のがん遺伝子の活性
化は、同様にありそうにもない。ベクターとしてＨＦＶ
誘導体を使用することについて、さらに安全なファクタ
ーは、フォーミーウイルスの内因的相同性が知られてお
らず、それゆえ、内因性レトロウイルスとのいかなる組
み換えの問題も起き得ないことである。この考察は、ま
た、使用にさいしてフォーミーウイルスベクターの遺伝
的安定性を特に高度にするためにも重要である。

【００１５】例えば、以下に示すｐＦＯＶ−１ないしｐ
ＦＯＶ−４に関する構築実施例において記載するよう
に、組み換えフォーミーウイルスは、遺伝子材料を、永
久的な動物もしくはヒトの細胞系に、またはヒトもしく
は動物の体細胞に伝達するために好適である。それら
は、代々遺伝する情報を真核細胞中に導入するためのベ
クターを表していて、可能な応用範囲、標的細胞への遺
伝子導入の効率性および操作上の安全性において、通常
の遺伝子伝達系（ＭｏＭＬＶ、アデノ随伴ウイルスもし
くはシンビスウイルス、またはアデノウイルス粒子、界
面活性剤およびその他の添加剤、または物理的方法を用
いるＤＮＡの形成）よりも優位性をもっている。

【００１６】したがって、実施例実験において述べられ
る、そしてｂｅｌ−１もしくはｂｅｌ−２遺伝子の領域
に、外因性核酸を挿入するための多重クローニング配列
を有しているフォーミーウイルスベクターは、以下に述
べる目的のために使用することができる。しかしなが
ら、多重クローニング配列を挿入し、それによって別の
フォーミーウイルスベクターを構築するために、ｐＨＦ
ＶのプロウイルスＤＮＡもしくはその他のフォーミーウ
イルス分離株において他の欠失をつくることもまた可能
である。

【００１７】そのような組み換えフォーミーウイルスベ
クターは、長さで１７００塩基対を容易に越えるところ
の外因性核酸（ＤＮＡ断片）を受け入れることができる
ので、そのようなフォーミーウイルスベクターは、可能
な多数の応用のための発現可能な外因性ＤＮＡを、生産
目的のための細胞系に、または医薬的もしくは診断的目
的のための体細胞に導入され得る： Ｉ． 予防接種のためのフォーミーウイルスベクター 組み換えフォーミーウイルスベクター中の外因性核酸
は、１種もしくはそれ以上のポリペプチドを発現するた
めに１種もしくはそれ以上の完全な遺伝子を含有するこ
とができる。そのようなペプチドは、ヒトもしくは動物
において液性および／または細胞性免疫を引き出すため
に、好適であり、導入された標的細胞中のこのフォーミ
ーウイルスベクターによってそれらの発現を継続して起
こすことができる。細胞内で形成されたペプチドは、特
殊なポリペプチドであり、細胞性免疫を引き出すために
重要なものであることが、既に分かっている（J.B. Ulm
er et al., Science 259, 1745-1749 (1993)）。

【００１８】外因性核酸を運び、そして導入された標的
体細胞において、ＨＩＶ，ＨＴＬＶ，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝
炎，ヒトパピローマウイルス、シトメガロウイルス、Ｈ
ＳＶもしくはインフルエンザウイルス、または、例え
ば、ＰＲＶ，ＢＨＶもしくはＥＨＶのような動物ヘルペ
スウイルス等のウイルスタンパク質を発現するフォーミ
ーウイルスベクターは、予防的に、または病原性ウイル
スによるヒトもしくは動物の継続する感染の治療手段と
して使用される強力なワクチンを代表するものである。

【００１９】さらにまた、フォーミーウイルスベクター
は、バクテリア感染に対して、マイコプラズマ感染に対
して、またはプラズモジウムもしくは他の内部寄生虫に
よる感染に対して、同じ原理による予防接種のために使
用することができる。そのような予防接種のためには、
複製不能であるが、感染性のフォーミーウイルスベクタ
ー粒子、バッファー溶液ｍｌ当たり１０³〜１０⁷タイタ
ーもしくはそれ以上の粒子が、生体内での細胞導入のた
めに皮下もしくは筋肉内に注射される。さもなくば、繊
維芽細胞、筋芽細胞もしくはその他の体細胞が、そのよ
うな細胞とフォーミーウイルスを産生している細胞とを
混合培養することによって、または目的の体細胞を、ｍ
ｌ当たり１０³〜１０⁷タイターのフォーミーウイルスベ
クターもしくはそれ以上の粒子を含有するバッファー水
懸濁液とともに培養することによって、生体外で導入さ
れる。

【００２０】ＩＩ． 特にウイルス性疾患およびがん性
疾患の治療に関して、治療用ＲＮＡを発現するためのフ
ォーミーウイルスベクター 組み換えフォーミーウイルスベクターにおける外因性核
酸は、標的細胞で望ましくないＲＮＡ分子の配列と相補
的な（アンチセンス）ヌクレオチド塩基配列を保持する
か、またはほかにヌクレアーゼ活性のあるリボザイムＲ
ＮＡを保持するＲＮＡを、導入細胞中で発現する１個な
いしそれ以上の遺伝子を包含している。これらの望まし
くないＲＮＡ分子は、レンチウイルスもしくはその他の
ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡであり得る。それらはま
た、レンチウイルス（中でも、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）、Ｂ
型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイル
ス、シトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイル
ス、単純ヘルペスウイルス、動物のヘルペスウイルス
（例えばＰＲＶ，ＢＨＶおよびＥＨＶ）、またはその他
の病原ウイルスもしくはマイコプラズマ、または細胞内
で複製する原核生物、のような細胞内病原体のメッセン
ジャーＲＮＡ分子でもあり得る。

【００２１】しかしながら、望ましくないＲＮＡ分子
は、また、体細胞の悪性増殖の原因となるがん遺伝子も
しくはその他の遺伝子のｍＲＮＡ転写物でもあり得る。
したがって、ｃ−ｍｙｃＲＮＡ転写物に対するアンチセ
ンスＲＮＡを発現するフォーミーウイルスベクターは、
例えば、バーキットリンパ腫のような悪性障害の場合に
使用されるであろう。望ましくないＲＮＡ分子はまた、
自己免疫障害もしくは代謝障害の遺伝もしくは発現に、
原因として関与しているタンパク質をコードしているこ
ともある。組み換えフォーミーウイルスベクターによっ
てコードされ得る相補的アンチセンスＲＮＡを用いて、
そのような望ましくないＲＮＡ分子は、導入細胞におい
て、ワトソン−クリック塩基対による配列選択的方法で
不活化することができる。フォーミーウイルスベクター
は、それゆえ、感染されたもしくは病理学的に変性した
細胞において、アンチセンスＲＮＡ発現を用いて、細
菌、ウイルスおよびその他の生物による感染病、および
がん性もしくは自己免疫疾患の治療のために使用するこ
とができる。

【００２２】フォーミーウイルスベクターを用いて発現
されたアンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムＲＮＡは
また、代謝障害もしくは神経変性障害に関与しているそ
の他の遺伝子に対しても使用することができる。したが
って、フォーミーウイルスベクターによって発現された
アンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムＲＮＡを用い
て、アルツハイマーβ−アミロイドタンパク質前駆体も
しくは神経組織のアセチルコリンエステラーゼをコード
しているｍＲＮＡを不活化することは、また治療上価値
をもつものである。

【００２３】アンチセンスＲＮＡをコードしている外因
性核酸の代わりに、デコイＲＮＡをコードする外因性核
酸が、治療的に使用される組み換えフォーミーウイルス
ベクター中に挿入されることもある。

【００２４】デコイＲＮＡは、強力な抗ウイルス作用を
示すことができ、例えば、ウイルス感染の治療のために
使用される。

【００２５】この目的のために、そのデコイＲＮＡは、
病原ウイルスの複製に不可欠なウイルスタンパク質を、
それらの部分に対して、結合する特殊なヌクレオチド塩
基配列を有する。したがって、デコイＲＮＡ配列は、例
えば、ＴＡＲヌクレオチド塩基配列およびＨＩＶ由来の
ＲＥＶ応答要素ヌクレオチド塩基配列（ＲＲＥ）の多重
コピーを含有し、ＨＩＶのｔａｔおよびｒｅｖ調節タン
パク質と拮抗的に結合し、それによって感染細胞中での
ＨＩＶの複製速度を低下させる。これは、治療的抗ウイ
ルス作用を表している。

【００２６】しかしながら、そのデコイＲＮＡはまた、
ＨＩＶに関して記載したようにレンチウイルス由来のパ
ッケージング配列を、例えば、５’−ＬＴＲおよびｇａ
ｇ配列中への伸長との間のゲノムＲＮＡ中に含有してい
る。

【００２７】目的の体細胞中への治療的核酸の送達のた
めにフォーミーウイルスベクターを用いることは、生体
外もしくは生体内フォーミーウイルスの応用に関して２
種の異なる方法が、適用できる、一般に：導入されるべ
き細胞を含む体細胞のあるサンプルの生体外導入のため
には、これらの細胞は、適切な細胞培養培地中で、一定
培養時間、フォーミーウイルスベクター産生細胞系とと
もに混合培養される。通常、生体外導入に対する培養時
間は、４〜３６時間である。混合培養の条件は、標的細
胞の効率的導入を許し、また導入される体細胞に再注射
するかまたは再注入するために、培養後、標的細胞とフ
ォーミーウイルスベクター産生細胞系の分別ができるよ
うに選択される。臨床適用のための体細胞の生体外導入
の技術は、レトロウイルス遺伝子伝達の場合に、十分確
立されている。科学文献に詳細に報告されているそのよ
うな技術は、また、フォーミーウイルスベクターによる
細胞の形質導入にも応用することができる（概観のため
に以下を参照、Richard C. Mulligan:“遺伝子治療の基
礎科学"，Science. Vol. 260, 926-932, 1993; W. Frec
h Anderson:“ヒトの遺伝子治療", Science、 Vol. 256,
808-813, 1992; A. Dusty Miller:“ヒトの遺伝子治療
の到来", Nature, Vol. 357, 455-460, 1992）。

【００２８】フォーミーウイルスベクターを用いる体細
胞の生体内導入のために、ｍｌ当たり１０³〜１０⁷もし
くはそれ以上のフォーミーウイルスベクター粒子を含む
バッファー水懸濁液が、導入されるべき標的細胞を有す
る組織に注射される。容量１μｌ〜１ｍｌもしくはそれ
以上の懸濁液からなるフォーミーウイルスベクターが、
生体内で種々の組織に注射することができる。中でも、
それは、骨髄、肝臓、血液、リンパ節、骨格筋、皮膚表
皮組織、皮膚繊維芽組織、脳、胸腺、もしくはその他の
器官である。生体内導入は、ペースト剤もしくはクリー
ム剤の製剤を含有するフォーミーウイルスベクターの局
所投与のような非侵入性フォーミーウイルスベクターに
よって、または吸入用の、エアゾル、泡沫もしくは粉末
製剤によって実施されてもよい。

【００２９】生体外および生体内適用に対するフォーミ
ーウイルスベクターの産出のために、これらのベクター
粒子のいわゆる偽性タイプが使用できることも、また述
べる必要がある。偽性フォーミーウイルスベクターは、
遺伝的に改変されたパッケージング細胞系によるか、あ
るいは水泡性口内炎ウイルスに似たウイルスまたはエン
ベロープ糖タンパク質様タンパク質を発現している複製
不能ＨＩＶもしくはその他のウイルスによって意図的に
感染された生産細胞系を用いることによって、産生され
る。これらの外来のウイルスタンパク質は、そのベクタ
ーの異種構成分をもつエンベロープを形成するように、
フォーミーウイルスベクタータンパク質コート中に取り
入れられる。そのような偽性タイプベクターは、ある種
の応用に対して優位性を発揮する。それらは、パッケー
ジング細胞の上澄液中のフォーミーウイルスベクター粒
子濃度を増加させるために使用できる。それらは、また
フォーミーウイルスベクター粒子の宿主範囲を拡大する
ためにも使用できる。特に、ＨＩＶエンベロープタンパ
ク質を保持する偽性フォーミーウイルスベクターは、そ
のベクターをＣＤ４受容体を発現する標的細胞に特異的
に指向させるために、興味が深い。同様に、異種エンベ
ロープタンパク質によって、例えば、標的とするＩＣＡ
Ｍ−１発現細胞に対する肝炎ウイルスタンパク質もしく
はライノウイルスタンパク質を用いる肝細胞類似の他の
細胞に、優先的に向けられた偽性フォーミーウイルスベ
クターは、興味が深い。

【００３０】この優位性に加えて、偽性フォーミーウイ
ルスベクター中のＨＩＶエンベロープタンパク質類似の
異種タンパク質は、望ましい免疫応答を発揮する。

【００３１】ＩＩＩ． ウイルス性、がん性および自己
免疫性疾患の治療に関する発現ポリペプチドのためのフ
ォーミーウイルスベクター 組み換えフォーミーウイルスベクター中の外因性核酸
は、発現ポリペプチドのための１個ないしそれ以上の遺
伝子を包含することがでできる。もしこれらのポリペプ
チドが、そのベクターを導入された標的細胞中で発現さ
れるならば、それらは、トランスドミナントに負に働
き、病原ウイルスの複製速度を減退させ、それ故、抗ウ
イルス作用を有する調節タンパク質となることができ
る。トランスドミナントに負に働く調節タンパク質は、
例えば、ウイルス粒子の構築を妨害するか、またはＨＩ
Ｖの改変されたｔａｔタンパク質もしくはｒｅｖタンパ
ク質を表すタンパク質である。

【００３２】これらの改変されたタンパク質は、ＨＩＶ
ＲＮＡのＴＡＲもしくはＲＲＥ配列になお結合するの
で、それらの生物学的機能、すなわち抗転写終結（ｔａ
ｔ機能）またはｒｅｖのＲＮＡプロセシング機能は、そ
のタンパク質の非結合部分における変異によってもはや
発現されない。

【００３３】ウイルス性疾患に治療効果を有するその他
の抗ウイルスポリペプチドは、ウイルス結合部位におい
て病原ウイルスを取り込むための受容体に類似している
ものである。ウイルスが細胞の受容体に結合するために
重要な病原ウイルスの結合部位に結合するポリペプチド
が、フォーミーウイルスベクターを用いて、生物体にお
いて発現され、分泌され、その結果、細胞中へのウイル
スの取り込みを妨げる。この関係において、ＨＩＶ ｇ
ｐ１２０への結合によって、ＨＩＶによるヒト細胞の新
規な感染を防ぐＣＤ４ポリペプチド断片を発現するフォ
ーミーウイルスベクターは、治療上有効なものとなろ
う。

【００３４】同様にして、組み換えフォーミーウイルス
ベクターの力を借りて形成されたそのペプチドは、増殖
因子受容体の可溶性部分であってもよく、そして悪性の
細胞増殖へ導きつつある発現された増殖因子を捕捉する
ことにもなる。これらの意味によって、フォーミーウイ
ルスベクターは、抗腫瘍性を発現することになる。

【００３５】この原理は、また自己免疫病を治療するた
めに使用することもできるであろう。２つの例が、この
関連で述べられる： １． 免疫抑制の目的で、そして臓器移植拒絶を防ぐた
めに、外因性核酸によって標的組織中に分泌される抗イ
ンターロイキン２抗体を発現するフォーミーウイルスベ
クターが、使用される。

【００３６】２． そのフォーミーウイルスベクター
は、標的組織に分泌されるポリペプチドを発現し、その
ポリペプチドは、アセチルコリン受容体のα−サブユニ
ットのペプチド断片を有し、そして重症性筋無力症にか
かっている患者において抗体を結合し、不活化すること
ができる。

【００３７】組み換えフォーミーウイルスベクターを用
いて発現されるその他のポリペプチドは、がん免疫療法
のために、新生物性に形質転換されるが、化学的もしく
は物理的手段によって増殖を妨げられる細胞中の、例え
ば、インターロイキン２のようなリンホカインであって
もよい。この場合には、免疫療法のために使用されるそ
の細胞は、フォーミーウイルスベクターを用いて生体外
で導入される。同様に、がんの免疫療法は、実施例ＩＩ
に概説したようなフォーミーウイルスベクターによる腫
瘍細胞の生体内形質導入によって実施することもでき
る。

【００３８】フォーミーウイルスベクターの仲介によ
り、標的組織での１種以上のインターフェロンの発現
は、また抗ウイルス治療および／またはがん治療の手段
として考えられる。

【００３９】さらにまた、新生物性に転換された細胞、
またはレンチウイルスもしくは肝炎ウイルスに感染した
細胞は、標的組織において、そのベクターが毒素もしく
は細胞内の病原体によるか、または新生物性に転換され
た細胞の特別な代謝により細胞毒性のポリペプチドに変
換されるその他のポリペプチドを発現させることによっ
て、組み換えフォーミーウイルスベクターを用いて治療
的に処置することができる。フォーミーウイルスベクタ
ーは、リシンＡもしくはジフテリア毒素もしくはスタフ
ィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）
エンテロトキシンＢもしくはコリシンＥ、またはその
他の毒素を発現するために構築されてもよい。細胞もし
くは器官に特異的なそのような生産物の発現を確実にす
るために、細胞特異性もしくは器官特異性であるプロモ
ーターの調節下の細胞毒ポリペプチドを形成するフォー
ミーウイルスベクターが、構築されることもある。

【００４０】フォーミーウイルスベクターによって標的
細胞中に内生的に発現され得るその他の治療用タンパク
質は、例えば、病原性レンチウイルスもしくは肝炎ウイ
ルスのウイルスプロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害
剤である。それらはまた、エラスターゼおよび／または
トリプシン、およびその他のプロテアーゼに対するプロ
テアーゼ阻害剤でもあり、それは、成人呼吸困難症候群
および気腫、およびその他の病状を防ぐことになる。そ
れらはまた、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のような
タンパク質でもよく、それは、フォーミーウイルスベク
ターを用いてがん治療のために使用される。さらに、腫
瘍抑制遺伝子を見落とすことが、フォーミーウイルスベ
クターの力で発現させることもできる。

【００４１】フォーミーウイルスベクターの重要な応用
のさらなる例は、細胞静止性の化学療法剤、又は骨髄を
損なうようなその他の薬剤を用いる腫瘍治療の間に、骨
髄細胞（骨髄幹細胞、ＣＤ３４−始原細胞およびその他
の造血細胞）を保護する目的で、多剤耐性遺伝子（ＭＤ
Ｒ）を造血細胞に伝達するために、このベクターを使用
することである。

【００４２】ＩＶ． 細胞染色体ＤＮＡとの相同組み換
えのためのフォーミーウイルスベクター 望ましくない遺伝子、例えば、レンチウイルスのプロウ
イルスＤＮＡ、増幅されたがん遺伝子、遺伝病を引き起
こす遺伝子、およびその他の遺伝子は、望ましくない遺
伝子に相同であるＤＮＡ配列を有する外因性核酸を保持
しているフォーミーウイルスベクターによって不活化す
ることができる。この目的のために、フォーミーウイル
スベクターの外因性核酸が、高頻度で、適切な方法で、
相同組み換えによる対応する細胞遺伝子の破壊へ導くよ
うな方向において選択される。しかしながら、欠陥遺伝
子は、フォーミーウイルスベクターの外因性核酸の、完
全な遺伝子との組み換えによって、遺伝子座においてこ
の手段で修正されることもあり得る。

【００４３】Ｖ． 遺伝病の体細胞遺伝子療法のための
フォーミーウイルスベクター 例えば、血液凝固因子ＶＩＩＩもしくはＩＸにおける欠
損、アデノシンデアミナーゼ欠損、ヘモグロビン異常
症、嚢胞性繊維症、家族性高ステロール血症、デュシェ
ン・筋ジストロフィー、もしくはその他の遺伝病のよう
な遺伝病は、フォーミーウイルスベクターを用いて、体
細胞中へ適切な修正遺伝子を導入することによって治療
することができる。

【００４４】ＶＩ． 心臓血管疾患治療のためのフォー
ミーウイルスベクター 組み換えフォーミーウイルスベクターは、その外因性核
酸が、血圧調節効果をもつポリペプチドを発現させるた
めの１個以上の遺伝子を保持するように構築され得る。
したがって、そのポリペプチドは、例えば、トランスド
ミナントに負に作用する調節心房性ナトリウム利尿ペプ
チドであってもよい。それらは、循環するＡＮＰ（心房
性ナトリウム利尿ペプチド）もしくはＡＮＦ（心房性ナ
トリウム利尿因子）に結合し、不活化するためのポリペ
プチドである。これらのポリペプチドは、例えば、抗体
類似タンパク質であるか、または、例えば、ＡＮＰもし
くはＡＮＦ結合受容体の可溶性受容体誘導体である。そ
れらは、数種の例を挙げると、レニンの阻害剤、または
アンジオテンシン変換酵素の阻害剤であってもよい。

【００４５】フォーミーウイルスベクターにおける外因
性核酸の遺伝子は、また、動脈硬化もしくはその他の心
臓血管疾患の進展を阻止する生産物をコードすることも
できる。これらの生産物は、内皮細胞もしくは平滑筋細
胞の増殖を阻止する物質、例を挙げると、ｃ−ｍｙｂの
ｍＲＮＡもしくはＴＧＦ−βのｍＲＮＡに対するアンチ
センスＲＮＡである。

【００４６】これに関連して、フォーミーウイルスベク
ターにより生成される治療用生産物は、また、ＬＤＬ受
容体であってもよい。

【００４７】フォーミーウイルスベクターは、例えば、
ＥセレクチンもしくはＰセレクチンのような粘着タンパ
ク質に対するアンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムＲ
ＮＡを発現するように構築することができる。相補性Ｒ
ＮＡによって、選択された粘着タンパク質のｍＲＮＡの
翻訳を阻害するほかに、そのフォーミーウイルスベクタ
ーは、また、血液循環中に分泌され、血液細胞間の（例
えば、血小板凝集）、または血液細胞と内皮細胞との相
互作用を、例えば、ＥセレクチンもしくはＰセレクチン
のような粘着タンパク質に選択的に結合することによっ
て阻止するポリペプチドを発現する外因性核酸を保持す
ることもできる。

【００４８】血液中および内皮細胞上での粘着タンパク
質の阻止は、血管の病理学的変化および炎症疾患に関し
ての治療原理として重要である。

【００４９】ＶＩＩ． 診断上の応用のためのフォーミ
ーウイルスベクター 組み換えフォーミーウイルスベクターの外因性核酸は、
検出されるべきある物質によって細胞内で活性化され、
そしてそのために、特異的に、しかも増幅可能なシグナ
ルを用いて、その物質を高い感度で検出可能にする遺伝
子もしくは遺伝子断片を保持することもできる。

【００５０】細胞内のウイルス性もしくは細菌性トラン
スアクチベータータンパク質を、生検材料、体液、細胞
系、生産細胞系もしくはその他の細胞から検出すること
は、例を挙げて本明細書で述べることができる。トラン
ス活性可能な遺伝子配列を、例えば、ルシフェラーゼ、
β−ガラクトシダーゼもしくはペルオキシダーゼのよう
な下流のレポーター遺伝子に共役させることによって、
感染の存在を確認できるそのようなトランスアクチベー
タータンパク質が、検査下の細胞内のフォーミーウイル
スベクターによって、感度よく検出できる。

【００５１】ＶＩＩＩ． 核酸の試験管内組み換えによ
るフォーミーウイルスベクターの構築 感染性分子クローンｐＨＳＲＶ−２（図１および２）
は、ｐＨＳＲＶ−１の誘導体である。ｐＨＳＲＶ−１
は、ヒト・フォーミーウイルスベクターのｃＤＮＡクロ
ーニングおよび組み込まれていないウイルスＤＮＡのク
ローニングによって得られた（A. Rethwilm et al., Ge
ne 59, 19-28 (1987), A. Rethwilm et al.,Nucleic ac
ids Res. 18, 733-738 (1990)）。ｐＨＳＲＶ−１にお
いては、約５００塩基対が、５’ＬＴＲのＵ３領域から
欠失し、約３５０塩基対が、３’ＬＴＲのＵ３領域から
欠失している（A. Rethwilm et al., 未発表）。ｐＨＳ
ＲＶ−２においては、５００塩基対が、両ＬＴＲで欠失
している。このことは、ｐＨＳＲＶ−１の３’ＬＴＲに
おけるＡｆｌＩＩ／ＸｂａＩ断片を、５’ＬＴＲの対応
する断片により置換することによって容易になされた。
両プラスミドは、感受性細胞へのトランスフェクション
の後、感染性ウイルスを誘発する。図３−８に描かれた
ｐＦＯＶベクターを得るために、ｂｅｌ−２／ｂｅｌ−
３における欠失が、制限エンドヌクレアーゼＡｃｃＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩによって、ｐＨＳＲＶ−２の、それ
ぞれヌクレオチド位置１０４２０および１０８４４の間
に導入された。ＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩおよびＮｒｕＩに
対する切断部位を有する多重クローニング配列が、ｐＦ
ＯＶ−１におけるこの欠失中に挿入された。ｐＦＯＶ−
１において、外来のＤＮＡ配列は、Ｃ−末端を切り取ら
れたＢｅｔタンパク質の融合タンパク質として発現され
る。ｐＦＯＶ−２においては、内部リボソームランディ
ングパッド（ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ）が、ＡｃｃＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ欠失中に挿入された。その上、２個の終
止コドンが、ｂｅｌ−２の読み枠中に導入された（G. B
aunach et al., J. Virol. 67, 5411-5418,(1993)）。
ｐＦＯＶ−３、ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−６は、ｐ
ＦＯＶ−２の誘導体であり、そこには、ｂｅｌ−１読み
枠中のスプライス供与部位（ｐＦＯＶ−３）、ｂｅｌ−
２読み枠のスプライス受容部位（ｐＦＯＶ−５）、また
は両方（ｐＦＯＶ−６）が、変異を受けている。ｐＦＯ
Ｖ−２，ｐＦＯＶ−３，ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−
６は、これらのベクター中に挿入された外来ＤＮＡによ
ってコードされた真のタンパク質を生じる。

【００５２】これらのベクターは、複製能があり、外因
性核酸を発現するために（例えば、ＣＡＴ遺伝子（クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を発現
するために）引き続いて使用された。

【００５３】ベクターｐＦＯＶ−４（図１，２および
６）は、ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド位置９５２９）およ
びＨｉｎｄＩＩＩ（ヌクレオチド位置１０８４４）制限
部位の間でプロウイルスＤＮＡを欠失させることにより
作製された。このフォーミーウイルスベクターは、複製
能をもたない。

【００５４】ＩＸ． フォーミーウイルスベクターの生
産 複製能のあるフォーミーウイルスベクター、例えば、ｐ
ＦＯＶ−１ないしｐＦＯＶ−３は、細胞系、例えばＨＥ
Ｌ２９９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３７）ヒト胎児性肺繊維
芽細胞、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１０）ハムスター腎細胞、ＣＦ２ＴＨ（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ１４３０）イヌ胸腺細胞系、ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ１７１）ヒト肺細胞系、ＣＨＯチャイニーズ・ハム
スター卵巣細胞系、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）
アフリカミドリザル腎細胞系、３ＴＳ−ＴＫ^-（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ９２）マウス繊維芽細胞系、およびその他の
細胞系、または一次組織培養もしくは感染動物において
増殖させられる。感染性フォーミーウイルスベクター粒
子を含む細胞培養上澄液もしくは感染動物からの液は、
感染させる標的細胞に対して使用できる。

【００５５】複製能をもたないフォーミーウイルスベク
ターは、組み換え的に改変されたパッケージング細胞系
を用いて生産される。その複製能のないフォーミーウイ
ルスベクターは、複製能のあるフォーミーウイルスによ
って感染されない体細胞において、そのベクターの複製
を排除する遺伝子欠失をもっている。ｂｅｌ遺伝子に加
えて、これらの遺伝子欠失は、ｇａｇ遺伝子領域および
／またはｐｏｌ遺伝子領域および／またはｅｎｖ遺伝子
領域を含むことができる。

【００５６】欠失遺伝子のタンパク質は、例えば通常の
伝達（例えば、エレクトロポレーションもしくはＣａＰ
Ｏ₄沈殿）によってパッケージング細胞系中にトランス
フェクションされた１個もしくはそれ以上のフォーミー
ウイルス遺伝子によって産生される。パッケージング細
胞系の特徴は、それが、外因性核酸を包含するベクター
のゲノムＲＮＡを、感染性フォーミーウイルス粒子中に
詰め込むことを可能とするｇａｇ、ｐｏｌおよび／また
はｅｎｖタンパク質のような１個もしくはそれ以上のフ
ォーミーウイルスタンパク質を発現することである、何
故ならば、これらのタンパク質は、パッケージング細胞
系においてトランスに供給されるからである。

【００５７】感染性であるが複製能のないフォーミーウ
イルスベクター粒子は、安全性の理由からこの方法で生
産される。パッケージング細胞系は、前記細胞系もしく
はその他の適切な細胞系のひとつであり得る。

【００５８】Ｘ． 生物学的、薬理学的、および医学的
研究に関して特別な生理学的性質を有する組織培養およ
び動物（細胞および動物モデル）を作出するためのフォ
ーミーウイルスベクター 組織培養（生体外）の細胞、または動物における組織細
胞（生体内）は、そのベクターを用いて、これらの細胞
に特殊な遺伝子の発現を起こさせるために、フォーミー
ウイルスベクターによって形質導入される。これらの方
法によって、特殊な生理学的状態、特殊な代謝効果、ま
たは細胞の特殊な生化学的性質が、生体外もしくは生体
内で作り出される。この方法で改変されたこれらの細胞
は、生理学的、薬理学的、または医学的研究のために大
きな価値をもつことができる。例えば、それらは、生体
外もしくは生体内で、遺伝子の機能を決定するため、ま
たは研究中の活性化合物もしくは薬物の効果を決定する
ために試験される。さらに、そのような導入細胞（その
ベクターによって遺伝的に改変された細胞）は、生体外
細胞試験もしくは生体内動物実験によって、薬物として
さらに開発するために適切な活性化合物（化学合成的も
しくは生物学的に作製された物質）に関する研究（活性
化合物のスクリーニング）において、非常に価値ある助
けとなり得る。具体的な例は、遺伝的に改変された細胞
中のがん遺伝子のがん遺伝子的能力を研究するため、が
ん遺伝子依存性の腫瘍発生を研究するため、そして腫瘍
発生を阻害するための活性に関して生体内で活性化合物
を試験するために、選ばれた動物器官中にｃ−ｍｙｃ、
ｒａｓ，ｂｃｒ−ａｂｌ，もしくはＨＩＶ−ｔａｔのよ
うながん遺伝子を伝達すべきそのベクターの使用によっ
て提供される。

【００５９】ｂｅｌ−１を発現するパッケージング細胞
系は、ＨＩＶ−ＬＴＲ−レポーター遺伝子構成物を保持
するｐＦＯＶ−４−ベクターを作製するために使用され
る。このベクターは、ヒト一次マクロファージ、神経細
胞およびその他の体細胞に感染する。そのような導入マ
クロファージもしくは他の一次細胞は、実施例ＶＩＩに
概説したように、ＨＩＶ汚染に関して分析されるべきサ
ンプルとの混合培養によって、感受性のＨＩＶ検出ため
の診断目的に対して使用することができる。何故なら
ば、狭い宿主領域に限定され、それゆえ、抹消の血液リ
ンパ球サンプルで培養できない臨床関連ＨＩＶ分離株が
あるからである。

【００６０】そのようなｐＶＯＦ−４を導入されたマク
ロファージもしくはその他の細胞は、また、ＨＩＶの阻
害物である。さらに、もしｐＶＯＦ−４のレポーター遺
伝子が、ブドウ球菌エンテロトキシンＢもしくはリシン
Ａのような潜在的ｓｕｉｚｉｄｅ遺伝子、または細胞毒
性産物をコードしているその他の遺伝子によって置換さ
れるならば、ｐＶＯＦ−４は、そのような一次体細胞の
ＨＩＶ感染において活性化されるｓｕｉｚｉｄｅ遺伝子
のスクリーニングに使用される。

【００６１】さらに、ヒトの細胞粘着タンパク質（セレ
クチン）は、フォーミーウイルスベクターを用いて種々
の動物の体細胞において発現され、それによって、動物
（例えば、マウス）において抗炎症性、セレクチン結合
性の、活性化合物のスクリーニングを可能とする。これ
らには、動物においてヒトのタンパク質を用いて、フォ
ーミーウイルスベクターの力で実現されつつある“分子
薬理学”に関する２例の試験モデルがある。

【００６２】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。

【００６３】１． 治療的、免疫的もしくは診断的効果
を有する１個ないしそれ以上の遺伝子産物を発現するた
めの外因性核酸を含むフォーミーウイルスベクター。

【００６４】２． 上記１記載のフォーミーウイルスベ
クターであって、そのフォーミーウイルスベクターは、
外因性核酸を挿入するためのｂｅｌ−１、ｂｅｌ−２お
よび／またはｂｅｌ−３遺伝子の領域に欠失を有するヒ
ト・フォーミーウイルス（ヒト・スプーマレトロウイル
スＨＳＲＶ−１もしくはＨＳＲＶ−２の感染性もしくは
非感染性ＤＮＡ）の誘導体であることを特徴とする。

【００６５】３． 上記１ないし２記載のフォーミーウ
イルスベクターであって、その外因性核酸は、液性およ
び／または細胞性免疫化に関するポリペプチドを発現す
るための１個の完全な遺伝子、または数個の完全な遺伝
子を含むことを特徴とする。

【００６６】４． 上記１ないし２記載のフォーミーウ
イルスベクターであって、その外因性核酸は、アンチセ
ンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡもしくはデコイＲＮＡを
発現するための遺伝子を含むことを特徴とする。

【００６７】５． 上記１ないし２記載のフォーミーウ
イルスベクターであって、その外因性核酸は、腫瘍形成
を阻害するための遺伝子産物を発現することを特徴とす
る。

【００６８】６． 上記１ないし２記載のフォーミーウ
イルスベクターであって、その外因性核酸は、標的生物
において遺伝子欠損を償う遺伝子産物を発現することを
特徴とする。

【００６９】７． 自己免疫疾患、心臓血管疾患、腫
瘍、ウイルス性疾患もしくは遺伝子欠損を治療するため
の上記１ないし６記載のフォーミーウイルスベクター。

【００７０】８． 上記１ないし６記載のフォーミーウ
イルスベクターであって、それは、診断的使用のための
産物を発現する外因性核酸配列を含んでいる。

【００７１】９． 上記１ないし７記載のフォーミーウ
イルスベクターを含有する医薬品。

【００７２】１０．上記１ないし９記載のフォーミーウ
イルスベクターを産生するための、真核生物細胞系もし
くは組み換え真核生物細胞系。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＨＦＶ（ヒト・スプーマレトロウイルスｐＨ
ＳＲＶ−２の感染性プロウイルスＤＮＡ）、およびＡｃ
ｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（それぞれ、ヌクレ
オチド位置１０４２０および１０８４４）における欠失
によって、それから作出されるフォーミーウイルスベク
ターｐＦＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２およびｐＦＯＶ−３の
ゲノム構造の図式表示。複製不能ベクターｐＦＯＶ−４
は、ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド位置９５２９）およびＨ
ｉｎｄＩＩＩ（ヌクレオチド位置１０８４４）の間に、
より大きい欠失を有する。多重クローニング部位、例え
ば、ここに示されたＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩおよびＮｒｕ
Ｉ切断部位は、その欠失の場所に挿入された。

【図２】図１と一緒になって、上述のベクターを構成す
る一方の部分を示す図である。

【図３】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−１の制
限酵素切断地図。

【図４】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−２の制
限酵素切断地図。

【図５】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−３の制
限酵素切断地図。

【図６】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−４の制
限酵素切断地図。

【図７】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−５の制
限酵素切断地図。

【図８】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−６の制
限酵素切断地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/21 ＡＢＮ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4Ｃ 49/00 Ａ 9051−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/64 // Ａ６１Ｋ 35/74 Ｚ 7431−4Ｃ 35/76 ＡＡＭ 7431−4Ｃ 37/02 ＡＢＢ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 15/04 8318−4Ｈ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 治療的、免疫的もしくは診断的効果を有
   する１個ないしそれ以上の遺伝子産物を発現するための
   外因性核酸を含むフォーミーウイルスベクター。
2. 【請求項２】 請求項１記載のフォーミーウイルスベク
   ターを含有する医薬品。
3. 【請求項３】 請求項１ないし２記載のフォーミーウイ
   ルスベクターを産生するための、真核生物細胞系もしく
   は組み換え真核生物細胞系。