DE19503082A1

DE19503082A1 - Gegenstand und Verfahren zur bevorzugt transienten Expression und möglichen Translation spezifischer RNA im cytoplasmatischen Bereich höherer eukaryontischer Zellen

Info

Publication number: DE19503082A1
Application number: DE19503082A
Authority: DE
Inventors: Roland Prof Dr Mertelsmann; Felicia Dr Rosenthal; Joachim Prof Dr Kalden; Wolf Prof Dr Bertling; Albrecht Dr Lindemann; Peter Dr Kulmburg; Hendrik Dr Veelken
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: BERTLING, WOLF, PROF. DR., 91056 ERLANGEN, DE
Priority date: 1995-02-01
Filing date: 1995-02-01
Publication date: 1996-08-08
Also published as: US6255104B1; AU5259896A; WO1996023889A1; EP0804598A1

Description

Bei diesem Verfahren wird ein von einem RNA-Virus abgeleitetes Vektorsystem dazu verwendet, die Expression eines in dieses Vektorsystem klonierten Gens nach Infektion von eukaryontischen Zellen zu gewährleisten. Diese zum Expressionsvektor umgestalteten Viren sind zwar noch infektiös, jedoch nicht mehr vermehrungsfähig und bedürfen zu ihrer Herstellung ein Helfervirus bzw. eine Helferzell-Linie, die fehlende Genomteile, bzw. deren Expressionsprodukt supplementiert. Diese Expression ist bevorzugt transient, da die Expressionsvektoren nicht in das Genom der Wirtszellen integrieren.

Dieses Vektorsystem kann, je nachdem welche Sequenzen spezifisch in ihm zur Expression gebracht werden, sowohl für die in vitro Expression, in Zellkultur, als auch für die Expression von Genen in vivo, im lebenden Organismus, verwendet werden. Die vorliegende Erfindung behandelt ein Gebiet der Molekular biologie, speziell der medizinischen Molekularbiologie.

Besondere Bedeutung ist der Anwendung im medizinischen Bereich zuzumessen, wo z. B. durch Klonie rung und nachfolgender Expression immunstimulierender Substanzen eine Krebstherapie ex vivo und in vivo durchführbar wird, und wo z. B. durch Klonierung von Suizid-Genen eine Ablation bestimmter Zell typen, z. B. virusinfizierter Zellen bei der HIV-Infektion. Durch Klonierung und Expression solcher Suizidge ne in rekombinante Polioviren, die Immunzellen infizieren, die Autoantigene erkennen, wird auch Be handlung von Autoimmunerkrankungen möglich.

Gegenstand der Erfindung sind Gegenstände und ein Verfahren zur spezifischen Expression von vor gegebenen Genen in einem RNA-Virus-abhängigen Vektorsystem sowie Gegenstände und Verfahren zur Herstellung dieses Systems und zu deren Durchführung.

RNA ist ein intermediärer Informationsträger, der nach der Transkription der Information von der DNA selbst wiederum als Matrize zur Translation bei der Herstellung der Proteine dient. Einige virale Systeme benötigen den ersten Schritt, die Transkription der DNA und damit die DNA nicht, es handelt sich dabei um sogenannte RNA-Viren.

Die RNA kann dabei einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegen, sie wird ausschließlich über RNA- Intermediate vermehrt und als solche auch in neue Viruspartikel verpackt. Ein RNA-abhängiges System hat gegenüber einem DNA-abhängigen System mehrere Vorteile: Es werden keine transkriptions regulierenden Sequenzen und Faktoren benötigt eine Gewebsspezifität auf dieser Ebene kann also nicht gegeben sein, es müssen keine weiteren für eine Prozessierung notwendigen Signale wie z. B. Intronse quenzen und Polyadenylierungssequenzen vorhanden sein, es müssen keine für den Transport der RNA aus dem Kern in das Cytoplasma notwendigen Sequenzen vorhanden sein und es ist somit eine viel kleinere kompaktere Version von genetischer Information ausreichend, um ein hohes Expressionsniveau zu erreichen.

Während es eine ganze Reihe von DNA-abhängigen Expressionssystemen für Eukaryonten gibt, vor allem für Zellen in Zellkultur aber auch in vivo, gibt es nur wenige Systeme, die auf der RNA-Expression direkt beruhen. Von den existierenden Systemen zur Proteinexpression in höheren eukaryotischen Zellen ist das Baculovirus-System das am besten eingeführte (Bishop DHL, 1990 Gene expression using insect cells and viruses, p62-67. In: Current Opinion in Biotechnology. M. Rosenberg, B Moss (eds.) Current Opinion Ltd, London). Dieses System kann jedoch nur in Insektenzellen angewendet werden. Andere eukary ontische Systeme, wie das Semliki Forest Virussystem von Liljeström und Garoff (Liljeström P, Garoff H 1991 A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest Virus replicon. Bio/Technology 9, 1356-1361) basiert zwar auch auf einem RNA-abhängigen Prinzip, ist jedoch nicht in vivo anwendbar aufgrund seines pathogenen Potentials, ähnliches gilt auch für das RNA-abhängige Sindbis-Vektorsystem (Xiong C, Levis R, Shen P, Schlesinger S, Rice CM, Huang HV 1989 Sindbis virus: An efficient, broad host range vector for gene expression in animal cells. Science 243, 1188-1191). Alle anderen Systeme, die zur Zeit zur Anwendung in vivo bereitstehen, wie das Adenovirussystem und das AAV-System (Muro-Cacho CA, Samulski RJ, Kaplan D 1992 Gene transfer in human lymphocytes using a vektor based on adenoassociated virus. J. Immunother. 11, 231-237), werden zur Zeit auf ihre Anwend barkeit am Patienten geprüft, basieren aber auf DNA-Vektoren mit einem gewissen Potential zur In tegration ins Wirtsgenom. Retrovirale Systeme (für einen Überblick siehe: Gene Therapeutics, JA Wolff, ed. Birkhäuser Verlag, Basel, 1994) besitzen darüber hinaus auch noch ein gewisses cancerogenes Potential.

Das von uns verwendete RNA-Virus-abhängige System basiert bevorzugterweise auf Enteroviren und dabei wieder bevorzugterweise auf Polioviren, speziell den attenuierten Sabin-Stämmen. Diese attenuier ten Viren (Sabinstämme der Polioviren) wurden schon zur Herstellung rekombinanter Viren, die zum Einsatz als rekombinante Impfstoffe gedacht sind, verwendet (Nomoto, Almond: recombinante Poliovakzi ne; für einen Überblick siehe: Girard M., Martin A., van der Werf S. 1993 Potential use of Poliovirus as a vector. Biologicals 21, 371-377).

Das ebenfalls auf RNA-Viren beruhende System des Semliki Forest Virus (Liljeström P. 1993 Virally based transient expression systems. Curr. Opin. Therapeutic Pat. 3, 375-402) dient der Überexpression rekombinanter Proteine in Zellkultur.

Ein weiteres System beruht auf RNA-kodierten Viren, den sogenannten Retro-Viren. Die Expression von neuen viralen und nicht-viralen Genen in solchen Vektorsystemen beruht jedoch nicht auf einem aus schließlich translationsabhängigen System, sondern erfolgt erst nach Integration der von diesem Vektor system getragenen genetischen Information als DNA in die genomische DNA der Zielzelle. Damit ist dieses System sowohl transkriptions- als auch translationsabhängig und nicht mit einem rein translational kontrollierten Expressionssystem zu vergleichen.

Alle beschriebenen Techniken, Verfahren und Gegenstände zu diesen Verfahren zeigen Nachteile, die ihre Anwendung limitieren. Besonders hervorzuheben sind die nachteiligen Eigenschaften DNA-abhängi ger Expressionssysteme. Alle diese Systeme sind prinzipiell dazu in der Lage, in das Genom der jeweili gen Zielzellen zu integrieren. Da zu transkribierende Gene sowohl Enhancer- als auch Promoterstruktu ren benötigen, die in den jeweiligen Zielzellen aktiv sind, kann eine Integration zu einer unkontrollierten Aktivierung anderer Gene, zur Zerstörung anderer Gene oder zur Interferenz mit anderen Genen führen, was dann zumindest bei einer ex vivo und in vivo Applikation an Tier oder Mensch fatale Folgen haben kann. Integrierte Expressionssysteme zeigen eine stabile Expression der entsprechenden Genprodukte über viele Zellgenerationen und sind somit mit den Folgen einer Langzeitexpression behaftet und nicht geeignet zur zeitlich genau definierten Expression oder Überexpression bestehender Gene.

Zusätzlich dazu beherbergt ein Großteil der auf Virensystemen basierenden Vektoren auch noch replika tionsfähige Elemente, so daß nicht nur eine Persistenz durch Integration, sondern auch durch Replikation, eventuell sogar durch Infektion weiterer Zellen gegeben ist. Weiterhin sind solche Elemente dadurch in der Lage, mit anderen eventuell endogenen Viren, oder auch akzidentiellen infektiösen Agenzien zu rekombinieren und einen völlig neuen, möglicherweise gefährlichen Virustyp hervorzubringen. Das Semliki Forest System beruht auf einem Humanvirus der Klasse II, und ist so gestaltet, daß eine Rekombination des Helfervirus mit dem eigentlichen Vektor möglich ist und so zur Rekonstruktion eines potentiell pathogenen Virus bei einer ex vivo oder in vivo Behandlung am Patienten führen kann. Dieses System ist daher nur zum Einsatz in Zellkultur verwendbar. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß eine Infektion mit diesem Virus bzw. diesem Vektorsystem innerhalb von 2-3 Tagen zum Absterben der jeweiligen Zielzellen führt.

Vektorsysteme, die auf Retroviren basieren, gelangen zwar auch als RNA in die Zielzellen, jedoch werden sie dort in cDNA übersetzt und integrieren als solche. Auch diese Konstrukte müssen daher mit regulatori schen Sequenzen versehen sein, die für ein RNA-System nicht nötig sind. Zu diesen regulatorischen Sequenzen gehören Enhancer-, Promoterstrukturen, und RNA-Signalsequenzen, die zur Ausschleusung aus dem Kern führen, Intronsequenzen, die für eine korrekte Prozessierung notwendig sind, sowie Sequenzen, die für eine ausreichende Stabilisierung der RNA sorgen und u. a. eine ausreichenden Polyadenylierung mit den entsprechenden Sequenzen.

Ein Nachteil dieser Systeme ist daher, daß sie sehr oft nicht vorhersagbar in ihrer Wirkung, speziell ihrer Langzeitwirkung, in den jeweiligen Zielzellen sind.

Die vorliegende Erfindung verspricht, diese Nachteile aufzuheben, bzw. zu bessern. Es handelt sich dabei um ein Verfahren und Gegenstände zur Verwendung in diesem Verfahren zur Expression von spezi fischen RNA-Sequenzen und deren mögliche Translation unter Verwendung eines auf einem RNA-Virus, präferenziell einem Enterovirus, preferenziell einem attenuierten Poliovirus, basierenden Systems, das die Möglichkeit gibt, mit hoher Transfektionseffizienz die Expression spezifischer RNA-Sequenzen im Cytoplasmabereich mit sehr hoher Effizienz zu gewährleisten. Die Herstellung der benötigten RNA- vektoren erfolgt über DNA-Zwischenstufen im Labor, zur Applikation kommen jedoch bevorzugt RNA- Moleküle, preferenziell in passende virale Kapside verpackt. Das von uns vorgeschlagene System kann nicht reverstranskribiert werden - obwohl es ein in der Menschheitsgeschichte sehr altes Virus ist, ist noch keine einzige Integration von Polioviren in das Humangenom beobachtet worden oder überhaupt nur denkbar. Ferner benötigt unser System keine transkriptionsregulierenden Sequenzen, d. h. relativ kurze cDNA-Fragmente reichen gewöhnlich für eine hocheffiziente Expression des darauf codierten Gen produkts, die lange persistieren kann. Unser System führt nicht zwangsläufig zu einer letalen Schädigung der infizierten Zellen und ist daher, gerade aufgrund seiner primär transienten Expressionseigenschaft, sehr gut zu einer in vivo oder ex vivo Applikation am Patienten geeignet.

Eine bevorzugte Anwendung der Erfindung ist das Herstellen von Klonen, die für ein das Immunsystem aktivierende Gen, z. B. IL-2, kodieren und daher geeignet sind, im Rahmen der genetischen Therapie von Tumorpatienten, eingesetzt zu werden. Als immunmodulatorische Substanzen sind hier Interleukine, wie IL-2, IL-10, GMCSF, GCSF sowie immunologisch relevante Adhäsionsmoleküle, wie CD2, CD4, CD8, LFA-1, 4F2, CD40 und CD28 sowie deren Liganden LFA-3, ICAM-1, B7, oder CD45 zu verstehen. Diese Gene sind bevorzugt anstelle der viruseigenen Strukturproteine in rekombinanten Polioviren kloniert und werden dort exprimiert. Die in cis nötigen Virusproteine bleiben exprimiert durch die Verwendung eines Signals, das eine dicistronische Aneinanderreihung von Genen und deren Expression erlaubt, einer internal ribosomal entry site (IRES).

In der beigefügten Zeichnung wird ein Teil des Virusgenoms (von VP4 über VP2, VP3 bis VP1) durch das menschliche GMCSF-Gen ersetzt und die nachfolgenden Virusproteine werden durch ein zusätzlichen IRES gesteuert.

Um eine neue Spezifizität für diese rekombinanten Viren einzuführen, kann auf dem Helferkonstrukt, das die viralen Strukturgene zur Verfügung stellt die antigenen Epitope der Virushüllen, z. B. das Hauptepitop in VP1, verändert werden. Eine solche Modifikation läßt sich zweckmäßigerweise durch eine Manipulation z. B. der der VP-1-Region und dort wiederum spezifisch an der VP1-kodierenden Sequenz NSAST- KNKDK erreichen.

Das Prinzip einer Tumortherapie mit Interleukinen besteht darin, daß die Expression von z. B. IL-2 in bestimmten suszeptiblen Tumoren dazu führt, daß das Immunsystem für die dieses Gen exprimierenden Zellen aktiviert wird und so Oberflächenantigene, die tumorspezifisch sind, als nichtselbst erkannt werden. Diese Immunsystemaktivierung kann dadurch erfolgen, daß Krebszellen mit dem Gegenstand dieser Erfindung ex vivo behandelt, zerstört und wieder reimplantiert werden oder aber, indem eine in vivo Applikation des attenuierten rekombinanten Poliovirus zur direkten Infektion z. B. solider Tumoren oder aber auch durch systemische Applikation mit nichtsoliden Tumorzellen auf die Zellen appliziert wird.

Durch Modifikation der an der Oberfläche gelegenen Rezeptorbindungsstellen des Virus (s. o.) ist es möglich, ein geändertes Aufnahme- und Bindungsverhalten des rekombinanten Virus zu erreichen.

In diesem Zusammenhang ist auch zu erwähnen, daß prinzipiell auch eine Veränderung der Zielzell population durch Veränderung des entsprechenden virusspezifischen rezeptorbindenden Systems ein Hüllprotein, Bestandteil des Virus, modifiziert wird. (Almond: veränderter VP1 schon patentiert?).

Eine weitere bevorzugte Anwendung der Erfindung ist das Herstellen von Klonen, die für ein Apoptose induzierendes Gen kodieren bzw. für ein sogenanntes Suizid-Gen und deren Oberflächeneigenschaften so verändert sind, daß sie sich speziell an Zellen des Immunsystems binden, die ein bestimmtes Autoanti gen bzw. dessen Epitop erkennen, und diese Zellen infizieren.

Als apoptoseinduzierende Gene können der Rezeptor fas, das Tumorsuppressorgen p53 oder das frühe Adenovirusgen E1A angesehen werden. In diese Richtung zielt auch die Verwendung von TNFα, das ebenfalls apoptotischen und nekrotischen Zelltod hervorruft, sowie die als Suizidgene bekannten Gene TK und CDD. Eine Ausschaltung bestimmter immunologisch relevanter Zellen kann auch durch Anergie induktion mittels der Depletion von primären Rezeptormolekülen (z. B. durch Antisens-Konstrukte) bzw. der rezeptorassoziierten Motive (Reth-Motive) geschehen. Eine Spezifität für derartige Zielzellen kann durch den Austausch des Hauptantigens von VP1 durch das reaktionsauslösende Antigen oder durch gezielte Rezeptorerkennung erreicht werden. Im Fall CD4-tragender Zielzellen bietet sich z. B. das entsprechende Epitop des HI-Virus (gp120-V3) an (s. u.). Derartige Klone können dazu verwendet werden, auf autoimmunreaktive Patienten appliziert zu werden, bevorzugterweise systemisch, und dort die entsprechenden autoimmunreaktiven Zellen zu befallen.

Nach ihrer Infektion wird dort ein Suizid-Gen oder ein Apoptose-induzierendes Gen, was zu einer höheren Spezifität bezüglich der Zielzellen führt, exprimiert. Diese Expression führt dann zum Absterben solcher Zellpopulationen.

Eine weitere bevorzugte Anwendung der Erfindung ist das Herstellen von Klonen, die ebenfalls für Gene kodieren, die zum Absterben der Zielzellen führen. Die Applikation dieser Virusklone, sofern sie zusätzlich noch eine vorgegebene Spezifität für eine Zielzellgruppe z. B. Cd-4 oder Cd-26 tragender Zellen enthalten, ist die Verwendung als Therapeutikum gegen eine schon bestehende HIV-Infektion.

Durch das Abtöten aller potentiellen Zielzellen des HIV-Virus sowie aller Zellen, in die das HIV-Virus schon integriert ist, führt das in der Phase geringer Virusbelastung zu einer Reversion der Infektion und damit einer Heilung der Krankheit (s. o.).

Eine weitere bevorzugte Anwendung ist die Expression antiinflammatorischer Moleküle in der Therapie von Autoimmunopathien, bei denen gewebsdestruierende Mechanismen durch Zytokine das bisherige Therapierepertoire unzureichend erscheinen lassen.

Diese Anwendungen beinhalten auch die nicht-therapeutischen Ansätze in Tierversuchen.

Eine Anwendung der Erfindung und der dazugehörigen Gegenstände der Erfindung besteht daher als erstem Schritt in einem Klonierungsschema, das folgende Schritte umfaßt:
In einem ersten Schritt wird eine doppelsträngige cDNA-Kopie eines RNA-Virus, bevorzugterweise eines attenuierten Poliovirus, bereitgestellt, hergestellt, gewonnen oder anderweitig erworben (Vektor-DNA). Dabei ist darauf zu achten, daß diese cDNA-Kopie in einem prokaryotischen Replikations-System vorliegt.

In einem zweiten Schritt werden, entsprechend der Größe des zu klonierenden Gens, Bereiche aus dem cDNA-Konstrukt herausgeschnitten, die für eine spätere Funktion nicht unbedingt von Nöten sind. Dabei handelt es sich in erster Linie um Sequenzen deren Funktion in trans ersetzbar sind, präferentiell um kodierte Hüllproteine, im Falle des Poliovirus um die Gene VP4, VP3 VP2 und/oder VP1. Dabei ist darauf zu achten, daß die für die Expression in cis nötigen Sequenzen, wie die zur Prozessierung nötigen Erkennungsstellen für die Proteasen, die internen ribosomalen Bindungsstellen und die Polymerasen erhalten bleiben.

In einem weiteren Schritt werden anstelle der herausgeschnittenen Sequenzen passend zurechtgeschnit tene Sequenzen anderer Gene, die zur Expression anstehen, hineinkloniert (Zeichnung und Zeichen erklärung).

In einem weiteren Schritt wird die Transsupplementation mit den entfernten Genen durch einen Helfervirus bzw. eine Helferzell-Linie sichergestellt.

Es ist darauf zu achten, daß das neu in dem viralen Genom zu exprimierende Gen, falls es, was preferen ziell der Fall ist, nach dem Beginn der viruseigenen Kapsidproteine kloniert wird, erst nach einem Stopco don zur Termination dieses viruseigenen Kapsidproteins ferner nach einer geeigneten Internen Ribosoma len Bindungsstelle (internal ribosomal entry site, IRES) und, mit einem eigenen Methionin versehen, zu klonieren ist.

Ferner ist darauf zu achten, daß das zu klonierende Gen mit einem Stopcodon endet und für eine Neuinitiation der Translation der nachfolgenden Strukturen, u. a. der Nicht-Strukturproteine des Virus, eine weitere IRES codiert sein muß, die noch von einem Methionin für die Wiederaufnahme der Translation gefolgt werden muß. Es ist ebenfalls darauf zu achten, daß die neu hinzugefügte Sequenz inklusive der eben erwähnten Struktur etwa in der gleichen Größenordnung bezüglich der Sequenzlänge liegt, wie das entfernte Fragment.

Die entfernten Fragmente, die in trans supplementiert werden sollen, müssen von einem Helfervirus oder preferenziell einer Helferzell-Linie supplementiert werden. Dafür ist dann nötig, für eine ausreichende Transkription in den Helferzellen zu sorgen und es ist darauf zu achten, nicht zu große bzw. zu aktive Teile - z. B. das komplette P1-Fragment, das, wenn es komplett in nennenswerten Mengen exprimiert wird, toxisch für Zellen sein kann - von der Helferzelle in ausreichendem Maße zur Verfügung gestellt wird.

In einem weiteren Schritt wird das replikationsdefekte, rekombinante Poliovirus-Genom hinter eine Transkriptionsstelle eines eukaryotischen Expressionsvektors kloniert und in die Helferzell-Linie z. B. elektroporiert. Eine Expression des rekombinanten Viruskonstrukts in dieser Helferzell-Linie führt dann zum Vorliegen der rekombinanten Poliovirus-RNA, die mit Hilfe der Helferzell-Linie in infektiöse Partikel verpackt wird.

Alternativ dazu kann das rekombinante Poliovirus-Genom hinter einen starken prokaryontischen Promoter kloniert werden, wie z. B. den Promoter des T7- oder SP6-Phagen, anschließend in vitro in RNA trans kribiert werden und diese RNA kann zur Transfektion z. B. der Helferzelle verwendet werden. Auch in diesem Fall resultiert mit Hilfe der Helferzell-Linie, die das rekombinante RNA-Virus-Genom verpackt, eine größere Menge infektiöser rekombinanter Partikel.

Alternativ zu einer Helferzell-Linie kann auch ein Helfervirus verwendet werden, da es aufgrund des Fehlens essentieller Genombereiche nicht mehr in virale Partikel verpackt werden kann. Dabei ist dann darauf zu achten, daß eine Rekombination des Helfervirus und des rekombinanten Expressionsvirus nicht möglich ist.

In einem weiteren Schritt werden die infektiösen Partikel, die das rekombinante Expressionsvirus enthal ten, geerntet. Dazu kann sowohl der Überstand der Zellkultur als auch eventuell noch im Cytoplasma infizierter Zellen befindliche Partikel verwendet werden.

In einem weiteren Schritt werden diese infektiösen Partikel mit rekombinantem Virusgenom zur Infektion von Zielzellen eingesetzt. Dabei kann es sich um in Zellkultur gehaltene Zellen, um Klone, um ex vivo Explantate oder um systemische Applikationen ganzer Organismen handeln.

Beispiel 1 a) Rekombinante Poliovirus Konstrukte zur transienten Expression von Interleukin 2 b) Konstruktion des rekombinanten Poliovirus

Ein Fragment der cDNA eines Sabin 1 Poliovirus (Impfstamm) wird über seine Schnittstellen CeIII und SnaBI rekloniert.

In dieses Fragment wird über Adaptoren und die Schnittstellen MunI und SpeI die cDNA des mensch lichen IL-2 Gens eingesetzt. Die IL-2 kodierende Region ist gefolgt von einer zweiten internal ribosomal entry site (IRES, interne Ribosomenbindungsstelle) des EMC Virus. Diese zweite IRES ist notwendig, um die Translation der für die Vermehrung und Verpackung wichtigen viralen Gene zu gewährleisten. Um sicherzustellen, daß die Bildung von Fusionsproteinen zwischen viralen und nicht-viralen Genen ausgeschlossen ist, liegen vor dieser zweiten IRES Stopcodons in allen drei Leserahmen.

Das erhaltene subgenomische Fragment des Poliovirus mit dem IL-2 Gen und der zweiten IRES wird nun in das ursprüngliche Konstrukt eingefügt. Durch Transkription mit T7 RNA Polymerase läßt sich daraus rekombinante Vollängen-RNA von Poliovirus erhalten.

Dem mit T7 RNA Polymerase transkribierbaren Ausgangsvektor wird für ein weiteres Konstrukt die Nicht-Strukturprotein Sequenzen zwischen der ersten (Pos. 3913) und letzten (Pos. 6770) HincII Stelle entfernt. Das RNA-Transkript dieses Konstrukts stellt bei einer Koinfektion die für die Verpackung nötigen Strukturproteine zur Verfügung. Kotransfektion beider rekombinanter RNAs führt zur Verpac kung der IL-2 kodierenden RNA in Virushüllen und damit zu rekombinanten Polioviren, die wiederum zur Infektion von Tumorzellen verwendet werden.

c) Biopsie

Tumorzellen und Fibroblasten werden durch Biopsie zu einem früheren Zeitpunkt gewonnen und in vitro kultiviert bzw. tiefgekühlt gelagert. Fibroblasten und/oder Tumorzellen werden mit einem geneti schen Konstrukt infiziert, das eine konstitutive Interleukin 2-Sekretion induziert. Vor klinischer Anwen dung werden Fibroblasten und Tumorzellen letal bestrahlt.

d) Präparation der als Vakzine verwendeten ex vivo behandelten Zellen

Tumorzellen und Fibroblasten des Patienten werden in vitro kultiviert. Nach Separation von Stroma zellen werden die Tumorzellen in Aliquots zu 10⁷ Zellen tiefgefroren bei -180°C. Die Fibroblasten werden durch Koinkubation mit einem rekombinanten Poliovirus, der IL-2 exprimiert transfiziert. Die adäquaten Sequenzen innerhalb des Konstrukts wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die von erfolgreich transfizierten Zellen produzierte IL2-Menge wird mit Hilfe eines ELISA gemessen. Die Zellen werden entsprechend den o.a. Mengen tiefgefroren. Vor definitivem klinischen Einsatz werden die Zellen erneut in Kultur genommen und auf Reinheit und Zytokinsekretion geprüft. Die eigentliche Vakzinierung wird nach letaler Bestrahlung der Fibroblasten und Tumorzellen mit 10.000 rad durch geführt.

e) Aufbereitung der als Vakzine verwendeten ex vivo behandelten Zellen

Autologe Tumorzellen und funktionell aktive Zytokin-transfizierte autologe Fibroblasten werden in Flüssigstickstoff konserviert. Einige Tage vor geplanter Impfung werden entsprechend den o.a. Mengen Zellen aufgetaut und expandiert. Die Zytokin-Produktion der Fibroblasten wird erneut im ELISA geprüft, ebenso die Reinheit und Freiheit von Kontaminationen (Bakterien, Pilze, Mykoplasma). Am Tag der Vakzinierung werden die Zellen gezählt und 5 × 10⁶ (bzw. 2 × 10⁷ Zellen in je 0,5 ml PBS aufgenom men. Nach Mischung von autologen Tumorzellen und Fibroblasten in einer 1 ml Spritze werden sie mit 10.000 rad bestrahlt. Die subkutane Applikation erfolgt unmittelbar anschließend.

f) Behandlungsplan

Patienten erhalten mindestens vier Vakzinierungen von letal bestrahlten autologen Tumorzellen und Interleukin 2 sezenierenden Fibroblasten. Die Zellen werden in zwei Dosierungen verabreicht und zwar niedrig dosiert in einer Menge von je 5 × 10⁶ Zellen und hoch dosiert je 2 × 10⁷ Zellen. Beginnend mit dem Niedrig-Dosis-Protokoll werden auf jedem Dosisniveau sieben Patienten behandelt, wobei mit dem Niedrig-Dosis-Protokoll begonnen wird.

Die ersten drei Vakzinierungen werden in zweiwöchigem Abstand gegeben. Eine Booster-Impfung soll zwei Monate nach der letzten Gabe verabreicht werden. Im Falle eines Ansprechens (< 25% Tumor rückbildung) werden die Impfungen vierteljährlich wiederholt mit einer Gesamtbehandlungsdauer von einem Jahr bzw. bis zum erneuten Tumorprogress oder einer kompletten Tumorrezession.

Beispiel 2 a) Rekombinante Poliovirus Konstrukte zur transienten Expression des Apoptose induzierenden fas Gens b) Konstruktion des rekombinanten Poliovirus

In dieses Fragment wird über Adaptoren und die Schnittstellen MunI und SpeI die cDNA des mensch lichen fas Gens eingesetzt. Die für den Rezeptor fas kodierende Region ist gefolgt von einer zweiten IRES des EMC Virus.

Das erhaltene subgenomische Fragment des Poliovirus mit dem fas Gen und der zweiten IRES wird nun in das ursprüngliche Konstrukt eingefügt. Durch Transkription mit T7 RNA Polymerase läßt sich daraus rekombinante Vollängen-RNA von Poliovirus erhalten.

Dem mit T7 RNA Polymerase transkribierbaren Ausgangsvektor wird für ein weiteres Konstrukt die Nicht-Strukturprotein Sequenzen zwischen der ersten (Pos. 3913) und letzten (Pos. 6770) HincII Stelle entfernt. Das RNA-Transkript dieses Konstrukts stellt bei einer Koinfektion die für die Verpackung nötigen Strukturproteine zur Verfügung. Kotransfektion beider rekombinanter RNAs führt zur Verpac kung der fas kodierenden RNA in Virushüllen und damit zu rekombinanten Polioviren, die wiederum zur systemischen Infektion von zu ablatierenden Zellen verwendet werden. Immunzellen, die ein körper eigenes Antigen erkennen, lösen eine Autoimmunerkrankung aus. Epitope eines solchen Autoantigens sind bekannt für den Acetylcholinrezeptor bei Patienten mit Myasthenia gravis, aber auch z. B. für das Myelobasische Protein in der Experimentellen Autoimmunen Encephalitis der Ratte. Solche Epitope werden in die Hauptantigenstelle des Poliovirus an die Stelle der Sequenz NSAST-KNKDK eingesetzt, zu diesem Zweck wird also das Helferkonstrukt, das die Strukturproteine liefert an der entsprechenden Stelle verändert.

Dadurch wird eine speziell bevorzugte Aufnahme des Poliovirus in diese autoreaktiven Lymphocyten erleichtert.

c) Herstellung rekombinanter Viren durch in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase

Durch in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase wird RNA sowohl vom fas exprimierenden, als auch vom Strukturprotein exprimierenden Konstrukt gewonnen. Diese RNA wird durch Elektroporation in Hep-2 Zellen eingebracht. Dort wird dann fas exprimierende rekombinante Virus-RNA in Hüllen, die vom Helferkonstrukt resultieren, verpackt. Die erhaltenen rekombinanten Viren werden zur gerichteten systemischen Infektion verwendet.

d) Präparation der zur Zellablation verwendeten rekombinanten Viren

Nach Abtrennung und säulenchromatographischer Aufreinigung der rekombinanten Viruspräparation werden systemisch relevante, vorher in Tierversuchen zu ermittelnde Dosen an rekombinantem Virus den Patienten i.v. verabreicht.

e) Behandlungsplan

Patienten erhalten mindestens drei Applikationen von fas exprimierenden rekombinanten Polioviren. Die rekombinanten Polioviren werden in zwei Dosierungen verabreicht und zwar niedrig dosiert in einer Menge von je 1 × 10⁶ rekombinanten Viren und hoch dosiert je 2 × 10⁷ Viren.

Die ersten zwei Applikationen werden in zweimonatigem Abstand gegeben. Eine Booster-Impfung soll sechs Monate nach der letzten Gabe verabreicht werden. Im Falle eines Ansprechens werden die Applikationen rekombinanter Polioviren nach einem Jahr wiederholt.

Beispiel 3 a) Rekombinante Poliovirus Konstrukte zur Zelltyp spezifischen Apoptose-Induktion b) Konstruktion des rekombinanten Poliovirus

In dieses Fragment wird über Adaptoren und die Schnittstellen MunI und SpeI die cDNA des mensch lichen p53 Tumorsuppressor-Gens eingesetzt. Die für p53 kodierende Region ist gefolgt von einer zweiten IRES des EMC Virus.

Das erhaltene subgenomische Fragment des Poliovirus mit dem p53 Gen und der zweiten IRES wird nun in das ursprüngliche Konstrukt eingefügt. Durch Transkription mit T7 RNA Polymerase läßt sich daraus rekombinante Vollängen-RNA von Poliovirus erhalten.

Dem mit T7 RNA Polymerase transkribierbaren Ausgangsvektor wird für ein weiteres Konstrukt die Nicht-Strukturprotein Sequenzen zwischen der ersten (Pos. 3913) und letzten (Pos. 6770) HincII Stelle entfernt. Das RNA-Transkript dieses Konstrukts stellt bei einer Koinfektion die für die Verpackung nötigen Strukturproteine zur Verfügung. Kotransfektion beider rekombinanter RNAs führt zur Verpac kung der gp53 kodierenden RNA in Virushüllen und damit zu rekombinanten Polioviren, die wiederum zur systemischen Infektion von zu ablatierenden Zellen verwendet werden. Immunzellen, die CD4 an ihrer Oberfläche exprimieren sind bevorzugte Ziele des HI-Virus. Durch Verwendung eines Teils des CD4-spezifischen HIV-Rezeptor, die Region V3 des HIV Glykoproteins gp120, kann das rekombinante Poliovirus an dieselben Zielzellen wie das HIV gebracht werden. Eine Expression des p53 Gens induziert nun in allen CD4 exprimierenden Zellen und damit allen HIV-Provirus beherbergenden Zellen den Zelltod. Das Epitop der Proteinregion gp120-V3 wird in die Hauptantigenstelle des Poliovirus an die Stelle der Sequenz NSAST-KNKDK eingesetzt, zu diesem Zweck wird also das Helferkonstrukt, das die Strukturproteine liefert an der entsprechenden Stelle verändert.

Dadurch wird eine speziell bevorzugte Aufnahme des rekombinanten Poliovirus in diese CD4-positiven Zellen erleichtert.

Durch in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase wird RNA sowohl vom gp53 exprimierenden, als auch vom Strukturprotein exprimierenden Konstrukt gewonnen. Diese RNA wird durch Elektroporation in Hep-2 Zellen eingebracht. Dort wird dann gp53 exprimierende rekombinante Virus-RNA in Hüllen, die vom Helferkonstrukt resultieren, verpackt. Die erhaltenen rekombinanten Viren werden zur systemischen Infektion verwendet.

d) Präparation der zur Zellablation verwendeten rekombinanten Viren

Nach Abtrennung und säulenchromatographischer Aufreinigung der rekombinanten Viruspräparation werden systemisch relevante, vorher in Tierversuchen zu ermittelnde Dosen an rekombinantem Virus Patienten i.v. verabreicht.

e) Behandlungsplan

Patienten erhalten mindestens vier Applikationen von gp53 exprimierenden rekombinanten Polioviren. Die rekombinanten Viren werden in zwei Dosierungen verabreicht und zwar niedrig dosiert in einer Menge von je 5 × 10⁶ rekombinanten Viren und hoch dosiert je 5 × 10⁷ rekombinanten Viren.

Die ersten zwei Applikationen werden in zweiwöchigem Abstand gegeben. Eine Booster-Impfung soll sechs Monate nach der letzten Gabe verabreicht werden. Im Falle eines Ansprechens (Nachwachsen provirusfreier CD4-tragender Zellen) werden die Impfungen jährlich wiederholt mit einer Gesamtbe handlungsdauer von drei Jahren.

Beispiel 4 a) Rekombinante Polioviruskonstrukte zur Expression antiinflammatorischer Moleküle in Körperzellen b) Konstruktion des rekombinanten Poliovirus

In dieses Fragment wird über Adaptoren und die Schnittstellen MunI und SpeI die cDNA antiinflamma torischer Gene, z. B. der Gene, die für IL-10, IL13, IL-4, TGFβ oder den TNFα-T55-Rezeptor kodieren, eingesetzt. Die für das antiinflammatorische Genprodukt kodierende Region ist gefolgt von einer zweiten IRES des EMC Virus.

Das erhaltene subgenomische Fragment des Poliovirus mit dem antiinflammatorischen Gen und der zweiten IRES wird nun in das ursprüngliche Konstrukt eingefügt. Durch Transkription mit T7 RNA Polymerase läßt sich daraus rekombinante Vollängen-RNA von Poliovirus erhalten.

Durch in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase wird RNA sowohl des antiinflammatorisch wirken den Gens, als auch der virusspezifischen Gene gewonnen. Diese RNA wird durch Elektroporation in Hep-2 Zellen eingebracht. Dort wird dann rekombinante Virus-RNA, die antiinflammatorische Gene exprimiert, in Hüllen, die vom Helferkonstrukt resultieren, verpackt. Die erhaltenen rekombinanten Viren werden zur Infektion von isolierten Körperzellen verwendet.

d) Präparation der zur Entzündungshemmung verwendeten rekombinanten Viren

Nach Abtrennung und säulenchromatographischer Aufreinigung der rekombinanten Viruspräparation werden zuvor ermittelte und festgelegte Dosen an rekombinantem Virus frisch isolierten Körperzellen, z. B. Synoviozyten, bzw. mononukleäre Zellen von Patienten i.vitro infiziert.

e) Behandlungsplan

Patienten erhalten mindestens vier Vakzinierungen von letal bestrahlten autologen Synoviozyten bzw. mononukleäre Zellen, die IL-10 sezenieren. Die Zellen werden in zwei Dosierungen in den Synovial spalt verabreicht und zwar niedrig dosiert in einer Menge von je 5 × 10⁶ Zellen und hoch dosiert je 2 × 10⁷ Zellen. Beginnend mit dem Niedrig-Dosis-Protokoll werden auf jedem Dosisniveau sieben Patien ten behandelt, wobei mit dem Niedrig-Dosis-Protokoll begonnen wird.

Die ersten zwei Vakzinierungen werden in dreimonatigem Abstand gegeben. Eine weitere Booster- Impfung soll drei Monate nach der letzten Gabe verabreicht werden. Im Falle eines Ansprechens können die Impfungen wiederholt werden.

Beispiel 5 a) Konstruktionsprinzip eines GMCSF Expression

b) Die Fig. 1-5 geben einen Überblick über das Konstruktionsprinzip am Beispiel einer GMCSF Expression. Als Ausgangsvektor für die rekombinanten Virusgenome wird der Serotyp 1 (Sabin1) des attenuierten Poliovirus verwendet. Fig. 1 zeigt den Bauplan des Impfvirus Sabin 1, Fig. 2 das rekombinante Virus, das GMCSF exprimiert und Fig. 3 den Bauplan eines Helferkonstrukts, das bei Koinfektion in eine geeignete Zell-Linie (z. B. Hep-2) zur Verpackung der in vitro transkribierten RNA des Konstrukts (Fig. 2) führt. Wird eine nicht-menschliche Zell-Linie verwendet, so können nach der Verpackung die rekombinanten infektiösen Partikel aufgrund des Fehlens passender Akzeptieren an der Oberfläche dieser Zell-Linie nicht readsorbieren werden. In beiden Fällen wird dabei das Gen VP-2 und das Gen VP-3 als ein kontinuierliches Protein exprimiert, da es, nach Infektion mit rekombinantem virus, durch die vom rekombinatem Expressionsvirus expremierten Proteasen passend prozessiert wird.

In beiden Fällen werden die infektiösen rekombinanten Partikel entsprechend GMP-Richtlinien aufge reinigt bevor eine Applikation am Patienten erfolgt.

Claims

1. Verfahren zur spezifischen Expression von Genen bzw. Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein von einem RNA-Virus abgeleitetes Vektorsystem, vorzugsweise vom Poliovirusgenom, dazu verwendet wird, die Expression eines in dieses Vektorsystem klonierten Gens nach Infektion von eukaryontischen Zellen zu gewährleisten. Diese zum Expressionsvektor umgestalteten Viren sind noch infektiös, jedoch nicht mehr vermehrungsfähig und bedürfen der Ergänzung der fehlenden Genomteile bzw. deren Expressionsprodukte durch z. B. ein Helfervirus bzw. eine Helferzell-Linie. Die erfindungsgemäße Expression ist bevorzugt transient, da die Expressionsvektoren nicht in das Genom der Wirtszelle integrieren.

2. RNA-Virus-Vektorsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß keine Integration des Vektorsystems in das Genom der Zielzelle, der Zielzellen oder von Nicht-Zielzellen erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Ausgangsvirus nicht-eigene Sequenz eine Antissenz- oder Ribozymsequenz gegen ein zelleigenes oder gegen ein virales RNA- Molekül oder DNA-Molekül darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch das Verfahren eine Expression eines Gens erreicht wird, das dem Ausgangsvirus nicht zu eigen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression eines fremden Genes durch Deletion eines Teils der kodierenden Sequenz, vorzugsweise der Strukturproteine-kodierenden Sequenz und durch Einfügen einer geeigneten cDNA-Sequenz erreicht wird.

6. Gewährleistung der Expression eines Gens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß diesem Gen eine interne ribosomale Bindungsstelle, vorzugsweise des Enzephalomyokarditis-Virus, des Poliovirus, des Foot-and-Mouth-Disease-Virus oder des Hepatitis-C-Virus vorgeschaltet ist.

7. Gewährleistung der Expression der dem Ausgangsvirus nicht-eigenen Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den auf die viruseigene Sequenz folgenden Bereichen eine interne ribosomale Bindungsstelle vorgeschaltet wird, vorzugsweise durch das Enzephalomyokarditis-Virus, das Poliovirus, das Foot-and-Mouth-Disease Virus oder das Hepatitis Cvirus oder durch Einführung eines neuen Methionin-Startcodons.

8. Ergänzung der für das Ausgangsvirus nach Anspruch 1 erforderlichen Gene, dadurch gekennzeichnet, daß diese Gene ganz oder in Teilen von einem oder mehreren Helfersystemen exprimiert werden oder exprimiert werden können.

9. Verwendung eines Helfersystems nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß auch ein anderes virales System als Helfersystem verwendet werden kann, es muß sich dabei nicht ebenfalls um ein RNA-Virussystem handeln.

10. Exprimierendes Helfersystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei diesem Helfersystem um ein transient oder permanent in eukaryontischen Zellen exprimiertes Helfersystem handelt.

11. Ein Helfersystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Zell-Linie handelt, die permanent die genannten Genomsequenzen des Ausgangs-Poliovirus exprimiert.

12. RNA-Virus-Vektorsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der dem Ausgangsvirus nicht-eigenen Sequenzen nicht permanent erfolgt.

13. RNA-Virus-Vektorsystem nach Anspruch 1 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Gegenstände in einem Kit eingebracht vorliegen.

14. Verfahren zur Genexpression nach Anspruch 1, die mindestens einen der Gegenstände der An sprüche 1 bis 11 verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur in vitro Expression dieser Gene eine Zellkultur verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Gene in Zellkulturen der Synthese von Proteinen dient.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine in vivo Expression der Gene in Zellkultur herbeigeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß diese Expression zu phenotypischen oder serologischen oder anderen Änderungen der Charakteristika dieser Zellen bzw. Zell-Linien führt. Diese Expression kann ebenfalls der Proteinproduktion dienen.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine ex vivo Veränderung von Körper zellen stattfindet.

20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren an Mensch oder Tier angewendet werden kann.

21 Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine ex vivo Behandlung von Zellen erfolgt.

22. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine systemische Applikation des infektiösen Virusvektorsystems erfolgt.

23. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß isolierte Organe oder Organbestandteile, Gewebe oder Gewebebestandteile oder Kulturen davon einer Behandlung mit dem Vektorsystem unterzogen werden.