DE4225094A1 - Medikament zur gentherapeutischen behandlung von menschen, tieren und pflanzen, insbesondere zur blockierung der virenvermehrung und der tumorgene sowie verfahren zur herstellung des medikaments - Google Patents
Medikament zur gentherapeutischen behandlung von menschen, tieren und pflanzen, insbesondere zur blockierung der virenvermehrung und der tumorgene sowie verfahren zur herstellung des medikamentsInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Medikament zur
gentherapeutischen Behandlung von Menschen, Tieren und
Pflanzen, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung
und der Tumorgene sowie auf ein Verfahren zur Herstellung des
Medikaments.
Im menschlichen und tierischen Körper werden Krankheiten
unter anderem durch Viren hervorgerufen. Eine besondere
Stellung nehmen Retroviren ein. Bei ihnen handelt es sich um
einzelsträngige RNA-Viren, die über eine doppelsträngige DNA-
Form repliziert und exprimiert werden. Diese DNA-Form wird
von dem Virus-Enzym Reverse Transcriptase synthetisiert.
Viele Retrovieren tragen Onkogene. Auch die erworbene
Schwäche des Immunsystems - AIDS (Acquired-Immune-Deficiency-
Syndrome) - bei der die Patienten an einer fortschreitenden
Schwächung des Immunsystems sterben, wird in Zusammenhang mit
einer Infektion durch ein Retrovirus gebracht.
Zur Bekämpfung der Retroviren versucht man, in fertige
Retroviren einzugreifen. Einer Retrovirenvermehrung begegnet
man bisher beispielsweise durch Chemotherapie, bei der
Cytostatika eingesetzt werden, die den Virenzyklus hemmen
sollen. Gegenwärtig scheint die Reverse Transcriptase ein
gutes Ziel antiviraler Therapie zu sein, beispielsweise mit
Hilfe von AZT (Azidothymidin).
Die Nachteile der bekannten Therapie bestehen darin, daß
verschiedene Formen von Nebenwirkungen unvermeidlich sind,
die den therapierten Patienten stark belasten, und darin, daß
viele Krankheiten zwar in ihrem Verlauf verlangsamt, jedoch
nicht geheilt werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Medikament,
insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und zur
Blockierung der Tumorgene sowie ein Verfahren zur Herstellung
des Medikaments zu schaffen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die in den Ansprüchen
aufgeführten Merkmale gelöst.
Die Erfindung weist gegenüber dem Bekannten die Vorteile auf,
daß beim therapierten Patienten belastende Nebenwirkungen
kaum auftreten und Krankheiten überwunden werden können. Die
Therapie besteht in einer Impfung, die der Patient wie andere
Impfungen empfindet. Daneben wird das Immunsystem im Kampf
gegen andere, virale Infektionen unterstützt. Dieser Vorteil
macht sich besonders bei der Behandlung der
Immunschwächekrankheit AIDS bemerkbar, da Sekundärinfektionen
wirksam bekämmft werden können. Um ein Höchstmaß an
Effektivität bei der gleichzeitigen Bekämpfung mehrerer
Virenarten zu gewährleisten, ist es möglich, an sich bekannte
gegenläufige DNA- oder RNA-Sequenzen so zu kombinieren, daß
eine Polyselektivität gegenüber einer Vielzahl von Viren
erreicht wird.
Es ist pränatale Retroviren-Immunisierung möglich, wobei jede
Körperzelle des entstehenden Organismus - also jede Nerven-,
Muskel- und Immunzelle - gegen Retroviren immun gemacht
werden kann. Es wird eine Resistenz erreicht, die jede
medikamentöse Behandlung gegen Retroviren überflüssig macht.
Die Immunität wird sogar auf Nachkommen weitervererbt. Das
Medikament ist gegen die meisten Mutationen der zu
bekämpfenden Viren gepuffert, weil sich geringe Unterschiede
in der jeweiligen gegenläufigen Sequenz nicht merklich
auswirken, da die Hybridisierung dadurch nicht unterbunden
wird.
Ein Vorteil des Verfahrens zur Herstellung des Medikaments
besteht darin, daß das Medikament schnell und in größeren
Mengen herstellbar ist, und daß das gleiche Verfahren auf
sämtliche Virenarten anwendbar ist. Die Gene wurden bei den
meisten Virenarten mit Hinblick auf die Basensequenzen
bereits analysiert, so daß Spezifizierungen, wie Start- und
Stopcodons und Spleißsequenzen, mittels elektronischer
Datenverarbeitung auf dem Antisense-Strang ohne größeren
Forschungsaufwand lokalisierbar sind.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus
den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung
hervor.
Hat ein Retrovirus eine Zelle infiziert, wird seine RNA
(Ribonukleinsäure) durch reverse Transcription in DNA
(Desoxyribonukleinsäure) umgeschrieben, und diese DNA wird
danach in das Genom der Wirtszelle integriert. Normalerweise
wird nur einer von zwei Strängen in einem vorgegebenen Anteil
der Doppelhelix in mRNA (Messenger-RNA oder Boten-RNA)
übersetzt. Für ein gegebenes Gen ist dies immer der Leit-
Strang. Wird ein geklontes Gen künstlich so hergestellt, daß
nur der Folgestrang transkribiert wird, erhält man als
Ergebnis eine gegenläufige mRNA, deren Sequenz komplementär
zu den normalen mRNA-Transcripten ist. Wird gegenläufige mRNA
in ausreichend großer Menge sythetisiert, kann sie mit der
ursprünglichen normalen mRNA hybridisieren und die Synthese
der entsprechenden Proteine verhindern. Sind diese Proteine
für das Überleben des lytischen und temperenten Zyklus der
Retroviren unverzichtbar, werden die beschriebenen Mutationen
innerhalb des Wirtszellengenoms den Aufbau weiterer,
pathogener Viren verhindern.
Gibt man darüberhinaus den Anteil des DNA-Folgestrangs zur
Transcription frei und hebt dadurch indirekt die Wirkung des
entsprechenden DNA-Leitstrangs auf, der für die ursprüngliche
mRNA kodiert, die ihrerseits für die Reverse Transcriptase
kodiert, so wird
- 1) die Revertase in der Bildung gehemmt,
- 2) der gegenläufige mRNA-Revertase-Strang unmittelbar in die Zelle eintretende Virusgenome fest anbinden, und
- 3) eine weitere Inaktivierung der Retroviren zustandekommen.
Wird die Revertase in der Bildung gehemmt, steht sie den
neusynthetisierten mRNA-Strängen des Retrovirus nicht mehr
zur Verfügung. Das inaktiviert die Viren und raubt ihnen die
Fähigkeit, andere Zellen zu infizieren und sich in das
Wirtsgenom einzubauen. Bindet der gegenläufige
mRNA-Revertase-Strang unmittelbar in die Zelle eintretende
Virusgenome fest an, so wird die Translation neuer Reverser
Transcriptase verhindert. Eine weitere Inaktivierung der
Retroviren erfolgt dadurch, daß die entstandene Doppelhelix
in der Zelle des Gens der Reversen Transcriptase an dem mRNA-
Strang, der das Virusgenom darstellt, den Einbau in
Proteinhüllen verhindert, weil sie nur einen beschränkten
Raum zur Verfügung stellen. Ebenso wird eine spezifische
Anordnung des Virengenoms unterbunden, die für die Virulenz
unerläßlich wäre.
Die vorstehend beschriebenen Vorgänge werden dadurch
unterstützt, daß weitere, gegenläufige Gene spezieller
Retroviren in das Wirtsgenom eingebaut werden, die dann
ebenfalls an die Retrovirengenome - hier ganz speziell auf
einen bestimmten Virus bezogen - komplementär binden und so
die Synthese von Proteinhüllen der Viren hemmen.
Gleichermaßen kann man mit Oncogenen und Virusgenomen
verfahren.
Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, auch die Gene von DNA-
Viren zu hemmen, nachdem sie in das Wirtsgenom eingebaut
wurden, oder wenn sie in den lytischen Zyklus eintreten.
Führt man die Hemmung der Revertase durch, kann man durchaus
sicher sein, daß keine wichtigen Stoffwechselprozesse des
Wirtes gestört werden, weil die Revertase in der Zelle
keinerlei Funktion hat und somit die gegenläufige mRNA keine
Hybridisierung mit wirtszelleigenen mRNA-Strängen bildet. Die
Revertase übersetzt mit einer Fehlerquote von 1:104 bp
(bp=Basenpaare der Nukleinsäure) auch fehlerhaft
transkribierte mRNA des normalen Wirtsgenoms wieder in DNA
um, die dann - in das Wirtsgenom eingebaut - dieses
verfälschen kann. Dies ist ein möglicher Grund für die
unvorstellbare Größe des eukaryontischen Genoms, für die
vielen Repetitiven Sequenzen und für die
Familienähnlichkeiten von Proteinen.
Es sind aber die mRNA-Synthetisierungen der Wirtszellen zu
beachten, die bei ihrem Aufbau und vor allem in ihrer
Funktion auf keinen Fall gestört werden dürfen, weil es
andernfalls zu erheblichen Entwicklungsstörungen kommen
könnte.
Im Verlauf der geschilderten Evolution entstehen nämlich neue
Gene durch Duplikation und Zerfall alter Gene sowie durch
Wiederverwendung von Teilen alter Gene in neuen
Kombinationen.
Aus diesem Grund besitzen die meisten Gene eine Familie nahe
verwandter Gene an anderen Stellen im Genom. Einige von ihnen
besitzen vermutlich ähnliche Funktionen.
Dieses Problem ist aber bei den für Mensch und Tier
gefährlicheren Retroviren, die nur schwer zu bekämpfen sind,
nicht in großem Umfang gegeben, weil die Reverse
Transcriptase ausschließlich ein Enzym der Retroviren ist,
weil nur sie RNA in DNA umschreiben müssen.
Dieses hochspezifische, aus Proteinen zusammengesetzte Enzym
hat deshalb eine Aminosäuresequenz und von da her eine mRNA-
Sequenz, die nur der Reversen Transcriptase eigen ist. Somit
sind Hybridisierungen mit wirtszelleigenen mRNA-Strängen kaum
erreichbar. So verhält es sich auch bei anderen
Virusgenabschnitten.
Die richtige Paarung der komplementären Basenpaare beruht
vermutlich auf Zufall. Dementsprechend muß das Gen für den
gegenläufigen Strang einen sehr starken Promotor, also eine
spezielle DNA-Sequenz, bekommen, damit auch genügend
entsprechende mRNA gebildet wird. Der Promotor enthält sowohl
den Startpunkt für die RNA-Synthese, als auch die
Information, wo sie beginnen soll. Der Promotor sorgt auch
dafür, daß die Konzentration der mRNA innerhalb der Zelle
hoch genug ist, um ausreichende Abwehrkraft gegen
eindringende Viren zu gewährleisten.
Es ist vorteilhaft, Promotoren zu verwenden, die ihre
Bindefähigkeit bezüglich der RNA-Polymerase II durch Zugabe
einer chemischen Verbindung sehr verstärken oder sie
vollkommen verlieren, um eine Kontrolle der Genaktivität von
außen zu ermöglichen.
Die Prozessierung des primären Transcriptes führt zu
folgenden Problemen:
- a) Die "Cap"-Struktur, die aus einem 7-Methylguanosinrest und einem daran gekoppelten Triphosphat besteht, wird zwar an das während der Transcription zuerst sythetisierte 5′-Ende, des primären Transcriptes angehängt, hemmt aber nicht die Hybridisierung,
- b) der Spleißmechanismus kann umgangen werden, indem die dafür zuständigen Signalsequenzen beim gegenläufigen Gen umkodiert werden,
- c) die Synthese eines Poly-A-Schwanzes an das 3′-Ende wird durch Umkodierung der Sequenz AUAAA (auf dem codogenen Strang TATTT), die diese Synthese einleitet, verhindert, und
- d) im künstlichen, gegenläufigen Gen müssen zusätzlich terminierende Sequenzen für die Polymerase II, z. B. in Form einer Haarnadelstruktur, eingebaut werden, damit die Polymerisation des primären Transcripts beendet werden kann.
Eine weitere Erhöhung der Konzentration der gegenläufigen
mRNA ist durch die Häufigkeit der entsprechenden DNA-Sequenz
im Genom zu erreichen.
Zur Behandlung der erworbenen Schwäche des Immunsystems -
AIDS (Acquired-Immune-Deficiency-Syndrome) - ist eine große
Menge gegenläufige DNA oder gegenläufige RNA nötig, die zur
akuten Behandlung notwendig ist. In vitro können beliebig
viel gegenläufige mRNA oder gegenläufige DNA aus Folgestrang-
DNA durch Zugabe von RNA-DNA-Polymerase und der nötigen
Bausteine gewonnen werden. Man kann ausgewählte DNA-
Abschnitte im Reagenzglas mit einer Polymerase-Kettenreaktion
klonieren.
In einem ersten Schritt wird der Körper zunächst mit
gegenläufiger mRNA-Revertase oder den allgemeinen
entsprechenden, gegenläufigen Genen überschwemmt, die durch
spezielle Modifikation die Plasmamembrane der Zelle
durchtritt. Dadurch wird der Virenzyklus sofort unterbrochen.
Weitere Synthese und weitere Infektion sind unterbunden. Das
Immunsystem kann sich stabilisieren und die Viren bekämpfen.
Da das gegenläufige Gen der Revertase auch in nicht
infizierte Zellen eingebracht wird, wird dieses Gen vom
Starpunkt der normalen Transcription aus an den Enden eines
jeden 150 Basenpaaren langen Intervalls durch den Austausch
der sich dort befindenden Base durch die entsprechende
komplementäre Base entsprechend verändert, um sämtliche
Möglichkeiten einer Expression der Revertase in diesen Zellen
zu verhindern.
In den Zellen, in denen Revertase auf Grund von Infektion
bereits vorhanden ist, wird die gegenläufige mRNA-Revertase
durch die Revertase selbst in gegenläufige DNA-Revertase
umgeschrieben. Ist letztere in hinreichender Menge vorhanden,
kann die DNA-Revertase so in das Wirtsgenom eingebaut werden,
daß sie mit großer Sicherheit vor die wirtseigenen Promotoren
gelangt und dann selbständig gegenläufige RNA-Revertase
bildet. In anderen Fällen entstehen Repetitive Sequenzen mit
den oben beschriebenen Folgen. Das gleiche gilt auch für
andere Genabschnitte im Virusgenom.
Ein zweiter Schritt besteht darin, permeabel gemachte
gegenläufige DNA-Revertase in den Körper einzubringen, die
nur bei Zellteilung jeweils in das Genom der Zellen eingebaut
werden kann. Diese Behandlung muß jeweils über einen so
langen Zeitraum durchgeführt werden, daß alle sich mitotisch
teilenden Zellen erreicht werden. Auf diese Weise werden die
Keimzellen ebenfalls künstlich mutiert, wodurch dann eine
Retrovirus-Immunisierung bei den Nachkommen erfolgt. Damit
kann auch die Virusinfektion der Nachkommen unterbunden
werden. Die erforderliche DNA-Menge läßt sich durch
Genklonierung erzeugen.
Sind die sich nicht mehr teilenden Nervenzellen bereits
angegriffen, ist eine lebenslange Therapie mit gegenläufiger
mRNA notwendig, weil das oben beschriebene Verfahren nur
während der Zellteilung wirksam ist. Infizierte Zellen, die
sich nicht mehr teilen, produzieren ein Leben lang pathogene
Viren.
Mit der Zeit werden so die genomintegrierten Proviren durch
zufällige Mutation zerstört und aus der Keimbahn entfernt
werden. Hierdurch werden humanpathogene Viren mehr und mehr
verdrängt werden. Das AIDS- und das Krebsrisiko nimmt für den
einzelnen Menschen und seine Nachkommen beständig ab.
Ein gewisses Problem stellt die Transduktion von mRNA und DNA
in die Eukaryontenzelle dar, wobei die Plasmamembranen die
Barriere bilden, die es zu überwinden gilt.
Eine sehr gute Möglichkeit, die infizierten Zellen im
Organismus zu finden und selektiv zu behandeln, besteht
darin, die Virenproteinhüllen selbst als Träger einzusetzen.
In die Virenproteinhüllen wird nicht das intakte Virusgenom,
sondern das genetische Material, nämlich ihre eigenen
gegenläufigen Nukleinsäuren und gegebenenfalls bestimmte
Enzyme eingetragen, die dann hochselektiv in die betroffenen
Zellen eingebracht werden. Somit sind auch sich nicht mehr
mitotisch teilende Zellen behandelbar. Weil die gegenläufige,
komplementäre Virus-RNA in ihrer Länge mit der ursprünglichen
Virus-RNA übereinstimmt, gibt es in den dazugehörigen Viren-
Proteinhüllen keinerlei Platzprobleme, bezogen auf das
gesamte, umgeschriebene Genom.
Ein weiterer Ansatz zur Permeation der Zellmembrane ist die
konvalente Bindung von bestimmten, chemischen Verbindungen an
die Enden der Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise durch eine
Phosphatbrücke, wie bei der "Cap"-Struktur, die aus einem 7-
Methylguanosinrest und einem daran gekoppelten Triphosphat
besteht, die leicht durch ein beliebiges, bekanntes Enzym
abhydrolysiert und abgebaut werden können.
Eine Verstärkung der Bindung der kodierenden, viralen mRNA
mit der gegenläufigen mRNA, die zur akuten Behandlung
eingesetzt wird, kann durch spezielle chemische Gruppen oder
Verbindungen gewährleistet werden.
So könnten auch Doppelstrang-Retroviren, die ja auch
irgendwann beim Eintritt in die Zelle einsträngig vorliegen
müssen, ausgeschaltet werden, denn die gegenläufige mRNA
bindet so fest an den Strang, daß sie weder durch thermische
noch durch enzymatische Spaltung getrennt werden können. Der
Komplex besteht so lange, bis die mRNA des Virus zerfällt
oder abgebaut wird, während die langlebigere, durch bestimmte
Komplexe stabilisierte gegenläufige mRNA eine neue Paarung
eingehen kann und einen künstlichen Biokatalysator darstellt.
Wird gegenläufige DNA in die Zellen eingebracht, gestaltet
man diese DNA vorzugsweise wie ein transponierbares Element,
wodurch sich die DNA leichter in das Genom integriert, sich
dort bewegen und möglicherweise vervielfachen kann. Die
Wahrscheinlichkeit ist relativ groß, daß dieses Element, das
einen starken Promotor besitzen sollte, in eine Gruppe
aktiver Gene (Operon-Modell) integriert wird. Die gleiche
Wirkung erzielt man, wird der DNA-Strang in LTR-Sequenzen
eingebettet, wie es bei Viren allgemein der Fall ist.
Oben wurde bereits auf eine Art pränataler Retroviren-
Immunisierung in Zusammenhang mit der AIDS-Bekämpfung
hingewiesen.
Bei einem anderen Verfahren wird die befruchtete Eizelle
(Zygote) mit gegenläufiger DNA versetzt. Damit ist jede
Körperzelle des entstehenden Organismus - also jede Nerven-,
Muskel- und Immunzelle - gegen Retroviren immun. Es wird eine
Resistenz erreicht, die jede medikamentöse Behandlung gegen
Retroviren überflüssig macht. Die Immunität wird auch auf
Nachkommen weitervererbt.
Das beschriebene Medikament eignet sich zur Anwendung bei
allen Pro- und Eukaryonten, also sowohl bei Ein- als auch
Vielzellern, also Menschen, Tiere und Pflanzen. Es eignet
sich sowohl zur prophylaktischen Schutzimpfung, wie auch zur
akuten Behandlung.
Es wird der Self-assembly- Mechanismus eingesetzt, um die
spezifizierten Antisense-RNA- oder DNA-Stränge und die
entsprechenden Enzyme in den entsprechenden, geeigneten
Virushüllen zu integrieren, um diese Virushüllen als
Transportmittel und Einschleusungsmittel in die jeweiligen
betroffenen Zellen mit den entsprechenden Rezeptoren
aufzufinden.
Diese Selbstorganisation oder Selbstordnung durch
thermodynamische Gesetzmäßigkeiten und/oder kinetische
Determinationen, d. h. vom Reaktionsweg abghängige Reaktionen,
verursacht, ist die Eigenschaft von komplizierten
biologischen Strukturen, die sich aus makromolekularen
Bausteinen von selbst zusammensetzen. Die Fähigkeit zur
Selbstorganisation bedeutet, daß bereits in den
Makromolekülen die Information dazu ausreicht, um die
richtige Virusstruktur festzulegen. Genau diese Fähigkeit ist
demnach allen Viren beim Aufbau ihrer vollständigen Struktur
eigen. Entscheidend für den eigenständigen
Virusstrukturaufbau ist nur das äußere Medium, also der
entsprechende pH-Wert, günstige Temperaturverhältnisse, die
richtige Ionenkonzentration und die Zugabe von geeigneten
Enzymen.
Will man nun Antisense-RNA oder -DNA in einer geeigneten
Virusproteinhülle unterbringen, so schält man zuvor die
ursprüngliche RNA oder DNA in vitro heraus, indem man z. B.
den pH-Wert verändert, so daß die Hülle in ihre
Proteinbestandteile zerfällt. Nun kann man die ursprüngliche
RNA oder DNA aus der Lösung entfernen. Nun gibt man die
entsprechenden Antisensegene zu diesen Proteinbausteinen
dazu, die - wie oben erwähnt - den gleichen Raumbedarf haben,
wie die ursprüngliche Erbinformation.
Da die meisten Viren ihre eigenen Enzyme schon fertiggestellt
mit in ihrer Hülle integriert haben, ist man folglich in der
Lage diese Enzyme oder gegebenenfalls andere Stoffe auch in
diese Lösung zu geben.
Wird der pH-Wert z. B. wieder in den Ausgangszustand gebracht,
so kommt es zu der oben beschriebenen Self-assembly-Reaktion,
bei der die Virushülle um die Nukleinsäuren bzw. um die
Enzyme herum aufgebaut wird.
Kloniert man nun vorher die zu bekämpfenden Viren, so kann
man beliebig große Virusmengen mit Antisensegenen als
Medikament industriell herstellen.
Dieses Herstellungsverfahren muß an jede Virenart bezüglich
des äußeren Mediums angepaßt werden. Der Vorteil des
Verfahrens besteht darin, daß es auf alle Virenarten
anwendbar ist.
Alle nachfolgenden Verfahrensschritte laufen in vitro (im
Reagenzglas) ab.
- a) Ausgangspunkt ist ein Virus, gegen den eine Resistenz durch die Herstellung eines gentherapeutischen Medikaments ermöglicht werden soll.
- b) Durch Veränderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentration und durch Zugabe von Enzymen wird die Virushülle abgebaut.
- c) Es erfolgt die Extraktion der viralen RNA.
- d) Zu der einzelsträngigen viralen RNA wird Reverse Transcriptase hinzugegeben (unter Berücksichtigung aller anderen wichtigen Komponenten, wie pH-Wert etc.).
- e) Ein RNA-DNA-Hybrid entsteht, der nach Waschen mit DNA-Polymerase versetzt wird. Letztere ersetzt die RNA durch DNA.
- f) Eine DNA-Doppelhelix entsteht, die dem Provirusgenom des Retrovirus entspricht. Dieser ist noch befähigt, normale virale RNA zu bilden. Werden DNA-Viren verwendet, können die Schritte (b) bis einschließlich (e) übergangen werden.
- g) Durch Zugabe geeigneter Restriktionsenzyme wird das Virusgenom so zerschnitten, daß viruseigene Promotoren herausgeschnitten und künstliche Promotoren integriert werden können, die die Transcription auf dem Folgestrang und somit die Herstellung der gegenläufigen RNA gewährleisten. Gleichermaßen wird mit Spleißsequenzen, Start- und Stopcodons verfahren.
- h) Zum Abschluß der Synthese der gegenläufigen DNA wird Ligase, ein Enzym, das neu kombinierte DNA-Fragmente fest verknüpft, zugegeben, wodurch die an den Sticky Ends zusammengelagerten DNA-Fragmente zu einer stabilen Doppelhelix verbunden werden.
i) Die DNA-Doppelhelix wird erhitzt und dadurch in ihre
Stränge zerlegt.
- j) Die Stränge läßt man dann mit zwei, im Überschuß vorhandenen, chemisch sythetisierten DNA-Oligonukleotiden hybridisieren, die jeweils 15 bis 20 Nukleotide lang und in ihrer Sequenz zu zwei Abschnitten passen, die durch beliebig viele Nukleotide getrennt sind. Die beiden Oligonukleotide dienen als spezifische Primer für die in vitro-Synthese der DNA, die von der DNA-Polymerase katalysiert wird.
- k) Nach Zugabe der DNA-Polymerase und den für die DNA-Synthese wichtigen Komponenten, wie z. B. Triphosphatnukleotide, kopiert dieses Enzym die DNA zwischen den Sequenzen, die den Oligonukleotiden entsprechen.
- l) Nach mehreren der Verfahrensschritte (i) bis einschließlich (k) liegt die gewünschte DNA-Sequenz, die gegenläufige DNA in großer Menge vor. Durch die Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction - PCR) kann man DNA-Sequenzen beliebiger Länge über eine Million mal vervielfältigen.
m) Ein Virus, dessen Proteinhülle als Transportmittel für
die entsprechende gegenläufige DNA geeignet ist, wird durch
pH-Wert-, Ionenkonzentrations- und Temperaturänderungen in
die elementaren Bausteine der Virushülle und in das virale
Erbgut zerlegt.
- n) Das virale Erbgut wird durch Enzyme zerstört und ausgewaschen.
- o) Die gereinigten, viralen Hüllelementarproteine werden mit dem gegenläufigen RNA- bzw. DNA-Strang inkubiert.
- p) Zur abschließenden Fertigstellung des Medikaments setzt sich die Virushülle im geeigneten Milieu um den gegenläufigen RNA- bzw. DNA-Strang zusammen (self assembly).
q) Ausgehend von dem Verfahrensschritt (1) versetzt man die
gegenläufige DNA mit RNA-Polymerase und anderen, für die
Transcription wichtigen Komponenten, wie z. B.
Triphosphatnukleotide. Die RNA-Polymerase produziert laufend
neue gegenläufige Einzelstrang-RNA in großen Mengen.
Claims (20)
1. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung von Menschen,
Tieren und Pflanzen, insbesondere zur Blockierung der
Virenvermehrung und der Tumorgene, dadurch gekennzeichnet,
daß
- a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, insgesamt eingebettet in LTRs,
- b) Virushüllen, geeignet für die Größe des Antisense-Genoms, das in die Zellen transferiert werden soll, und geeignet für die spezifische Aufnahme dieser Virushüllen in die angestrebten Zielzellen und
- c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.
2. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung, insbesondere
zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene,
dadurch gekennzeichnet, daß
- a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, strukturiert als transponierbare Elemente,
- b) Virushüllen, geeignet für die Größe des Antisense-Genoms, das in die Zellen transferiert werden soll, und geeignet für die spezifische Aufnahme dieser Virushüllen in die angestrebten Zielzellen und
- c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.
3. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung, insbesondere
zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene,
adurch gekennzeichnet, daß
- a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, insgesamt eingebettet in LTRs,
- b) rezeptorspezifische Substanzen, an die gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA gebunden sind, die in die Zellen transferiert werden sollen, und geeignet für die spezifische Aufnahme in die angestrebten Zielzellen und
- c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.
4. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung, insbesondere
zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene,
dadurch gekennzeichnet, daß
- a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, strukturiert als transponierbare Elemente,
- b) rezeptorspezifische Substanzen, an die gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA gebunden sind, die in die Zellen transferiert werden sollen, und geeignet für die spezifische Aufnahme in die angestrebten Zielzellen und
- c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.
5. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß der Spleißmechanismus umgangen wird,
indem die dafür zuständigen Signalsequenzen beim
gegenläufigen Gen umkodiert werden.
6. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß an sich bekannte gegenläufige DNA- oder
RNA-Sequenzen so kombiniert sind, daß eine Polyselektivität
gegenüber einer Vielzahl von Viren erreicht wird.
7. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sequenz des das die Reverse
Transcriptase exprimirenden Gens für alle Retroviren sich von
der bekannten Sequenz vom Startpunkt der normalen
Transcription aus an den Enden eines jeden 150 Basenpaaren
langen Intervalls durch den Austausch der sich dort
befindenden Base durch die entsprechende, komplementäre Base
unterscheidet.
8. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Sequenz der DNA-Doppelhelix des das
die Reverse Transcriptase exprimirenden Gens für alle
Retroviren sich von der bekannten Sequenz vom Startpunkt der
normalen Transcription aus an den Enden eines jeden 150
Basenpaaren langen Intervalls durch den Austausch der sich
dort befindenden Basen durch die entsprechende, komplementäre
Base unterscheidet.
9. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß Promotoren verwendet werden, die ihre
Bindefähigkeit bezüglich der RNA-Polymerase II durch Zugabe
einer chemischen Verbindung sehr verstärken.
10. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß Promotoren verwendet werden, die ihre
Bindefähigkeit bezüglich der RNA-Polymerase II durch Zugabe
einer chemischen Verbindung vollkommen verlieren.
11. Verfahren zur Herstellung des Medikaments nach einem der
Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die in vitro (im
Reagenzglas) ablaufenden Verfahrensschritte:
- a) Ausgangspunkt ist ein Virus, gegen den eine Resistenz durch die Herstellung eines gentherapeutischen Medikaments ermöglicht werden soll.
- b) Durch Veränderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentration und durch Zugabe von Enzymen wird die Virushülle abgebaut.
- c) Es erfolgt die Extraktion der viralen RNA.
- d) Zu der einzelsträngigen viralen RNA wird Reverse Transcriptase hinzugegeben (unter Berücksichtigung aller anderen wichtigen Komponenten, wie pH-Wert etc.).
- e) Ein RNA-DNA-Hybrid entsteht, der nach Waschen mit DNA- Polymerase versetzt wird. Letztere ersetzt die RNA durch DNA.
- f) Eine DNA-Doppelhelix entsteht, die dem Provirusgenom des Retrovirus entspricht. Dieser ist noch befähigt, normale virale RNA zu bilden. Werden DNA-Viren verwendet, können die Schritte (b) bis einschließlich (e) übergangen werden.
- g) Durch Zugabe geeigneter Restriktionsenzyme wird das Virusgenom so zerschnitten, daß viruseigene Promotoren herausgeschnitten und künstliche Promotoren integriert werden können, die die Transcription auf dem Folgestrang und somit die Herstellung der gegenläufigen RNA gewährleisten. Gleichermaßen wird mit Spleißsequenzen, Start- und Stopcodons verfahren.
- h) Zum Abschluß der Synthese der gegenläufigen DNA wird Ligase, ein Enzym, das neu kombinierte DNA-Fragmente fest verknüpft, zugegeben, wodurch die an den Sticky Ends zusammengelagerten DNA-Fragmente zu einer stabilen Doppelhelix verbunden werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch
Vervielfältigung der in vivo und in vitro ablaufenden
Verfahrensschritte:
- i) Die DNA-Doppelhelix wird erhitzt und dadurch in ihre Stränge zerlegt.
- j) Die Stränge läßt man dann mit zwei, im Überschuß vorhandenen, chemisch sythetisierten DNA-Oligonukleotiden hybridisieren, die jeweils 15 bis 20 Nukleotide lang und in ihrer Sequenz zu zwei Abschnitten passen, die durch beliebig viele Nukleotide getrennt sind. Die beiden Oligonukleotide dienen als spezifische Primer für die in vitro-Synthese der DNA, die von der DNA-Polymerase katalysiert wird.
- k) Nach Zugabe der DNA-Polymerase und den für die DNA-Synthese wichtigen Komponenten, wie z. B. Triphosphatnukleotide, kopiert dieses Enzym die DNA zwischen den Sequenzen, die den Oligonukleotiden entsprechen.
- l) Nach mehreren der Verfahrensschritte (i) bis einschließlich (k) liegt die gewünschte DNA-Sequenz, die gegenläufige DNA in großer Menge vor. Durch die Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction - PCR) kann man DNA-Sequenzen beliebiger Länge über eine Million mal vervielfältigen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 und 12,
gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte zur Integration
der gegenläufigen Erbinformation zu den ursprünglichen Viren
in die geeigneten Virenproteinhüllen:
- m) Ein Virus, dessen Proteinhülle als Transportmittel für die entsprechende gegenläufige DNA geeignet ist, wird durch pH-Wert-, Ionenkonzentrations- und Temperaturänderungen in die elementaren Bausteine der Virushülle und in das virale Erbgut zerlegt.
- n) Das virale Erbgut wird durch Enzyme zerstört und ausgewaschen.
- o) Die gereinigten, viralen Hüllelementarproteine werden mit dem gegenläufigen DNA-Strang inkubiert.
- p) Zur abschließenden Fertigstellung des Medikaments setzt sich die Virushülle im geeigneten Milieu um das gegenläufige Gen zusammen (self assembly).
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, daß ausgehend von dem Verfahrensschritt (1)
die gegenläufige DNA mit RNA-Polymerase und anderen, für die
Transcription wichtigen Komponenten versetzt wird, wie z. B.
Triphosphatnukleotide.
15. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß spezifizierte, zum Virusgenom
gegenläufige RNA - durch bestimmte Komplexe stabilisiert -
seine Wirkung als Biokatalysator entfaltet.
16. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und 15,
dadurch gekennzeichnet, daß spezifizierte, zum Virusgenom
gegenläufige DNA vorzugsweise wie ein transponierbares
Element gestaltet ist.
17. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 und
16, dadurch gekennzeichnet, daß die befruchtete Eizelle
(Zygote) mit spezifizierter, zum Virusgenom gegenläufiger DNA
versetzt ist.
18. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 bis
17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament Flüssigform
aufweist.
19. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 bis
17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament Gelatineform
aufweist.
20. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 bis
17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament Tablettenform
hat.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP9200923 | 1992-04-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4225094A1 true DE4225094A1 (de) | 1993-11-04 |
Family
ID=8165650
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4225094A Ceased DE4225094A1 (de) | 1992-04-28 | 1992-07-29 | Medikament zur gentherapeutischen behandlung von menschen, tieren und pflanzen, insbesondere zur blockierung der virenvermehrung und der tumorgene sowie verfahren zur herstellung des medikaments |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4225094A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19503082A1 (de) * | 1995-02-01 | 1996-08-08 | Univ Ludwigs Albert | Gegenstand und Verfahren zur bevorzugt transienten Expression und möglichen Translation spezifischer RNA im cytoplasmatischen Bereich höherer eukaryontischer Zellen |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990013641A1 (en) * | 1989-05-10 | 1990-11-15 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter |
DE3990262T1 (de) * | 1988-03-21 | 1991-04-04 | Viagene Inc | Rekombinante retroviren |
WO1991004753A1 (en) * | 1989-10-02 | 1991-04-18 | Cetus Corporation | Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof |
WO1992017211A1 (en) * | 1991-04-05 | 1992-10-15 | Edison Animal Biotechnology Center, Ohio University | Retrovirus inhibition with antisense nucleic acids complementary to packaging sequences |
-
1992
- 1992-07-29 DE DE4225094A patent/DE4225094A1/de not_active Ceased
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