DE4225094A1

DE4225094A1 - Medikament zur gentherapeutischen behandlung von menschen, tieren und pflanzen, insbesondere zur blockierung der virenvermehrung und der tumorgene sowie verfahren zur herstellung des medikaments

Info

Publication number: DE4225094A1
Application number: DE4225094A
Authority: DE
Inventors: Frank Andreas Harald Meyer; Michael Cyrus Nassiri
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-04-28
Filing date: 1992-07-29
Publication date: 1993-11-04

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Medikament zur gentherapeutischen Behandlung von Menschen, Tieren und Pflanzen, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene sowie auf ein Verfahren zur Herstellung des Medikaments.

Im menschlichen und tierischen Körper werden Krankheiten unter anderem durch Viren hervorgerufen. Eine besondere Stellung nehmen Retroviren ein. Bei ihnen handelt es sich um einzelsträngige RNA-Viren, die über eine doppelsträngige DNA- Form repliziert und exprimiert werden. Diese DNA-Form wird von dem Virus-Enzym Reverse Transcriptase synthetisiert. Viele Retrovieren tragen Onkogene. Auch die erworbene Schwäche des Immunsystems - AIDS (Acquired-Immune-Deficiency- Syndrome) - bei der die Patienten an einer fortschreitenden Schwächung des Immunsystems sterben, wird in Zusammenhang mit einer Infektion durch ein Retrovirus gebracht.

Zur Bekämpfung der Retroviren versucht man, in fertige Retroviren einzugreifen. Einer Retrovirenvermehrung begegnet man bisher beispielsweise durch Chemotherapie, bei der Cytostatika eingesetzt werden, die den Virenzyklus hemmen sollen. Gegenwärtig scheint die Reverse Transcriptase ein gutes Ziel antiviraler Therapie zu sein, beispielsweise mit Hilfe von AZT (Azidothymidin).

Die Nachteile der bekannten Therapie bestehen darin, daß verschiedene Formen von Nebenwirkungen unvermeidlich sind, die den therapierten Patienten stark belasten, und darin, daß viele Krankheiten zwar in ihrem Verlauf verlangsamt, jedoch nicht geheilt werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Medikament, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und zur Blockierung der Tumorgene sowie ein Verfahren zur Herstellung des Medikaments zu schaffen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die in den Ansprüchen aufgeführten Merkmale gelöst.

Die Erfindung weist gegenüber dem Bekannten die Vorteile auf, daß beim therapierten Patienten belastende Nebenwirkungen kaum auftreten und Krankheiten überwunden werden können. Die Therapie besteht in einer Impfung, die der Patient wie andere Impfungen empfindet. Daneben wird das Immunsystem im Kampf gegen andere, virale Infektionen unterstützt. Dieser Vorteil macht sich besonders bei der Behandlung der Immunschwächekrankheit AIDS bemerkbar, da Sekundärinfektionen wirksam bekämmft werden können. Um ein Höchstmaß an Effektivität bei der gleichzeitigen Bekämpfung mehrerer Virenarten zu gewährleisten, ist es möglich, an sich bekannte gegenläufige DNA- oder RNA-Sequenzen so zu kombinieren, daß eine Polyselektivität gegenüber einer Vielzahl von Viren erreicht wird.

Es ist pränatale Retroviren-Immunisierung möglich, wobei jede Körperzelle des entstehenden Organismus - also jede Nerven-, Muskel- und Immunzelle - gegen Retroviren immun gemacht werden kann. Es wird eine Resistenz erreicht, die jede medikamentöse Behandlung gegen Retroviren überflüssig macht. Die Immunität wird sogar auf Nachkommen weitervererbt. Das Medikament ist gegen die meisten Mutationen der zu bekämpfenden Viren gepuffert, weil sich geringe Unterschiede in der jeweiligen gegenläufigen Sequenz nicht merklich auswirken, da die Hybridisierung dadurch nicht unterbunden wird.

Ein Vorteil des Verfahrens zur Herstellung des Medikaments besteht darin, daß das Medikament schnell und in größeren Mengen herstellbar ist, und daß das gleiche Verfahren auf sämtliche Virenarten anwendbar ist. Die Gene wurden bei den meisten Virenarten mit Hinblick auf die Basensequenzen bereits analysiert, so daß Spezifizierungen, wie Start- und Stopcodons und Spleißsequenzen, mittels elektronischer Datenverarbeitung auf dem Antisense-Strang ohne größeren Forschungsaufwand lokalisierbar sind.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung hervor.

Medikament

Hat ein Retrovirus eine Zelle infiziert, wird seine RNA (Ribonukleinsäure) durch reverse Transcription in DNA (Desoxyribonukleinsäure) umgeschrieben, und diese DNA wird danach in das Genom der Wirtszelle integriert. Normalerweise wird nur einer von zwei Strängen in einem vorgegebenen Anteil der Doppelhelix in mRNA (Messenger-RNA oder Boten-RNA) übersetzt. Für ein gegebenes Gen ist dies immer der Leit- Strang. Wird ein geklontes Gen künstlich so hergestellt, daß nur der Folgestrang transkribiert wird, erhält man als Ergebnis eine gegenläufige mRNA, deren Sequenz komplementär zu den normalen mRNA-Transcripten ist. Wird gegenläufige mRNA in ausreichend großer Menge sythetisiert, kann sie mit der ursprünglichen normalen mRNA hybridisieren und die Synthese der entsprechenden Proteine verhindern. Sind diese Proteine für das Überleben des lytischen und temperenten Zyklus der Retroviren unverzichtbar, werden die beschriebenen Mutationen innerhalb des Wirtszellengenoms den Aufbau weiterer, pathogener Viren verhindern.

Gibt man darüberhinaus den Anteil des DNA-Folgestrangs zur Transcription frei und hebt dadurch indirekt die Wirkung des entsprechenden DNA-Leitstrangs auf, der für die ursprüngliche mRNA kodiert, die ihrerseits für die Reverse Transcriptase kodiert, so wird

1) die Revertase in der Bildung gehemmt,
2) der gegenläufige mRNA-Revertase-Strang unmittelbar in die Zelle eintretende Virusgenome fest anbinden, und
3) eine weitere Inaktivierung der Retroviren zustandekommen.

Wird die Revertase in der Bildung gehemmt, steht sie den neusynthetisierten mRNA-Strängen des Retrovirus nicht mehr zur Verfügung. Das inaktiviert die Viren und raubt ihnen die Fähigkeit, andere Zellen zu infizieren und sich in das Wirtsgenom einzubauen. Bindet der gegenläufige mRNA-Revertase-Strang unmittelbar in die Zelle eintretende Virusgenome fest an, so wird die Translation neuer Reverser Transcriptase verhindert. Eine weitere Inaktivierung der Retroviren erfolgt dadurch, daß die entstandene Doppelhelix in der Zelle des Gens der Reversen Transcriptase an dem mRNA- Strang, der das Virusgenom darstellt, den Einbau in Proteinhüllen verhindert, weil sie nur einen beschränkten Raum zur Verfügung stellen. Ebenso wird eine spezifische Anordnung des Virengenoms unterbunden, die für die Virulenz unerläßlich wäre.

Die vorstehend beschriebenen Vorgänge werden dadurch unterstützt, daß weitere, gegenläufige Gene spezieller Retroviren in das Wirtsgenom eingebaut werden, die dann ebenfalls an die Retrovirengenome - hier ganz speziell auf einen bestimmten Virus bezogen - komplementär binden und so die Synthese von Proteinhüllen der Viren hemmen.

Gleichermaßen kann man mit Oncogenen und Virusgenomen verfahren.

Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, auch die Gene von DNA- Viren zu hemmen, nachdem sie in das Wirtsgenom eingebaut wurden, oder wenn sie in den lytischen Zyklus eintreten.

Führt man die Hemmung der Revertase durch, kann man durchaus sicher sein, daß keine wichtigen Stoffwechselprozesse des Wirtes gestört werden, weil die Revertase in der Zelle keinerlei Funktion hat und somit die gegenläufige mRNA keine Hybridisierung mit wirtszelleigenen mRNA-Strängen bildet. Die Revertase übersetzt mit einer Fehlerquote von 1:10⁴ bp (bp=Basenpaare der Nukleinsäure) auch fehlerhaft transkribierte mRNA des normalen Wirtsgenoms wieder in DNA um, die dann - in das Wirtsgenom eingebaut - dieses verfälschen kann. Dies ist ein möglicher Grund für die unvorstellbare Größe des eukaryontischen Genoms, für die vielen Repetitiven Sequenzen und für die Familienähnlichkeiten von Proteinen.

Es sind aber die mRNA-Synthetisierungen der Wirtszellen zu beachten, die bei ihrem Aufbau und vor allem in ihrer Funktion auf keinen Fall gestört werden dürfen, weil es andernfalls zu erheblichen Entwicklungsstörungen kommen könnte.

Im Verlauf der geschilderten Evolution entstehen nämlich neue Gene durch Duplikation und Zerfall alter Gene sowie durch Wiederverwendung von Teilen alter Gene in neuen Kombinationen.

Aus diesem Grund besitzen die meisten Gene eine Familie nahe verwandter Gene an anderen Stellen im Genom. Einige von ihnen besitzen vermutlich ähnliche Funktionen.

Dieses Problem ist aber bei den für Mensch und Tier gefährlicheren Retroviren, die nur schwer zu bekämpfen sind, nicht in großem Umfang gegeben, weil die Reverse Transcriptase ausschließlich ein Enzym der Retroviren ist, weil nur sie RNA in DNA umschreiben müssen.

Dieses hochspezifische, aus Proteinen zusammengesetzte Enzym hat deshalb eine Aminosäuresequenz und von da her eine mRNA- Sequenz, die nur der Reversen Transcriptase eigen ist. Somit sind Hybridisierungen mit wirtszelleigenen mRNA-Strängen kaum erreichbar. So verhält es sich auch bei anderen Virusgenabschnitten.

Die richtige Paarung der komplementären Basenpaare beruht vermutlich auf Zufall. Dementsprechend muß das Gen für den gegenläufigen Strang einen sehr starken Promotor, also eine spezielle DNA-Sequenz, bekommen, damit auch genügend entsprechende mRNA gebildet wird. Der Promotor enthält sowohl den Startpunkt für die RNA-Synthese, als auch die Information, wo sie beginnen soll. Der Promotor sorgt auch dafür, daß die Konzentration der mRNA innerhalb der Zelle hoch genug ist, um ausreichende Abwehrkraft gegen eindringende Viren zu gewährleisten.

Es ist vorteilhaft, Promotoren zu verwenden, die ihre Bindefähigkeit bezüglich der RNA-Polymerase II durch Zugabe einer chemischen Verbindung sehr verstärken oder sie vollkommen verlieren, um eine Kontrolle der Genaktivität von außen zu ermöglichen.

Die Prozessierung des primären Transcriptes führt zu folgenden Problemen:

a) Die "Cap"-Struktur, die aus einem 7-Methylguanosinrest und einem daran gekoppelten Triphosphat besteht, wird zwar an das während der Transcription zuerst sythetisierte 5′-Ende, des primären Transcriptes angehängt, hemmt aber nicht die Hybridisierung,
b) der Spleißmechanismus kann umgangen werden, indem die dafür zuständigen Signalsequenzen beim gegenläufigen Gen umkodiert werden,
c) die Synthese eines Poly-A-Schwanzes an das 3′-Ende wird durch Umkodierung der Sequenz AUAAA (auf dem codogenen Strang TATTT), die diese Synthese einleitet, verhindert, und
d) im künstlichen, gegenläufigen Gen müssen zusätzlich terminierende Sequenzen für die Polymerase II, z. B. in Form einer Haarnadelstruktur, eingebaut werden, damit die Polymerisation des primären Transcripts beendet werden kann.

Eine weitere Erhöhung der Konzentration der gegenläufigen mRNA ist durch die Häufigkeit der entsprechenden DNA-Sequenz im Genom zu erreichen.

Zur Behandlung der erworbenen Schwäche des Immunsystems - AIDS (Acquired-Immune-Deficiency-Syndrome) - ist eine große Menge gegenläufige DNA oder gegenläufige RNA nötig, die zur akuten Behandlung notwendig ist. In vitro können beliebig viel gegenläufige mRNA oder gegenläufige DNA aus Folgestrang- DNA durch Zugabe von RNA-DNA-Polymerase und der nötigen Bausteine gewonnen werden. Man kann ausgewählte DNA- Abschnitte im Reagenzglas mit einer Polymerase-Kettenreaktion klonieren.

In einem ersten Schritt wird der Körper zunächst mit gegenläufiger mRNA-Revertase oder den allgemeinen entsprechenden, gegenläufigen Genen überschwemmt, die durch spezielle Modifikation die Plasmamembrane der Zelle durchtritt. Dadurch wird der Virenzyklus sofort unterbrochen. Weitere Synthese und weitere Infektion sind unterbunden. Das Immunsystem kann sich stabilisieren und die Viren bekämpfen.

Da das gegenläufige Gen der Revertase auch in nicht infizierte Zellen eingebracht wird, wird dieses Gen vom Starpunkt der normalen Transcription aus an den Enden eines jeden 150 Basenpaaren langen Intervalls durch den Austausch der sich dort befindenden Base durch die entsprechende komplementäre Base entsprechend verändert, um sämtliche Möglichkeiten einer Expression der Revertase in diesen Zellen zu verhindern.

In den Zellen, in denen Revertase auf Grund von Infektion bereits vorhanden ist, wird die gegenläufige mRNA-Revertase durch die Revertase selbst in gegenläufige DNA-Revertase umgeschrieben. Ist letztere in hinreichender Menge vorhanden, kann die DNA-Revertase so in das Wirtsgenom eingebaut werden, daß sie mit großer Sicherheit vor die wirtseigenen Promotoren gelangt und dann selbständig gegenläufige RNA-Revertase bildet. In anderen Fällen entstehen Repetitive Sequenzen mit den oben beschriebenen Folgen. Das gleiche gilt auch für andere Genabschnitte im Virusgenom.

Ein zweiter Schritt besteht darin, permeabel gemachte gegenläufige DNA-Revertase in den Körper einzubringen, die nur bei Zellteilung jeweils in das Genom der Zellen eingebaut werden kann. Diese Behandlung muß jeweils über einen so langen Zeitraum durchgeführt werden, daß alle sich mitotisch teilenden Zellen erreicht werden. Auf diese Weise werden die Keimzellen ebenfalls künstlich mutiert, wodurch dann eine Retrovirus-Immunisierung bei den Nachkommen erfolgt. Damit kann auch die Virusinfektion der Nachkommen unterbunden werden. Die erforderliche DNA-Menge läßt sich durch Genklonierung erzeugen.

Sind die sich nicht mehr teilenden Nervenzellen bereits angegriffen, ist eine lebenslange Therapie mit gegenläufiger mRNA notwendig, weil das oben beschriebene Verfahren nur während der Zellteilung wirksam ist. Infizierte Zellen, die sich nicht mehr teilen, produzieren ein Leben lang pathogene Viren.

Mit der Zeit werden so die genomintegrierten Proviren durch zufällige Mutation zerstört und aus der Keimbahn entfernt werden. Hierdurch werden humanpathogene Viren mehr und mehr verdrängt werden. Das AIDS- und das Krebsrisiko nimmt für den einzelnen Menschen und seine Nachkommen beständig ab.

Ein gewisses Problem stellt die Transduktion von mRNA und DNA in die Eukaryontenzelle dar, wobei die Plasmamembranen die Barriere bilden, die es zu überwinden gilt.

Eine sehr gute Möglichkeit, die infizierten Zellen im Organismus zu finden und selektiv zu behandeln, besteht darin, die Virenproteinhüllen selbst als Träger einzusetzen. In die Virenproteinhüllen wird nicht das intakte Virusgenom, sondern das genetische Material, nämlich ihre eigenen gegenläufigen Nukleinsäuren und gegebenenfalls bestimmte Enzyme eingetragen, die dann hochselektiv in die betroffenen Zellen eingebracht werden. Somit sind auch sich nicht mehr mitotisch teilende Zellen behandelbar. Weil die gegenläufige, komplementäre Virus-RNA in ihrer Länge mit der ursprünglichen Virus-RNA übereinstimmt, gibt es in den dazugehörigen Viren- Proteinhüllen keinerlei Platzprobleme, bezogen auf das gesamte, umgeschriebene Genom.

Ein weiterer Ansatz zur Permeation der Zellmembrane ist die konvalente Bindung von bestimmten, chemischen Verbindungen an die Enden der Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise durch eine Phosphatbrücke, wie bei der "Cap"-Struktur, die aus einem 7- Methylguanosinrest und einem daran gekoppelten Triphosphat besteht, die leicht durch ein beliebiges, bekanntes Enzym abhydrolysiert und abgebaut werden können.

Eine Verstärkung der Bindung der kodierenden, viralen mRNA mit der gegenläufigen mRNA, die zur akuten Behandlung eingesetzt wird, kann durch spezielle chemische Gruppen oder Verbindungen gewährleistet werden.

So könnten auch Doppelstrang-Retroviren, die ja auch irgendwann beim Eintritt in die Zelle einsträngig vorliegen müssen, ausgeschaltet werden, denn die gegenläufige mRNA bindet so fest an den Strang, daß sie weder durch thermische noch durch enzymatische Spaltung getrennt werden können. Der Komplex besteht so lange, bis die mRNA des Virus zerfällt oder abgebaut wird, während die langlebigere, durch bestimmte Komplexe stabilisierte gegenläufige mRNA eine neue Paarung eingehen kann und einen künstlichen Biokatalysator darstellt.

Wird gegenläufige DNA in die Zellen eingebracht, gestaltet man diese DNA vorzugsweise wie ein transponierbares Element, wodurch sich die DNA leichter in das Genom integriert, sich dort bewegen und möglicherweise vervielfachen kann. Die Wahrscheinlichkeit ist relativ groß, daß dieses Element, das einen starken Promotor besitzen sollte, in eine Gruppe aktiver Gene (Operon-Modell) integriert wird. Die gleiche Wirkung erzielt man, wird der DNA-Strang in LTR-Sequenzen eingebettet, wie es bei Viren allgemein der Fall ist.

Oben wurde bereits auf eine Art pränataler Retroviren- Immunisierung in Zusammenhang mit der AIDS-Bekämpfung hingewiesen.

Bei einem anderen Verfahren wird die befruchtete Eizelle (Zygote) mit gegenläufiger DNA versetzt. Damit ist jede Körperzelle des entstehenden Organismus - also jede Nerven-, Muskel- und Immunzelle - gegen Retroviren immun. Es wird eine Resistenz erreicht, die jede medikamentöse Behandlung gegen Retroviren überflüssig macht. Die Immunität wird auch auf Nachkommen weitervererbt.

Das beschriebene Medikament eignet sich zur Anwendung bei allen Pro- und Eukaryonten, also sowohl bei Ein- als auch Vielzellern, also Menschen, Tiere und Pflanzen. Es eignet sich sowohl zur prophylaktischen Schutzimpfung, wie auch zur akuten Behandlung.

Es wird der Self-assembly- Mechanismus eingesetzt, um die spezifizierten Antisense-RNA- oder DNA-Stränge und die entsprechenden Enzyme in den entsprechenden, geeigneten Virushüllen zu integrieren, um diese Virushüllen als Transportmittel und Einschleusungsmittel in die jeweiligen betroffenen Zellen mit den entsprechenden Rezeptoren aufzufinden.

Diese Selbstorganisation oder Selbstordnung durch thermodynamische Gesetzmäßigkeiten und/oder kinetische Determinationen, d. h. vom Reaktionsweg abghängige Reaktionen, verursacht, ist die Eigenschaft von komplizierten biologischen Strukturen, die sich aus makromolekularen Bausteinen von selbst zusammensetzen. Die Fähigkeit zur Selbstorganisation bedeutet, daß bereits in den Makromolekülen die Information dazu ausreicht, um die richtige Virusstruktur festzulegen. Genau diese Fähigkeit ist demnach allen Viren beim Aufbau ihrer vollständigen Struktur eigen. Entscheidend für den eigenständigen Virusstrukturaufbau ist nur das äußere Medium, also der entsprechende pH-Wert, günstige Temperaturverhältnisse, die richtige Ionenkonzentration und die Zugabe von geeigneten Enzymen.

Will man nun Antisense-RNA oder -DNA in einer geeigneten Virusproteinhülle unterbringen, so schält man zuvor die ursprüngliche RNA oder DNA in vitro heraus, indem man z. B. den pH-Wert verändert, so daß die Hülle in ihre Proteinbestandteile zerfällt. Nun kann man die ursprüngliche RNA oder DNA aus der Lösung entfernen. Nun gibt man die entsprechenden Antisensegene zu diesen Proteinbausteinen dazu, die - wie oben erwähnt - den gleichen Raumbedarf haben, wie die ursprüngliche Erbinformation.

Da die meisten Viren ihre eigenen Enzyme schon fertiggestellt mit in ihrer Hülle integriert haben, ist man folglich in der Lage diese Enzyme oder gegebenenfalls andere Stoffe auch in diese Lösung zu geben.

Wird der pH-Wert z. B. wieder in den Ausgangszustand gebracht, so kommt es zu der oben beschriebenen Self-assembly-Reaktion, bei der die Virushülle um die Nukleinsäuren bzw. um die Enzyme herum aufgebaut wird.

Kloniert man nun vorher die zu bekämpfenden Viren, so kann man beliebig große Virusmengen mit Antisensegenen als Medikament industriell herstellen.

Dieses Herstellungsverfahren muß an jede Virenart bezüglich des äußeren Mediums angepaßt werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß es auf alle Virenarten anwendbar ist.

Verfahren zur Herstellung des Medikaments Synthese der in vivo und in vitro gegenläufige RNA herstellenden gegenläufigen DNA (gegenläufiges Genom)

Alle nachfolgenden Verfahrensschritte laufen in vitro (im Reagenzglas) ab.

a) Ausgangspunkt ist ein Virus, gegen den eine Resistenz durch die Herstellung eines gentherapeutischen Medikaments ermöglicht werden soll.
b) Durch Veränderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentration und durch Zugabe von Enzymen wird die Virushülle abgebaut.
c) Es erfolgt die Extraktion der viralen RNA.
d) Zu der einzelsträngigen viralen RNA wird Reverse Transcriptase hinzugegeben (unter Berücksichtigung aller anderen wichtigen Komponenten, wie pH-Wert etc.).
e) Ein RNA-DNA-Hybrid entsteht, der nach Waschen mit DNA-Polymerase versetzt wird. Letztere ersetzt die RNA durch DNA.
f) Eine DNA-Doppelhelix entsteht, die dem Provirusgenom des Retrovirus entspricht. Dieser ist noch befähigt, normale virale RNA zu bilden. Werden DNA-Viren verwendet, können die Schritte (b) bis einschließlich (e) übergangen werden.
g) Durch Zugabe geeigneter Restriktionsenzyme wird das Virusgenom so zerschnitten, daß viruseigene Promotoren herausgeschnitten und künstliche Promotoren integriert werden können, die die Transcription auf dem Folgestrang und somit die Herstellung der gegenläufigen RNA gewährleisten. Gleichermaßen wird mit Spleißsequenzen, Start- und Stopcodons verfahren.
h) Zum Abschluß der Synthese der gegenläufigen DNA wird Ligase, ein Enzym, das neu kombinierte DNA-Fragmente fest verknüpft, zugegeben, wodurch die an den Sticky Ends zusammengelagerten DNA-Fragmente zu einer stabilen Doppelhelix verbunden werden.

Vervielfältigung der in vivo und in vitro gegenläufige RNA herstellenden gegenläufigen DNA (gegenläufiges Genom)

i) Die DNA-Doppelhelix wird erhitzt und dadurch in ihre Stränge zerlegt.

j) Die Stränge läßt man dann mit zwei, im Überschuß vorhandenen, chemisch sythetisierten DNA-Oligonukleotiden hybridisieren, die jeweils 15 bis 20 Nukleotide lang und in ihrer Sequenz zu zwei Abschnitten passen, die durch beliebig viele Nukleotide getrennt sind. Die beiden Oligonukleotide dienen als spezifische Primer für die in vitro-Synthese der DNA, die von der DNA-Polymerase katalysiert wird.
k) Nach Zugabe der DNA-Polymerase und den für die DNA-Synthese wichtigen Komponenten, wie z. B. Triphosphatnukleotide, kopiert dieses Enzym die DNA zwischen den Sequenzen, die den Oligonukleotiden entsprechen.
l) Nach mehreren der Verfahrensschritte (i) bis einschließlich (k) liegt die gewünschte DNA-Sequenz, die gegenläufige DNA in großer Menge vor. Durch die Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction - PCR) kann man DNA-Sequenzen beliebiger Länge über eine Million mal vervielfältigen.

Integration der gegenläufigen Erbinformation zu den ursprünglichen Viren in die geeigneten Virenproteinhüllen

m) Ein Virus, dessen Proteinhülle als Transportmittel für die entsprechende gegenläufige DNA geeignet ist, wird durch pH-Wert-, Ionenkonzentrations- und Temperaturänderungen in die elementaren Bausteine der Virushülle und in das virale Erbgut zerlegt.

n) Das virale Erbgut wird durch Enzyme zerstört und ausgewaschen.
o) Die gereinigten, viralen Hüllelementarproteine werden mit dem gegenläufigen RNA- bzw. DNA-Strang inkubiert.
p) Zur abschließenden Fertigstellung des Medikaments setzt sich die Virushülle im geeigneten Milieu um den gegenläufigen RNA- bzw. DNA-Strang zusammen (self assembly).

Produktion großer Mengen gegenläufiger Einzelstrang-RNA

q) Ausgehend von dem Verfahrensschritt (1) versetzt man die gegenläufige DNA mit RNA-Polymerase und anderen, für die Transcription wichtigen Komponenten, wie z. B. Triphosphatnukleotide. Die RNA-Polymerase produziert laufend neue gegenläufige Einzelstrang-RNA in großen Mengen.

Claims

1. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung von Menschen, Tieren und Pflanzen, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene, dadurch gekennzeichnet, daß

a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, insgesamt eingebettet in LTRs,
b) Virushüllen, geeignet für die Größe des Antisense-Genoms, das in die Zellen transferiert werden soll, und geeignet für die spezifische Aufnahme dieser Virushüllen in die angestrebten Zielzellen und
c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.

2. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene, dadurch gekennzeichnet, daß

a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, strukturiert als transponierbare Elemente,
b) Virushüllen, geeignet für die Größe des Antisense-Genoms, das in die Zellen transferiert werden soll, und geeignet für die spezifische Aufnahme dieser Virushüllen in die angestrebten Zielzellen und
c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.

3. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene, adurch gekennzeichnet, daß

a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, insgesamt eingebettet in LTRs,
b) rezeptorspezifische Substanzen, an die gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA gebunden sind, die in die Zellen transferiert werden sollen, und geeignet für die spezifische Aufnahme in die angestrebten Zielzellen und
c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.

4. Medikament zur gentherapeutischen Behandlung, insbesondere zur Blockierung der Virenvermehrung und der Tumorgene, dadurch gekennzeichnet, daß

a) gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA mit jeweils vorgeschalteten, geeigneten Promotoren, strukturiert als transponierbare Elemente,
b) rezeptorspezifische Substanzen, an die gegenläufige Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA gebunden sind, die in die Zellen transferiert werden sollen, und geeignet für die spezifische Aufnahme in die angestrebten Zielzellen und
c) zur Unterstützung der Integration gegenläufiger Viren-RNA und/oder Viren- oder Onkogen-DNA geeignete Enzyme oder chemische Verbindungen vorgesehen sind.

5. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Spleißmechanismus umgangen wird, indem die dafür zuständigen Signalsequenzen beim gegenläufigen Gen umkodiert werden.

6. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß an sich bekannte gegenläufige DNA- oder RNA-Sequenzen so kombiniert sind, daß eine Polyselektivität gegenüber einer Vielzahl von Viren erreicht wird.

7. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des das die Reverse Transcriptase exprimirenden Gens für alle Retroviren sich von der bekannten Sequenz vom Startpunkt der normalen Transcription aus an den Enden eines jeden 150 Basenpaaren langen Intervalls durch den Austausch der sich dort befindenden Base durch die entsprechende, komplementäre Base unterscheidet.

8. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der DNA-Doppelhelix des das die Reverse Transcriptase exprimirenden Gens für alle Retroviren sich von der bekannten Sequenz vom Startpunkt der normalen Transcription aus an den Enden eines jeden 150 Basenpaaren langen Intervalls durch den Austausch der sich dort befindenden Basen durch die entsprechende, komplementäre Base unterscheidet.

9. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Promotoren verwendet werden, die ihre Bindefähigkeit bezüglich der RNA-Polymerase II durch Zugabe einer chemischen Verbindung sehr verstärken.

10. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Promotoren verwendet werden, die ihre Bindefähigkeit bezüglich der RNA-Polymerase II durch Zugabe einer chemischen Verbindung vollkommen verlieren.

11. Verfahren zur Herstellung des Medikaments nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die in vitro (im Reagenzglas) ablaufenden Verfahrensschritte:

a) Ausgangspunkt ist ein Virus, gegen den eine Resistenz durch die Herstellung eines gentherapeutischen Medikaments ermöglicht werden soll.
b) Durch Veränderung des pH-Wertes, der Ionenkonzentration und durch Zugabe von Enzymen wird die Virushülle abgebaut.
c) Es erfolgt die Extraktion der viralen RNA.
d) Zu der einzelsträngigen viralen RNA wird Reverse Transcriptase hinzugegeben (unter Berücksichtigung aller anderen wichtigen Komponenten, wie pH-Wert etc.).
e) Ein RNA-DNA-Hybrid entsteht, der nach Waschen mit DNA- Polymerase versetzt wird. Letztere ersetzt die RNA durch DNA.
f) Eine DNA-Doppelhelix entsteht, die dem Provirusgenom des Retrovirus entspricht. Dieser ist noch befähigt, normale virale RNA zu bilden. Werden DNA-Viren verwendet, können die Schritte (b) bis einschließlich (e) übergangen werden.
g) Durch Zugabe geeigneter Restriktionsenzyme wird das Virusgenom so zerschnitten, daß viruseigene Promotoren herausgeschnitten und künstliche Promotoren integriert werden können, die die Transcription auf dem Folgestrang und somit die Herstellung der gegenläufigen RNA gewährleisten. Gleichermaßen wird mit Spleißsequenzen, Start- und Stopcodons verfahren.
h) Zum Abschluß der Synthese der gegenläufigen DNA wird Ligase, ein Enzym, das neu kombinierte DNA-Fragmente fest verknüpft, zugegeben, wodurch die an den Sticky Ends zusammengelagerten DNA-Fragmente zu einer stabilen Doppelhelix verbunden werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch Vervielfältigung der in vivo und in vitro ablaufenden Verfahrensschritte:

i) Die DNA-Doppelhelix wird erhitzt und dadurch in ihre Stränge zerlegt.
j) Die Stränge läßt man dann mit zwei, im Überschuß vorhandenen, chemisch sythetisierten DNA-Oligonukleotiden hybridisieren, die jeweils 15 bis 20 Nukleotide lang und in ihrer Sequenz zu zwei Abschnitten passen, die durch beliebig viele Nukleotide getrennt sind. Die beiden Oligonukleotide dienen als spezifische Primer für die in vitro-Synthese der DNA, die von der DNA-Polymerase katalysiert wird.
k) Nach Zugabe der DNA-Polymerase und den für die DNA-Synthese wichtigen Komponenten, wie z. B. Triphosphatnukleotide, kopiert dieses Enzym die DNA zwischen den Sequenzen, die den Oligonukleotiden entsprechen.
l) Nach mehreren der Verfahrensschritte (i) bis einschließlich (k) liegt die gewünschte DNA-Sequenz, die gegenläufige DNA in großer Menge vor. Durch die Polymerase- Kettenreaktion (polymerase chain reaction - PCR) kann man DNA-Sequenzen beliebiger Länge über eine Million mal vervielfältigen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 und 12, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte zur Integration der gegenläufigen Erbinformation zu den ursprünglichen Viren in die geeigneten Virenproteinhüllen:

m) Ein Virus, dessen Proteinhülle als Transportmittel für die entsprechende gegenläufige DNA geeignet ist, wird durch pH-Wert-, Ionenkonzentrations- und Temperaturänderungen in die elementaren Bausteine der Virushülle und in das virale Erbgut zerlegt.
n) Das virale Erbgut wird durch Enzyme zerstört und ausgewaschen.
o) Die gereinigten, viralen Hüllelementarproteine werden mit dem gegenläufigen DNA-Strang inkubiert.
p) Zur abschließenden Fertigstellung des Medikaments setzt sich die Virushülle im geeigneten Milieu um das gegenläufige Gen zusammen (self assembly).

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von dem Verfahrensschritt (1) die gegenläufige DNA mit RNA-Polymerase und anderen, für die Transcription wichtigen Komponenten versetzt wird, wie z. B. Triphosphatnukleotide.

15. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß spezifizierte, zum Virusgenom gegenläufige RNA - durch bestimmte Komplexe stabilisiert - seine Wirkung als Biokatalysator entfaltet.

16. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß spezifizierte, zum Virusgenom gegenläufige DNA vorzugsweise wie ein transponierbares Element gestaltet ist.

17. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß die befruchtete Eizelle (Zygote) mit spezifizierter, zum Virusgenom gegenläufiger DNA versetzt ist.

18. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament Flüssigform aufweist.

19. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament Gelatineform aufweist.

20. Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medikament Tablettenform hat.