DE69126311T2

DE69126311T2 - Therapeutische zusammensetzungen auf der basis von ribozymen

Info

Publication number: DE69126311T2
Application number: DE69126311T
Authority: DE
Inventors: Sidney Hamden Ct 06517 Altman; Anthony C. Boston Mass. 02114 Forster; Cecilia L. New Haven Ct 06511 Guerrier-Takada
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1990-08-17
Filing date: 1991-08-15
Publication date: 1998-01-08
Anticipated expiration: 2011-08-16
Also published as: AU1647095A; AU675613B2; DE69126311D1; CA2088917A1; WO1992003566A1; JPH06502761A; ES2104722T3; AU8627391A; AU659102B2; CA2088917C; ATE153699T1; EP0546092A4; US5168053A; EP0546092A1; EP0546092B1

Description

Diese Erfindung betrifft ganz allgemein die gentechnologische Herstellung von Nukleinsäuresequenzen, insbesondere RNA-Sequenzen, die Substrate für die von Ribonuclease P herrührende Ribozymaktivität bilden.
Die Regierung der vereinigten Staaten kann an dieser Erfindung infolge von Zuschüssen der National Institutes of Health and National Science Foundation bestimmte Rechte besitzen.
Entdeckungen im Reich der Molekularbiologie innerhalb der vergangenen 5 Jahre haben zu der Erkenntnis geführt, daß RNA eine Reihe von zuvor nicht vermuteten ausgeprägten Fähigkeiten und biologischen Aktivitäten aufweist. Die wichtigste dieser neuen Entdeckungen auf RNA-Ebene war die Erkenntnis, daß RNA sowohl ein Enzym als auch einen Informationsträger darstellen kann.
Derzeit sind fünf Klassen von Ribozymen bekannt, die an der Spaltung und/oder Ligation von RNA-Ketten beteiligt sind. Ein Ribozym ist als aus RNA bestehendes Enzym definiert. Die meisten Ribozyme arbeiten auf RNA-Substraten. Ribozyme sind seit 1982 bekannt. Zu diesem Zeitpunkt zeigten Cech und Kollegen ("Cell" 31: 147-157), daß ein ribosomaler RNA-Vorläufer in Tetrahymena, einem einzelligen Eukaryonten, eine durch Elemente in der während der Umwandlung des rRNA-Vorläufers in reife rRNA zu entfernenden RNA-Sequenz katalysierte Spaltung erfährt. Diese zu entfernende Sequenz (die als "vermittelnde Sequenz" oder "Intron" bezeichnet wird) stellt eines der nunmehr bekannten zahlreichen Beispiele von Intronribozymaktivitäten der "Klasse I" dar. Ein ähnlicher Intronribozymmechanismus der "Klasse II" wurde in jüngster Zeit entdeckt. Hierbei kommt es zu einer Spaltung und anschließenden Ligation einer Anzahl von Hefemitochondrien- RNAs ("Nature" 324: 429-433, 1987). Cech und Kollegen beschrieben in der PCT/US87/03161 von University Patents, Inc., Inc. (veröffentlicht als WO 88/04300 vom 16. Juni 1988) bestimmte in-vitro-Einsatzmöglichkeiten für Ribozyme der "Klasse I". Ihr Potential für therapeutische Einsatzmöglichkeiten in Zellen und bei Patienten bleibt unklar.
Eine 1983 aufgefundene dritte Ribozymklasse war die erste, von der gezeigt wurde, daß sie im trans-Zustand arbeiten (d.h. sie arbeiten unter Bedingungen, bei welchen das Ribozym in eine RNA-Kette eingebaut wird, während das zu spaltende Substrat aus einer zweiten getrennten RNA-Kette besteht). Dieses M1 RNA bezeichnete Ribozym wurde 1983 von Altmann und Kollegen dahingehend gekennzeichnet, daß es für die reife 5'-Enden sämtlicher Transfer-RNAs (tRNAs) in E. coli bildende Spaltung verantwortlich ist. Analoge RNA- haltige und mit tRNA-Synthese befaßte Enzyme wurden seitdem in sämtlichen Zellen, in denen sie gesucht wurden, einschließlich in einer Reihe menschlicher Zellinien, aufgefunden. Allerdings konnte noch nicht gezeigt werden, daß die relevanten eukaryotischen RNAs als solche in vitro katalytisch wirken können.
Die Entdeckung und Kennzeichnung dieser katalytischen RNA finden sich bei Sidney Altman in "Ribonuclease P: An Enzyme with a Catalytic RNA Subunit" in "Adv. Enzymol." 62, 1-36 (1989). Die Aktivität wurde zunächst aus E.-coli-Extrakten isoliert. Anschließend wurde sie als Ribonucleoprotein mit zwei Komponenten, einer M1 bezeichneten RNA-Komponente und einer C5 bezeichneten Proteinkomponente, bestimmt. Die RNA spaltete Substrate in echter enzymatischer Reaktion, wie eine Bestimmung unter Heranziehung der Michaelis-Menton- Kinetik ergab. Es wurde gefunden, daß M1 lediglich für die Substraterkennung verantwortlich war. Von C5 wurde ermittelt, daß es kcat, jedoch nicht KM ändert (vgl. Guerrier- Takada und Mitarbeiter in "Cell 35, 849 (1983) und McClain und Mitarbeiter in "Science" 238, 527 (1987)). Eine Sequenzierung zeigte, daß die M1 RNA 377 Nucleotide lang war und Mr etwa 125.000 betrug. Das Protein bestand aus 119 Aminosäuren, Mr betrug etwa 13.800 (vgl. Hansen und Mitarbeiter in "Gene" 38, 535 (1987)).
Die beiden restlichen Ribozymklassen stehen mit dem Replikationszyklus einer Gruppe selbst replizierender RNAs, die als "viroidartige Pathogene" oder VLPS bezeichnet werden, in Beziehung. Pflanzenviroide, RNA-Satelliten von Pflanzenviren und Hepatitis-delta-Virus gehören sämtliche zu der VLP- Gruppe. Die VLPs lassen sich in zwei Klassen einteilen: Klasse , freilebende Viroide, und Klasse II, zu der Virusoide und Satellitenviroide (RNA-Moleküle, die zur Replikation ein Helfervirus erfordern) gehören. Aufgrund dieser Definition stellt das Hepatitis-delta-Virus ein zur Klasse II gehörendes VLP dar.
1984 veröffentlichten Branch und Robertson ("Science", 233: 450-455) die Replikationszyklusstrategien für diese Pathogene. Diese wurden anschließend durch in verschiedenen Laboratorien durchgeführte Experimente verifiziert. Ein Schlüsselelement dieser "Umlauf-Kreis"-Replikationsstrategie ist, daß das eine Replikation durch laufende VLP größere als eine Einheitslänge aufweisende Kopien seiner Information liefert. Diese werden dann durch in die RNA des VLP selbst eingebaute Ribozymaktivitäten auf monomere Größe gespalten. Sharmeen und Mitarbeiter ("J. Virol.", 62, 2674-2679 (1988)), Branch und Mitarbeiter ("Science", 243, 649-652 (1989)) und Wu und Lai ("Science", 243, 652-655 (1989)) definierten die Ribozymspaltungspunkte beider delta-Stränge und die sie enthaltenden Domänen für das Hepatitis-delta-Virus.
Ein Typ von VLP-Ribozymen wird durch eine aus lediglich etwa 30 Nucleotiden bestehende kleine Strukturdomäne, die als "Hammerkopf" bezeichnet wird, definiert. Uhlenbeck ("Nature" (1987)) entwickelte als erster diese kleinen (nur 18 Nucleotide großen) und relativ spezifischen Ribozymsequenzen aus Pflanzenviroiden, z.B. Avocadosonnenfleckviroid, den Satelliten-RNAs von Tabakringfleckvirus und dem bei Luzerne vorübergehende Streifen hervorrufendem Virus (lucerne transient streak virus). Uhlenbeck (1987) und Forster und Symons ("Cell" 50, 9-16, 1987) legten die Erfordernisse für die Spaltung durch diese Ribozymklasse fest. Von Haseloff, Gerlach und Jennings wurden in der PCT/AU88/00478 von Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (als WO 90/05852 am 29. Juni 1989 veröffentlicht) verschiedene Ausführungsformen und mögliche Einsatzgebiete beschrieben.
Sämtliche von RNA in vivo gelenkte Reaktionen führen zu einer Umesterung oder Hydrolyse spezifischer Phosphodiesterbindungen in RNA. Bei einigen Klassen dieser Reaktionen wird eine intramolekulare Spaltungs- oder Ligationsstelle durch interne Führungssequenzen (IGSs), die mit dem Segment der die Spaltungsstelle enthaltenden Phosphodiesterkette Basenpaare bilden, identifiziert. Die Tetrahymena-Sequenz sowie die später in Hefe aufgefundene Sequenz stellen kein echtes Enzym dar, da es im Rahmen des Verfahrens nicht regeneriert wird. Es wirkt vielmehr in stöchiometrischem Anteil. Obwohl Fragmente dieser Sequenz mit enzymatischer Aktivität unter bestimmten in-vitro-Bedingungen und der Fähigkeit zur Spaltung und Ligation von RNA hergestellt bzw. konstruiert werden können, besteht ein Nachteil dieser Fragmente darin, daß sie sehr groß sind (sie erfordern mehr als 200 Reste der ursprünglichen 415 Nucleotide umfassenden Sequenz) und nur eine begrenzte Spezifität aufweisen. In ihren derzeitigen Formen besitzen die Tetrahymena-Ribozyme Vier-Basen-Erkennungssequenzen. Die Hammerkopfribozyme besitzen etwa 12- Basen-Erkennungssequenzen. Die Wahrscheinlichkeit einer RNA von der Größe einer typischen mRNA mit einer speziellen 4- Basensequenz ist weit größer als die Wahrscheinlichkeit der RNA mit 12-Basensequenz. Dies ermöglicht den Einsatz dieser Ribozyme in komplementärer Weise zur Spaltung von RNA.
IGSs sind bei einer Klasse von durch in-vivo-enzymatischer RNA gelenkten Reaktionen, bei der Spaltung von Vorläufer- tRNA-Molekülen durch die RNA-Komponente von eubakterieller RNase P (beschrieben von Guerrier-Takada und Mitarbeiter in "Cell" 35, 849 (1983) und zusammengefaßt von Altman in "Adv. Enzymol." 62, 1 (1989)) nicht vorhanden. Die Nucleotidsequenz des Abschnitts der Phosphodiesterkette, der die Spaltungsstelle enthält, bleibt bei verschiedenen Substraten für RNase P nicht erhalten, so daß sie nicht als einzigartige IGS für das Enzym erkannt werden kann.
In der Literatur gibt es eine Reihe von Vermutungen, daß sich Ribozyme als Reagenzien oder therapeutische Mittel eignen könnten, in dieser Hinsicht gab es bislang allerdings noch kaum Erfolge. Das Schlüsselwissen für die Nutzbarmachung irgendeiner Ribozymklasse, d.h. die Kenntnis ihrer detaillierten Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur, die zum Verständnis ihres Mechanismus führt, und ähnliche Daten bezüglich ihres Substrats und des Substraterkennungsprozesses stehen noch nicht zur Verfügung.
Es ist folglich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Methoden und Zusammensetzungen zur speziellen Spaltung von Target-RNA-Sequenzen mittels RNase P oder von funktionellen Äquivalenten hiervon verfügbar zu machen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen zur speziellen Spaltung von RNA sowohl in vitro als auch in vivo zur Behandlung von Krankheitszuständen mit Beteiligung einer RNA-Transkription oder -Translation, z.B. von Krankheiten, die durch RNA- und DNA-Viren und die Expression übermäßiger oder pathogener Proteine aus mRNA hervorgerufen werden.

Zusammensetzung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß man sich irgendein RNA-Molekül für die Spaltung durch RNase P zielgerichtet aussuchen kann, indem man eine Nucleotidsequenz bildet, von der ein Teil zu der Target-Stelle komplementar ist und eine terminale 3'- NCGA-Sequenz enthält. Dabei ist die Sequenz derart ausgestaltet, daß sie zu der Target-RNA hybridisiert, so daß RNase P das Substrat am basengepaarten Hybridbereich spaltet. Die Spezifität wird durch die komplementäre Sequenz bestimmt. Die Sequenz ist vorzugsweise 10 bis 15 Nucleotide lang und kann so viele nicht komplementäre Nucleotide enthalten, daß diese die Bildung mehrerer Basenpaare durch die komplementäre Sequenz mit nachgeschalteter NCCA-Sequenz am 3'-Ende nicht stören.
Diese Ausführungsformen eignen sich besonders gut zur Behandlung von Viruserkrankungen und bei mit der Expression spezifischer Proteine aus mRNA einhergehenden oder durch die Anwesenheit von viralen RNAs selbst verursachten Störungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: Ein Modell für die Sekundärstruktur von M1 RNA entsprechend den Vorschlägen von James und Mitarbeitern in "Cell" 52, 19 (1988).
Fig. 2: Sequenzen und vorgeschlagene Sekundärstruktur von Substraten [A und B] und Komplexen zwischen Substraten und EGS RNAs [C bis F]. Dicke Pfeile markieren die Stellen einer Spaltung durch M1 RNA und RNase P. Dünne Pfeile markieren die 3'-Enden stumpfendig gemachter Derivate von pAT1, die aus der Plasmidmatrize für pAT1 nach der Verdauung mit der angegebenen Restriktionsendonuclease synthetisiert wurden. Sequenzen von drei oder mehr Nucleotiden, die in sämtlichen Vorläufer-tRNAs aus E. coli unverändert sind, sind unterstrichen. Die Nucleotide in (A), (C) und (D), die sich von denen in (B) unterscheiden, sind in Kästchen eingeschlossen. Das Sternchen in (D) identifiziert die in (A) fehlende Phosphodiesterbindung. Das in der Doppelhelix- Struktur von (E) vorhandene Symmetrieelement ist ein C&sub2;-geeignete Rotationsachse. Das Schema in Fig. 2F demonstriert die Beziehung der generalisierten EGS RNA zu der Spaltungsstelle auf der Substrat-RNA.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß man irgend ein RNA-Molekül für die Spaltung durch RNase P zielgerichtet ansteuern kann, indem man proximal zu der zu spaltenden Stelle eine kurze Sequenz von Basenpaaren mit nachgeschalteter 3'-NCCA-Sequenz bildet. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform sind eine komplementäre Sequenz und die 3'-NCCA-Sequenz (hierin gemeinsam als externe Führungssequenz bzw. "EGS" bezeichnet) an die Spaltungsstelle gebunden, indem zwischen dem Substrat und der komplementären Nucleotidsequenz Basenpaare gebildet werden. Hierbei hybridisiert die externe Führungssequenz an die Target-RNA mit der NCCA-Sequenz 3' zu dem komplementären Bereich, so daß eine Spaltung an der Stelle auf dem RNA- Substrat an der Verbindung der basengepaarten Sequenz und der Nucleotide 5' zu der basengepaarten Sequenz erfolgt. Die Spezifität ist durch die komplementäre Sequenz bestimmt. Die Sequenz ist vorzugsweise 10 bis 15 Nucleotide lang und kann nicht komplementäre Nucleotide in einem Ausmaß enthalten, daß diese nicht die Gesamtfähigkeit der EGS zum Eingeben einer Basenpaarung stören.
Diese Ausführungsformen eignen sich besonders gut zur Behandlung viraler Erkrankungen und von bei der Expression spezifischer Proteine aus mRNA in vivo auftretenden Störungen oder zur Spaltung irgendeiner RNA in vitro. Bei den bevorzugten Ausführungsformen werden die Target-Sequenzen an die die zu spaltende RNA enthaltenden Zellen verabreicht, wobei die endogene RNase P die RNA gemäß der Steuerung durch die Targetsequenz spaltet. Dieselben Reagenzien können in vitro verwendet werden.
Es wurden Oligonucleotide konstruiert, die ein endogenes Ribozym zu einer Stelle innerhalb einer zu spaltenden RNA- Sequenz dirigieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Oligonucleotid direkt an die die zu spaltende RNA enthaltenden Zellen oder eine die zu spaltende RNA enthaltende Lösung verabreicht. Bei einer anderen Ausführungsform wird das Oligonucleotid intrazellulär über einen viralen Vektor oder Plasmidvektor an die Target-RNA abgegeben. Die kritischen Elemente der externen Führungssequenz sind (1) die Nucleotidsequenz, die eine spezifische Bindung mit dem Target-RNA-Substrat zur Produktion einer kurzen Sequenz von Basenpaaren 3' zur Spaltungsstelle auf der Substrat-RNA eingeht, und (2) eine terminale 3'-NCCA-Sequenz, wobei N für ein beliebiges Nucleotid, vorzugsweise ein Purin, steht. Die Sequenz ist im allgemeinen nicht kürzer als 6 oder 7, üblicherweise 10 bis 15 zu der Target-RNA komplementäre Nucleotide lang. Es müssen nicht sämtliche Nucleotide komplementär sein, solange nur die Sequenz unter den bei der Target-RNA vorliegenden Bedingungen hybridisieren kann. Die Spaltungsgeschwindigkeit hängt von der RNase P, der Sekundärstruktur des Hybridsubstrats, das die Target-RNA enthält, und dem Vorhandensein der 3'-NCCA-Sequenz in dem Hybridsubstrat ab.
Aus einer RNA-Sequenz und einem Protein bestehende RNase P ist in sämtlichen Zellen, einschließlich von Bakterien- und Hefezellen sowie eukaryotischen Zellen, vorhanden. Die RNase P aus E. coli wurde am besten charakterisiert. Es wurde allerdings auch bereits die RNase P aus Hefezellen und eukaryotischen Zellen einschließlich menschlicher Zellen isoliert und auf ihre Aktivität hin analysiert. Die Struktur und Aktivität einschließlich der Substratspezifität und der Kinetik waren zwischen den beiden Hobenzymen sehr ähnlich. Die Sequenz der RNA-Komponente menschlicher Zellen, als "H1" bezeichnet, wurde bereits sequenziert. Die Sekundärstruktur und die Aktivität wurden mit der Sequenz, der Sekundärstruktur und der Aktivität von M1, der RNA-Komponente von Bakterienzellen, verglichen. Die Sekundärstrukturen der beiden RNA-Komponenten waren ähnlich.
In vitro wurde belegt, daß die RNA-Komponente der eubakteriellen RNase P, M1, ein Substrat in Abwesenheit der Proteinkomponente zu spalten vermag. Es ist nicht nötig, das gesamte Molekül bereitzustellen, es reicht lediglich der Teil mit katalytischer Aktivität.
Es ist ferner möglich, unter Anwendung gentechnologischer Standardmaßnahmen die M1 RNA und erforderlichenfalls das Gen für das C5-Protein in einen Vektor zu klonieren. Dieser kann dann in die Zelle mit der zu spaltenden Target-RNA eingebaut werden. In einigen Fällen kann das C5-Protein durch Kationen ersetzt werden. So kann beispielsweise das C5-Protein mit M1 RNA durch eine Konzentration zwischen mehr als 10 mM Mg²&spplus; bis zu etwa 100 mM Mg²&spplus; ersetzt werden. Geeignete Vektoren sind den Fachleuten bekannt.
Sofern nicht anders angegeben, bedeutet hierin "RNase P" die endogene RNase P in der Zelle, in der die zu spaltende RNA lokalisiert ist. Den Fachleuten sind zahlreiche der hierin beschriebenen Techniken als Maßnahmen zur Herstellung von und Lieferanten für Reagenzien bekannt.

Die externe Führungssequenz

Die Erkenntnis, daß es möglich war, irgendeine RNA zur Spaltung durch RNase P zielgerichtet anzusteuern, basiert auf Studien unter Verwendung der 3'-proximalen Sequenz des Akzeptorstamms einer Vorläufer-tRNA als zum Teil die Spaltungsstelle durch Bildung von Basenpaaren mit dem Segment der Phosphodiesterkette, das gespalten wird, identifizierende "externe Führungssequenz" (EGS). Im Gegensatz zu internen Führungssequenzen (IGSs), die in vivo in kovalenter Weise an eine "katalytische" Sequenz gebunden sind und in hohem Maße erhalten bleiben, sind die EGSs zu dem nativen Enzym extern und in hohem Maße variabel.

A. 3'-NCCA-Sequenz

Sämtliche hierin beschriebenen Nucleotidsequenzen werden in üblicher Weise abgekürzt. Die EGS enthält eine komplementäre Sequenz mit einer 3'-NCCA-Sequenz, wobei N für ein Nucleotid, vorzugsweise ein Purin, steht. Die endogene RNase P spaltet das Substrat an der Stelle 5' zu einem Ort, an dem die komplementären Sequenzen eine doppelsträngige RNA oder eine Stamm-Schleifenstruktur bilden. In den meisten invitro-Fällen mit M1 RNA ist für die Spaltungslenkung nichts anderes als die Basenpaare aufweisende RNA in Kombination mit der 3'-NCCA-Sequenz erforderlich.

B. Komplementäre Sequenz

Die komplementären Sequenzen bestehen im allgemeinen aus mindestens 10 bis 15 zu einer Sequenz 3' zu der für die Spaltung vorgesehenen Stelle komplementären Nucleotiden oder sind von ausreichender Länge, um unter spaltungsfördernden Bedingungen alleine mit der Target-Sequenz zu hybridisieren.

Ribozymaktivität

Es ist nicht erforderlich, Ribozymaktivität bereitzustellen, wenn die Spaltung intrazellulär erfolgen soll, da sämtliche Zellen RNase P enthalten. Aus Bequemlichkeitsgründen bezeichnet hierin RNase P das Ribonucleoprotein aus dem C5- Protein oder seinen Analogen und einer RNA-Untereinheit, die für die katalytische Aktivität der RNase P verantwortlich ist, und zwar ungeachtet der Herkunft. Die katalytisch aktive RNA umfaßt eine eine Nucleotidsequenz spaltende RNA, die aus Bakterien, Hefe oder sonstigen eukaryotischen Zellen isoliert wurde, oder ein durch enzymatische Spaltung, chemische Synthese oder Transkription aus dem Gen hergestelltes funktionell aktives Derivat derselben. Die RNA-Untereinheit braucht in Abwesenheit von Proteinunterheiten in vitro nicht zwangsläufig eine katalytische Aktivität zu zeigen.

A. Endogene RNase P, einschließlich von Analogen von M1 RNA und Analogen der Proteinkomponente C5

Die Sequenz und vorgeschlagene Sekundärstruktur von M1 RNA ist in Fig. 1 dargestellt. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, daß die funktionellen Äquivalente von M1 RNA aus anderen Bakterien als E. coli, Hefe (vgl. beispielsweise Lee und Engelke in "Mol. Cell. Biol." 9(6), 2536-2543 (1989)) und eukaryotischen Zellen, z.B. HeLa-Zellen (vgl. beispielsweise Bartkiewiez und Mitarbeiter in "Genes Develop.", 3, 488-499 (1989)) in ihrer Struktur und Substratspezifität ähnlich sind. Über die Sequenz und Struktur von H1 RNA, die RNA-Komponente von Human-RNase P, wurde von Baer und Mitarbeitern in "Nucleic Acids Res." 18(1), 97-103(1989) berichtet.
Vergleichende Besprechungen von Berichten über die RNA-Komponente von RNase P aus den verschiedensten Quellen wurden von Venkstern in "Mol. Biol." 21(4), Pt. 1, 719-723 (1988), Pace and Smith in "J. Biol. Chem." 265(7), 3587-3590 (1990) und Pace und Mitarbeiter in "Gene" 82 (1), 65-75 (1989) veröffentlicht. Wegen der Ähnlichkeit von RNase P'en unterschiedlicher Herkunft in der Sekundärstruktur und Substratspezifität ist es möglich, die EGS zur zielgerichteten Ansteuerung einer beliebigen RNA in einer beliebigen Zelle zu verwenden, obwohl die katalytisch aktiven RNA-Untereinheiten deutlich verschiedene Sequenzen aufweisen können. Die Sekundärstruktur wird durch intramolekulare Assoziationen komplementärer Sequenzen an mindestens zwei Basenpaaren in Längsrichtung definiert Die Basenpaare können kanonisch, A/U und G/C, oder nicht-kanonisch, G/U, A/G und dgl. sein.

B. Exogene RNA mit katalytischer Aktivität

Eine EGS kann auch in Kombination mit einer exogenen RNA-Sequenz mit Ribozymaktivität oder einem exogenen Holoenzym verwendet werden. Die Sequenz mit Ribozymaktivität kann das gesamte M1-RNA-Molekül oder einen beliebigen Teil desselben mit katalytischer Aktivität oder irgendein funktionell aqulvalentes Molekül eukaryotischen Ursprungs oder eukaryotischer Herkunft repräsentieren.
Es gibt zwei Hauptsituationen, in denen exogene RNA oder RNase P in Kombination mit EGS benutzt wird, nämlich in vitro in Abwesenheit von Zellen oder zellulärer RNase P und dann, wenn die zu spaltende RNA in einem Teil einer Zelle ohne RNase P lokalisiert ist. In letzterem Fall werden das Gen mit Kodierung für die M1 RNA (entsprechend der angegebenen Definition) und das C5-Protein unter Benutzung eines geeigneten Vektors oder nach einem sonstigen dem Fachmann zum Einführen und zur Expression eines Gens in einer Zelle bekannten Verfahren in die Zelle an der gewünschten Spaltungsstelle eingeführt. Auf der Basis von in-vitro-Studien mit M1 RNA in Gegenwart einer hohen Kationenkonzentration braucht das Protein nicht in sämtlichen Fällen bereitgestellt zu werden.

Beispiel 1: Spaltung von durch EGS angesteuertem RNA- Substrat durch M1 RNA in vitro

Es wurde gezeigt, daß eine EGS für die Spaltung eines Substrats durch RNase P aus E. coli von wesentlicher Bedeutung ist und daß auch noch wirksam ist, wenn sie von der Target- Sequenz abgetrennt ist. EGS-haltige RNAs (EGS RNAs) dienten auch zur Konstruktion eines sehr kleinen Modellsubstrats für RNase P und zur Untersuchung des Substrat-Erkennungs- und -Spaltungsmechanismus.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen belegen, daß für eine spezifische Spaltung in vitro oder in vivo durch RNase P jede beliebige RNA herausgesucht werden kann, sofern nur die RNA mit einer maßgeschneiderten EGS RNA assoziiert wird. Die wesentlichen Kriterien für die EGS RNA sind, daß sie eine mit der Target-Sequenz unter Bildung einer doppelsträngigen RNA und hybridisierende Sequenz und eine 3'-NCCA-Sequenz aufweist.
Die Bedeutung der EGS für die Spaltung durch RNase P wurde mit Derivaten des kleinsten Modellsubstrats, das gemäß Mcclain und Mitarbeitern in "Science" 238, 527-530 (1987) wirksam durch RNase P, pAT1, gespalten wird, getestet. Die Substrate wurden auf die Spaltung durch entweder M1 RNA oder RNase P in Anwesenheit oder Abwesenheit von EGS RNAs getestet und nach einer Polyacrylamidgelelektrophorese durch Autoradiographie analysiert. Die Nucleotide sind mit "nt" abgekürzt.

Materialien und Methoden

Ein Gemisch aus nicht markierter und [α-³²P] -GTP-markierter Substrat-RNA in 0,1 mM EDTA [pAT1 (P; 51 nt), TaqI pAT1 (T; 31 nt), HinfI pAT1 (H; 24 nt) oder 17-nt RNA] wurde bei Raumtemperatur mit 0,1 mM EDTA oder nicht markierter EGS RNA in 0,1 mM EDTA [29-nt EGS RNA, 20-nt EGS RNA oder 17-nt RNA] gemischt, worauf jedes Gemisch mit nicht markiertem Enzym oder ohne nicht markiertes Enzym bei 37ºC in einem Reaktionspuffer inkubiert wurde.
Stumpfendig gemachte pAT1 RNAs wurden durch SP6-RNA-Polymerase aus der pGEM2-AT1-Plasmidmatrize synthetisiert (vgl. McClain und Mitarbeiter in "Science" 238, 527 (1987)). McClain und Mitarbeiter beschreiben ein als "AT1" bezeichnetes synthetisches Derivat mit lediglich dem Akzeptor-Stamm, dem T-Stamm und der T-Schleife sowie den 3'-terminalen NCCA- Nucleotidresten des tRNAPHE-Gens. Dieses war in die EcoRI/PSTI-Stellen eines von Promega Biotec gelieferten Expressionsplasmids pGEM-2 insertiert. Unter Nutzung der Anweisungen des Herstellers wurde die Plasmid-pGP18-DNA mit EcoRI/PSTI verdaut. Das das synthetische Gen tragende Fragment wurde isoliert und in die EcoRI/PstI-Stelle des Plasmids pGEM-2 insertiert. Das das synthetische Gen tragende Plasmid pGEM-2 wurde mit PstI verdaut. Die erhaltene lineare DNA wurde in vitro durch SP6-RNA-Polymerase transkribiert. Die SP6-Transkription liefert eine kurze 5'-Leadersequenz, pppGAAUACACGGAAUUC und einen extra 3'-C-Rest entsprechend dem restlichen Teil der mit Psti verdauten Restriktionsenzymstelle. Die verdauten Matrizen mit 3'-terminalen einsträngigen Bereichen wurden vor der Transkription mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aus E. coli inkubiert. Die 17-nt RNA und EGS RNAs wurden durch T7-RNA-Polymerase aus Oligodesoxyribonucleotidmatrizen (vgl. J.F. Milligan und Mitarbeiter in "Nucleic Acids Res." 15, 8783 (1987)) synthetisiert und gemäß Forster und Symons ("Cell" 49, 211 (1987)) gereinigt. Wild-Typ M1 RNA und C5-Protein wurden entsprechend A. Vioque und Mitarbeiter ("J. Mol. Biol. 202, 835 (1988)) hergestellt.
Die Konzentrationen der Substrate, EGS RNAs, M1 RNA und C5- Protein betrugen 50, 60, 5 bzw. 100 rim. Reaktionsgemische mit M1 RNA wurden 100 min in 50 mM Tris -HCl (pH-Wert: 715), 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM NH&sub4;Cl, 4% Polyethylenglykol 6000-7500 und 0,06 mM EDTA bei 3700 inkubiert. Reaktionsmischungen mit RNase P wurden 20 min in 50 mM Tris -HCl (pH-Wert: 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NH&sub4;Cl, 0,06 mM EDTA, 0,2 mM NaOAc, 1,2 mM NaCl und 28 mM Harnstoff bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von Formamid und überschüssiger EDTA abgebrochen. Dann wurden die Reaktionsgemische auf 19%igen Polyacrylamidgelen mit 7 M Harnstoff einer Elektrophorese unterworfen und anschließend durch Audioradiographie analysiert.

Ergebnisse

Die Reaktionsbedingungen und Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Als "HinfI pAT1 bzw. TaqI pAT1" bezeichriete Derivate von pAT1 mit 3'-terminalen Abstumpfungen, aufgrund derer die EGS deletiert war, (bestehend aus den 5'- terminalen 24- bzw. 31-nt von pAT1; vgl. Fig. 28) wurden durch RNase P aus E. coli (M1 RNA plus OS-Protein) oder durch M1 RNA unter Bedingungen, unter denen pAT1 wirksam gespalten wurde, nicht gespalten. Wenn jedoch dem Reaktionsgemisch eine die deletierte EGS, entweder die 29-nt EGS RNA oder die 20-nt EGS RNA (Fig. 2, 0 und D) enthaltende RNA zugegeben wurde, wurden HinfI pAT1 und TaqI pAT1 an derselben Spaltungsstelle wie bei pAT1 wirksam gespalten. Die 20- und 29-nt EGS RNAs stimulierten die Spaltung von pAT1 durch M1 RNA oder RNase P. Darüber hinaus wurde eine 17-nt RNA, die derart ausgestaltet war, daß aus derselben Sequenz ein Substrat und eine EGS RNA hergestellt werden konnten (Fig. 2E), durch RNase P wirksam, durch M1 RNA jedoch nur schwach gespalten. Die Spaltungsstelle wurde durch Markieren mit [5'-³²P]-pCp des 3'-Endes des durch Spalten von nicht markierter 17-nt RNA durch RNase P hergestellten kleinen Spaltungsfragments, Verdauen der RNA zu Mononucleotiden mit RNase T2 und Chromatographieren (vgl. A.C. Forster und R.H. Symons in "Cell" 49, 211 (1987)) bestimmt. Das einzige nachgewiesene radioaktive Nucleotid war Uridin-3'-Monophosphat.
Obwohl die 17-nt RNA dieselbe Octanucleotid 3'-terminale Sequenz wie die 20- oder 29-nt EGS RNAn enthält, wurden HinfI pAT1 und TaqI pAT1 durch M1 RNA oder RNase P in Gegenwart der 17-nt RNA nicht gespalten. Dies deutet darauf hin, daß die Funktionen der 20- und 29-nt EGS RNAs eben nicht auf ihren acht 3'-terminalen Nucleotide beruhten. Nichts desto weniger ist mindestens eines der drei 3'-terminalen Nucleotide von pAT1 (und vermutlich der 20- und 29-nt EGS RNAs) wichtig, da Derivate von pAT1 mit kleinen 3'-terminalen Abstumpfungen, die als Bani pAT1, NLAIV pAT1 bzw. Bsp1286 pAT1 bezeichnet wurden (vgl. Fig. 28) unter genau denselben Bedingungen wie für pAT1 in 0,1 mM EDTA bei Inkubation mit M1 RNA nicht als Substrate funktionierten. Dieses Ergebnis ist nicht überraschend, da Basensubstitutionen für das 5'- proximale C der CCACOH-Sequenz von pAT1 die Spaltung drastisch reduzierte.
TaqI pAT1 oder HinfI pAT1, die gemeinsam mit der 15-nt RNA wandern, ist ein 5'-Spaltungsfragment, da es das einzige radioaktiv markierte Produkt einer Spaltung von [y-³²P]-GTPmarkiertem TaqI pAT1 oder HinfI pAT1 in Gegenwart von 20oder 29-nt EGS RNA durch M1 RNA oder RNase P darstellt. Die erwarteten 3'-Spaltungsfragmente von pAT1, TaqI pAT1 und HinfI pAT1 sind 36-, 16- bzw. 9-nt lang (die Heterogenität in den nicht gespaltenen RNAs und 3'-Spaltungsfragmenten beruht auf einer heterogenen Termination der Transkription durch SP6-RNA-Polymerase). Die 5'- und 3'-Spaltungsfragmente der 17-nt RNA sind 6- bzw. 11-nt lang.
Fig. 2F ist ein Schema für ein RNA-Substrat, das Basenpaare mit einer EGS RNA bildet. Ein Pfeil zeigt die Spaltungsstelle auf der Substrat-RNA proximal zur Verbindung mit der komplementären-NCCA-Sequenz. TABELLE 1: Spaltung von RNA-Substraten durch M1 RNA und RNase P A: Inkubiert mit M1 RNA
* keine M1 RNA. TABELLE 1 Forts. B.: Inkubiert mit RNase P
P pAT1, enthaltend den Akzeptorstamm, die T-Stammschleife, 3' CCA der tRNAPhe.
H HinfI pAT1 mit den 5'-terminalen 24-nt von pAT1.
T TaqI pAT1 mit den 5'-terminalen 31-nt von pAT1.
17-nt besitzt dieselbe 8-nt-3'-Sequenz wie die 20-, 29-nt- Sequenz
* keine RNase P.
Die Ergebnisse mit HinfI pAT1/20-nt EGS RNA und TaqI pAT1/20-nt EGS RNA belegen, daß EGSs, die länger sind als die 7-nt EGS und in dem Aminoacylakzeptorstamm der Vorläufer-tRNAs (Fig. 2A) vorhanden sind, funktionell sind und daß die erhalten gebliebene GUUC-Schleife der Vorläufer-tRNAs für eine wirksame Spaltung durch RNase P unnötig ist. Das Ergebnis mit der 17-nt RNA belegt, daß die einzigen Teile einer Vorläufer-tRNA, die für eine wirksame Spaltung durch RNase P erforderlich sind, der Aminoacylakzeptorstamm und einige zusätzliche 5'- und 3'-terminale Sequenzen sind. Die Spaltungsstelle der 17-nt RNA (Fig. 2E) ist ein möglicherweise doppelsträngiger Bereich, wie im Fall zahlreicher in vivo gefundener RNase-P-Substrate. Die schlechte Spaltung der 17-nt RNA durch M1 RNA, jedoch nicht durch RNase P könnte auf der Basenpaarung der Nucleotide auf der 5'-Seite der Spaltungsstelle zurückzuführen sein. Es scheint so, daß in diesem Fall die Lage der durch M1 RNA und RNase P gespaltenen Stelle teilweise durch die Lage der erhalten gebliebenen NCCA-Sequenz und nicht nur durch die Verbindung der einund doppelsträngigen Bereiche bestimmt werden kann.
Es gibt Ausnahmen für diese allgemeine Regel für die Auswahl der Spaltungsstellen in Substrat/EGS-RNA-Komplexen, wobei RNase-P-Substrate entweder ein Nucleotid weg von der erwarteten Spaltungsstelle (z.B. Tabakmosaikvirusderivate) oder in Abwesenheit der gesamten NCCA-Sequenz akkurat gespalten werden.

Beispiel 2: Spaltung von viraler RNA durch M1 RNA aus E.coli

Der Qβ-Bakteriophage von E. coli stellt ein gut charakterisiertes RNA-Virus, bei welchem mehr als 90% der Phagen-RNA fur virale Proteine kodiert, dar (vgl. Kramer und Mills in "Nucl. Acids Res." 9, 5109-5124 (1981)). Es wurde nun gezeigt, daß rekonstituierte RNase P diese virale RNA spaltet.
Damit wurde gezeigt, daß RNase P ein langes Virus-RNA-Substrat mit einer Struktur, die mit dem zwischen einer Target- RNA und einer EGS gebildeten Hybridsubstrat äquivalent ist, zu spalten vermag.
Eine P³²-markierte midivariante RNA wurde 10 bis 15 min bei 37ºC in einem Puffer mit 50 mM Tris -HCl (pH-Wert: 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NH&sub4;Cl in Gegenwart von rekonstituierter RNase P (M1 RNA plus C5-Protein) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 10 molarem Harnstoff der Aufspürfarbstoffe (Bromphenolblau + Xylolcyanol) enthielt, abgestoppt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel (5% Polyacrylamid-Denaturiergel mit 7 Mol Harnstoff) aufgegeben. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese und Autoradiographieanalyse nachgewiesen.
Die Ergebnisse dieser Studie belegen, daß M1 RNA ein Virussubstrat an einer Stelle auf dem Substrat 5' zu einer kurzen Sequenz von Basenpaaren, die in diesem Falle durch ein Oligonucleotid gebildet wird, das eine Stamm-Schleifenstruktur ausbildet, mit nachgeschalteter 3'-NCCA-Sequenz zu spalten vermag.

Einsatz der EGS als Laborreagens oder klinisches Reagens

Die externen Führungssequenzen sind als in-vitro-Reagenzien in ähnlicher Weise wie Restriktionsenzyme und als therapeutische Mittel zur Spaltung und Aktivierung spezieller Bakterien- und Virussequenzen in vivo einsetzbar. Die externe Führungssequenz aus der Kombination einer 10- bis 15-Basensequenz, die zu der Sequenz proximal zu der gewünschten Spaltungsstelle komplementär und für die Target-RNA spezifisch ist, und einer 3'-NCCA-Sequenz kann zu einer beliebigen RNA mit Sequenzen komplementär zu der EGS in Gegenwart von endogener RNase P oder zugesetzter M1 RNA zugegeben werden, wobei dann die RNA an der ausgewählten Stelle gespalten wird. Auf diese Weise kann die Aktivität der endogenen RNase P in einer beliebigen Zelle, z.B. der RNase P von menschlichen Zellen, dazu gebracht werden, mit Hilfe einer geeigneten EGS RNA spezifische Messenger-, Virus- oder sonstige RNAs zu zerstoren.

1. Reagenzien für in-vitro-Applikationen

DNA-Restriktionsendonucleasen sind unschätzbare Reagenzien für den Molekularbiologen. Muster von Restriktionsfragmentgrößen dienen zur Erstellung von Sequenzbeziehungen zwischen DNA-Molekülen. Große DNAs können gespalten werden, um Fragmente einer für gentechnologische Konstruktionen, zur Sequenzierung und zur Untersuchung einer Proteinbindung geeigneten Größe zu liefern. Ribozyme andererseits spalten RNA mit deutlich höherer Sequenzspezifität.
Kleine spezifische Ribozyme lassen sich durch Kombinieren der spezifischen Target-Sequenz mit M1 RNA oder funktionellen Äquivalenten hiervon erstellen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegen die beiden Sequenzen getrennt vor. Andererseits können die beiden Sequenzen auch mit einem Oligonucleotidlinker, der eine ausreichende Flexibilität zwischen der Target-Sequenz und der katalytischen Sequenz für die Target-Sequenz (zum Binden) und die katalytische Sequenz (zur Spaltung) zuläßt, kombiniert werden. Bei einigen in-vitro-Ausführungsformen wird vorzugsweise als Ersatz für das C5-Protein eine hohe Kationenkonzentration, insbesondere Mg²&spplus;, zugegeben.

2. Therapeutika

a. Bestimmung und Herstellung von komplementären Sequenzen

Jedes als RNA exprimierte zelluläre Genprodukt einschließlich von durch mRNA kodierten Proteinen und die Struktur-RNAs selbst können für eine spezifische Spaltung und Inaktivierung durch RNase P unter Benutzung von Sequenzen, die dahingehend hergestellt wurden, daß sie geeignete Sequenzund/oder Strukturbereiche für eine Bindung an die Target-RNA und die 3'-NCCA-Sequenz enthalten, ausgesucht bzw. angesteuert werden. Das zelluläre Genprodukt kann aus einem modifizierten Produkt eines Oncogens, z.B. dem ras-Genprodukt, (hierbei handelt es sich bei dem Produkt nicht um eine normale Zellkomponente), einem Virusprotein, z.B. einem durch ein essentielles Gen für ein HIV-Replikation kodiertes Virusprotein, oder einem Bakterienprotein bestehen.
In vielen Fällen, wurden die kritischen Gene in einem infektiösen oder pathologischen Mittel isoliert und sequenziert. Geeignete komplementäre Sequenzen lassen sich nach Standardtechniken, mit Standardreagenzien und mit einer Standardanlage auf der Basis dieser bekannten Sequenzen synthetisieren.

b. Herstellung einer geeigneten Arzneimittelzubereitung zur Abgabe der EGS an die Target-RNA

Es gibt zwei Primärmechanismen für die Zuführung der EGS zu intrazellulärer RNA als Spaltungsziel, nämlich die Diffusion und über einen Vektor.
Wie bereits ausgeführt, kann jede bei einem Krankheitsprozeß wichtige RNA das Ziel sein. Geeignete komplementäre Sequenzen können synthetisch hergestellt oder durch Kopieren einer klonierten Sequenz hergestellt werden. Da sich RNase P vornehmlich im Kern eukaryotischer Zellen findet, handelt es sich bei den durch die Verabreichung geeigneter EGS an die infizierten Zellen höchstwahrscheinlich gehemmten infekiösen Mitteln um solche, bei denen kritische RNA-Sequenzen im Kern transkribiert werden. Wichtige Beispiele für im Zellkern replizierte virale Mittel sind Herpesviren (einschließlich Herpes-simplex-Virus, Varicella-herpes-Zostervirus, Cytomegalovirus und Epstein-Barr-Virus), Adenoviren, Paramyxoviren, wie Masernviren, und Retroviren, z.B. das Humanimmundefizienzvirus (HIV-I, HIV-I und HIV-III).

Vektorvermittelte Abgabe von EGS

Bevorzugte Vektoren sind Virusvektoren, z.B. die Retroviren, welche die EGS direkt in den Kern einführen. Dort erfolgt dann eine Transkription und Freisetzung in den Kern. Unter geeigneten Bedingungen hybridisiert die EGS an die Target- RNA und die endogene RNase P spaltet dann die hybridisierte RNA an der 5'-Stelle des Hybridbereichs.
Defekte retrovirale Vektoren, die ihre eigene RNA-Sequenz in DNA-Form in das Wirtchromosom einbauen, können derart ausgestaltet werden, daß sie die EGS in den Wirt einschleusen. Dort werden Kopien erstellt und in das Cytoplasma zur Wechselwirkung mit den Target-Nucleotidsequenzen freigegeben.
Die Fähigkeit zur Einführung speziell ausgestalteter Nukleinsäuresequenzen als Maßnahme einer Target-Therapie in hämopoetische Zellen von Patienten, die an einer virusinduzierten Erkrankung dieser Zellen, z.B. AIDS, leiden, besitzt ein hohes Potential. Die derzeit wirksamste Methode zum Einschleusen spezifischer genetischer Sequenzen in menschliche Zellen besteht in der Verwendung von RNA-haltigen Retroviren, die als Vehikel oder Vektoren für einen hochwirksamen Gentransfer in menschliche Zellen dienen.
Eine Therapie auf RNase-P-Basis kann sich auch als Mittel zur Verhinderung einer Ausbreitung von HIV-I oder zur Bereitstellung einer HIV-I-resistenten Population von T-Zellen, die infizierten Individuen eine Immunfunktion zu verleihen vermögen, eignen. Patienten, bei denen kurz vorher Antikörper gegen HIV-I diagnostiziert wurden, die jedoch noch keine AIDS-Symptome zeigen, dürften die am besten geeigneten Therapiekandidaten darstellen. Dieses Verfahren erfordert die Entfernung einiger Knochenmarkstammzellen des Patienten und eine anschließende Teilcytoblation. Die entfernten Zellen können im Labor mit geeigneten EGS-Zubereitungen behandelt und dann demselben Individuum wieder zugeführt werden. Die behandelten Zellen entwickeln sich im Patienten zu reifen hämopoetischen Zellen, einschließlich von T-Zellen. Diese T-Zellen zeigen normale Immunfunktion und werden höchstwahrscheinlich intrazellulär immunisiert, um ihre Zerstörung durch irgendwelches noch im Patienten vorhandenes HIV-I zu verhindern.
Knochmarkstammzellen und hämopoetische Zellen werden relativ einfach entfernt und ersetzt und liefern eine sich selbst regenerierende Population von Zellen für die Fortpflanzung übertragener Gene. Wie bereits ausgeführt, sollten HIV-I und HTLV-I diesen Versuchen zugänglich sein. In längeren Zeiträumen gedacht, ist davon auszugehen, daß der Einsatz von Therapeutika auf RNase-P-Basis die selektive Inaktivierung sonstiger unerwünschter Gene in Zellen, z.B. aktivierter Oncogene, die für die Bildung und Erhaltung von Krebszellen ursächlich sind, gestatten.
Im Gegensatz zu den derzeitigen Versuchen, bei denen eine HIV-Infektion verhindert oder begrenzt werden soll, sollte es möglich sein, die Technologie auf RNase-P-Basis zur Behandlung und möglicherweise Heilung von HIV-Infektion und verwandter Erkrankungen weißer Blutkörperchen, die für eine Transformation durch EGS tragende Retrovirusvektoren zugänglich sind, zu benutzen. Spezielle Beispiele für Krankheiten, die unter Verwendung von EGS zur Ansteuerung von RNA für eine Spaltung durch RNase P behandelt werden können, sind nicht nur HTLV-I, sondern auch die verschiedensten durch Retroviren induzierten Leukämiearten. Andere Arten transformierter Gewebe, die behandelbar sein dürften, sind identifizierte Oncogene bekannter Sequenz tragende Darm- und Brustzellen.

Topische und andere EGS-Zubereitungen für eine direkte Verabreichung

Die EGS kann in einem geeigneten pharmazeutischen Träger auch topisch oder systemisch verabreicht werden. In Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Ausgabe, Herausgeber E.W. Martin (Mark Publishing Company, 1975) werden typische Träger und Zubereitungsverfahren beschrieben. Die EGS kann auch in geeigneten biologisch verträglichen Mikrokapseln oder Liposomen zur zielgerichteten Ansteuerung phagocytischer Zellen eingekapselt sein. Solche Systeme sind dem Fachmann bekannt.
Therapeutisch werden die Oligoribonucleotide als Arzneimittelzubereitung mit einer wirksamen Menge der EGS zur Hemmung einer Transkription einer Target-RNA und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht. Beispiele für typische alleine oder in Kombination verwendbare pharmazeutische Träger sind ein oder mehrere fester (feste), halbfester (halbfeste) oder flüssiger (flüssige) Verdünnungsmittel, Füllstoff(e) und Hilfsstoff(e), der (die) nicht toxisch, inert und aus pharmazeutischen Gesichtspunkten akzeptabel ist (sind) . Solche Arzneimittelzubereitungen werden vorzugsweise in Einheitsdosisform, d.h. physikalisch diskreten Einheiten mit einer gegebenen Menge des Mittels entsprechend einer Fraktion oder einem Mehrfachen der Dosis, die zur Herbeiführung des gewünschten therapeutischen Ansprechens berechnet wurde, üblicherweise als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulver, wäßrige oder ölige Suspensionen, Sirupe, Elixiere und wäßrige Lösungen verabreicht.
Die bevorzugte Zubereitung besteht aus einer topischen Zubereitung, beispielsweise zur Applikation auf eine virale Läsion oder Wunde, wie sie vom Herpes-simplex-Virus hervorgerufen wird. Diese enthält im allgemeinen zwischen 1 und 100 ng Oligonucleotid/ml Träger. Orale Zubereitungen (obwohl nicht bevorzugt) sind Tabletten oder Kapseln. Sie können übliche Streckmittel, z.B. Bindemittel, wie Sirup, Akaziengummi, Gelatine, Sorbit, Traganth oder Polyvinylpyrrolidon, Füllstoffe, z.B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin, Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyethylenglykol oder Siliciumdioxid, den Zerfall fördernde Mittel, z.B. Stärke, und Benetzungsmittel, z.B. Natriumlaurylsulfat, enthalten. Lösungen oder Suspensionen der EGS mit üblichen pharmazeutischen Trägern werden als parenterale Zubereitungen, z.B. als wäßrige Lösungen zur intravenösen Injektion oder als ölige Suspension zur intramuskulären Injektion, verwendet.
Für klinische Anwendungen sollten die Dosierungen und die Dosiervorschriften in jedem Falle sorgfältig eingestellt werden. Zu diesem Zweck wird auf eine fundierte Fachkenntnis unter Berücksichtigung des Alters, des Gewichts und des Zustands des Patienten, des Verabreichungswegs und der Natur und Schwere der Krankheit zurückgegriffen.

Claims

1. Zusammensetzung zur Spaltung einer Target RNA-Sequenz an einer speziellen Spaltungsstelle in der RNA durch prokariotische RNAase P, wobei die Zusammensetzung einen Vektor umfaßt, der eine externe Führungssequenz enthält und sich zur Einführung der externen Führungssequenz in eine die zu spaltende Target RNA enthaltende Zelle eignet, wobei die externe Führungssequenz im wesentlichen aus einem isolierten Oligoribonukleotid mit mindestens 7 zu den Nukleotiden 3' zur Spaltungsstelle in der zu spaltenden RNA komplementären Nukleotiden an seinem 5' Terminus und den Nukleotiden N C C A, die mit den komplementären Nukleotiden verknüpft sind, an seinem 3' Terminus, wobei N für ein beliebiges Nukleotid steht und die Komplementärnukleotide in dem Oligoribonukleotid an die Komplementärnukleotide in der zu spaltenden RNA hybridisieren, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Abgabe einer wirksamen Dosis der externen Führungssequenz an einen Patienten, so daß die prokariotische Rnaase P die Target RNA- Sequenz spaltet, besteht.

2. Zusammensetzung zur Spaltung einer Target RNA-Sequenz an einer speziellen Spaltungsstelle in der RNA durch prokariotische RNAase P, wobei die Zusammensetzung eine externe Führungssequenz umfaßt, die im wesentlichen aus einem isolierten Oligoribonukleotid mit mindestens 7 zu den Nukleotiden 3' zur Spaltungsstelle in der zu spaltenden RNA komplementären Nukleotiden an seinem 5' Terminus und den Nukleotiden N C C A, die an die komplementären Nukleotide gebunden sind, an seinem 3' Terminus, wobei N für ein beliebiges Nukleotid steht und die komplementären Nukleotide in dem Oligoribonukleotid an die komplementären Nukleotide in der zu spaltenden RNA hybridisieren, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Abgabe einer wirksamen Dosis der externen Führungssequenz an eine Patienten, so daß die prokariotische RNAase P die Target RNA- Sequenz spaltet,

wobei die RNAase P in einer derartigen Weise zielgerichtet ansteuert, daß die Spaltung der Sequenzen durch die RNAase P zu einer Inaktivierung von aus DNA, aus aus der Gruppe Oncogene, Tumorsupressorgene, pathogene bakterielle Gene und zelluläre mRNAs, die für Proteine, einschließlich Enzymen, Hormonen, Cofaktoren, Antikörpern und Wachstumsfaktoren, kodieren, transkribierter RNA führt, besteht.

3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin N für ein Purin steht.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die komplementäre Sequenz mindestens 7 Nukleotide lang ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Rnaase P M1 RNA oder M1 RNA aus von E. coli verschiedenen Bakterien umfaßt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, bei welcher die RNA mit der externen Führungssequenz versehen ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, die desweiteren Protein C5 oder Protein C5 aus von E. coli verschiedenen Bakterien umfaßt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der pharmazeutische Träger aus für eine topische und subkutane Verabreichung geeigneten Trägern ausgewählt ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die externe Führungssequenz durch einen Vektor zur Einführung der externen Führungssequenz in eine die zu spaltende Target RNA enthaltende Zelle bereitgestellt wird.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 9, wobei der Vektor ein retroviraler Vektor ist.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die zusätzlich bakterielle Rnaase P oder diekatalytische RNA Untereinheit von Bnaase P und zweiwertige Kationen enthält.

12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.

13. Verfahren zur spezifischen Spaltung einer Target RNA, die von einer Vorläufer tRNA verschieden ist, an einer speziellen Spaltungsstelle in der RNA durch Verabreichen von bakterieller RNAase P oder der katalytischen RNA Untereinheit von Rnaase P und von zweiwertigen Kationen unter eine Hybridisierung zwischen RNA-Sequenzen fördernden Bedingungen sowie einer wirksamen Menge eines isolierten Oligoribonukleotids mit mindestens 7, zu den Nukleotiden 3' zur Spaltungsstelle in der zu spaltenden RNA komplementären Nukleotidbasen an seinem 5' Terminus und den Nukleotiden N C C A, die an die komplementären Nukleotide gebunden sind, an seinem 3' Terminus, wobei die komplementären Nukleotide in dem Oligoribonukleotid an die komplementären Nukleotide in der zu spaltenden RNA hybridisieren, an Zellen (ex vivo, wenn die Zellen aus menschlichen oder anderen tierischen Zellen bestehen).

14. Isoliertes Oligonukleotid zur Spaltung einer Target RNA- Sequenz an einer speziellen Spaltungsstelle in der RNA, umfassend

eine RNA Untereinheit von Rnaase P und

eine externe Führungssequenz mit einer Nukleotidsequenz mit mindestens 7, zu den Nukleotiden 3' zu der Spaltungsstelle in der zu spaltenden RNA komplementären Nukleotiden an ihrem 5' Terminus und den Nukleotiden N C C A, die mit den komplementären Nukleotiden verbunden sind, an ihrem 3' Terminus, wobei N für ein beliebiges Nukleotid steht und die komplementären Nukleotide in der Nukleotidsequenz an die komplementären Nukleotide in der zu spaltenden RNA hybridisieren.

15. Zusammensetzung zur Spaltung einer Target RNA-Sequenz an einer speziellen Spaltungsstelle in der RNA, die das isolierte Oligonukleotid von Anspruch 14 in einem pharazeutisch akeptablen Träger zur Abgabe einer wirksamen Dosis des Oligonukleotids an einen Patienten zur Spaltung der Target RNA-Sequenz umfaßt.

16. Rekombinantes Oligonukleotid nach Anspruch 14, wobei die RNA Untereinheit von Rnaase P an den 5' Terminus der externen Führungssequenz gebunden ist.

17. Rekombinantes Oligonukleotid nach Anspruch 14, wobei die RNA Untereinheit der Rnaase P-Sequenz an den 3' Terminus der externen Führungssequenz gebunden ist.

18. Verwendung einer wirksamen Menge eines Oligonukleotids mit einer RNA Untereinheit von Bnaase P und einer externen Führungssequenz, die eine Nukleotidsequenz mit mindestens 7, zu den Nukleotiden 3' der Spaltungsstelle der zu spaltenden RNA komplementären Nukleotiden an ihrem 5' Terminus und den Nukleotiden N C C A, die an die komplementären Nukleotide gebunden sind, an ihrem 3' Terminus, wobei N für ein beliebiges Nukleotid steht und die komplementären Nukleotide in der Nukleotidsequenz an die komplementären Nukleotide in der zu spaltenden RNA hybridisieren, umfaßt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Patienten, bei dem die Spaltung von RNA an einer speziellen Stelle erforderlich ist.