JPH06502761A - 治療用リボザイム組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療用リボザイム組成物 発明の背景 本発明は、核酸配列、特にリボヌクレアーゼＰ由来のりボザイム活性体に対する 基質であるＲＮＡ配列の遺伝子工学の一般領域に属している。

米国国立衛生研究所および全米科学財団からの助成金によってなされた本発明に 対し、米国政府は一定の権利を有し得る。

過去５年間の分子生物学の領域における発見によって、ＲＮＡが以前には予想も されていなかった一連の独特な性能および生物学的活性を有していることが分か ってきた。これらの新規なＲＮＡレベルの発見の中で最も重要なのは、ＲＮＡが 情報の運搬体であるのみならず酵素になる場合があり得るという知見であった。

ＲＮＡ鎖の開裂および／または連結に関与する５つのクラスのりボザイムが現在 知られている。リボザイムはＲＮＡで構成される酵素と定義され、その大部分は ＲＮＡを基質として作用する。

リボザイムは１９８２年以来知られており、その年にＣｅｃｈおよびその共同研 究者は、単細胞真核生物であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のリポ ソームＲＮＡの前駆物質が、ＲＮＡ配列中の成分によって触媒されて開裂され、 ｒＲＮＡ前駆物質が成熟ｒＲＮＡに変換する間に除去されることを示した（Ｃｅ １１．３１巻、１４７〜１５７頁、１９８２年）。この除去される配列（介在配 列またはイントロンと呼ばれる）は、「クラス！」イントロンリボザイム活性体 の多数の例として現在知られているものの１つである。

同様の「クラス■」イントロンリボザイム機構がごく最近明らかにされたが、こ れによると、多くの酵母ミトコンドリアのＲＮＡが開裂され次いで連結される（ 　Ｎａｔｕｒｅ、　３２４巻、４２９〜４３３頁、１９８７年）　、　Ｃｅｃｈ および共同研究者らは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｔｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、のＰ ＣＴ／ＵＳ８７１０３１６１で、１クラス■”のりボザイムのある種のインビト ロでの適用を記載している（なおこの特許出願は、１９８８年６月１６日にＷＯ ３８１０４３００として公開されている）。細胞および患者の治療的応用につい てのそれらの潜在的能力は不明のままである。

クラス■のリボザイムは１９８３年に発見されたが、トランス式に作動すること が分かった最初のりボザイムである（すなわち、このＩへボザイムは１つのＲＮ Ａ鎖に組込まれているが、開裂されるべき基質は第２の別個のＲＮＡ鎖であると いう条件下で作動する）。このリボザイムは、ＭＩ　ＲＮＡと呼ばれているもの で、Ａｌｔｍａｎおよびその共同研究者によって１９８３年に特性決定がなされ 、Ｅ、　ｃｏｌｉ中の全てのトランスフｙ　−ＲＮＡ　（ｔＲＮＡ）の成熟５° 末端を形成する開裂に関与していることがわかっている。ｔ　ＲＮＡの合成に関 連する類似のＲＮＡ含有酵素は、以後、多くのヒトの細胞系を含めて、このよう な酵素の存在が探求された全ての細胞に見出されているが、関連する真核ＲＮＡ がそれ自体、インビトロで触媒作用をすることはまだ示されていない。

この触媒性ＲＮＡの発見と特性決定については、５ｉｄｎｅｙ　Ａｌｔｍａｎが 、Ａｄｖ、　Ｅｎｚ　ｌｌ１ｏｆ、、６２巻、１〜３６頁（１９８９年）に”　 Ｒ４ｂ。

ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｐ：　、Ａｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｃａｔａｌｙ ｔｉｃ　ＲＮＡ　５ｕｂｕｎｉｔ−で概説している。その活性体は最初Ｅ、　ｃ ｏｌｉ抽出物から単離され、次いで２つの成分、すなわちＭｌと呼ばれるＲＮＡ 成分と０５と呼ばれるタンパク質成分とを有するリボ核酸タンパク質であること が決定された。そのＲＮＡは、ミカエリス・メンテン速度論を用いて測定したと ころ、真性の酵素反応で基質を開裂した。

Ｍｌは単に基質の認識に関与するだけであると決定され、およびＣ５はＫＣａｔ を変化させるかに、を変化させないと決定された。

このことは、Ｇｕｅｒｒ　１ｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌ上、３５巻、８４９ 頁、１９８３年およびＭｃＣｌａｉｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８巻、５２７ 頁、１９８７年に報告されている。配列決定の結果、Ｍｌ、ＲＮＡは３７７ヌク レオチドの長さで分子量（Ｍ、）は約１２５．０００であり、そのタンパク質は Ｈａｎｓｅｎら、Ｇｅｎｅ、３８巻、１９８７年に報告されているように１１９ アミノ酸（町は１３．８００）で構成されている。

リボザイムの２つの残りのクラスは、「ウィロイド様病原体（ｖｉｒｏｉｄ−１ ｉｋｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）ＪすなわちＶＬＰと呼ばれる一群の自己慢性ＲＮ Ａの複製サイクルに関連している。植物ウィロイド、植物ウィルスのＲＮＡサテ ライト、およびデルタ肝炎ウィルスが、ＶｔＰ群の全メンバーである。ＶＬＰは ２つのクラスに分割することができる。すなわち遊離の生きているウィロイドで あるクラス！ならびにウィルソイドおよびサテライトウィロイドを含むクラスＩ Ｉ　（？ｊ［製するのにヘルパーウィルスを必要とするＲＮＡ分子）である。デ ルタ肝炎ウィルスはこの定義によればクラス■のＶＬＰである。

１９８４年に、ＢｒａｎｃｈおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３ ３巻、４５０〜４５５頁）はこれらの病原体の？ＪＩ製サイクルの方式を発表し たが、その後、この方式はいくつかの研究所で実施された実験で証明された。こ の「ローリングサークル」複製方式の主要な成分は、？ｌＩ製を行っているＶＬ Ｐが、その情報の単位長より長いコピーをつくり、次いでそのコピーが、ＶＬＰ それ自体のＲＮＡに組込まれたりボザイム活性体によってモノマーの大きさに開 裂されるということである。Ｓｈａｒｍｅｅｎら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６２ 巻、２６７４〜２６７９頁、１９８８年；　Ｂｒａｎｃｈら、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４３巻、６４９〜６５２頁、１９８９年；ならびにＷｕおよびＬａｉ、　５ｃ ｉｅｎｃｅ、２４３巻、６５２〜６５５Ｊｊ、１９８９年に、デルタ肝炎ウィル スについて、デルタストランドのりボザイム開裂点と、これらストランドを含有 するデルタ肝炎ウィルスのドメインの開裂点が定義されている。

ＶＬＰリボザイムの１つのタイプは、わずかに約３０ヌクレオチドで構成された 小さな構造ドメイン（「ハンマーへノド」と呼ばれている）により定義される。

Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（Ｎａｔｕｒｅ、　１９８７年）は、これらの短くて（１ｇ ヌクレオチド）比較的特種なりボザイム配列を、アボカドサンブロノチウイロイ ドのような植物ウィロイドならびにタバコ軸点ウィルスおよびアルファルファの トランジェントストリークウィルスのサテライトＲＮＡから最初に明かにした。

　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ　（１９８７年）、ならびにＦＯｒｓｔｅｒおよびＳｙｍ ｏｎｓ（二、５０巻、９〜１６頁、１９８７年）は、このクラスのりボザイムに よる開裂に関する要件を定義した。種々の実施態様および潜在的な用途もまた、 Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ ａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎによるＨａｓｅｌｏｆｆ、 　ＧｅｒｌａｃｈおよびＪｅｎｎｉｎｇｓのＰＣＴ／ＡＵ８８１００４７８　ｉ こＳ己載されている（１０９０１０５８５２として１９８９年６月２９日に公開 された）。

インビボでＲＮＡによって支配される全ての反応は、ＲＮＡ中の特異的なリン酸 ジエステル結合のエステル交換反応または加水分解反応を生じる。これらの反応 のいくつかのクラスでは、開裂または連結が行われる分子内部位置は、開裂部位 を含有するリン酸ジエステル鎖のセグメントと塩基対を形成する内部指針配列（ Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｇｕｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＩＧｓ）によって確認さ れる。テトラヒメナの配列は、その後酵母中に発見された配列と同様に真性の酵 素ではない。というのは、プロセシング中で再生されず、代わりに化学量論的比 率で作用するからである。インビトロで、所定条件下にて酵素活性を有しＲＮＡ を開裂し連結し得るこの配列のフラグメントを作ることはできるが、これらのフ ラグメントにとって不利なことは、これらフラグメントが非常に大きく　（元の ４１５ヌクレオチド配列の２００以上の残基を必要とする）、かつ特異性が制限 されていることである。その現在の形態で、テトラヒメナのりボザイムは４塩基 のａＫＲ配列を有し、ハンマーへノドのリボザイムは約１２塩基の認識配列を有 している。特定の４塩基配列を有する一般的なｍＲＮＡの大きさのＲＮＡは、１ ２塩基対を有するＲＮＡよりもはるかに有望で、これらのりポザイムはＲＮＡを 開裂するために補足的様式で使用できる。

ＩＧＳは、ＲＮＡに支配されている１クラスの反応、すなわち真巻、８４９頁、 １９８３年に記載され、Ａｌｔｍａｎ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、　６２ 巻１頁、１９８９年に概説されている）には存在しない。開裂部位を含有するリ ン酸ジエステル鎖のセグメントのヌクレオチド配列は、ＲＮＮアーゼ一対する異 なる基質には保存されていないため、該酵素にとって特有のＩＧＳとしては認識 し得ない。

リボザイムが試薬または治療薬として有用であるという示唆は文献中に多数みら れるが、その目的を達成したものはほとんどない。あらゆるクラスのりボザイム を利用するのに重要な知識、すなわちその機構を理解するための詳細な一次、二 次および三次の構造の知識、ならびにその基質および基質２３プロセスに関する 同様のデータをさらに得なければならない。

それ故に、本発明の目的は、ＲＮＮアーゼ−しくはこれと機能が同等のものを用 いて、標的ＲＮＡ配列を特異的に開裂する方法と組成物を提供することである。

本発明のその他の目的は、ＲＮＡをインビトロおよびインビボでともに特異的に 開裂して、ＲＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルス、ならびに１ＲＮＡ由来の過剰 のもしくは病原性のタンパク質の発現で生じる疾患のような、ＲＮＡの転写もし くは翻訳に関わる疾患の症状を治療する方法と組成物を提供することである。

発明の要約 標的部位に対して相補的でありかつ３−ＮＣＣＡ末端を有するヌクレオチド配列 の部分を形成することにより、ＲＮＮアーゼ−用いて、あらゆるＲＮＡ分子をも 標的として開裂することができることが発見された。この場合、該ヌクレオチド 配列は標的ＲＮＡとハイブリダイズし、ＲＮＮアーゼ−上記ｌ＼イブリントの塩 基対領域で基質を開裂するように設計されてしする。特異性（ま相補的配列によ って決定される。この配列は、ｌＯ〜１５ヌクレオチドの長さが好ましく、３゛ 末端にＮＣＣＡが続く相補的配列（こよっていくつかの塩基対が形成されるのを 妨害しない程度に非相補性ヌクレオチドを含有していてもよζ＼。

これらの実施態様は、ｍＲＮＡ由来、もしくはウィルスＲＮＡそれ自体の存在由 来の特異的タンノくり質の発現に関連する、ウィルス性疾患と障害を治療するの に特に有用である。

図面の簡単な説明 図１は、Ｊａｍｅｓら、Ｃｅ１ｌ、５２巻、１９頁、１９８８年に提案されたＭ Ｉ　ＲＮＡの二次構造のモデルである。

図２は、基質の配列と提案された二次構造（ＡとＢ）、および基質とＥＧＳ　Ｒ ＮＡとの複合体（Ｃ−Ｆ）を示す。太（Ａ矢印はＭＩ　ＲＮＡおよびＲＮＮアー ゼ−よる開裂部位を示す。細（λ矢印は、指定の制限エンドヌクレアーゼによる 消化の後、ｐＡＴｌのプラスミド鋳型から合成されたｐＡＴｌの切望の誘導体の ３°末端を示す。Ｅ、　ｃｏｌｉ由来の全ｔＲＮＡ前駆体中の変異しなＬｔ３つ 以上のヌクレオチドの配列には下線で示す。（Ｂ）におけるヌクレオチドと異な る（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）におけるヌクレオチドは箱枠で囲んでいる。（Ｂ ）中の星印は（Ａ）には存在しないリン酸ジエステル結合を示す。（Ｅ）の二重 らせん構造中に存在する対称成分は０２回転軸線である。図２Ｆの概略図は、− 級化して示したＥＧＳ　ＲＮＡの、基質ＲＮＡ上の開裂部位に対する関係を示す 。

発明の詳細な説明 開裂される部位に対して近位な短い塩基対の配列をつくり、これに３−ＮＣＣＡ を続けることによって、あらゆるＲＮＡ分子もＲＮＮアーゼ−よる開裂の標的と し得ることが発見された。好ましい実施態様では、相補的配列および、３−ＮＣ ＣＡ　（ここでは外部指針配列すなわちＥＧＳ″とじて結合していることを意味 する）が、基質と該相補的ヌクレオチド配列との間に塩基対を形成゛することに よって開裂部位に結合しており、その外部指針配列は、その相補的領域に対する ＮＣＣＡ３’とともに標的ＲＮＡとハイブリダイズする。その結果、塩基対配列 と、この塩基対配列に対して５°側のヌクレオチドとの連結点のＲＮＡ配列の部 位で開裂が起こる。特異性はその相補的配列によって決定される。

その配列は、１０〜１５ヌクレオチドの長さが好ましく、また塩基対を作るＥＧ Ｓの全能力を妨害しない程度に非相補的ヌクレオチドを含有し得る。

これらの実施態様は、インビボでのｌｌＲＮＡ由来の特異的なタンパク質の発現 に関連するウィルス性疾患と障害の治療、またはインビトロでのＲＮＡの開裂に 特に有用である。好ましい実施態様では、上記の標的配列が、開裂されるＲＮＡ を含有する細胞に投与され、そこで内在性ＲＮアーゼＰが、上記標的配列によっ て導かれてＲＮＡを開裂する。同じ試薬をインビトロで使用できる。

開裂されるＲＮＡ配列内の部位に、内在性リボザイムを導くオリゴヌクレオチド を構築した。好ましい実施態様では、そのオリゴヌクレオチドを、開裂すべきＲ ＮＡを含有する細胞もしくは溶液に直接投与する。別の実施態様では、そのオリ ゴヌクレオチドは、ウィルスもしくはプラスミドのベクター介して、標的ＲＮＡ を送達するために、細胞内に導入される。外部指針配列の重要な成分は、（１） 標的ＲＮＡ基質に特異的に結合して、その基質ＲＮＡの開裂部位の３°側に短い 塩基対配列を生成するヌクレオチド配列、および（２）末端３’−ＮＣＣＡ　（ Ｎはいかなるヌクレオチドでもよいが、プリンが好ましい）である。この配列は 一般に、標的ＲＮＡに相補的な少なくとも６もしくは７個のヌクレオチドの長さ であるが、通常は１Ｏ−１ｓヌクレオチドで構築されている。この配列は、標的 ＲＮＡが存在する条件下でハイブリダイズできるかぎり、全てのヌクレオチドが 相補的である必要はない。開裂速度は、ＲＮアー七Ｐ、標的ＲＮＡを含むハイブ リッド基質の二次構造、およびハイブリッド基質中の３゛〜ＮＣＣＡの存在によ って決まる。

ＲＮＮアーゼは、ＲＮＡ配列およびタンパク質で構成されているが、細菌、酵母 および真核細胞を含む全ての細胞に存在している。Ｅ、　ｃｏｌｉ由来のＲＮＮ アーゼが最もよ（特性決定されているが、酵母およびヒト細胞を含む真核細胞の ＲＮＮアーゼも単離され、その活性は分析されている。基質特異性と化学速度論 を含む構造と活性は、２つのホロ酵素間で非常によく類似している。ヒト細胞の ＲＮＡ成分（旧と呼ばれている）の配列決定をし、その二次構造と活性を、細菌 細胞のＲＮＡ成分であるＭｌの配列、二次構造および活性と比較した。この２つ のＲＮＡ成分の二次構造は類似していた。

真正細菌のＲＮＮアーゼのＲＮＡ成分であるＭｌがタンパク質の成分なしで基質 を開裂し得ることが、インビトロで実証された。

全分子を提供する必要はなく、触媒活性を有する部分のみ提供すれば充分である 。

標的ＲＮＡが開裂される細胞中に導入できるベクターに、ＭＩＲＮＡおよび必要 に応じてＣ５タンパク質の遺伝子を、標準的遺伝子工学の技術を用いてクローニ ングすることも可能である。

場合によっては、カチオンをＣ５のタンパク質の代わりに用いることができ９、 例えばｌｈＭ　Ｍｇ”から約１００ｍＭ　Ｍｇ”７：での濃度を、ＭＩ　ＲＮＡ とともに、Ｃ５タンパク質の代わりに使用し得る。

適切なベクターは、当業者に公知である。

ＲＮＮアーゼという用語は、本願で用いる場合、特にことわりがなければ、開裂 されるＲＮＡが位置している細胞中の内在性のＲＮＮアーゼを意味する。本願に 記載されている技術の多（は、製造法および試薬の起源については、当業者に公 知である。

方法と試薬に関する、本願で引用する文献の教示事項は、特に本願に援用し、当 該技術分野の技術の適用範囲とレベルを示すのを目的とするものである。

外部指針配列 あらゆるＲＮＡをＲＮＮアーゼによる開裂の標的にし得るという発見は、開裂さ れるリン酸ジエステル鎖のセグメントと部分的に塩基対を形成することによって 開裂部位を確認する「外部指針配列Ｊ　（ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｇｕｉｄｅ　５ｅ ｑｕｅｎｃｅ：ＥＧＳ）としてｔＲＮＡ前駆体のアクセプターステムの３゛側近 の配列を用いた研究に基づく。インビボで「触媒性」配列に共有結合し高度に保 存されている内部指針配列（ＩＧＳ）とは対象的に、ＥＧＳは未変性酵素に対し て外側にあり、高度に変異性である。

Ａ、３°−ＮＣＣＡ 本願に記載するヌクレオチド配列は全て通常の意味の略語で使用される。ＥＧＳ は３°−ＮＣＣＡを有する相補的配列を有している。なおＮはヌクレオチドであ るがプリンが好ましい。内在性ＲＮアーゼＰは、この相補的配列が二本鎖ＲＮＡ もしくはステム−ル−プ構造を形成するｓ側の部位まで基質を開裂する。ＭＩ　 ＲＮＡをインビトロで用いるほとんどの場合、開裂を行うために、３−ＮＣＣＡ と結合している塩基対ＲＮＡ以外は何も必要としない。

Ｂ、相補的配列 相補的配列は一般に、３から開裂の標的になっている部位までの配列に対し相補 的な少なくとも１Ｏ−１ｓヌクレオチドで構成されているか、あるいは開裂を促 進する条件下で標的配列と特異的に・・イブリダイズするのに充分な長さを有す るヌクレオチドで構成されている。

リボザイム活性体 全ての細胞がＲＮＮアーゼを含有している故に、開裂を細胞内で行う場合には、 リボザイム活性体を供給する必要はない。

本願で便宜上用いる場合、ＲＮＮアーゼという用語は、その起源にかかわらず、 Ｃ５タンパク質もしくはその類似体、およ−びＲＮＮアーゼの触媒活性に関与す るＲＮＡサブユニットで構成されているリボ核タンパク質を意味する。触媒とし て活性なＲＮＡは、細菌、酵母または他の真核細胞から単離されるヌクレオチド 配列を開裂するＲＮＡ、あるいは酵素的開裂、化学合成もしくは遺伝子からの転 写によって生成される機能的に活性なその誘導体を含む。このＲＮＡサブ二二、 トは、インビトロでタンパク質サブユニットが存在しない場合、必ずしも触媒活 性を示す必要はない。

Ａ、　ＭＩ　ＲＮＡの類似体およびタンパク質成分Ｃ５の類似体とを含有する内 在性ＲＮアーゼＰ ＭＩ　ＲＮＡの配列および推定二次構造を図１に示す。多数の研究が、Ｅ、　ｃ ｏｌｉ以外の細菌、酵母（例えばＬｅｅおよびＥｎｇｅｌｋｅ、Ｍｏ１．　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ、　９（６）巻、２５３６〜２５４３頁、１９８９年に報告され ている）、およびＨｅ１ａ細胞のような真核細胞（例えばＢａｒｔｋｉｅｖｉｅ ｚら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅ旦１．　３巻、４８８〜４９９頁、１９８９年に報 告されている）由来のＭＩ　ＲＮＡと機能が同等のものは、構造と基質特異性が 類似していることを実証している。旧ＲＮＡ、すなわちヒ１−ＲＮアーゼＰのＲ ＮＡ成分の配列と構造は、Ｂａｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、１８（１）巻、９７〜１０３頁、１９８９年に報告されている。種々の起源由 来のＲＮＮアーゼのＲＮＡ成分に関する報告を比較している概説が刊行されてい る。すなわちｌ／ｅｎｋｓｔｅｒｎ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　２１（４）巻 、ｐｔ、　１．７１９〜７２３頁、１９８８年：　ＰａｃｅおよびＳｍ１ｔｈ、 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５（７）巻、３５８７〜３５９０頁、 １９９０年；およびＰａｃｅら、Ｇｅｎｅ、８２（１）巻、６５〜７５頁、１９ ８９年である。

起源が異なるＲＮアーゼＰ゛の二次構造と基質特異性が類似しているため、たと え触媒として活性なＲＮＡサブユニットが明確に異なる配列を有し得ても、ＥＧ Ｓを用いることにより、いかなる細胞のいかなるＲＮＡをも標的とし得る。二次 構造は、長さが少なくとも２つの塩基対を有する相補的配列の分子内会合により 確定される。塩基対は標準的なＡ／ＵおよびＧ／Ｃまたは非標準的なＧ／Ｕおよ びＡ／Ｇなどで有り得る。

Ｂ、触媒活性を有する外在性ＲＮＡ ＥＧＳは、リボザイム活性を有する外在性ＲＮＡ配列または外在性ホロ酵素と組 合わせても使用し得る。リボザイム活性を有する配列は、全ＭＩ　ＲＮＡ分子、 もしくはこの分子の触媒活性を有していることが分かっている部分、または真核 の起源もしくは誘導体と機能的に同等なあらゆる分子を示し得る。

外在性のＲＮＡもしくはＲＮＮアーゼ−ＥＧＳと組合わせて利用される２つの基 本的な場合がある。すなわち、インビトロで細胞もしくは細胞のＲＮＮアーゼ− 存在しない場合、および開裂されるＲＮＡがＲＮＮアーゼ−含有していない細胞 の一部分に位置している環境内にある場合である。後者の場合、ＭＩ　ＲＮＡ　 （上記定義の）およびＣ５タンパク質をフードする遺伝子は、細胞内に遺伝子を 導入および発現させるための、当業者に公知の適切なベクターおよび他の方法を 用いて、開裂するのに望ましい位置で細胞内に導入される。高濃度のカチオンの 存在下でのＭＩ　ＲＮＡに関するインビトロでの研究に対しては、全ての場合１ 、［タンパク質を提供する必要はない。

実施例１　：　ＥＧＳが標的とするＲＮＡ基質のＭＩ　ＲＮＡによるインビトロ での開裂 ＥＧＳは、Ｅ、　ｃｏｌｉ由来のＲＮＮアーゼ−よって基質を開裂するために必 須であり、標的配列からはずしたときでもまだ機能を有していることが実証され た。ＥＧＳ含有ＲＮＡ　（ＥＧＳ　ＲＮＡ５）を用いて、ＲＮＮアーゼ一対する 非常に小さなモデルの基質を構築し、基質の認識と開裂の機構を研究した。

これらの研究の結果は、いずれのＲＮＡも、特別に設計されたＥＧＳ　ＲＮＡと 会合するならば、ＲＮＮアーゼ−よって標的され、インビトロもしくはインビボ で特異的に開裂されることを示しテイル。ＥＧＳ　ＲＮＡに対する必須の基準は 、このＥＧＳ　ＲＮＡが、標的配列とハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡおよび３ −ＮＣＣＡを形成する配列を有していることである。

ＲＮＮアーゼ−よって開裂する場合のＥＧＳの重要性は、ＲＮＮアーゼ−有効に 開裂されると報告されている最小のモデル基質であるｐＡＴｌの誘導体で試験し た。なおこの基質ｐＡＴＩは、ＭｃＣｌａｉｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３８巻、 ５２７〜５３０頁、１９８７年に記載されており、この文献の教示事項は本願に 参考として援用される。基質を、ＥＧＳ　ＲＮＡの存在下もしくは非存在下で、 ＭＩ　ＲＮＡもしくはＲＮＮアーゼ−よる開裂反応について検定し、次にオート ラジオグラフィに続くポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。ヌ クレオチドは、”ｎｔ”という略号で示す。

材料および方法 ０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　［ｐＡＴｌ（Ｐ：５１ｎｔ）、　Ｔａｑｌ　ｐＡＴｌ（ Ｔ；３１ｎｊ＞、Ｈｉｎｆｌ　ｐＡＴＬ　（Ｈ：２４ｎｔ）または１７−ｎｔＲ ＮＡ］に未標識の、および口α−ｆｆ２ｐ］−ＧＴＰで標識した基質ＲＮＡの混 合物を、室温で、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

まタハ未標識ｔ７）ＥＧＳ　ＲＩＪＡを含有する０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　［２９ −ｎｔ　ＥＧＳＲＮＡ、　２Ｏ−ｎｔ　ＥＧＳ　ＲＮＡまたはｌ７−ｎｔ　ＲＮ Ａ］と混合し、各混合物を未１識の酵素あり、またはなしで反応緩衝液内で３７ ℃でイン牛二ベー／−Ｊンした。

切望のｐＡＴＩ　ＲＮＡを、ＭｃＣｌａｉｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８巻、 ５２７頁、１９８７年に報告されているｐＧＥＭ２−ＡＴＩプラスミド鋳型から 、５Ｐ５ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。ＭｃＣｌａｉｎらは、単にｔＲ ＮＡＰＨＥ遺伝子のアクセプターステム、Ｔステム・ループおよび３′末端ＮＣ ＣＡ残基たけを含有するＡＴＬと呼ぶ合成誘導体を、Ｐｒ。

＋ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社から入手した発現プラスミドｐＧＥＭ−２のＥｃｏ Ｒｌ／Ｐｓｔ　Ｉ部位に挿入したと報告している。メーカーのプロトコルを利用 して、プラスミドｐＧＰ１８　ＤＮＡをＥｃｏＲＩ、’Ｐｓｔ　Ｉでｔ’ｆ４化 し、上記合成遺伝子を保存するフラグメントを単離し、次にプラスミドｐＧＥＭ −２のＥｃｏＲＩ／　Ｐｓｔ　Ｉ部位に挿入した。前記合成遺伝子を有するプラ スミドｐＯＥＭ−２をＰｓ目で消化し、得られた線形ＤＮＡをＳＦ３　ＲＮＡポ リメラーゼによってインビトロで転写した。

ＳＦ３による転写により短い５゛リーダー配列ｐｐｐＧＡＡＵＡｃＡｃＧＧＡＡ ＵＵＣおよび、Ｐｓｔ　Ｉで消化された制限酵素部位の残留部分に相当する余分 の３’Ｃ残基とを得た。３−末端の一本鎖領域を有する消化された鋳型は、Ｅ、 　ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントとともにインキ一ベ ートしてから転写し、そしてｌ７−ｎｔ　ＲＮＡおよびＥＧＳ　ＲＮＡは、Ｊ、 　Ｆ、　Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｎｕｃｌｅｉａ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５ 巻、８７８３頁、１９８７年に記載されているオリゴデオキシリボヌクレオチド 鋳型からＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成し、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙ ｍｏｎｓ、　Ｃｅ１１．４９巻、２１１頁、１９８７年に記載しであるようにし て精製した。野生型ＭＩ　ＲＮＡと０５タンパク質は、Ａ、　Ｖ　１ｏｑｕｅら 、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、２０２巻、８３５頁、１９８８年に記載されて いるのと同様にして調製した。これらの文献の教示事項は本願に参考として援用 される。

（以下余白） 基質、ＥＧＳ　ＲＮＡ、　ＭＩ　ＲＮＡおよびＣ５タンパク質の濃度はそれぞれ Ｓｏ、　６０．５およびｌｏＯｎＭであった。　ＭＩ　ＲＮＡとの反応は、５０ ＩＩＭトリスＴ門−ＨＣ１ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｌｏｏｍＭ　 ＮＨ４Ｃｌ、４％ポリエチレンレンゲリコール６０００〜７５００、および０． ０６ｍＭ　ＥＤＴＡの混合物中で１００分間、３７℃でインキュベートして行っ た。ＲＮＮアーゼ−の反応は、５０１１Ｍトリス”−ＭＣＩ　ｐＨ７，５、ｉｏ ＋ａＭ　ＭｇＣｌ２．１００ｉＭｌＪ１００ｉ、０．０６ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０ ．２ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ、　１．２ｍＭ　ＮａＣ１および２８ＩＩＩＭ尿素の混合 物中で２０分間、３７℃でインキュベートして行った。

反応はホルムアミドと過剰のＥＤＴＡを添加して停止させ、生成物を７Ｍの尿素 を含有する１９％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付し、次いでオートラン ジオグラフィーで分析した。

試験結果 反応条件と試験結果は表１に要約しである。ＥＧＳを欠失した切望の３′末端を 冑するｐＡＴｌの誘導体で、Ｈｉｎｆｌ　ｐＡｔｌおよびＴａｑｌ　ｐＡＴｌと 呼ばれるもの（それぞれｐＡＴｌの５゛−末端の２４ｎｔと３１ｎｔとで構成さ れている；図２Ｂ）は、ｐＡＴｌが有効に開裂される条件下で、Ｅ、　ｃｏｌｉ 由来のＲＮＮアーゼ−（ＭＩ　ＩＩＩＮＡプラスＣ５タンパク質）およびＭＩ　 ＲＮＡのどちらによっても開裂されなかった。しかし、欠失したＥＧＳ　（２９ −ｎｅのＥＧＳ　ＲＮＡまたは２Ｏ−ｎｔのＥＧＳ　ＲＮＡ　（図２のＣとＤ） を含有するＲＮＡを反応混合物に添加したところ、Ｈｉｎｆｌ　ｐＡＴｌとＴａ ｑｌ　ｐＡＴｌは、ｐＡＴｌと同じ開裂部位で有効に開裂された。２０−ｒ＋ｔ と２９−ｎＬのＥＧＳ　ＲＮＡは、ＭＩ　ＲＮＡもしくはＲＮＮアーゼ−よるｐ ＡＴｌの開裂反応を刺激した。さらに、基質およびＥＧＳ　ＲｈＡを同じ配列か ら作ることができるように設計されたｌ　？−ｎ　Ｌの１ｉＮＡ　Ｃ図２Ｅ）も ＲＮＮアーゼ−よって有効に開裂されたが、ＭＩ　ＲＮＡでは不完全にしか開裂 されなかった。開裂部位は、Ａ、　Ｃ，ＦｏｒｓｔｅｒおよびＲ，）１．　Ｓｙ ｍｏｎｓ、　Ｃｅ１ｌ、　４９巻、２１１頁、１９８７年に記載されているよう にして測定した。すなわち、未標議のｌ７−ｎｔ　ＲＮＡをＲＮＮアーゼ−よっ て開裂することによって生成した開裂フラグメントの３′−末端をＣ５’−３２ Ｐ〕−ｐＣｐで標識し、そのＲＮＡをＲＮアーゼＴ２で消化してモノヌクレオチ ドにし、次いでクロマグラフィに付して測定した。唯一の検出された放射性ヌク レオチドがウリジン３′　−モノリン酸であった。

ｌ７−ｎｔのＲＮＡは、２Ｏ−ｎｔもしくは２９−ｎｔのＥＧＳ　ＲＮＡと同じ オクタヌクレオチド、の３′−末端配列を有しているけれども、ＨｉｎｆｌｐＡ ＴｌとＴａｑｌ　ｐＡＴＬは、１フーｎｔ　ＲＮＡの存在下、ＭＩ　ＲＮＡとＲ Ｎアーゼｐのどちらによっても開裂されなかった。このことは２Ｏ−ｎｔと２９ ｎｔのＥＧＳ　ＲＮＡの機能が、それらの８個の３′末端ヌクレオチドに基づい たものではなかったことを示している。しかしｐＡＴｌ（ならびに恐らくは２Ｏ −ｎｔおよび２９−ｎｔのＥＧＳ　ＲＮＡ）の３個の３°−末端ヌクレオチドの うちの少なくとも１つは重要である。

というのは、切望の小さな３゛−末端を有するｐＡＴｌの誘導体であってＢａｎ ｔ　ｐＡＴｌ、Ｎ１ａｌＶ　ｐＡＴｌ、Ｂｓｐ１２８６　ｐＡＴｌと呼ばれるも のく図２Ｂ）は、ＭＩ　ＲＮＡとともにインキュベートした０、１ｍＭＥＤＴＡ 中のｐＡＴｌと正確に同じ条件下で、基質として機能しなかったからである。こ の結果は、ｐＡＴ　１のＣＣＡＣＯＭ配列の５°−近位のＣの塩基置換が劇的に 開裂を抑制するためで驚くに当たらない。

ｌ５−ｎｔのＲＮＡと共泳動（ｃｏｗ　ｉｇｒａ　ｔｅ）するＴａｑｌ　ｐＡＴ ＩもしくはＨｉｎｆｌ　ｐＡＴＩは５′開裂フラグメントである。なんとなれば 、それは［ｙ−３２Ｐ）　−ＧＴＰで標識したＴａｑｌ　ｐＡＴＩもしくは）ｌ ｉｎｆｌ　ｐＡＴｌを、２Ｏ−ｎｔもしくは２９−ｎｔのＥＧＳ　ＲＮＡの存在 下、ＭＩ　ＲＮＡもしくはＲＮＮアーゼ−よって開裂して生成した唯一の放射能 標識生成物だからである。ｐＡＴｌ、　Ｔａｇｌ　ｐＡＴＩおよびＨｉｎｆｌ　 ｐＡＴＩの期待される３′開裂フラグメントは、それぞれ３６ｎｔ、　１６ｎｔ および９０ｔの長さである（未開裂のＲＮＡおよび３″開裂フラグメントが不均 質なのは、ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応の終止が不均一だからで ある）。ｌ７−ｎｔ　ＲＮＡの５゛　および３′の開裂フラグメントは、それぞ れ６と１１のｎＬ長さである。

図２Ｆは、ＦＪＧＳ　ＲＮＡと塩基対を形成するＲＮＡ基質の概略図であり、矢 印は、相捕的な−ＮＣＣＡ配列の結合部に近位の基質ＲＮＡ上の開裂部位を示す 。

（以下余白） 表１　：　ＭＩ　ＲＮＡおよびＲ’４アーゼＰによるＲＮＡ基質の開裂Ａ、ＭＬ 　ＲＮＡ　ヒめ　イン〒＞へ゛−″／多ンＩＰ（閂１ＲＮＡｔ宮番１つ （以下余白） ム１　坑で Ｂ、にＮ７−りＰｖ硝　インｆ＞へ゛−ンタンＩＰ（Ｒ＃７−ｖＰｔ含シイつ Ｐ　アクセプターステム、Ｔステムループ、ｔＲＮＡｐｈ”）３’ＣＣを含有す るｐＡＴ　１ ）１　ｐＡＴＩの５°末！２４ｎＬ８含宵するＨｉｎｆｌ　ｐＡＴＩＴ　ｐＡＴ ｌの５°末端３１ｎｔを含有するＴａｑ　Ｉ　ｐＡＴ１１７ｎｔは、２０．２９ ｎｔ配列と同Ｌ；８ｎｔの３゛末瑞を宵する。

Ｈｉｎｆｌ　ｐＡＴ１／２Ｏ−ｎｔ　ＥＧＳ　ＲＮＡおよびＴａｑ！　ｐＡＴｌ ／２Ｏ−ｎｔ　ＥＧＳ　ＲＮＡによる試験結果は、　ｔＲＮＡ前駆体のアミノア シルアクセプターステム中に存在する７−ｎｔのＥＧＳより長いＥＧＳ　（図２ Ａ）は機能性であり、ｔＲＮＡ前駆体の保存ＧＵＵＣループはＲＮＮアーゼ−よ って有効な開裂を行うのには不必要であることを示している。ｌ７−ｎｔのＲＮ Ａによる試験結果は、ＲＮＮアーゼ−よる有効な開裂を行うのに必要なｔＲＮＡ 前駆体の部分はア／ルアミ／アクセプターステムならびにいくつかの追加の５“ −末端および３′−末端の配列である。ｌ７−ｎｔのＲＮＡの開裂部位（図２Ｅ ）は、インビボにみられるＲＮＮアーゼ−多くの基質の場合のように、潜在的に 二本鎖の領域内にある。ｌ７−ｎｔ　ＲＮＡは、ＲＮＮアーゼ−はなくてＭＩ　 ＲＮＡによる開裂が不充分であるということは、開裂部位の５゛側のヌクレオチ ドが塩基対を作ることが原因かもしれない。この場合、ＭＩ　ＲＮＡおよびＲＮ Ｎアーゼ−よって開裂される部位の位置が、単に一本鎖と二本鎖の領域の結合部 だけでな（、ある程度は保存ＮＣＣＡ配列の位置によって決定され得るためであ る。

基質／ＥＧＳ　ＲＮＡ複合体における開裂部位の選択に関するこの一般規則には 例外がある。すなわち、タバコモザイクウィルスの誘導体のようなＲＮＮアーゼ −基質は、予想開裂部位より１ヌクレオチド離れた部位で開裂されるか、または 全ＮＣＣＡ配列がない場合に正確に開裂される。

実施例２　：　Ｅ、　ｃｏｌｔ由来のＭＩ　ＲＮＡによるウィルスＲＮＡの開裂 Ｅ、　ｃｏｌｉのＱβバクテリオファージは充分に特性決定がなされているＲＮ Ａウィルスであり、９０％以上のファージＲＮＡがウィルスタンパク貫をフード し、そのことはＫｒａｍｅｒおよびＭｉｌｌｓ。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９＠、　Ｓ１０’Ｊ−５１２４頁、１９８ １年に概説されている。現在、再構成されたＲＮＮアーゼ−このウィルスＲＮＡ を開裂することが実証されているので、これによりＲＮＮアーゼ−、標的ＲＮＡ とＥＧＳとの間に形成された）・イブリッド基質と同等の構造を有する長いウィ ルスＲＮＡ基質を開裂できることが示される。

ｐ３２で標識されたミディバリアント（ｍｉｄｉｖａｒｉａｎｔ）ＲＮＡを、５ ０ｍＭ）リス”−ＨＣｌ　（ｐＨ＝７．５＞、　ｌｏｍＭ　ＭｇＣｌ２および１ １００ｎ　ＮＨ４Ｃｌを含有する緩衝液中で、再構成したＲＮＮアーゼ−（ＭＩ 　ＲＮＡプラスＣ５−タンパク質）の存在下、１０〜１５分間３７℃でインキュ ベートした。

１０モルの尿素を含有する追跡用色素（ブロムフェノールブルー＋キシレンシア ／−ル）を添加して反応を停止させ、得られた反応混合物を変性ポリアクリルア ミドゲル（７モルの尿素を含有する５％ポリアクリルアミド変性ゲル）に負荷し た。

反応生成物を電気泳動で検出しオートラジオグラフィーで分析した。

この試験の結果は、個の場合ステム−ループ構造を作り３′−ＮＣＣＡが続くオ リゴヌクレオチドで形成される塩基対の短い配列に対して５゛側の基質の部位で 、ＭＩ　ＲＮＡがウィルス基質を開裂できることを実証している。

研究室用もしくは臨床用の試薬としてのＥＧＳの用途外部指針配列には、インビ トロの試薬として制限酵素と同様の方式の用途、ならびに治療用試薬として、イ ンビボで特定の細菌およびウィルスの配列を開裂および不活性化する用途がある 。外部指針配列は、所望の開裂部位に近位の配列に対して相補的でかつ標的ＲＮ Ａに対して特異的な１０〜１５塩基の配列および３’−ＮＣＣＡ配列とで構成さ れているが、ＥＧＳに対し相補的な配列を有するあらゆるＲＮＡに、内在性ＲＮ アーゼＰもしくは添加したＭＩ　ＲＮＡの存在下で添加することができ、その結 果該ＲＮＡは標的部位で開裂される。このような方法で、ヒト細胞のＲＮＮアー ゼ−ような細胞中の内在性ＲＮアーゼＰの活性は、適切なＥＧＳ　ＲＮＡを用い ることによって、特異的なメツセンジャーＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ、他のＲＮＡ を破壊するのに利用できる。

１、インビトロの用途に用いられる試薬ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは分子生 物学者とって計り知れないほど貴重な試薬である。制限フラグメントの大きさの 、？ターンが、ＤＮＡ分子間の配列関係を決定するために利用され、大きなりＮ Ａは開裂されて、遺伝子工学、配列決定およびタンノｆとができる。一方すボザ イムは、かなり大きな配列特異性でＲＮＡを開裂する。

小さくて特異的なりボザイムは、特異的な標的配列とＭＩ　ＲＮＡもしくはこれ と機能が同等の物を結合させて調製することができる。好ましい実施態様におい て、この２つの配列は別個であるか、あるいはこれら２つの配列は、オリゴヌク レオチドのリンカ−を用いて結合させることができ、標的配列および開裂する触 媒配列に対して、標的配列には結合のための、そして触媒配列には開裂のための 、両配列間に充分なフレキシビリティをもたらす。いくつかのインビトロの実施 態様では、Ｃ５タンパク質に代わる置換体として、高濃度のカチオン、最も好ま しくはｙ　ｇ　２°を添加することが好ましい。

２、治療法 ａ、相補的配列の決定および調製 ｍＲＮＡおよび構造ＲＮＡ自体によってコードされるタンパク質を含むＲＮＡと して発現されるあらゆる細胞遺伝子産物は、標的ＲＮＡおよび３’−ＮＣＣＡＣ Ｃ−結合するために適切な、配列および／または構造のための領域を含むように 加工された配列を用いることにより、ＲＮＮアーゼ−特異的に開裂し不活性化す る標的とすることができる。この細胞遺伝子産物は、その産物が正常細胞の成分 でない場合の、工遺伝子産物のようなｍ瘍遺伝子の修飾産物；旧Ｖ７ＪＩ製のた めの必須の遺伝子でコードされているようなウィルスタンパク質；または細菌タ ンパク質であり得る。

多くの場合、感染性もしくは病原性の作用因子としての重要な遺伝子は単離され て配列決定がなされている。適切な相補的配列は、標準の方法、試薬、およびこ れらの公知の配列に対する装置を用いて合成することができる。

１）、　ＥＧＳを標的ＲＮＡに対して送る適切な医薬組成物の調製開裂するため に標的にされた細胞内ＲＮＡにＥＧＳを送るのに２つの主要な機構、すなわち拡 散法およびベクター経由がある。

上記のように、疾患の過程で作用するいかなるＲＮＡでも標的にすることができ 、および適切な相補的な配列は、合成によるかまたはクローニングされた配列を コピーすることによって作ることができる。ＲＮアーセＰは主として真核細胞の 核内に見られるので、感染した細胞に適切なＥＧＳを投与することによってほと んど阻止されると考えられる感染性作用因子は、重要なＲＮＡ配列が核内で転写 されている作用因子である。細胞核内で複製する。ウィルス作用因子の主要な例 には、ヘルペスウィルスｉｌｌ　（ｊｌ純ヘルペスウィルス、水痘Ｗｒ状庖ＦＥ ウィルス、サイトメガロウィルスおよびエプスタイン−バーウィルス）、アデノ ウィルス類、麻疹のようなバラミクソウィルス類、およびヒト免疫不全ウィルス （ＨＩＶ　１．ＨＩＶ　１１および旧Ｖ　ｌ１１）のようなレトロウィルス類が ある。

ＥＧＳのベクターによる送達 好ましいベクターは、ＥＧＳが転写されて核内に放出される、核にＥＧＳを直接 導入するレトロウィルスのようなウィルスベクターである。適正な条件下で、Ｅ ＧＳは標的ＲＮＡとハイブリダイズし、次に内在性ＲＮアーゼＰが上記のハイブ リダイズされたＲＮＡを、ハイブリッド領域の５°側で開裂する。

欠陥レトロウィルスは、自らのＲＮＡ配列をＤＮＡの形態で宿主の染色体中に組 込むが、ＥＧＳを宿主中に組込むように加工することができ、その宿主内でコピ ーが作られて細胞質に放出され、標的ヌクレオチド配列と相互作用を行う。

標的治療の手段として、特別に加工された核酸配列を、造血細胞に関するウィル ス性疾患、例えばエイズに罹患している患者の造血細胞に導入する能力には大き な可能性がある。

特定の遺伝子配列をヒト細胞へ導入するために現在利用できる最も有効な方法は 、ヒト細胞に遺伝子を高効率で送達するビヒクルもしくはベクターとして働＜Ｒ ＮＡ含有レトロウィルスを使用する方法である。

ＲＮＮアーゼ−基づいた治療法も、ＨＩＶ−１の広がりを防止する手段および／ または感染した個体に免疫機能を付与することができる旧Ｖ−１耐性のＴ細胞集 団を提供する手段として使用し得る。旧Ｖ−１に対する抗体を有していると新た に診断されたかの候補である。この方法は、患者のｔＵ幹細胞をいくらか取出し 次いで軽度にｃｙｔｏｂｌａｔ　ｉｏｎを行う必要がある。取出した細胞は実験 室で適切なＥＧＳ組成物で処理した後、同じ個体に戻される。この処理された細 胞は、愚者の体内で発育してＴ細胞を含む成熟造血細胞になる。これらのＴ細胞 は、正常な免疫機能を有し、かつ最も重要なことは、細胞内機能的に免疫化がな され、患者の体内にまだ存在している旧Ｖ−ｔによって該細胞が破壊されるのを 防止する。

ｔＵ幹細胞と造血細胞は、比較的容易に取出され、元に戻し、細胞集団を自己再 生させて転移された遺伝子を増殖させることができる。上記のように、ＨＩＶ− １およびＨＴＬＶ−１はこれらの方法への適０合が容易なはずである。ＲＮＮア ーゼ−よる治療方法を用いることによる、癌細胞の発生と維持に関与する活性化 された腫瘍遺伝子のような細胞内の他の望ましくない遺伝子の選択的な不活性化 を、長期間的視野から予想することができる。

ＨＩＶによる感染症を予防もしくは制限するのを目的とじて現在使用されている 方法とは対照的に、ＲＮＮアーゼ−用いる方法を使用して、ＨＩＶ感染症および ＥＧＳを有するレトロウィルスベクターで形質転換されている白血球細胞に関連 する疾患を治療し治癒させることが可能なはずである。ＥＧＳを利用し、ＲＮＡ を標的としてＲＮＮアーゼ−開裂して治療できる特定の疾患の例としては、ＨＴ ＬＶ−１だけでなくレトロウィルスで誘発される各種の臼血病が含まれる。治療 することができるかもしれない他のタイプの形質転換組織としては、公知の配列 の同定された腫瘍遺伝子を有する腸および乳房の細胞がある。

直接投与に用いる局所用および他のＥＧＳ組成物ＥＧＳはまた、適切な医薬担体 中に含有させて、局所的もしくは全身的に投与し得る。Ｅ、　Ｖｌ、　Ｍａｒｔ 　ｉｒ＋ｇ集、第１５版、■■■ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　 Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

１９７５年）には代表的な担体および調製法が記載されている。

なおこの文献の教示事項は、本願に参考として援用されている。またＥＧＳは、 適切な生体適合性のマイクロカプセルもしくはリポソームで被包化して食細胞に 向けることができる。このような系は、当業者に公知である。

治療に用いる場合、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの転写を阻害するＥＧＳ の有効量および、医薬として受容できる担体とで構成された医薬組成物として投 与される。単独もしくは混合して用いられる代表的な医薬の担体の例には、１つ 以上の固体、半固体、もしくは液体の希釈剤、充填剤および非毒性で不活性かつ 製薬的に受容できる製剤アジユバントが含まれる。このような医薬組成物として は、単位投与剤形、すなわち所望の治療応答を生じるように計算された投与の一 回量もしくは複数回量に相当する医薬の予め決められた量を含有する物理的に別 個の単位が好ましく、これは通常、錠剤、口内錠剤、カプセル剤、散剤、水性も しくは油性の懸濁剤、シロ７ブ剤、エリキフル剤および水溶液剤として調製され る。

好ましい組成物としては、例えば単純ヘルペスウィルスによって生じるようなウ ィルス病巣に塗布するための局所用組成物がある。これらの組成物は一般に担体 １ｍｌ当り、１〜１００ｎＨのオリゴヌクレオチドを含有する。経口組成物は好 ましいものではないが、錠剤もしくはカプセル剤の形態であり、結合剤（ｆｌｌ えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポ リビニルピロリドン）、充填剤（例えばラクトース、糖、トウモロコシデンプン 、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）　、ｉｆ［１ｆｌｌ　Ｕｌ えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ ）、崩壊剤（例えばデンプン）および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム） のような通常の賦形剤を含有し得る。通常の医薬用ビヒクルによるＥＧＳの溶液 もしくは懸Ｒ液は、静脈注射用の水溶液剤または筋肉内注射用油性懸濁剤のよう な非経口組成物として使用される。

臨床に使用する場合、各症例の投与量と投与計画は、慎重に調節し、被投与者の 年齢、体重及び症状、投与経路ならびに疾病の状態と重症度を確実にかつ専門的 に判断し熟慮して実施しなければならない。

あらゆるＲＮＡを標的としてＭＩ　ＲＮＡもしくはＲＮアーゼＰで開裂する方法 と組成物の修飾と変更は、当業者には前記の詳細な説明から明白であろう。この ような修飾と変更は本願の特許請求の範囲の°適用範囲内にあると意図される。

ＦＩＧＵＲＥ　２ｄ ｐｐｐＧＡＡＵＡｃＡｃＧＧＡＡＵＵｃ　ＡＣＣＡＣｏ。

ノ’Ｇ　−Ｃ −Ｇ −Ｇ Ｃ＠Ｇ −Ｃ −Ｃ −ｔＪ Ｃ自Ｇ −Ｃ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ゲリエールータカダ、セシリア　エル。

アメリカ合衆国　コネティカット　０６５１５−１６１５　ニュー　ヘイブン、 ラムズデルストリート５７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｎがいずれかのヌクレオチドである３′−ＮＣＣＡ配列、および基質に対し て棺補的なヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチド配列が、その塩基対形成 領域の５′側のヌクレオチドの位置でＲＮアーゼＰもしくは触媒として活性なそ の同等物により開裂が促進される条件下で、基質と塩基対を形成する外部指針配 列を含有する、 ＲＮＡ配列を標的として、ＲＮアーゼＰまたは触媒として活性なその同等物によ り開裂を行うための、組成物。 ２．３′−ＮＣＣＡのＮがプリンである、請求項１に記載の組成物。 ３．前記相補的配列が少なくとも７個のヌクレオチドの長さである、請求項１に 記載の組成物。 ４．ＲＮアーゼＰが、真正細菌と真核生物のＲＮアーゼＰからなる群から選択さ れる、請求項１に記載の組成物。 ５．ＲＮアーゼＰの触媒として活性な同等物が、細菌、酵母および他の真核細胞 由来のＲＮアーゼＰのＲＮＡ成分からなる群から選択される、請求項４に記載の 組成物。 ６．ＲＮＡが、原核細胞由来の、ＭｌＲＮＡおよびそれとの機能的同等物からな る群から選択される、請求項５記に記載の組成物。 ７．ＲＮＡに外部指針配列を送達することをさらに包含する、請求項６に記載の 組成物。 ８．Ｃ５タンパク質またはこれとの機能的同等物をさらに含有する、請求項５に 記載の組成物。 ９．１０ｍＭの量Ｍｇ２より大きい当量の濃度の二価のカチオンをさらに含有す る、請求項５に記載の組成物。 １０．ＲＮアーゼＰが配列を標的とし、その配列がＲＮアーゼＰによって開裂さ れて、腫瘍遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、ウィルス遺伝子、ならびに酵素、 ホルモン、補因子、抗体、および成長因子からなる群から選択されるタンパク質 をコードする細胞性ｍＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡを不活性化する、 請求項１に記載の組成物。 １１．局所、皮下、非経口および腸内の投与に適切な担体からなる群から選択さ れる医薬用担体をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。 １２．開裂する標的のＲＮＡを含有する細胞中に前記外部指針配列を導入するた めのベクターをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。 １３．前記ベクターがレトロウイルスのベクターである、請求項１２に記載の組 成物。 １４．Ｎがいずれかのヌクレオチドである３′−ＮＣＣＡ配列、および基質に対 して相補的なヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチド配列が、その塩基対形 成領域の５′側のヌクレオチドの位置でＲＮアーゼＰもしくは触媒として活性な その同等物により開裂が促進される条件下で、基質と塩基対を形成する外部指針 配列を含有する、 ＲＮアーゼＰまたは触媒として活性なその同等物と組合わせて提供することを包 含する、 ＲＮＡを特異的に開製する、方法。 １５．３′−近位ＮＣＣＡ中のＮがプリンである、請求項１４に記載の方法。 １６．前記相補的配列が少なくとも７個のヌクレオチドの長さである、請求項１ ４に記載の方法。 １７．ＲＮアーゼＰが、真正細菌および真核生物のＲＮアーゼＰからなる群から 選択される、請求項１４に記載の方法。 １８．ＲＮアーゼＰの触媒として活性な同等物が、細菌、酵母および他の真核細 胞由来のＲＮアーゼＰのＲＮＡ成分からなる群から選択される、請求項１７に記 載の方法。 １９．ＲＮＡが、原核細胞由来の、ＭｌＲＮＡおよびそれとの機能的同等物から なる群から選択される、請求項１８に記載の方法。 ２わ．標的ＲＮＡが細胞内にあり、ＲＮアーゼＰがその細胞に内在している、請 求項１４に記載の方法。 ２１．ＲＮアーゼＰとの機能的同等物を前記外部指針配列に送達することをさら に包含する、請求項１４に記載の方法。 ２２．ＲＮアーゼＰが配列を標的とし、その配列がＲＮアーゼＰによって開裂さ れて、腫瘍遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、ウィルス遺伝子、ならびに酵素、 ホルモン、補因子、抗体および成長因子からなる群から選択されるタンパク質を コードする細胞性ｍＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡを不活性化する、請 求項１４に記載の方法。 ２３．局所、皮下、非経口および腸内の投与に適切な担体からなる群から選択さ れる医薬用担体に組合わせて、前記外部指針配列を送達することをさらに包含す る、請求項１４に記載の方法。 ２４．前記外部指針配列を、開製する標的のＲＮＡを含有する細胞中に該外部指 針配列を導入するベクターと組合わせて送達することをさらに包含する、請求項 １４に記載の方法。