ES2255703T3 - Acidos nucleicos y procedimientos para la utilizacion de los mismos para el control de patogenos viricos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION CONSISTE EN UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE NO MARCHA DE FORMA NATURAL CAPAZ DE BLOQUEAR O INTERFERIR EN UN INTERMEDIO REPLICATIVO DE UN VIRUS, UN VIRUSOIDE O UN VIROIDE. LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO PUEDE CONTENER UNA RIBOZIMA O UNA PLURALIDAD DE RIBOZIMAS. ALTERNATIVAMENTE, LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO PUEDE SER UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO ANTISENTIDO. LA RIBOZIMA PUEDE SER UNA RIBOZIMA EN FORMA DE U, UNA RIBOZIMA EN FORMA DE CABEZA DE MARTILLO, UNA RIBOZIMA DE ARNASA P, UNA MINIMIZONA O OTRA MOLECULA DE ARN CATALITICA. EL VIRUS PUEDE SER UN ANIMAL, UN MAMIFERO, UNA PLANTA, UN HONGO, UN PROTOZOO, UNA LEVADURA, UN VIRUS BACTERIANO O UN VIRUS HUMANO. LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO SE PUEDE EXPRESAR EN LA CELULA O SE PUEDE PREFORMAR O ADMINISTRAR EX VIVO. EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN LOS METODOS PARA CONTROLAR LA INFECCION DE UN AGENTE INFECCIOSO PATOGENICO EN UNA PLANTA O EN UN ANIMAL.

Description

Ácidos nucleicos y procedimientos para la utilización de los mismos para el control de patógenos víricos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere generalmente al control de patógeno en plantas y más particularmente al control de virus y viroides en plantas transgénicas.

La capacidad de controlar los patógenos vegetales ha sido desde hace mucho tiempo un objetivo principal de la investigación agronómica. En la investigación contemporánea, los esfuerzos se han centrado en la tecnología del ADN recombinante en los esfuerzos por desarrollar plantas resistentes a enfermedades. Sin embargo, a pesar de los efectos comercialmente devastadores de diversas enfermedades sobre, por ejemplo, los cultivos, se han realizado pocos progresos en el control de la infección de plantas por viroides y por virus.

Un viroide es un agente infeccioso patógeno vegetal que comprende una molécula de una sola cadena de ARN circular desnudo (es decir, no asociado a proteínas). La mayoría de los viroides conocidos presentan una estructura similar y aparentemente se basan únicamente en enzimas de la célula huésped para replicarse. La replicación se cree que ocurre en el núcleo de la célula huésped, donde el ARN se encuentra asociado con el nucleolo. El ARN(+) viroide infeccioso se transcribe en un ARN(-) oligomérico complementario de varias veces la longitud unitaria del ARN(+) del viroide. A continuación, los oligómeros de ARN(-)sirven probablemente como moldes para la síntesis de ARN(+) que después se cortan en cadenas lineales de longitud unitaria y a continuación se ligan para formar moléculas de ARN(+) infeccioso de una sola cadena.

La clase viroide de patógenos vegetales está constituida por moléculas de bajo peso molecular de una sola cadena de ARN. Son los agentes de replicación autónoma de dimensiones más reducidas que se conoce, con un intervalo de tamaño comprendido entre 246 y 375 nucleótidos. Se ha demostrado que el ARN presenta un apareamiento intramolecular de bases extensivo, proporcionando a los viroides una estructura de bastoncillo (Sanger et al., 1976). El resultado de la interacción de los viroides con la planta huésped puede ser desde la falta aparente de síntomas o un fenotipo asociado leve del huésped hasta una patología extremadamente severa. En muchos casos la infección puede conducir a una alteración significativa del crecimiento y de la fructificación de la planta, provocando una enfermedad económicamente importante. Aunque la patología de las infecciones viroides está bien documentada, no se ha informado de la identificación de genes de resistencia o del diseño e introducción de genes sintéticos de resistencia en las plantas huésped. Un factor que ha contribuido a ello es que no se conocen bien los detalles de los mecanismos y de la aparición de la patogénesis. De esta manera, resulta difícil identificar los genes diana del huésped para el cultivo de un genotipo resistente. Un enfoque potencialmente útil para evitar este problema y que conduzca al desarrollo de cultivares resistentes a viroides es la aplicación del concepto de mecanismos de resistencia derivados de patógenos (Sanford y Johnston, 1985).

La resistencia derivada de patógenos incluye estrategias que implican la expresión de un componente del patógeno en huéspedes transgénicos, resultando en una tolerancia o resistencia incrementadas en el huésped cuando se encuentra infectado por dicho patógeno. La resistencia derivada de patógeno se ha aplicado a una amplia diversidad de combinaciones de virus vegetales y huéspedes. Algunos de los procedimientos exitosos que implican la expresión de marcos de lectura abiertos (ORF) víricos en huéspedes vegetales transgénicos incluyen la expresión de genes de proteínas de la cápside vírica (para una revisión ver Beachy et al., 1990) y, en el caso del virus del mosaico del tabaco y el virus del pardeamiento temprano del guisante, la expresión de la secuencia ultraleída del gen codificado en el virus de la ARN polimerasa (Golemboski et al., 1990; Macfarlane y Davies, 1992). Aunque resultan muy efectivas contra los virus, estas técnicas resultan inadecuadas para la aplicación a viroides debido a que no presentan ORF identificables (Sanger, 1987). Sin embargo, el hecho de que los viroides son moléculas de ARN de una sola cadena implica que resultan potencialmente sensibles a estrategias de resistencia que implican la expresión de transgenes que codifican moléculas de ARN antisentido o de ribozima. Estas técnicas de manipulación génica que resultan en la regulación muy probablemente a través de una interacción primaria entre el transcrito del transgén y una molécula diana de ARN, se ha demostrado que resultan extremadamente efectivas en plantas. Se ha demostrado para algunos genes endógenos que las cadenas antisentido pueden controlar la expresión génica de los mismos. Además, las estrategias antisentido han permitido proporcionar un grado de resistencia a los patógenos víricos siguientes: virus X de la patata, virus del mosaico del pepino y virus del enrollado de la hoja de la patata (Hemenway et al., 1988; Cuozzo et al., 1988; Kawchuk et al., 1991) en los huéspedes vegetales apropiados. Las estrategias de inactivación génica mediadas por ribozima se han utilizado contra el gen bacteriano de la neomicín fosfotransferasa en protoplastos de Nicotiana tabacum (Steinecke et al., 1992) y contra la replicación del TMV en protoplastos (Edington y Nelson, 1992). Hasta el momento, no se ha evaluado ninguna de estas técnicas contra la clase viroide de patógenos.

La presente solicitud describe el primer ensayo del que se informa sobre dichas estrategias para proporcionar resistencia a viroides. El sistema experimental implica el bien caracterizado viroide de la exocortis de los cítricos y el huésped fácilmente transformable del tomate, Lycopersicon lycopersicum cv. UC82B. Como infección productiva se seleccionó la combinación del aislado australiano del CEV (CEV A, Visvader et al., 1982) y el cultivar Lycopersicon lycopersicum UC82B. Aunque esta combinación de viroide y huésped resulta en la replicación del viroide al mismo nivel que la infección del huésped sintomático L. lycopersicum Mill cv. Rutgers, la interacción produce síntomas inapreciables y permite la evaluación de la replicación del viroide con independencia de los síntomas devastadores que se observan en este último cultivar. Las estrategias sometidas a ensayo implicaban la expresión de transgenes que codificaban genes antisentido y de ribozima largo que reconocían la molécula viroide de ARN sentido (cadena positiva) o al ARN viroide complementario (cadena negativa). El razonamiento para la selección de dos ARN diana era que los ARN positivo y negativo representan posiblemente dianas bastante diferentes en términos de abundancia, localización celular y/o estructura.

Aunque los detalles completos del ciclo de replicación viroide no se han esclarecido, se acepta generalmente que el ciclo de replicación implica la síntesis del molde de cadena negativa. A partir de esta cadena negativa, se forman copias de moléculas de cadena positiva que posteriormente se procesan para formar moléculas viroides circulares (Symons, 1990). Para el CEV se ha informado de que la cadena negativa es mucho menos abundante que la cadena positiva en las plantas infectadas y que la distribución de ARN, en términos de unidades multiméricas, es diferente para las dos especies de ARN(Hutchins et al., 1985).

Aunque todavía no se ha determinado cuál es la causa exacta de la patogenicidad de los viroides, resulta posible que los viroides interfieran con el procesamiento previo del ARN en las células huésped. El resultado es una serie de síntomas que van desde los leves (por ejemplo la decoloración y malformación de las hojas), hasta los severos y letales.

Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar un procedimiento para controlar con efectividad la infección de plantas por viroides, por virus y por otros agentes infecciosos similares a viroides.

Sumario de la invención

La invención consiste en una molécula de ácido nucleico de origen no natural capaz de bloquear o interferir con un intermediario replicativo de un virus o con un viroide. La molécula de ácido nucleico contiene un ribozima o una pluralidad de ribozimas. El ribozima puede ser un ribozima de horquilla, un ribozima de cabeza de martillo, un ribozima ARNasa P, un minizima u otra molécula de ARN catalítico.

El virus es un virus vegetal. La molécula de ácido nucleico se expresa en la célula.

La presente invención contempla un procedimiento para el control de la infección de un agente infeccioso patogénico en una planta.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación diagramática de genes utilizados para transformar Lycopersicon lycopersicum UC82B para proporcionar resistencia a la infección por CEV. La figura muestra las inserciones en el vector pGA470. Las estructuras de los cinco genes quiméricos construidos para la transformación de la planta con el fin de producir cadenas antisentido o ribozimas largos que sean complementarios a las cadenas negativas o positivas de ARN del CEV. El fragmento de ADNc del CEV utilizado en todos los constructos, de orientación dependiente del transcrito sentido requerido, era la secuencia de longitud completa con una deleción entre las bases 40 y 90. Se indican las posiciones de los ribozimas y se muestra el número de la base en el ARN diana en el que se produce el corte respecto a 3'. Abreviaturas: AS, antisentido; +Ve: ARN(+) de viroide; -Ve, ARN(-) de viroide; R_{z}101: ribozima que reconoce el nucleótido número 101 del CEV. Se indican las secuencias de procesamiento del promotor 35S del CaMV y de nos 3'.

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra las líneas generales experimentales del proyecto para determinar el grado de resistencia a viroides de las plantas transgénicas del tomate.

La figura 3 muestra el inicio de la replicación de viroide en plantas transgénicas detectado mediante transferencia northern. En el eje Y las unidades arbitrarias indican la intensidad de la señal de hibridación, cuantificada utilizando técnicas densitométricas. Cada barra vertical representa una sola planta en un punto temporal.

La figura 4 es una autorradiografía de análisis PAGE del corte in vitro de ARN sintético de CEV por ribozimas de CEV. Los carriles 1 y 2 muestran los productos de corte del ARN de cadena negativa incubado con un ARN que contiene 3 y 4 ribozimas de cabeza de martillo respectivamente [3Rz(-) y 4RZ(-)]. El carril 3 muestra los productos de corte del ARN de cadena positiva del CEV incubado con un ARN que contiene 3 ribozimas de cabeza de martillo [3RZ(+)]. Los carriles 4 y 5 muestran ARN negativo y positivo de longitud completa del CEV incubado en ausencia de ARN ribozima.

La figura 5 es una representación gráfica que muestra el inicio de la replicación de viroide en plantas transgénicas según se detecta mediante transferencia northern. Se muestran las eficiencias de corte in vitro del 3Rz(+) y TMV3Rz del CEV y el sustrato de ARN apropiado. Los datos muestran los cursos temporales de corte para los dos ribozimas a lo largo de un periodo de 900 minutos a 37ºC y a 50ºC. Cada punto del tiempo es la media de cuatro experimentos independientes.

La figura 6 es una autorradiografía del análisis de transferencia northern del ARN total extraído de tomates transgénicos transformados con los genes quiméricos indicados en la figura 1. Se transfirió un gel de agarosa igualmente cargado a un filtro de nilón y se hibridó con ADNc de CEV. Las muestras se prepararon a partir de (1-12) plantas no transformadas, y plantas transgénicas que expresaban 3Rz(+) nº 1, 3Rz(+) nº 2, 3Rz(+) nº 3, 4Rz(-), As(+) nº 1, As(+) nº 2, As(-) nº 1, As(-) nº 2, As(-) nº 3, 3Rz(-) nº 1 y 3Rz(-) nº 2.

La figura 7 muestra ejemplos de análisis de transferencia northern de extractos de ácidos nucleicos totales procedentes de plantas de tomate transgénicas inoculadas con ARN de CEV. La figura 7A muestra el resultado del sondeo con ADNc de CEV. La figura 7B muestra una serie doble de muestras de ácidos nucleicos sondeadas con la sonda de ADNr pTA71 para determinar la variación de los niveles de carga de ácido nucleico. Los carriles 1 y 2 son muestras de ARN procedentes de plantas transgénicas no inoculadas y los carriles 3 a 12 son muestras procedentes de 10 plantas de tomate transgénicas inoculadas con CEV.

La figura 8 muestra histogramas que representan los niveles de ARN de CEV, detectados mediante transferencia northern, en poblaciones de plantas inoculadas con una baja titulación de CEV (0,03 ng de ARN de CEV/cotiledón) a intervalos de tiempo a lo largo del curso de una infección. Cada barra representa el valor medio para cada punto del tiempo para una población dada tras la corrección para diferencias de nivel de hibridación y de carga entre lotes de muestras. El eje Y es una escala arbitraria relacionada con la intensidad detectada de sonda hibridada marcada radioactivamente. Cada panel muestra el curso temporal para familias derivadas de transformantes independientes para una clase de constructos en comparación con el resultado de la inoculación de CEV de la población de tipo salvaje. La figura 8A, plantas que expresan cadenas antisentidos que reconocen la cadena negativa de ARN de CEV [As(-) nº 1, AS(-) nº 2, AS(-) nº 3]; la figura 8B, plantas que expresan ribozimas largos que reconocen el ARN negativo de CEV [3Rz(-) nº 1, 3Rz(-) nº 2, 4Rz(-)]; la figura 8C, plantas que expresan cadenas antisentido respecto al ARN positivo de CEV [As(+) nº 1, As(+) nº 2]; la figura 8D, plantas que expresan ribozimas largos que reconocen el ARN positivo de CEV [3Rz(+) nº 1, 3Rz(+) nº 2, 3Rz(+) nº 3].

La figura 9 muestra los niveles medios de ARN de CEV detectados en cinco poblaciones de doce plantas que expresan As(-) nº 1, As(-) nº 2, As(-) nº 3, As(+) nº 1 o As(+) nº 2 y L. licopersicon cv UC82B no transformado que se inocularon a título elevado de ARN de CEV (0,3 ng de ARN de CEV/cotiledón). Cada barra representa el valor medio para cada punto del tiempo para una población dada tras la corrección para diferencias de nivel de hibridación y de carga entre lotes de muestras. El eje Y es una escala arbitraria relacionada con la intensidad detectada de sonda hibridada marcada radioactivamente.

Descripción detallada de la invención

La invención consiste en una molécula de ácido nucleico de origen no natural capaz de bloquear o de interferir con un intermediario replicativo de un virus o con un viroide. La molécula de ácido nucleico puede contener un ribozima o una pluralidad de ribozimas. Por ejemplo, el ribozima puede ser un ribozima de horquilla, un ribozima de cabeza de martillo, un ribozima ARNasa P, un minizima (McCall, 1992) u otra molécula de ARN catalítico.

La molécula diana de ARN(-) generalmente se forma durante el ciclo de replicación de un viroide. Aunque sin pretender limitar la presente invención a ninguna teoría particular respecto al modo de acción, resulta posible que la segunda molécula de ácido nucleico forme un dúplex con el ARN(-), evitando o reduciendo de esta manera la síntesis de ARN(+) y/o evitando, o de otra manera interfiriendo con la unión de la polimerasa. Sin embargo, también resultan posibles algunos otros mecanismos de acción, tales como la competición para otros enzimas del huésped.

Debido a que se desconoce el modo exacto de acción, se dice que el efecto es de "control de la infección", lo que significa que interfiere con el virus o viroide mismo o con su ciclo de replicación, limitando de esta manera el grado con el que el virus o el viroide puede replicarse y extenderse, o incluso mantenerse a niveles constantes, mejorando de esta manera los efectos de la infección.

El virus es un virus vegetal.

El virus vegetal puede ser un hordeivirus, un potexvirus, un carlavirus, un potivirus, un closterovirus, un timovirus, un tombusvirus, un sobemovirus o un luteovirus. El virus vegetal puede ser el virus del enanismo amarillo de la patata, el virus del mosaico del tomate, el virus X de la patata (PVX), el virus Y de la patata (PVY), el virus latente del clavel, el virus del cascabel del tomate, el virus del pardeamiento temprano del guisante, el virus del mosaico estriado de la cebada, el virus del mosaico amarillo del nabo, el virus del enanismo amarillo de la cebada, el virus del falso amarilleo de la remolacha, el virus del enrollado de la hoja de la patata, el virus del enanismo arbustivo del tomate, el virus del mosaico sureño de la judía, el virus clorótico del maíz, el virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha o el virus de la necrosis del tabaco.

El viroide puede ser el viroide de la mancha de sol del aguacate (ASBV), viroide del enanismo de la bardana (BSV), viroide del moteado clorótico del crisantemo (CCMV), viroide del enanismo del crisantemo (CSV), viroide de la exocortis de los cítricos (CEV), viroide del cadang-cadang del cocotero (CCCV), viroide del fruto pálido del pepino (CPFV), viroide del enanismo del lúpulo (HSV), viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTV), viroide del cogollo racimoso del tomate (TBTV), o viroide de la "planta macho" del tomate (TPMV).

La molécula de ADN codifica la molécula de ácido nucleico, un vector de transferencia que comprende ARN o ADN o un combinación de los mismos, que contiene una secuencia nucleótida que al transcribirse da lugar a la molécula de ácido nucleico de origen no natural indicada anteriormente.

El procedimiento por el que se proporciona resistencia a la infección vírica comprende introducir en la planta un constructo que al transcribirse dé lugar a la molécula de ácido nucleico anteriormente indicada. La introducción de la molécula de ácido nucleico se lleva a cabo mediante transformación genética de una parte de la planta con una secuencia de ADN que codifica la molécula de ácido nucleico, seguido de la regeneración de la planta transgénica. La transformación se lleva a cabo con el intermediario Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes.

La presente invención se refiere además a un cassette de ADN para una planta, comprendiendo dicho cassette una secuencia genética y un promotor capaces de dirigir la expresión de dichas secuencias genéticas, en el que dicha secuencia genética al expresarse proporciona ARN antisentido o ribozima al ARN(-) o a una parte del mismo asociado con un viroide. El cassette de ADN además puede ser parte de un vector de transferencia de ADN adecuado para transferir el cassette de ADN a una célula vegetal e insertarse en el genoma de una planta. En una forma de realización más preferente de la presente invención, el cassette de ADN lo porta el plásmido pGA470 de amplio rango de huésped y que es capaz de transformar células vegetales utilizando Agrobacterium. Sin embargo, la presente invención se extiende a otros medios de transferencia, tales como las balas genéticas (por ejemplo las partículas de tungsteno recubiertas de ADN, el bombardeo con microproyectiles a alta velocidad) y la electroporación, entre otros (Maliga, 1993; Bryant, 1992; o Shimamoto, 1989).

La planta transgénica resistente a un virus se caracteriza porque contiene en su genoma una secuencia que da lugar, al transcribirse, a la molécula de ácido nucleico indicada anteriormente. Esta planta transgénica, incluyendo los frutos y semillas de la misma, puede ser de alfalfa, manzana, judía, canola (colza), cantalupo, maíz, algodón, calabacín, pepino, melón, papaya, pimiento, patata, arroz, soja, calabaza, fresa, girasol, pimentón, tabaco, tomate o nuez. También se incluyen las células vegetales transformadas con el vector de transferencia indicado anteriormente, así como una planta que comprende una secuencia nucleótida que es, o que al transcribirse da lugar a, una molécula de ácido nucleico.

La invención también proporciona un método de interferencia con la replicación de un virus ARN que presenta una cadena replicativa, que comprende poner en contacto una célula con un ribozima capaz de cortar la cadena replicativa de manera que se interfiera con la replicación del virus ARN en esa célula.

La presente invención contempla un procedimiento para el control de la infección de un agente infeccioso patogénico en una planta, que comprende generar una planta transgénica que sintetiza una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico capaz de interferir con el intermediario replicativo de dicho agente infeccioso.

Más particularmente, la presente invención proporciona un procedimiento para el control de la infección de un agente infeccioso patogénico en una planta, que comprende generar una planta o animal transgénico que porta una primera molécula de ácido nucleico con una secuencia nucleótida que, al transcribirse, proporciona una segunda molécula de ácido nucleico que sustancialmente es antisentido respecto a por lo menos una parte de un intermediario replicativo asociado con dicho agente infeccioso.

La presente invención se refiere particularmente a viroides como agentes infecciosos, pero también se extiende a todos los patógenos en los que existe un ARN(-) o molécula equivalente asociada durante su ciclo de replicación. De acuerdo con ello, "asociada" se refiere a que el agente infeccioso comprende ARN(-) o que se forma ARN(-) en algún punto de su ciclo vital, tal como durante el ciclo de replicación.

La planta transgénica generalmente se realiza insertando una secuencia genética en la forma de ADN en el genoma de una célula vegetal y regenerando una planta a partir de la misma. De esta manera, la secuencia genética constituye la primera molécula de ácido nucleico indicada anteriormente. El "genoma" incluye ADN cromosómico y ADN extracromosómico.

La secuencia genética se requiere que sea expresable constitutivamente o en respuesta a estímulos naturales o estímulos proporcionados artificialmente. El promotor que dirige la expresión de la secuencia genética puede, por lo tanto, encontrarse naturalmente en el genoma vegetal o puede encontrarse asociado con la secuencia genética antes de la inserción en el genoma. Un promotor preferente es el promotor 355, tal como el presente en los vectores de expresión pJ35SN y pGA470. Para otras técnicas y huéspedes víricos ver la patente US nº 5.107.065.

La expresión de la secuencia genética en la célula vegetal da lugar a un transcrito que comprende la segunda molécula de ácido nucleico indicada anteriormente. La secuencia nucleótida de por lo menos una parte de esta molécula es complementaria a la secuencia nucleótida de un ARN(-) asociado al viroide diana. Las moléculas del segundo ácido nucleico también pueden ser moléculas de ribozima (es decir, de ribozima largo). Las moléculas del segundo ácido nucleico antisentido o ribozima largo, o una parte de los mismos, también pueden traducirse para formar un polipéptido, así como actuar como una molécula antisentido o catalítica.

En una forma de realización, el constructo se clona en un plásmido. A este fin sirven diversos plásmidos bien conocidos para el experto en la materia. Un procedimiento es clonar y expresar la molécula de ácido nucleico capaz de inhibir el intermediario replicativo bajo un promotor fuerte de manera que se produzca una gran cantidad de ARN contra el intermediario replicativo del virus. En una forma de realización preferente el constructo también incluye un gen marcador seleccionable.

La presente invención se describe adicionalmente haciendo referencia a las figuras y Ejemplos no limitativos proporcionados posteriormente.

Detalles experimentales Materiales y procedimientos

La presente invención se ejemplifica utilizando una línea de tomate, Lycopersicon lycopersicum UC82B. La cepa de tomate se utiliza rutinariamente para la transformación y, al igual que con algunas otras líneas de tomate, da soporte a la replicación del viroide patógeno de la exocortis de los cítricos (CEV). La inoculación de plántulas de UC82B con ARN infeccioso de CEV (CEV A, aislado australiano) resulta en la acumulación intracelular de ARN de viroide y puede conducir al desarrollo de síntomas leves, tales como la epinastia y el enanismo.

Se introdujeron cinco constructos génicos diferentes en L. lycopersicum (figura 1). Los constructos eran antisentido (As) del tipo de antisentido que contiene ribozima (antisentido catalítico). Los constructos específicos que se prepararon eran los siguientes:

(a)

Cadena antisentido que reconoce la cadena sentido de ARN de viroide (cadena positiva de ARN).

(b)

Ribozimas largos que contienen tres ribozimas que reconocen la cadena positiva de ARN.

(c)

Cadena antisentido que reconoce la cadena negativa de ARN(cadena de ARN complementaria a la cadena sentido de ARN de viroide).

(d)

Ribozimas largos que contienen tres ribozimas que reconocen la cadena negativa de ARN.

(e)

Ribozimas largos que contienen cuatro ribozimas que reconocen la cadena negativa de ARN.

Los constructos de As y de As catalítico se derivaron a partir de un clon de ADNc que comprendía la totalidad de los 371 pb del genoma de CEV. El ADNc genómico de longitud completa se clonó como fragmento de digestión de enzima de restricción BamHI en pGEM3Zf(+) (Promega) en ambas orientaciones y se mantuvo en la cepa JPA101 de E. coli. La forma de cadena única de este clon se aisló y se utilizó en combinación con desoxioligonucleótidos sintéticos con el fin de introducir tres o cuatro unidades catalíticas de ribozima que reconocen las secuencias de origen natural GUC y GUU en la cadena de ARN de CEV de sentido contrario. El procedimiento de introducción de las secuencias de ribozima implicaba procedimientos de mutágenesis in vitro estándares. Los nucleótidos diana se describen generalmente en la figura 1. La introducción con éxito de las secuencias de ribozima se analizó mediante mapaje de restricción con endonucleasa y todos los constructos se sometieron a ensayo para actividad catalítica en experimentos de corte in vitro. Los experimentos de corte se completaron mediante coincubación de transcritos de ARN del ribozima generados in vitro con ARN polimerasa de T7 y diana apropiada de ARN de CEV.

Se introdujo una deleción de 49 pb (bases 41 a 89) en todos los constructos para satisfacer los requisitos GMAC. La deleción se introdujo mediante subclonación de la secuencia restante como fragmento de restricción BamH1-PstI de extremos romos en el sitio SmaI de pJ35SN. La orientación de las inserciones respecto al promotor 35S se confirmó y seguidamente se subclonaron el promotor y el constructo como fragmento PstI en el sitio XhoI de extremos romos del plásmido de amplio rango de huésped pGA470. Se utilizó el cruzamiento triparental para movilizar los constructos en Agrobacterium tumefaciens.

Se utilizó la cepa de A. tumefaciens para inocular esquejes de hoja de L. lycopersicum UC82B. Se seleccionaron plantas individuales genéticamente transformadas como regenerantes resistentes a canamicina (generación T_{0}) y se transfirieron a un invernadero para su fructificación y posterior recolección de las semillas. Se cultivó la progenie de la generación T_{0} (la generación T_{1}) en invernaderos y se analizó la expresión del ARN As o ribozima apropiado y el ligamiento con la expresión del gen de resistencia a la canamicina (nptII). Las plantas en las que se detectó expresión de ARN As o ribozima mediante hibridación northern y el gen nptII mediante ensayo enzimático, se dejó que fructificasen y se recolectaron las semillas. Las plantas de las poblaciones de la generación T_{2} de cada una de las plantas T_{1} que habían expresado As o ribozima/nptII+ se cribaron para la expresión de nptII. Aquellas poblaciones T_{2} que eran 100% nptII+ se consideró que derivaban de progenitores que eran homocigóticos para los transgenes y se recogieron las semillas de las plantas T_{1} correspondientes. Se sometió a ensayo la susceptibilidad a la infección por CEV de las plantas que expresaban As y ribozima, tal como se describe generalmente en la figura 2.

Resultados

El experimento inicial implicaba el reto a 5 poblaciones de plantas transgénicas que consistían en cuatro plantas individuales de una familia de cada uno de los constructos descritos generalmente en la figura 1. En los casos en que se obtuvieron varias homocigotos independientes para un constructo, se seleccionó la familia que expresaba el nivel más elevado de transgén para someterla a reto de infección por CEV.

Se presenta el análisis cuantitativo de los resultados en la figura 3 como niveles relativos de ARN de CEV detectado mediante hibridación northern. La figura muestra los resultados para la totalidad de las 4 plantas de cada familia 15, 18 y 23 días después de la inoculación (p.i.). Los resultados se presentan en grupos del ARN de CEV reconocido, es decir, constructos que reconocen la cadena positiva y constructos que reconocen la cadena negativa.

En el primer punto del tiempo, podía detectarse ARN de CEV en 5/8 de las plantas que contenían transgenes que reconocen la cadena positiva, mientras que sólo 1/12 plantas de la población que contenía transgenes que reconocen la cadena negativa presentaba niveles detectables de ARN de CEV. A los 18 días p.i., todas las plantas de la primera población presentaban niveles detectables de ARN de CEV; los niveles más elevados eran del orden de diez veces superiores a los niveles detectados en plantas que expresaban transgenes que reconocían la cadena negativa de ARN. La inspección de los resultados de niveles de ARN detectados a los 23 días p.i. muestran claramente que todas las plantas que reconocían la cadena positiva de ARN contenían niveles relativamente elevados de ARN de CEV, y el valor medio era significativamente superior que el nivel alcanzado en cualquiera de las plantas que reconocían la cadena negativa de ARN. A los 23 días p.i., 3/12 de las plantas de esta última población todavía no presentaba niveles detectables de ARN de CEV.

Construcción de genes antisentido y de ribozima

Todas las manipulaciones rutinarias de ADN se llevaron a cabo tal como se describe en Sambrook et al. (1989). El clon de ADNc de aislado australiano de CEV (CEV A) se obtuvo del Dr. P. Keese, CSIRO Division of Plant Industry, Canberra, Australia. El ADNc de 371 pb de CEV se subclonó como fragmento BamHI en ADN de pGEM3Zf(+) digerido con BamHI (Promega) y se aislaron los plásmidos recombinantes, denominándolos pCEV10 o pCEV11 dependiendo de si la inserción se encontraba en la orientación de sentido o de antisentido respecto al promotor de la ARN polimerasa de T7, respectivamente. Se introdujeron secuencialmente tres o cuatro dominios catalíticos de ribozima (Haseloff y Gerlach, 1988) mediante mutagénesis de sitio específico dirigida por oligonucleótido (Kunkel et al., 1987) del plásmido pCEV apropiado. Se introdujeron cuatro ribozimas en pCEV11 (figura 1) que reconocían las secuencias GUC naturales dentro de la cadena de ARN positivo de CEV en las coordenadas genómicas 116, 144, 185 y 368 (Visvader et al., 1982). Se mutagenizó pCEV10 para que incluyese ribozimas que reconociesen tripletes en la cadena negativa de CEV en las posiciones 198 (GUU), 243 (GUC) y 270 (GUU). Se preparó un segundo ribozima derivado de pCEV10 mediante la introducción de una secuencia catalítica adicional en el ribozima anterior que reconocía el triplete GUU en la posición 90. Se confirmó la integridad de todos los constructos de ribozima mediante análisis de secuenciación de ADN.

Se utilizó un ribozima largo que reconocía el gen de la ARN polimerasa de TMV para completar el corte in vitro del ARN de TMV para que sirviese como comparación en el análisis de la cinética de los ribozimas de CEV. El ribozima largo de TMV se preparó mediante la introducción de tres dominios catalíticos de cabeza de martillo en un clon de ADNc de TMV de la secuencia 5' genómica, pTMV. Se derivó pTMV mediante subclonación de un fragmento SacI-XbaI de 999 pb procedente de un clon de ADNc de un aislado de TMV U1 que incluía los 1.004 nucleótidos en dirección 5', pTMV (cedidos por W.O. Dawson, University of California, Riverside, USA), en pGEM3Zf(+). La transcripción del gen de ribozima de TMV resultante, denominado pTMV3Rz, produjo un ribozima que reconocía la molécula genómica de ARN sentido de TMV en las secuencias GUC en las coordenadas de TMV 119, 137
y 159.

Reacciones de corte in vitro de ribozima

Se preparó ARN diana marcado con ^{32}P mediante reacciones de transcripción runoff in vitro (Melton et al., 1984) utilizando ARN polimerasa de T7 y ADN linearizado con XbaI de pCEV10 y de pCEV11 para producir ARN de CEV de cadena positiva y de cadena negativa, respectivamente. De manera similar, se linearizaron genes de ribozima mediante digestión con XbaI y se prepararon transcritos no marcados tal como anteriormente. El ribozima de TMV y el ARN diana se prepararon mediante la transcripción de pTMV3Rz o pTMV linearizados con PvuII o XbaI, respectivamente. Se llevaron a cabo las reacciones de corte de ribozima in vitro y se analizaron mediante electroforesis en geles de 7% de poliacrilamida, urea 7 M y autorradiografía, tal como se describe en Perriman et al. (1992). Las bandas de ARN marcadas radioactivamente se localizaron mediante autorradiografía y se cuantificaron mediante recuento de centelleo líquido.

Transformación del tomate

Los cinco constructos antisentido y de ribozima largo se subclonaron como fragmentos SmaI-extremo romo-PstI y extremo romo PstI procedentes de pGEM3Zf(+) en el sitio SmaI de pJ35SN. Este procedimiento de clonación resultó en una deleción de 49 pb del ADNc de CEV de las posiciones genómicas 41-89 con el fin de reducir el ADNc viroide a menos de una longitud genómica completa. Ello se llevó a cabo con el fin de evitar la construcción de plantas transgénicas que potencialmente pudiesen producir viroides infecciosos a partir de un gen integrado, particularmente en el caso de los genes antisentido. A continuación, todos los constructos se subclonaron como fragmentos PstI de extremos romos en el sitio XhoI de extremos romos del vector de transformación de plantas pGA470, los genes antisentido y de ribozima largo contenían entonces la secuencia promotora 35S de CaMV procedente de pJ35SN en el extremo 5' y la secuencia de poliadenilación del gen nos en el extremo 3'. Los constructos recombinantes se utilizaron para transformar Agrobacterium tumefaciens y los transformantes que contenían los plásmidos recombinantes correctos se identificaron mediante transferencia southern. Se transformó L. lycopersicon cv. UC82B con los cinco constructos mediante el procedimiento descrito por Fillatti et al. (1987).

Se seleccionó el tejido vegetal transformado a partir del fenotipo de resistencia a la canamicina, proporcionado por el gen nptII de pGA470. Tras la regeneración, se transfirieron plántulas de transformantes independientes a invernaderos para que produjesen semillas. Se cribaron todos los regenerantes de esta generación T_{0} para la expresión del transgén mediante transferencia northern y para la expresión del gen nptII mediante un procedimiento de ensayo de transferencia de puntos con fosfotransferasa (McDonnell et al., 1987). Se recolectó la fruta de las plantas en las que se detectó la expresión de ambos genes y se aislaron las semillas mediante tratamiento suave de la fruta con HCl diluido (dilución 1/20 de HCl concentrado en agua desionizada). Se generaron las plántulas T_{1} a partir de las semillas recolectadas y a su vez se cribaron para la expresión del transgén y del gen nptII, tal como anteriormente. Se cribaron suficientes plántulas con el fin de determinar si se producía una razón de segregación del transgén de aproximadamente 3:1. Se recolectaron las semillas de aquellas plantas T_{1} que expresaban el transgén y que pertenecían a una población en la que el transgén se segregaba a una razón de aproximadamente 3:1. A partir de estas plantas se generaron plántulas T_{2} y se cribaron para la expresión de nptII con el fin de determinar si derivaban de un progenitor T_{1} homocigótico o heterocigótico. Antes de considerar que una población derivaba probablemente de un progenitor T_{1} homocigótico se cribaban y demostraban que eran positivas para el gen marcador por lo menos 10 plántulas. Tras la identificación, los homocigotos T_{1} se propagaron y se preparaban bancos de semillas para experimentos de inoculación de viroides.

Extracción de ácidos nucleicos

Se prepararon los ácidos nucleicos totales a partir de hojas de tomate mediante la trituración de 100 mg de tejido en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml que contenía 200 \mul de tampón de extracción [2,5:1,25:0,025 TE3D {10% (p/v) Nonadet P-40, 15% de dodecil sulfato litio, 10% de desoxicolato sódico, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM pH 8,0}: solución de fenol: \beta-mercaptoetanol] con una barra de vidrio. Tras triturar el material hasta formar una pasta, se añadieron 200 \mul de acetato amónico 3 M y 150 \mul de cloroformo:alcohol isoamilo (24:1), se tapó el tubo y se centrifugó con vórtex durante 1 minuto. Se recuperó la fase acuosa y se introdujo en un tubo nuevo tras la centrifugación del extracto de hojas a 12.000 g durante 10 minutos a 4ºC. Se preparó la fracción requerida de ácidos nucleicos a partir de este extracto mediante precipitación diferencial. Para la recuperación del ARN total para la detección de los transcritos de transgén, la solución recuperada se ajustó para cloruro de litio 2 M y se incubó a -20ºC durante 2 horas. Se recuperó el ARN insoluble mediante centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos a 4ºC. Se lavó el pellet en 70% de etanol, se secó en el vacío y se resuspendió en 10 \mul de agua estéril doblemente destilada y tratada con DEPC. A fin de detectar el viroide y el ARNm, se requirieron muestras de ácidos nucleicos totales debido a que la forma similar a un bastón del ARN viroide garantiza su permanencia en solución en el cloruro de litio 2 M. Los ácidos nucleicos totales se prepararon mediante la adición de 0,1 vol. de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 2 volúmenes de etanol al 100% seguido de incubación y centrifugación tal como en el procedimiento de preparación de ARN total.

Transferencia northern

Se analizó mediante electroforesis a través de gel de 1,2% de agarosa que contenía formaldehído, tal como describen Sambrook et al. (1989), 1/10 de las muestras de ARN y de ácidos nucleicos totales extraídos a partir de 100 mg de tejido de hoja. Las muestras se desnaturalizaron en tampón formamida que contenía 1 \mug/ml de bromuro de etidio para permitir la visualización de los ácidos nucleicos inmediatamente después de la electroforesis. Los geles se lavaron en agua desionizada durante 1 hora, seguido de la inmersión en 2X SSC durante 30 minutos. Los ácidos nucleicos se transfirieron a membranas Hybond-N^{+} (Amersham, GB) mediante transferencia capilar en 20X SSC durante por lo menos 8 horas. Los ácidos nucleicos se reticularon con la membrana mediante tratamiento de UV con un Stratalinker (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la reticulación, la membrana se frotó vigorosamente con un dedo enguantado durante varios minutos para retirar la agarosa residual.

Todos los filtros se prehibridaron en 20 ml de solución de hibridación (3X SSC, 0,5% (p/v) SDS, 5X reactivo de Denhardt, 50% (v/v) de formamida desionizada, 100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque fragmentado y desnaturalizado en un tubo de hibridación de Hybaid grande a 45ºC durante 3 horas. Se prepararon todas las sondas de hibridación de ADN marcado radioactivamente mediante cebado con oligonucleótidos de un fragmento de restricción de ADN purificado en gel utilizando un kit Multiprime de Amersham siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN marcado radioactivamente se precipitó de la reacción de marcaje, se resuspendió en tampón TE, se hirvió durante 4 minutos y se añadió al filtro prehibridado en 10 ml de solución de hibridación. Se dejó transcurrir la hibridación a 42ºC durante 18 horas. Los filtros se lavaron a 60ºC en una sucesión de 2X SSC, 0,1% (p/v) de SDS durante 15 minutos y dos veces en 0,2X SSC, 0,1% (p/v) de SDS durante 30 minutos cada uno. Para la detección de la expresión de transgenes que codificaban la cadena antisentido o el ribozima largo de CEV o el ARN de viroide, se utilizó un fragmento BamHI de 371 pb purificado en gel del ADNc de CEV como molde de la sonda. Para el sondeo secundario de las membranas de transferencia de corrección de carga, para la preparación de las sondas se utilizó un fragmento EcoRI de 9 kb que representaba una parte del operón de ADNr de Triticum aestivum, preparado a partir del clon pTA71 (Gerlach y Bedbrook, 1979). Esta última sonda hibridaba fuertemente con el ARNr 18s y 26s del tomate. El contraanálisis se completó manteniendo húmeda la membrana de transferencia inicialmente analizada en los cassettes de fósforo y seguidamente repitiendo la prehibridación y la hibridación con la segunda sonda, tal como anteriormente. La sonda de ADN unida a las membranas se visualizó mediante exposición de las membranas a una pantalla de almacenamiento de fósforo, seguido del procesamiento de la pantalla en un Phosphorimager (Molecular Dynamics) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Preparación de ARN infeccioso de CEV e inoculaciones de plantas

Todas las plantas para las inoculaciones se mantuvieron a 30ºC en un fotoperiodo de 16 horas de día y 8 horas de noche. Todas las inoculaciones se completaron espolvoreando los cotiledones completamente expandidos con carborundo, seguido de la aplicación de 0,5 \mul de la solución de ARN apropiada y frotando suavemente con un dedo enguantado. Se aisló el ARN infeccioso de CEV a partir de Lycopersicon esculentum Mill cv. Rutgers inoculado con CEV, tal como describen Rigden y Rezaian (1992). El ARN purificado de CEV se analizó y se tituló para infectividad mediante la infección de cuatro poblaciones independientes de cuatro plantas de L. lycopersicon cv. UC82B con diluciones del ARN viroide. En paralelo, se infectó una población de plantas de L. esculentum Mill cv. Rutgers con el fin de realizar un seguimiento del desarrollo de los síntomas.

Análisis de la replicación del ARN viroide en tomates transgénicos infectados por CEV

Se mantuvieron e inocularon las poblaciones de tipo salvaje y las diversas plantas transgénicas tal como se ha descrito anteriormente. A intervalos específicos tras la inoculación, se tomaron aproximadamente 100 mg de muestras de hoja de la hoja más vieja de cada planta utilizando una cuchilla de escalpelo que previamente se había sumergido en hidróxido sódico 1 M y se había enjuagado en agua estéril doblemente destilada. Se aislaron los ácidos nucleicos totales del tejido de hoja inmediatamente después de la recolección de la muestra. Las muestras de ácidos nucleicos totales y una muestra estándar de ácidos nucleicos totales de planta infectada por CEV se analizaron mediante transferencia northern con la sonda de ADNc de CEV. Se obtuvieron valores cuantitativos para todas las señales de CEV presentes utilizando el programa informático suministrado con el Phosphorimager de Molecular Dynamics. A continuación, los filtros se sondearon con la sonda de ADNr y se cuantificó el nivel de ARNr 26s en cada muestra. Los valores se corrigieron para la variabilidad entre filtros de los niveles de hibridación normalizando el valor de la señal de CEV y de ARNr 26s en cada filtro respecto a los valores en la muestra estándar, con el nivel medio de toda la señal estándar de CEV o con los valores estándar de señal de ARNr 26s, respectivamente. Estos factores de corrección se aplicaron a cada valor de muestra dentro de cada filtro con el fin de estandarizar la señal de hibridación en todo el experimento. Se ecualizó la carga de muestra mediante la determinación del factor de corrección para cada valor de ARNr 26s a partir del valor medio de todos los valores de ARNr 26s. A continuación se utilizó este valor para corregir los valores de CEV dentro de cada muestra. El resultado final para cada punto del tiempo posterior a la inoculación se calculó como una media para la población y se presenta en forma de histograma. Se completó todo el almacenamiento y manipulaciones de datos utilizando el programa de hoja de cálculo Excel (Microsoft).

Actividad in vitro de corte de los ribozimas de CEV

Se construyeron los ribozimas diseñados para hidrolizar secuencias dentro de la cadena positiva o negativa de ARN de CEV (figura 1) y se analizó la secuencia de ADN con el fin de confirmar que los dominios catalíticos se habían introducido correctamente. Los transcritos de ARN generados in vitro de los genes de ribozima seguidamente se sometieron a ensayo para la actividad catalítica mediante el completado del corte in vitro de los transcritos in vitro de ARN de CEV. La figura 4 muestra que la incubación de todos los ARN ribozima de CEV con la diana apropiada de ARN de CEV resulta en por lo menos el corte y empalme parcial del ARN diana en los productos de ARN esperados.

Con el fin de determinar si las dianas de CEV resultaban particularmente recalcitrantes a la formación de dúplex de ARN y a la consecuente hidrólisis debido a su extensivo apareamiento intramolecular de bases, se comparó la cinética de corte con otra combinación de ribozima largo/ARN diana, con TMV y con TMV3Rz. Se completó un curso temporal de corte cuatro veces para cada diana a 37ºC y a 50ºC (figura 5). Los resultados se presentan como proporción del sustrato total de ARN que ha sido cortado. A 37ºC, el ARN de CEV de sustrato se mantuvo a aproximadamente el 50% del nivel de corte del ARN de TMV de sustrato hasta el punto temporal final, en el que las proporciones de ARN cortado eran similares, de 35% y 39% para las dianas de CEV y de TMV, respectivamente. Con el fin de determinar si las tasas de corte de los dos sustratos podían incrementarse reduciendo la estructura secundaria de ARN, también se llevaron a cabo reacciones de corte a 50ºC. El grado de corte tras 60 minutos de incubación de ambas dianas se incrementó en cuatro veces las tasas a 37ºC, y el nivel de corte de CEV se mantuvo, según observaciones realizadas a 37ºC, a aproximadamente el 50% del nivel de corte del TMV.

Análisis de las plantas transgénicas

Se seleccionaron plántulas T_{0} de tomate resistentes a la canamicina a partir de los experimentos de transformación iniciales del tomate para cada uno de los 5 constructos de CEV. De aquellas plántulas T_{0} en las que se había detectado expresión de transgenes derivados de CEV mediante transferencia northern, se prepararon plántulas T_{1} y se analizaron para coincidencia de la expresión de nptII y de los transgenes. Aquellas plantas T_{1} que se identificó que presentaban el genotipo deseado se caracterizaron adicionalmente como homocigóticas o hemicigóticas para los transgenes mediante análisis de la segregación del gen nptII en la población T_{2}. Se identificaron por lo menos 2 plantas homocigóticas procedentes de sucesos independientes de transformación primaria para cada transgén de CEV excepto para 4Rz(-), para el que sólo se identificó un solo homocigoto. La figura 6 muestra los niveles relativos de expresión de los transgenes, según detección mediante transferencia northern de un gel de agarosa igualmente cargado, en las 11 plantas homocigóticas identificadas. El nivel de expresión de transgén variaba entre el nivel más alto en As(+) nº 2 (carril 7), de aproximadamente diez veces el nivel más bajo en 3Rz(-) nº 2 (carril 12). Esta amplia variación en los niveles de expresión de los transgenes, incluso de la misma secuencia, es un fenómeno observado con frecuencia y se sugiere que depende del sitio de integración del transgén en el cromosoma vegetal.

Preparación y titulación del ARN infeccioso de CEV e inoculación de las plantas transgénicas

Se purificó ARN viroide a partir de 40 g de tejido de hoja de L. esculentum infectado por CEV A y se resuspendió en agua a una concentración final de 3 \mug/ml. Se sometió a ensayo la infectividad del ARN mediante la inoculación de cuatro poblaciones, conteniendo cada una cuatro plántulas de L. lycopersicon, con 3 ng, 0,3 ng, 0,03 ng o 0,003 ng de ARN de CEV por plántula. Además, se inoculó con blanco una población de L. lycopersicon y se inoculó una población de L. esculentum Mill cv. Rutgers con 3 ng de ARN por plántula con el fin de identificar los síntomas típicos del CEV. Se determinaron los niveles de ARN de CEV mediante análisis de transferencia northern de los ácidos nucleicos totales extraídos de la hoja más vieja de cada planta a intervalos de cinco días entre los 12 y los 37 días posteriores a la inoculación. Todas las inoculaciones con ARN de CEV resultaron en infección productiva y en la replicación del ARN de CEV y todos los retos de ARN proporcionaron tasas de infección productiva del 100% alcanzado el último punto temporal. El reto de 0,03 ng por cotiledón era el nivel más bajo que proporcionaba la aparición de una infección productiva en todos los miembros de la población en el mismo punto temporal. No se detectó ARN de CEV en las plantas inoculadas con blanco y se detectaron síntomas severos de infección por CEV, epinastia y enanismo, en la población de L. esculentum Mill cv. Rutgers a los 14 días de la inoculación. Se detectaron síntomas muy leves en aproximadamente la mitad de la población de L. lycopersicon infectada con el título más alto.

Las poblaciones de 8 plantas para cada una de las 11 líneas transgénicas homocigóticas se retaron con 0,03 ng de ARN de CEV; el nivel de inoculación de ARN más bajo que previamente se había determinado que proporcionaba replicación reproducible de viroide. Las plantas se muestrearon recogiendo la hoja más vieja a los 15, 19, 23, 28, 34 y 46 días de la inoculación y se preparó y se analizó el ARN por lotes inmediatamente después de la recolección del tejido. La figura 7 muestra un ejemplo de los resultados de las transferencias northern para 10 muestras de ARN de planta infectada por CEV y muestras de 2 plantas no inoculadas, obtenidas utilizando el procedimiento experimental descrito anteriormente. La figura 7A muestra el resultado de la hibridación con la sonda de CEV y la figura 7B proporciona muestras dobles hibridadas con la sonda de ADN-ARNr.

El proceso de replicación del ARN se analizó en términos de dos parámetros: el inicio de la replicación de viroide y los niveles de acumulación. El inicio de replicación se describe como la proporción de plantas de cada población que muestra niveles de ARN de viroide mayores o iguales a los niveles detectados en la población de tipo salvaje inoculada de manera similar. La definición se diseña para que permita la demostración de la variación respecto a un punto fijo de la tasa de incremento hasta un nivel detectable de la replicación de ARN en plantas de tipo salvaje inoculadas. La determinación de los niveles de acumulación de ARN se utilizó para determinar si estos se habían reducido de alguna manera en comparación con los niveles en las plantas de tipo salvaje.

Los resultados del análisis de los niveles medios de acumulación de ARN de viroide se muestran en la figura 8 en grupos de clases de constructo en comparación con el resultado obtenido para la población de tipo salvaje inoculada. Los niveles de ARN de CEV se encontraban en el umbral de detección únicamente en 2/8 de las plantas de tipo salvaje hasta los 28 días de la inoculación, punto en el que la proporción de plantas con ARN de CEV a nivel detectable y la tasa de acumulación se incrementaron de manera lineal a lo largo de los puntos temporales restantes. En los primeros puntos temporales, se produjeron inconsistencias en los niveles de ARN de CEV en la misma planta entre puntos temporales. Ello probablemente era debido al hecho de que los niveles de ARN de CEV se encontraban cerca del límite de detección y a que, aunque se adoptaron medidas exhaustivas para garantizar la consistencia del muestreo y del análisis de hibridación, se produjeron errores de muestreo significativos cuando las señales eran bajas. El análisis de las tres familias transgénicas independientes que expresaban la cadena antisentido respecto a la cadena negativa de ARN de CEV (figura 8A) demostró que todas manifestaban una proporción menor de plantas infectadas y un nivel significativamente reducido de los niveles de ARN de CEV a lo largo de los primeros 23 días posteriores a la inoculación. A los 28 días de la inoculación, dos de las tres poblaciones todavía no presentaban ARN de CEV a niveles detectables, y los niveles en estas poblaciones siguieron siendo más bajos que los niveles de tipo salvaje durante el resto del curso temporal. La tercera población de plantas que expresaba la cadena antisentido respecto a la cadena negativa [As(-) nº 3], mostró niveles de ARN de CEV y una proporción de plantas infectadas más altos que en el tipo salvaje únicamente en un punto. Después de este punto, los niveles de ambos parámetros para esta tercera población eran menores que en el tipo salvaje, reflejando los niveles reducidos en las otras dos poblaciones As(-). Todas las plantas que expresaban los ribozimas largos que reconocían la cadena negativa, 3Rz(-) nº 1 y nº 2 y 4Rz(-) nº 1 (figura 8B), mostraron niveles de ARN de CEV por debajo de los niveles detectados en las poblaciones de tipo salvaje. El retraso se mantuvo durante el curso temporal aunque no fue tan marcado como el observado en las plantas que expresaban el gen antisentido que reconocía la cadena negativa de ARN de CEV. La única desviación de este patrón fue el valor para 3Rz(-) nº 2 a los 23 días de la inoculación, cuando el nivel de viroide era más alto que los niveles correspondientes del tipo salvaje y que el punto temporal anterior y posterior en esta población. De las tres poblaciones que expresaban esta clase de constructos, el transgén que contenía cuatro secuencias catalíticas generalmente mostró el mayor retraso en el inicio de la replicación, aunque el nivel final de ARN acumulado era intermedio entre las dos poblaciones de 3Rz(-).

La replicación de ARN de CEV y la acumulación en las poblaciones de plantas que expresaban la cadena antisentido respecto a la cadena positiva de CEV, AS(+) nº 1 y AS(+) nº 2 (figura 8C), dio lugar a un resultado inesperado. La tasa de inicio de replicación y los niveles acumulados fueron significativamente mayores que en la población de tipo salvaje, con un nivel máximo entre 3 y 8 veces el del tipo salvaje, alcanzado en los 34 días posteriores a la inoculación, y no al final del curso temporal. Los valores para As(+) nº 1 y nº 2 se redujeron entre los dos últimos puntos temporales en las plantas transgénicas, con valores de ARN de CEV a los 49 días de la inoculación, menores en las plantas transgénicas que en las de tipo salvaje. Se pone claramente de manifiesto que los últimos puntos temporales no pueden compararse aisladamente debido a que la infección por CEV es más rápida en las plantas As(+) durante los primeros cinco puntos temporales. De manera similar, el análisis del resultado para las poblaciones 3Rz(+) (figura 8D) muestra niveles más altos de ARN de CEV en las plantas transgénicas que en las poblaciones de tipo salvaje, con un pico a los 39 días de la inoculación, seguido de una reducción hasta el último punto temporal. Los niveles acumulados de ARN de CEV, aunque más elevados que los niveles detectados en la población de tipo salvaje, no fueron tan elevados como los niveles observados en las plantas transgénicas que expresaban cadenas antisentido respecto a la cadena positiva de CEV.

Se consideró que las poblaciones que expresaban los genes antisentido mostraban los efectos más marcados de retraso aparente y de reducción o incremento de la replicación de CEV, y se sometieron a un título más elevado de inoculación de ARN de CEV (0,3 ng de ARN de CEV por cotiledón) con el fin de estudiar adicionalmente las observaciones del experimento anteriormente descrito. La figura 9 muestra los niveles de ARN de CEV en 4 puntos temporales de la inoculación de título elevado de las poblaciones transgénicas que expresaban los genes antisentido o de tipo salvaje. En contraste con la infección de título más bajo, la cinética de inicio y los niveles de acumulación de ARN de CEV no diferían de manera significativa entre ninguna de las poblaciones y las plantas de control. Este resultado indica que el retraso observado en las plantas que expresaban las cadenas antisentido o los ribozimas que reconocen la cadena negativa de ARN de viroide no se obtienen con la inoculación al título más elevado de viroide.

Comentario

Se construyó una serie de genes sintéticos que, al transcribirse, producían secuencias de ARN antisentido o de ribozima largo que reconoce la cadena positiva de CEV (cadena de ARN genómico) o la cadena negativa de ARN sintetizada durante la replicación. Se preparó el abanico de constructos con el fin de evaluar la adecuación de los diversos transgenes y la elección de ARN diana en la interferencia con la replicación de viroide. El diseño experimental permitió analizar directamente la replicación de viroide utilizando un huésped asintomático, sin necesidad de observar el desarrollo de síntomas. Se adoptó esta decisión debido a que se desconoce cuál es la relación entre el título de ARN de viroide y el desarrollo de síntomas y porque se deseaba un resultado experimental que detectase cuantitativamente efectos sobre la replicación de viroide.

No se confundieron con efectos secundarios debidos al desarrollo de síntomas.

Se prepararon los constructos de ribozima y se demostró que eran catalíticamente activos in vitro. Se llevó a cabo un análisis adicional de los ribozimas largos con diana en la cadena positiva de ARN de CEV comparando la eficiencia de corte con un ribozima largo y una diana de TMV. El ribozima de CEV era menos eficiente que el ribozima de TMV, con tasas de corte máximas de aproximadamente el 50% de la tasa de TMV. La eficiencia de corte del ribozima de CEV se incrementó en varias veces mediante la incubación a una temperatura más alta, sugiriendo la implicación de la estructura secundaria del ARN en la interferencia en el corte a la temperatura más baja. Esta observación no era inesperada, debido a que la estructura de ARN de viroide incluye una proporción elevada de apareamiento intramolecular de bases, que proporciona una estructura similar a un bastoncillo casi de doble cadena. Podría concebirse que resultaría un suceso termodinámicamente desfavorable que la diana de CEV y la diana de ribozima largo formasen un dúplex de ARN con una cadena complementaria sin cierto grado de desestabilización de la estructura del ARN. Aunque la tasa de corte in vitro era baja, resulta posible que incluso niveles bajos de corte de un patógeno en las primeras etapas del ciclo infectivo resulten efectivas en la reducción de la propagación del patógeno en etapas posteriores del ciclo.

Se identificaron varias plantas transgénicas homocigóticas independientes que expresaban transgenes que codificaban las diversas secuencias antisentido y de ribozima largo. La observación de la replicación de viroide y de acumulación de ARN de CEV en las plantas inoculadas proporcionó resultados bastante inesperados. Todas las poblaciones homocigóticas que expresaban transgenes con diana en la cadena negativa de ARN de CEV proporcionaron un grado de protección a lo largo del curso temporal. En contraste con esta observación, todas las plantas que expresaban transgenes que reconocen la cadena positiva de CEV aparentemente daban soporte a la replicación de viroide a un nivel significativamente superior que en el tipo salvaje o que las plantas transgénicas que expresaban el transgén que reconoce la cadena negativa de ARN de CEV. En ambas clases de constructo, la adición de secuencias de ribozima de cabeza de martillo a los genes antisentido, aunque proporcionaba actividad catalítica in vitro, resultó en una reducción de los efectos de la expresión de los genes antisentido. En todos los casos, cualquier diferencia en los efectos sobre la replicación o acumulación del ARN se perdió tras la inoculación de las plantas con un título más elevado de ARN de CEV.

La protección proporcionada por los transgenes que expresaban genes con diana en la cadena negativa de ARN de CEV podría reflejar una concentración intracelular más baja de esta molécula, que quizás permita el establecimiento de una proporción más efectiva de cadena antisentido/ribozima:diana. Además, la detección de la cadena negativa de ARN de viroide en formas concataméricas podría indicar que la molécula adopta una estructura secundaria de ARN alternativa y que se encuentra en una conformación más accesible a la formación de dúplex intermolecular de ARN. Alternativamente, la vulnerabilidad de la cadena negativa de ARN podría deberse a su localización, por lo menos transitoria, en un compartimento de la célula que permite que sea accesible a los transcritos transgénicos. La observación de los efectos reducidos por el ribozima largo que reconoce la cadena de ARN de CEV de igual polaridad podría ser el resultado de una desestabilización de cualquier formación potencial de dúplex con el ARN diana debido a la alteración de la complementariedad contigua.

Resulta posible que la aparente reducción en la replicación del ARN de CEV no sea el resultado de una interacción primaria entre ARN transgénico-ARN de CEV, sino más bien el resultado de una interacción entre el transcrito transgénico y el genoma de la planta. El efecto podría manifestarse en forma de fenómeno de partícula defectiva interfiriente (DI), en el que el ARN transgénico, de longitud inferior a la genómica, interacciona con el componente de la planta que se requiere normalmente para la replicación del viroide. Efectivamente, el ARN transgénico secuestra y provoca que no se encuentre disponible un componente de la interacción que se requiere normalmente para la replicación de CEV. La adición de secuencias de cabeza de martillo puede reducir la interacción y permitir de esta manera un nivel más alto de replicación de viroide.

Los resultados opuestos que se han observado en plantas que expresan constructos que reconocen la cadena positiva de ARN de CEV también podrían ser el resultado de interacciones productivas entre el ARN transgénico y el ARN de viroide o la planta huésped. Las secuencias transgénicas podrían proporcionar estimulación in trans de la replicación del viroide. En esta etapa resulta difícil concebir qué formas de interacción podrían resultar en la regulación positiva de la replicación del viroide, dadas las lagunas en el conocimiento de los detalles moleculares de la replicación de los viroides. Otra posibilidad es que el ARN transgénico interaccione con la planta huésped e impida o modere una respuesta de defensa del huésped. La reducción de los efectos en las secuencias de ribozima largo nuevamente podrían deberse a una perturbación de la estructura secundaria del ARN por parte de las secuencias de cabeza de martillo, que a su vez alteraría la estabilidad resultante del dúplex de ARN o las asociaciones de unión.

Estos resultados demuestran que la expresión de genes antisentido o de ribozima, cuando presentan una diana en la cadena negativa de viroide, resultan en un retraso de la replicación del ARN de CEV. Ésta es la primera descripción de una forma de resistencia inducida artificialmente frente a los viroides y proporciona un buen punto de inicio desde el que desarrollar genes de resistencia más eficientes. La observación de la aparente falta de correlación entre la protección y los niveles de expresión de transgenes sugiere que el sitio de expresión y la acumulación de transcritos podrían ser hechos más importantes. Los transgenes de CEV de segunda generación podrían dirigir el ARN al compartimento celular en el que se cree que los viroides se acumulan y se replican, el nucleolo. Dichos transgenes podrían introducirse dirigiendo constructos génicos bajo el control de promotores de ARN polimerasa I a los genes de ARNr, una técnica que se ha completado eficazmente en Saccharomyces cerevisiae. La observación del incremento aparente de la replicación de viroide en plantas que expresan genes que reconocen la cadena positiva de ARN de viroide resultó inesperada y requiere investigación adicional. Ésta permitiría determinar la naturaleza de la complementación trans que resulta efectiva y su significación en la biología de los viroides. Además, este último resultado resulta de particular importancia con respecto al diseño cuidadoso de experimentos transgénicos y el análisis exhaustivo de plantas en instalaciones con aislamiento.

Estos resultados constituyen la primera indicación de la utilización con éxito de genes antisentido y ribozimas largos para mediar en la resistencia de una planta frente a un patógeno viroide. Proporciona un enfoque general para un abanico de enfermedades viroides y el mecanismo puede explotarse y extenderse para proporcionar resistencia en varios cultivos importantes económicamente, tales como la protección del tomate, la patata y el aguacate frente a CEV, PSTV y ASV. Además, la utilización de genes de resistencia que reconocen la cadena negativa de ARN o la forma intermediaria replicativa, es única y puede extenderse al reconocimiento de patógenos víricos ARN de plantas o de animales, o de otros eucariotas o procariotas.

Los expertos en la materia apreciarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y modificaciones aparte de las ya descritas específicamente.

Referencias

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Claims (13)

1. Procedimiento para proporcionar resistencia a una planta frente a patógenos viroides o la infección vírica por hordeivirus, potexvirus, carlavirus, potivirus, closterovirus, timovirus, tombusvirus, sobemovirus, luteovirus, virus del enanismo amarillo de la patata, virus del mosaico del tomate, virus X de la patata, virus Y de la patata (PVY), virus latente del clavel, virus del cascabel del tomate, virus del pardeamiento temprano del guisante, virus del mosaico estriado de la cebada, virus del mosaico amarillo del nabo, virus del enanismo amarillo de la cebada, virus del falso amarilleo de la remolacha, virus del enrollado de la hoja de la patata, virus del enanismo arbustivo del tomate, virus del mosaico sureño de la judía, virus clorótico del maíz, virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha o virus de la necrosis del tabaco, que comprende introducir en la planta un constructo que al transcribirse da lugar a una molécula de ácido nucleico de origen no natural capaz de bloquear un intermediario replicativo de dicho viroide o virus vegetal, en el que la molécula de ácido nucleico comprende un ribozima.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico contiene una pluralidad de ribozimas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ribozima es un ribozima de horquilla, un ribozima de cabeza de martillo, un minizima o un ribozima ARNasa P.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el viroide es el viroide de la mancha de sol del aguacate (ASBV), el viroide del enanismo de la bardana (BSV), el viroide del moteado clorótico del crisantemo (CCMV), el viroide del enanismo del crisantemo (CSV), el viroide de la exocortis de los cítricos (CEV), el viroide del cadang-cadang del cocotero (CCCV), el viroide del fruto pálido del pepino (CPFV), el viroide del enanismo del lúpulo (HSV), el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTV), el viroide del cogollo racimoso del tomate (TBTV), o el viroide de la "planta macho" del tomate (TPMV).

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la introducción de la molécula de ácido nucleico se lleva a cabo mediante transformación genética de una parte de la planta con una secuencia de ADN que codifica la molécula de ácido nucleico, seguida de la regeneración de una planta transgénica.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la transformación se lleva a cabo con el intermediario Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes.

7. Método de interferencia en la replicación de un virus ARN vegetal, que comprende poner en contacto una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico de origen no natural capaz de bloquear un intermediario replicativo de dicho virus vegetal, en el que la molécula de ácido nucleico comprende un ribozima, de manera que se inhibe la replicación del virus ARN en dicha célula, en el que el virus es un hordeivirus, potexvirus, carlavirus, potivirus, closterovirus, timovirus, tombusvirus, sobemovirus, luteovirus, virus del enanismo amarillo de la patata, virus del mosaico del tomate, virus X de la patata, virus Y de la patata (PVY), virus latente del clavel, virus del cascabel del tomate, virus del pardeamiento temprano del guisante, virus del mosaico estriado de la cebada, virus del mosaico amarillo del nabo, virus del enanismo amarillo de la cebada, virus del falso amarilleo de la remolacha, virus del enrollado de la hoja de la patata, virus del enanismo arbustivo del tomate, virus del mosaico sureño de la judía, virus clorótico del maíz, virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha o virus de la necrosis del tabaco.

8. Planta transgénica que muestra resistencia a un patógeno viroide o a un virus, caracterizada porque contiene en su genoma una secuencia que da lugar, al transcribirse, a la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el virus es un hordeivirus, potexvirus, carlavirus, potivirus, closterovirus, timovirus, tombusvirus, sobemovirus, luteovirus, virus del enanismo amarillo de la patata, virus del mosaico del tomate, virus X de la patata, virus Y de la patata (PVY), virus latente del clavel, virus del cascabel del tomate, virus del pardeamiento temprano del guisante, virus del mosaico estriado de la cebada, virus del mosaico amarillo del nabo, virus del enanismo amarillo de la cebada, virus del falso amarilleo de la remolacha, virus del enrollado de la hoja de la patata, virus del enanismo arbustivo del tomate, virus del mosaico sureño de la judía, virus clorótico del maíz, virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha o virus de la necrosis del tabaco.

9. Planta transgénica según la reivindicación 8, caracterizada porque es un melón, un pepino, un calabacín, un tomate, un pimentón o una judía.

10. Frutos, injertos o semillas de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, caracterizados porque contienen en su genoma una secuencia que da lugar, al transcribirse, a la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Células vegetales transformadas por un vector de transferencia que comprende ARN o ADN o una combinación de los mismos, que contiene una secuencia nucleótida que al transcribirse da lugar a la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Célula vegetal que comprende una secuencia nucleótida que es, o que al transcribirse da lugar a, la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Planta transgénica según la reivindicación 8, que es la planta de la alfalfa, manzana, judía, canola (colza en semillas oleaginosas), cantalupo, maíz, algodón, calabacín, pepino, melón, papaya, pimiento, patata, arroz, soja, calabaza, fresa, girasol, pimentón, tabaco, tomate o nuez.